專利名稱：使用無針注射器進(jìn)行皮膚疾病基因治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用無針注射器皮下導(dǎo)入多核苷酸以治療皮膚疾病的方法。
背景技術(shù)：
皮膚疾病的種類有很多，包括例如創(chuàng)傷、皮膚潰瘍、遺傳過敏性皮炎、褥瘡、燒傷、凍瘡、光線過敏癥、銀屑病、掌跖膿胞病、濕疹和硬皮病。許多皮膚疾病是難治性疾病。
其中，慢性(難治性)創(chuàng)傷被具體定義為“不能以有序和及時(shí)的方式進(jìn)行愈合以產(chǎn)生解剖學(xué)和機(jī)能上的完整性的創(chuàng)傷或者無法進(jìn)行解剖學(xué)和機(jī)能上的修復(fù)過程的創(chuàng)傷”。這種創(chuàng)傷對任何形式的適當(dāng)?shù)姆e極的處理在形狀、外觀上都沒有反應(yīng)，即使在2～4周后也沒有顯示出有治愈的傾向。慢性(難治性)創(chuàng)傷是一種難治性皮膚疾病。
皮膚潰瘍，另一種難治性皮膚疾病，是由于持續(xù)的壓迫/摩擦、褥瘡或末梢循環(huán)障礙(脈管阻塞性病變等)導(dǎo)致血流和淋巴淤滯，使得組織處于持續(xù)缺血狀態(tài)，該狀態(tài)導(dǎo)致細(xì)胞壞死，從而引發(fā)的疾病。
銀屑病有幾種臨床類型。常見的類型是牛皮癬，牛皮癬是一種難治性的慢性炎癥性過度角化疾病，其伴隨有1.表皮增厚和角質(zhì)化，和2.炎癥細(xì)胞向表皮/真皮浸潤。
以往，藥物制劑例如腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、維甲酸、活性維生素D3、抗病毒劑、干擾素和前列腺素被用于治療這些皮膚疾病。但這些制劑都不滿足有效性、安全性、防止復(fù)發(fā)等。
通過參考，將US 2002/064876和日本專利公開號特表2003-502350合并到本說明書中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明預(yù)解決了缺乏有效用于治療皮膚疾病，特別是難治性皮膚疾病的臨床方法的問題。
具體地，本發(fā)明提供了以下用于治療皮膚疾病的方法。
(1)包括使用無針注射器皮下導(dǎo)入一種多核苷酸的皮膚疾病治療方法；(2)包括使用無針注射器在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入一種多核苷酸的皮膚疾病治療方法；(3)(1)～(2)的治療方法，其中所述多核苷酸選自DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈；(4)(1)～(3)的治療方法中的任一種，包括將每劑量10μg～10mg的多核苷酸分開噴射/皮下導(dǎo)入到患病皮膚周圍的多個(gè)部位；(5)(1)～(4)的治療方法中的任一種，其中無針注射器通過氣體壓力或者彈性部件的彈力使活塞移動(dòng)而噴射藥液；(6)(5)的治療方法，其中所述氣體為氦氣、氮?dú)饣蛘呖諝?，且其中所述彈性部件是彈簧?7)(1)～(6)的治療方法中的任一種，其中所述多核苷酸是肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；(8)(1)～(7)的治療方法中的任一種，其中的寡核苷酸是含有SEQ ID NO1或2所示序列的NF-κB誘餌寡核苷酸；(9)(1)～(8)的治療方法中的任一種，其中所述皮膚疾病為創(chuàng)傷、皮膚潰瘍或者銀屑??；(10)(1)～(9)的治療方法中的任一種，其中所述創(chuàng)傷為術(shù)后創(chuàng)傷或者由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷；(11)(1)～(10)的治療方法中的任一種，其中的皮膚潰瘍?yōu)橐环N難治性皮膚潰瘍；(12)(1)～(11)的治療方法中的任一種，其中的難治性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿⌒詽?、褥?壓迫性潰瘍)或伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍；(13)創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的治療方法，該方法包括使用無針注射器在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；(14)(13)的治療方法，該方法包括使用無針注射器，在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；(15)銀屑病的治療方法，該方法包括使用無針注射器，在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入NF-κB誘餌寡核苷酸；(16)一種用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑，其用于使用無針注射器進(jìn)行皮下導(dǎo)入，且其包含一種多核苷酸作為活效成分；(17)一種用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含一種多核苷酸作為活效成分；(18)(16)或(17)的制劑，其中所述多核苷酸選自DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈中；(19)(16)～(18)的制劑中的任一種，其用于在患病皮膚周圍的多個(gè)部位進(jìn)行分開噴射/皮下導(dǎo)入，且其含有每劑量10μg～10mg的多核苷酸作為活性成分；(20)(16)～(19)的制劑中的任一種，其中無針注射器通過氣體壓力或者彈性部件的彈力使活塞移動(dòng)而噴射藥液；
(21)(20)的制劑，其中所述氣體是氦氣、氮?dú)饣蛘呖諝?，且所述彈性部件是彈簧?22)(16)～(21)的制劑中的任一種，其中所述多核苷酸是肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；(23)(16)～(22)的制劑中的任一種，其中的寡核苷酸是含有SEQ ID NO1或2所示序列的NF-κB誘餌寡核苷酸；(24)(16)～(23)的制劑中的任一種，其中所述皮膚疾病為創(chuàng)傷、皮膚潰瘍或者銀屑??；(25)(16)～(24)的制劑中的任一種，其中創(chuàng)傷為術(shù)后創(chuàng)傷或者由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷；(26)(16)～(25)的制劑中的任一種，其中皮膚潰瘍?yōu)橐环N難治性皮膚潰瘍；(27)(16)～(26)的制劑中的任一種，其中的難治性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿⌒詽儭⑷殳?壓迫性潰瘍)或伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍；(28)一種用于治療、改善或預(yù)防創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因作為活性成分；(29)(28)的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因作為活性成分；(30)一種用于治療、改善或預(yù)防銀屑病的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含NF-κB誘餌寡核苷酸作為活性成分；(31)一種多核苷酸在制備使用無針注射器進(jìn)行皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑中的用途；(32)一種多核苷酸在制備使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑中的用途；(33)(31)或(32)的用途，其中所述多核苷酸是選自DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈中的一種；(34)(31)～(33)中任一項(xiàng)的用途，其中將每劑量10μg～10mg的多核苷酸分開噴射/皮下導(dǎo)入到患病皮膚周圍的多個(gè)部位；(35)(31)～(34)中任一項(xiàng)的用途，其中無針注射器通過氣體壓力或者彈性部件的彈力使活塞移動(dòng)而噴射藥液；(36)(35)的用途，其中所述氣體是氦氣、氮?dú)饣蛘呖諝?，且所述彈性部件是彈簧?37)(31)～(36)中任一項(xiàng)的用途，其中所述多核苷酸是肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；(38)(31)～(37)中任一項(xiàng)的用途，其中的寡核苷酸是包含SEQ ID NO1或2所示序列的NF-κB誘餌寡核苷酸；(39)(31)～(38)中任一項(xiàng)的用途，其中所述皮膚疾病為創(chuàng)傷、皮膚潰瘍或者銀屑??；(40)(31)～(39)中任一項(xiàng)的用途，其中創(chuàng)傷為術(shù)后創(chuàng)傷或者由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷；(41)(31)～(40)中任一項(xiàng)的用途，其中皮膚潰瘍?yōu)橐环N難治性皮膚潰瘍；(42)(31)～(41)中任一項(xiàng)的用途，其中的難治性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿⌒詽?、褥?壓迫性潰瘍)或伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍；
(43)肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因在制備使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的制劑中的用途；(44)肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因在制備用于治療、改善或預(yù)防的制劑的(43)的用途，其中所述制劑是使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入；和(45)NF-κB誘餌寡核苷酸在制備使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防銀屑病的制劑中的用途。
本發(fā)明中術(shù)語“無針注射器”是指不使用注射針，而通過氣體壓力或者彈性部件的彈力將活塞移動(dòng)將藥液注射入皮膚從而將藥物成分經(jīng)皮下施用，更優(yōu)選為施用到皮下細(xì)胞內(nèi)的醫(yī)療器械。
市售無針注射器的例子包括ShimaJETTM(Shimadzu Co.)、Medi-Jector VisionTM(Elitemedical)、PenJetTM(PenJet)等。
與傳統(tǒng)的針頭注射器不同，無針注射器的優(yōu)點(diǎn)在于例如可以避免疼痛和感染的危險(xiǎn)。
具體地，本發(fā)明的多核苷酸包括，例如DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈。
這些多核苷酸可以是裸露的，也可以被插入各種載體或質(zhì)粒中。
本發(fā)明的多核苷酸包括但不限于任何已知的多核苷酸。優(yōu)選的多核苷酸的例子包括血管生成因子基因、前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因、氧化氮合酶(NOs)基因和轉(zhuǎn)錄因子的誘餌寡核苷酸。
血管生成因子基因的具體例子有肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)基因、表皮生長因子(EGF)基因和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)基因等，其中更優(yōu)選肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因。肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因的序列已被公開，例如在日本專利號2577091中所公開。
術(shù)語“前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因”是指編碼與從前列腺素H2(PGH2)生成前列環(huán)素I2(PGI2)的過程相關(guān)的酶的基因。其具體的序列已被公開，例如在日本專利公開號特再表95/030013中所公開。
轉(zhuǎn)錄因子的誘餌寡核苷酸的具體例子包括NF-κB誘餌寡核苷酸、E2F誘餌寡核苷酸、AP-1誘餌寡核苷酸、Ets誘餌寡核苷酸、STAT-1誘餌寡核苷酸、STAT-6誘餌寡核苷酸和GATA-3誘餌寡核苷酸。其中，更優(yōu)選NF-κB誘餌寡核苷酸。
NF-κB誘餌寡核苷酸的具體例子包括含有GGGRA(C，T)TYYA(C，T)C的序列(R和Y分別代表嘌呤和嘧啶核苷酸)，更加具體地例如是含有SEQ ID NO1或2所示序列的寡核苷酸。
對本發(fā)明的皮膚疾病的種類沒有限定。特別地，優(yōu)選難治性皮膚疾病。具體的，這些疾病包括如創(chuàng)傷、皮膚潰瘍和銀屑病。
創(chuàng)傷的例子特別包括但不限于術(shù)后創(chuàng)傷和由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷。
對于皮膚潰瘍的類型沒有限定。優(yōu)選的皮膚潰瘍的例子包括難治性皮膚潰瘍，更優(yōu)選糖尿病性潰瘍、褥瘡(壓迫性潰瘍)和伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍。
本發(fā)明的最優(yōu)選實(shí)施方式包括以下組合。
(1)用于治療創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的方法，該方法包括使用無針注射器在患病區(qū)域周圍的多個(gè)部位噴射/皮下導(dǎo)入肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因；(2)用于治療創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的方法，該方法包括使用無針注射器在患病區(qū)域周圍的多個(gè)部位噴射/皮下導(dǎo)入前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；(3)用于治療創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的方法，該方法包括使用無針注射器在患病區(qū)域周圍的多個(gè)部位噴射/皮下導(dǎo)入肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因；和(4)用于治療銀屑病的方法，該方法包括使用無針注射器在患病區(qū)域周圍的多個(gè)部位噴射/皮下導(dǎo)入NF-κB誘餌寡核苷酸。
對本發(fā)明的多核苷酸劑量沒有具體限定，取決于疾病的種類和嚴(yán)重程度、疾病部位的位置和大小、患者的年齡和性別、并發(fā)癥、伴隨藥物和其它因素。通常，優(yōu)選將每劑量10μg～10mg的多核苷酸分開噴射/皮下導(dǎo)入到患病皮膚周圍的多個(gè)部位。
本說明書中引用的所有現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)都作為參考合并到本說明書中。


圖1是一組證明僅在表皮組織中檢測到黃色熒光蛋白(Venus)的表達(dá)的照片。
圖2是一組證明僅在表皮組織中檢測到LacZ表達(dá)的照片。
圖3表示ShimaJET注射組顯示出的熒光素酶活性約為針頭注射組的約100倍，并因此獲得了更高的導(dǎo)入效率。
圖4顯示了在第4和6天、在HGF和/或PGIS注射組中觀測到了創(chuàng)傷治愈促進(jìn)效果，在同時(shí)注射組(組5)中觀察到效果增強(qiáng)。
圖5是一組證明了HGF和PGIS兩者對增強(qiáng)創(chuàng)傷周圍血流都有效的照片。
圖6是一組證明了HGF和PGIS基因兩者都在創(chuàng)傷部位表皮組織中表達(dá)的照片。
圖7所示為確認(rèn)HGF蛋白質(zhì)水平增加的圖。
具體實(shí)施例方式
以下，通過實(shí)施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的說明。但是，這些實(shí)施例并非對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例1導(dǎo)入部位的確認(rèn)確認(rèn)無針注射入大鼠皮膚的黃色熒光蛋白(Yellow FluorescenceProtein)(Venus)質(zhì)粒(Venus/pCS2)導(dǎo)入部位(見圖1)。
方法(1)將大鼠背部皮膚剃毛，然后用Kanebo epilat除毛膏進(jìn)行除毛。然后，用ShimaJET注射100μg/100μl的黃色熒光蛋白(Venus)/pCS2。為了比較，將不含有Venus的質(zhì)粒(pCS2)用作對照。
(2)24小時(shí)后將大鼠處死，采集注射部位的皮膚。
(3)將組織放入OCT化合物中并在液氮中進(jìn)行迅凍，然后制作切片并在熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。
結(jié)果僅在表皮組織中檢測到黃色熒光蛋白(Venus)的表達(dá)。通過無針注射將LacZ質(zhì)粒(pcLacZ)注射到大鼠皮膚中的導(dǎo)入部位的確認(rèn)(見圖2)方法(1)將大鼠背部皮膚剃毛、除毛。然后，用ShimJET注射pcLacZ200μg/200μl。
(2)24小時(shí)后將大鼠處死，采集注射部位的皮膚。
(3)將該組織放入OCT化合物中，在液氮中進(jìn)行迅凍，然后制作切片。將切片用1％戊二醛固定，用β-gal染色液染色，并在顯微鏡下進(jìn)行觀察。
結(jié)果僅在表皮組織中檢測到了LacZ的表達(dá)。
實(shí)施例2 導(dǎo)入效率的評價(jià)熒光素酶活性測定(見圖3)方法(1)將大鼠背部皮膚剃毛。除毛后，用ShimaJET將50μg/50μl和100μg/100μl的熒光素酶質(zhì)粒(pGL3 luc)注射到該大鼠的皮膚中。
為了比較，用26G注射器將等量的質(zhì)粒用針頭對大鼠進(jìn)行皮內(nèi)注射。
(2)24小時(shí)后處死大鼠，采集注射部位中心約2cm2的皮膚。從未經(jīng)處置的大鼠采集皮膚作為對照組。
(3)加入1ml熒光素酶裂解緩沖液(Promega)，用剪刀將皮膚盡可能地剪碎成小片。
(4)在-80℃迅速冷凍所述皮膚10分鐘，之后在室溫下解凍。重復(fù)該處理2次。
(5)5000rpm離心10分鐘后取上清。
(6)測定熒光素酶活性(Berthold LB9507)。
圖3顯示了各處理后的總熒光素酶活性。在圖3中，“ID 50”和“ID 100”分別表示用針頭將50μg/50μl和100μg/100μl的pGL3 luc質(zhì)粒經(jīng)皮內(nèi)對大鼠進(jìn)行注射，“Shima 50”和“Shima 100”表示用ShimaJET分別將50μg/50μl和100μg/100μl的pGL3 luc質(zhì)粒注射入大鼠皮膚中。
結(jié)果ShimaJET注射組的熒光素酶活性約為針頭注射組的100倍，確認(rèn)獲得了高導(dǎo)入效率。
實(shí)施例3 創(chuàng)傷治愈效果的評估大鼠創(chuàng)傷治愈障礙模型的制備通過將作為類固醇的水溶性強(qiáng)的松龍(強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉Pz，Shionogi&CO.，LTD)施用給大鼠制備了大鼠創(chuàng)傷治愈障礙模型。將類固醇施用給類固醇施用大鼠模型產(chǎn)生了創(chuàng)傷張力、上皮化、血管發(fā)生、創(chuàng)傷收縮等方面的傷害，其結(jié)果是導(dǎo)致了創(chuàng)傷治愈的延遲。
(1)用針頭向7周齡的雄性Wister大鼠肌肉注射30mg/kg劑量的水溶性強(qiáng)的松龍(強(qiáng)的松龍琥珀酸鈉Pz，Shionogi & CO.，LTD)，3天后(創(chuàng)傷產(chǎn)生當(dāng)日)再次用針頭肌肉注射30mg/kg劑量的水溶性強(qiáng)的松龍。對照組肌肉注射PBS。
(2)將大鼠背部皮膚剃毛，除毛后，全層切除直徑1.6cm(面積約為2cm2)的圓形皮膚以產(chǎn)生創(chuàng)傷。
質(zhì)粒導(dǎo)入(3)在創(chuàng)傷周圍的5個(gè)部位用ShimaJET注射質(zhì)粒(HGF、PGIS或HGF+PGIS)。任何一種的質(zhì)粒，在1次注射中所使用的質(zhì)粒的量和溶液體積分別為100μg和100μl。
針頭注射PBS作為對照組(在各組中，n＝6)。
HGF質(zhì)粒CAS登錄號627861-07-8PGIS質(zhì)粒將WO95/30013中公開的SEQ ID NO11的cDNA插入pVAX1(Invitrogen)中。

創(chuàng)傷面積的測量(見圖4和下表)(4)在創(chuàng)傷產(chǎn)生第0、2、4、6、9和12天，用描圖紙將創(chuàng)傷描圖后用掃描儀掃描，利用NIH image1.61的方法計(jì)算面積。將第0天的面積取作100，然后計(jì)算在以后的天數(shù)上的相對面積。
結(jié)果在第4和6天，在HGF和/或PGIS無針注射組獲得了創(chuàng)傷治愈促進(jìn)效果。在同時(shí)注射組(組5)中發(fā)現(xiàn)效果被增強(qiáng)。
創(chuàng)傷面積％

血流測定(見圖5)(5)產(chǎn)生創(chuàng)傷后4天，使用Laser Doppler Imager(Moor)監(jiān)測大鼠背部創(chuàng)傷周圍的血流狀態(tài)。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)HGF和PGIS兩者在增強(qiáng)創(chuàng)傷周圍血流方面都是有效的。
HGF和PGIS基因表達(dá)的確認(rèn)(見圖6)采集創(chuàng)傷部位的皮膚，按照以下程序進(jìn)行HGF和PGIS的免疫染色HGF的免疫染色將采集的皮膚樣本固定在石蠟中，然后制作切片。用100％二甲苯處理5分鐘、3次，100％乙醇處理5分鐘、2次，99％乙醇處理5分鐘，90％乙醇處理5分鐘，75％乙醇處理5分鐘將石蠟除去，然后用水洗滌10分鐘。在95℃修復(fù)抗原15分鐘。用80％甲醇/0.6％過氧化氫和3％過氧化氫處理所述切片，然后用正常山羊血清封閉30分鐘。加入10倍稀釋的一抗(兔抗人HGFb(H495)多克隆抗體，18134，免疫生物研究所)，然后于4℃孵育所述切片過夜。洗凈一抗后，加入二抗(抗兔抗體、Vectastain Elite ABC kit，生物素化抗體)，在室溫下孵育所述切片30分鐘。洗凈二抗后，加入Vectastain Elite ABC試劑，將所述切片孵育30分鐘。用DAB(Funakoshi)對所述切片染色后，用蘇木精/伊紅復(fù)染色。將切片脫水、封固，然后在顯微鏡下進(jìn)行檢測。
結(jié)果在表皮組織中檢測到了HGF的表達(dá)。
PGIS的免疫染色從采集的皮膚樣本制備凍結(jié)切片并在制冷器中干燥過夜，然后用冷丙酮(-20℃)固定15分鐘。用抗生物素蛋白和生物素封閉后，用80％甲醇/0.6％過氧化氫和3％過氧化氫處理所述切片。加入復(fù)合抗體(一抗(兔抗PGIS C末端肽兔多克隆抗體(1000倍稀釋)、二抗(生物素標(biāo)記的山羊抗兔抗體(DAKO E0432)(300倍稀釋)以及正常兔血清的混合物)，然后將所述切片于4℃孵育過夜。洗凈抗體后，將所述切片與過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生素蛋白(DAKO E1016)在室溫下反應(yīng)30分鐘，用DAB(Funakoshi)染色，然后用蘇木精/伊紅復(fù)染色。然后將所述切片脫水、封固，并在顯微鏡下進(jìn)行檢測。
結(jié)果在表皮組織中檢測到PGIS的表達(dá)。
實(shí)施例4 HGF蛋白質(zhì)的定量(見圖7)方法(1)將大鼠背部皮膚剃毛、除毛后，用ShimaJET注射HGF質(zhì)粒。24小時(shí)后，將大鼠處死并采集組織(約40mg)。
(2)用800μlPBS洗滌所述組織，加入10倍量的提取緩沖液勻漿(提取液20mM Tris-HCL緩沖液(pH7.5)；2M NaCl；0.1％Tween80；1mM EDTA；1mM PMSF)。
(3)于4℃，以15000rpm將所述組織離心30分鐘。
(4)收集上清，用ELISA(Biosource)進(jìn)行測定。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)HGF蛋白質(zhì)水平增加。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明提供了用于治療皮膚疾病的方法，更特別地，本發(fā)明提供了用于治療難治性皮膚疾病的方法，對于這些疾病迄今為止還沒有高度有效的臨床治療方法。
序列表<110>安琪士摩奇 株式會(huì)社<120>使用無針注射器進(jìn)行皮膚病基因治療<130>MED-A0402P<150>JP 2003-307713<151>2003-08-29<160>2<210>1<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequence Synthetic DNA<400>1ccttgaaggg atttccctcc 20<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial Sequence<220>
<223>Description of Artificial Sequence Synthetic DNA<400>2ttgccgtacc tgacttagcc 20
權(quán)利要求
1.一種用于治療皮膚疾病的方法，該方法包括用無針注射器皮下導(dǎo)入一種多核苷酸。
2.一種用于治療皮膚疾病的方法，該方法包括用無針注射器在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入一種多核苷酸。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述多核苷酸選自DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈。
4.權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)的方法，包括將每劑量10μg～10mg的多核苷酸分開噴射/皮下導(dǎo)入到患病皮膚周圍的多個(gè)部位。
5.權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)的方法，其中無針注射器通過氣體壓力或者彈性部件的彈力使活塞移動(dòng)而噴射藥液。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述氣體是氦氣、氮?dú)饣蚩諝?，且其中所述彈性部件是彈簧?br> 7.權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)的方法，其中所述多核苷酸是肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因。
8.權(quán)利要求1～7中任一項(xiàng)的方法，其中的寡核苷酸是包含SEQ ID NO1或2所示序列的NF-κB誘餌寡核苷酸。
9.權(quán)利要求1～8中任一項(xiàng)的方法，其中所述皮膚疾病為創(chuàng)傷、皮膚潰瘍或者銀屑病。
10.權(quán)利要求1～9中任一項(xiàng)的方法，其中創(chuàng)傷為術(shù)后創(chuàng)傷或者由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷。
11.權(quán)利要求1～10中任一項(xiàng)的方法，其中皮膚潰瘍?yōu)橐环N難治性皮膚潰瘍。
12.權(quán)利要求1～11中任一項(xiàng)的方法，其中的難治性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿⌒詽?、褥?壓迫性潰瘍)或伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍。
13.一種用于治療創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的方法，該方法包括使用無針注射器在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因。
14.權(quán)利要求13的方法，包括使用無針注射器在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因。
15.一種用于治療銀屑病的方法，該方法包括使用無針注射器在患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入NF-κB誘餌寡核苷酸。
16.一種用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑，其用于使用無針注射器進(jìn)行皮下導(dǎo)入，且其包含一種多核苷酸作為活性成分。
17.一種用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含一種多核苷酸作為活性成分。
18.權(quán)利要求16或17的制劑，其中所述多核苷酸選自DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈。
19.權(quán)利要求16～18中任一項(xiàng)的制劑，其用于在患病皮膚周圍的多個(gè)部位進(jìn)行分開噴射/皮下導(dǎo)入，且其含有每劑量10μg～10mg的所述多核苷酸作為活性成分。
20.權(quán)利要求16～19中任一項(xiàng)的制劑，其中所述無針注射器通過氣體壓力或者彈性部件的彈力使活塞移動(dòng)而噴射藥液。
21.權(quán)利要求20的制劑，其中所述氣體為氦氣、氮?dú)饣蛘呖諝猓移渲兴鰪椥圆考閺椈伞?br> 22.權(quán)利要求16～21中任一項(xiàng)的制劑，其中所述多核苷酸為肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因。
23.權(quán)利要求16～22中任一項(xiàng)的制劑，其中所述寡核苷酸是包含SEQ ID NO1或2所示序列的NF-κB誘餌寡核苷酸。
24.權(quán)利要求16～23中任一項(xiàng)的制劑，其中所述皮膚疾病為創(chuàng)傷、皮膚潰瘍或者銀屑病。
25.權(quán)利要求16～24中任一項(xiàng)的制劑，其中的創(chuàng)傷為術(shù)后創(chuàng)傷或者由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷。
26.權(quán)利要求16～25中任一項(xiàng)的制劑，其中的皮膚潰瘍?yōu)橐环N難治性皮膚潰瘍。
27.權(quán)利要求16～26中任一項(xiàng)的制劑，其中的難治性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿⌒詽儭⑷殳?壓迫性潰瘍)或伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍。
28.一種用于治療、改善或預(yù)防創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因作為活性成分。
29.權(quán)利要求28的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因作為活性成分。
30.一種用于治療、改善或預(yù)防銀屑病的制劑，其用于使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入，且其包含NF-κB誘餌寡核苷酸作為活性成分。
31.一種多核苷酸在制備使用無針注射器進(jìn)行皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑中的用途。
32.一種多核苷酸在制備使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防皮膚疾病的制劑中的用途。
33.權(quán)利要求31或32的用途，其中所述多核苷酸是選自DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈中的一種。
34.權(quán)利要求31～33中任一項(xiàng)的用途，其中將每劑量10μg～10mg的多核苷酸分開噴射/皮下導(dǎo)入到患病皮膚周圍的多個(gè)部位。
35.權(quán)利要求31～34中任一項(xiàng)的用途，其中無針注射器通過氣體壓力或者彈性部件的彈力使活塞移動(dòng)而噴射藥液。
36.權(quán)利要求35的用途，其中所述氣體為氦氣、氮?dú)饣蛘呖諝?，且其中所述彈性部件為彈簧?br> 37.權(quán)利要求31～36中任一項(xiàng)的用途，其中所述多核苷酸為肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因。
38.權(quán)利要求31～37中任一項(xiàng)的用途，其中所述寡核苷酸是包含SEQ ID NO1或2所示序列的NF-κB誘餌寡核苷酸。
39.權(quán)利要求31～38中任一項(xiàng)的用途，其中所述皮膚疾病為創(chuàng)傷、皮膚潰瘍或者銀屑病。
40.權(quán)利要求31～39中任一項(xiàng)的用途，其中的創(chuàng)傷為術(shù)后創(chuàng)傷或者由于受傷或事故造成的創(chuàng)傷。
41.權(quán)利要求31～40中任一項(xiàng)的用途，其中的皮膚潰瘍?yōu)橐环N難治性皮膚潰瘍。
42.權(quán)利要求31～41中任一項(xiàng)的用途，其中的難治性皮膚潰瘍?yōu)樘悄虿⌒詽?、褥?壓迫性潰瘍)或伴隨靜脈或動(dòng)脈機(jī)能不全的潰瘍。
43.肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和/或前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因在制備使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防創(chuàng)傷或皮膚潰瘍的制劑中的用途。
44.肝細(xì)胞生長因子(HGF)基因和前列環(huán)素合成酶(PGIS)基因在制備用于治療、改善或預(yù)防的制劑的權(quán)利要求43的用途，其中所述制劑是使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入。
45.NF-κB誘餌寡核苷酸在制備使用無針注射器在患病皮膚周圍進(jìn)行噴射/皮下導(dǎo)入的、用于治療、改善或預(yù)防銀屑病的制劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于治療皮膚疾病，特別是難治性皮膚疾病的高度有效的臨床方法。具體地說，所述方法包括使用通過氣體壓力或者彈性部件的彈力將活塞移動(dòng)注射藥液的無針注射器，在與皮膚疾病相關(guān)的病變例如創(chuàng)傷、皮膚潰瘍、銀屑病的患病皮膚周圍噴射/皮下導(dǎo)入10μg～10mg劑量的多核苷酸例如DNA、寡核苷酸、RNA、siRNA和反義鏈。
文檔編號A61P17/06GK1842349SQ20048002482
公開日2006年10月4日 申請日期2004年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月29日
發(fā)明者椚座康夫, 富田奈留也, 吉川秀樹, 谷山義明, 玉井克人, 森下竜一 申請人:安琪士摩奇 株式會(huì)社