專利名稱：用于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體介導的基因送遞及作為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑的重組多肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于定向基因送遞、特別是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體介導的基因送遞及用作神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑的重組多肽，及其制備。
背景技術(shù)：
定向基因送遞(targeted gene delivery)至所選擇的細胞類型提供了一種用于高度特異性基因表達的手段?；蜣D(zhuǎn)移的效率提高可以通過增強基因載體進入所希望的細胞中并降低非靶細胞對所述載體的攝取而實現(xiàn)。對于治療性應用，定向基因送遞在保證在感興趣的細胞中的治療效果，同時限制由外源基因在非靶細胞中表達所致的副作用包括免疫應答、炎癥應答和胞毒性應答中是關(guān)鍵的。
一種定向基因送遞的方法是使用配體相關(guān)的送遞載體。通過該配體，所述載體識別并結(jié)合靶細胞獨特的細胞表面受體，并在與所述配體結(jié)合的基礎(chǔ)上可以被胞吞。所述受體-載體復合物與周圍的質(zhì)膜一起可因此成為胞內(nèi)運輸小泡。在基因從所述小泡中脫出并易位至細胞核之后，基因產(chǎn)物可被表達。這種受體介導的胞內(nèi)基因送遞最初由Wu GY和Wu CH在1987年報道(Receptor-mediated in vitro genetransformation by a soluble DNA carrier system.J Biol Chem 1987 Apr5；2624429-32；1992年11月24日授權(quán)的美國專利No.5,166,320)，并在藥物/基因送遞領(lǐng)域倍受關(guān)注。迄今為止對于定向基因送遞已經(jīng)研究試驗了許多配體-受體系統(tǒng)。測試的配體包括脫唾液酸糖蛋白(WuGY and Wu CH，J Biol Chem.，2624429-32，1987)、整聯(lián)蛋白結(jié)合肽(Berkner KL，Biotechniques 6616-629，1988；Cristiano RJ et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，902122-2126，1993)、運鐵蛋白(Zenke M et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，873655-3659，1990；Wanger E，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，884255-4259，1991；美國專利No 5,922,859)、半乳糖(Remy JS et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，921744，1995)、葉酸(Lee RJ and Huang L，J.Biol.Chem.，271，8481，1996)、成纖維細胞生長因子(Goldman CK etal.，Cancer Res，571447-1451，1997；HogansonDK et al.，Human Gene Therapy，92565-2575，1998)、及上皮生長因子(Schaffer and Lauffenburger，J Bio Chem，27328004-28009，1998)。這些配體已經(jīng)用于主要定向于肝細胞和腫瘤細胞?；谂潴w的基因送遞系統(tǒng)根據(jù)其功能通過相對充分鑒定的配體-受體結(jié)合機制包括相關(guān)的受體而闡明。然而對于通過受體-配體相互作用而將基因載體定向于一個復雜系統(tǒng)如神經(jīng)系統(tǒng)中的細胞，目前還了解極少。
神經(jīng)系統(tǒng)疾病，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，如中風、癲癇、頭部和脊髓損傷、帕金森病、亨廷頓病(Huntington′s disease)、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥及許多神經(jīng)遺傳學疾病，對個體具有破壞性作用并且由于需長期護理和喪失生產(chǎn)力而具有高社會成本。許多前述疾病與一或多個基因的缺乏、功能失?；蚴嚓P(guān)并且對常規(guī)的治療方式無很好的反應。因此已經(jīng)認為將基因轉(zhuǎn)移至CNS中是治療這些疾病的潛在方法。這種方法可改變神經(jīng)營養(yǎng)因子、抗程序性細胞死亡蛋白、抗氧化分子及其它治療因子的表達水平以恢復、停止或預防CNS中的細胞尤其是神經(jīng)元的退化。基因治療對CNS惡性腫瘤的治療也提供了很大希望。
CNS是機體中最復雜的器官，其獨特性質(zhì)對在該系統(tǒng)內(nèi)成功進行基因治療設(shè)置了一些障礙。這些特性包括由于顱骨和血腦屏障這些物理屏障的存在而限制接觸CNS、神經(jīng)元定期分化的性質(zhì)及用治療性基因有效轉(zhuǎn)染它們的難度。另外，在CNS中發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元類型多種多樣，其中許多神經(jīng)元類型對生理功能非常關(guān)鍵并且對任何類型的改變均非常敏感。在神經(jīng)學情況中，疾病可影響神經(jīng)元的一個亞類，而其它的則不受影響。這些特點強烈需要開發(fā)這樣的CNS基因療法其需要將治療性基因的表達限制在特定類型的CNS細胞中，由此限制非靶CNS細胞中基因表達可能引起的副作用。
目前，CNS中定向基因送遞僅簡單地通過將裸DNA或基因轉(zhuǎn)移載體直接定向注射進充分限定的解剖部位而完成，其可轉(zhuǎn)導注射部位周圍的各種類型的細胞。病毒或非病毒基因載體的逆行軸突運輸提供了通過在CNS或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中選擇適當?shù)淖⑸洳课欢ㄏ蛑敛煌瑓^(qū)域中神經(jīng)元的另一種方式進行。然而這種方法轉(zhuǎn)導所有的投射神經(jīng)元并且不區(qū)分神經(jīng)元的亞類。
本領(lǐng)域熟知神經(jīng)元在送遞信號所用的化學遞質(zhì)及接受所述信號所用的受體方面的差異。神經(jīng)系統(tǒng)利用9種小分子遞質(zhì)和50多種神經(jīng)活性肽，提供了基于其神經(jīng)遞質(zhì)表型對神經(jīng)元進行分類的方式。不同神經(jīng)元除了對各種神經(jīng)遞質(zhì)的敏感性不同，它們對稱為神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophic factor)的另一類型分子的應答也可能不同。這些營養(yǎng)因子是內(nèi)源的可溶性多肽，對神經(jīng)元的發(fā)育、生長和存活起重要作用，并且據(jù)信它們對治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病和CNS創(chuàng)傷性傷害具有巨大潛力。在20多種已知神經(jīng)營養(yǎng)因子中，研究最充分的一組是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白(neurotrophins)，這是長度為大約120個氨基酸并且呈現(xiàn)大約50％氨基酸序列相同性的一個結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的多肽家族。從哺乳動物中分離的4種主要神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是神經(jīng)生長因子(NGF)(人NGF序列參見SEQ ID NO1)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)(人BDNF序列參見SEQ ID NO2)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT3)(人NT3序列參見SEQ IDNO3)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(NT4/5)(人NT4/5序列參見SEQ ID NO4)。所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白作為非共價結(jié)合的同型二聚體從神經(jīng)元靶細胞中合成并分泌，并通過與其位于神經(jīng)末端的受體結(jié)合后逆行傳遞信號而起作用。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白有兩類主要的受體受體蛋白酪氨酸激酶(包括TrkA、TrkB和TrkC)及75-kDa跨膜糖蛋白p75NTR。NGF選擇性地與TrkA相互作用，BDNF和NT4/5主要與TrkB相互作用，NT3主要與TrkC相互作用，也與TrkA和TrkB程度略低地相互作用(MeakinSO and Shooter EM，Trends Neurosci.，15323-331，1992)。所有神經(jīng)營養(yǎng)蛋白均與p75NTR相互作用，但相比于其與Trk的相互作用，親和力相對較低。
免疫染色表明Trk在成人腦的神經(jīng)元中中等程度表達，在星形膠質(zhì)細胞中弱表達。在少突膠質(zhì)細胞中未發(fā)現(xiàn)Trk染色。p75NTR存在于神經(jīng)元中，特別是在發(fā)育期間，存在于少突膠質(zhì)細胞中及以極低水平存在于許多成熟的星形膠質(zhì)細胞中。Trk和p75NTR在各種類型神經(jīng)元中表達的結(jié)果是，神經(jīng)營養(yǎng)蛋白影響神經(jīng)元的相互重疊的亞組和神經(jīng)元的獨特亞組(Thorne RG and Frey II WH，Clin Pharmacokinet，40907-946，2001)?；撞壳澳X膽堿能神經(jīng)元對所有4種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白均應答。應答NGF的其它神經(jīng)元包括紋狀體膽堿能神經(jīng)元、交感神經(jīng)感覺神經(jīng)元和神經(jīng)嵴衍生的細纖維感覺神經(jīng)元。應答B(yǎng)DNF的其它神經(jīng)元包括中腦多巴胺能神經(jīng)元、脊髓運動神經(jīng)元、紋狀體-GABA能和神經(jīng)嵴衍生的中纖維感覺神經(jīng)元和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。應答NT3的其它神經(jīng)元包括藍斑神經(jīng)元、中腦多巴胺能神經(jīng)元、紋狀體-GABA能神經(jīng)元、交感神經(jīng)感覺神經(jīng)元、和神經(jīng)嵴衍生的大纖維感覺神經(jīng)元。應答NT4/5的神經(jīng)元還包括藍斑神經(jīng)元、中腦多巴胺能神經(jīng)元、紋狀體-GABA能神經(jīng)元、交感神經(jīng)和神經(jīng)嵴衍生的感覺神經(jīng)元、運動神經(jīng)元和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞。除了神經(jīng)系統(tǒng)之外，在B淋巴細胞、T淋巴細胞、肥大細胞、單核細胞和巨噬細胞中也檢測到NGF和TrkA表達，提示NGF在免疫和炎癥功能中的作用。另外，人腫瘤組織增量調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體并且應答NGF(Saragovi HUand Gehring K，TiPS，2193-98，2000)。
由于受體介導的配體-受體復合物的胞吞及逆向運輸對于在前述細胞中神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號傳導是必須的(NeetKE and Campenot RB，CMLS Cell.Mol.Life Sci.，581021-1035，2001)，因此這些多肽是可用于將基因載體定向于Trk或p75NTR陽性細胞的定向配體的候選物。例如，天然神經(jīng)營養(yǎng)蛋白多肽可以與具有結(jié)合并濃縮DNA能力的陽離子脂質(zhì)或聚合物化學綴合。然而這個方法要求相對大量的純化的多肽并也許涉及可能顯著降低所述多肽生物活性的苛刻化學反應。重組DNA技術(shù)是一種常用的產(chǎn)生具有生物活性的全長神經(jīng)營養(yǎng)蛋白多肽的方法，如美國專利5606031和美國專利6005081所述。在細菌表達系統(tǒng)中使用這些技術(shù)，由于其半胱氨酸殘基錯配對形成的與其真形式不同的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的錯折疊變體是一個主要問題。各種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白多肽具有含胱氨酸結(jié)節(jié)基序(cystine knot motif)的相似的結(jié)構(gòu)，在高度保守的部位具有6個半胱氨酸殘基。正確配對的分子內(nèi)二硫鍵的形成是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的完全生物活性所必須的。使用大腸桿菌(E.coli)表達BDNF的研究報道了具有在6個半胱氨酸殘基之間不正確配對的二硫鍵的10個蛋白質(zhì)變體，所有這些變體與天然BDNF相比生物活性均較低，并且當一起使用時可顯著抑制真BDNF的生物學活性(Shimizu N et al.，Biosci.Biotech.Biochem.，60971-974，1996)。阻礙有效應用大蛋白質(zhì)作為定向配體的其它潛在問題包括蛋白酶解傾向、免疫原性及藥物動力學不良。
盡管所有神經(jīng)營養(yǎng)蛋白均具有由一對雙鏈扭型β折疊組成的幾乎相同的核心結(jié)構(gòu)，但在這些蛋白質(zhì)中有7個獨特的區(qū)域，包括N末端、環(huán)形區(qū)域I、II、III、β鏈區(qū)域IV、環(huán)形區(qū)域V和C末端，這些區(qū)域具有高于平均水平的序列多樣性(Ibanez CF，TIBTECH，13217-227，1995)。各種方法，從定點誘變、缺失、嵌合分子構(gòu)建到晶體結(jié)構(gòu)分析的各種方法，均已經(jīng)用于研究神經(jīng)營養(yǎng)蛋白作用的結(jié)構(gòu)決定因素。這些研究證實在NGF的中，對于結(jié)合Trk受體重要的氨基酸殘基位于N末端區(qū)域(#1-8)、環(huán)形區(qū)域II(#40-49)和環(huán)形區(qū)域V(#96-97)(Ibanez CF，TIBTECH，13217-227，1995)。對與TrkA的免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域5復合的NGF的晶體結(jié)構(gòu)進行的研究(Wiesmann Cet al.，Nature，401184-188，1999)注意到兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域(patch)，一個結(jié)構(gòu)區(qū)域包括同型二聚體NGF分子的核心β折疊，另一個結(jié)構(gòu)區(qū)域包含NGF的與TrkA特異性相互作用的N末端殘基。已經(jīng)有報道NGF的小肽模擬物激活TrkA相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導并促進NGF樣神經(jīng)營養(yǎng)作用(美國專利No 5,958,875；美國專利No 6,017,878；Beglove N et al.，JMed Chem.，433530-3540，2000；Maliartchouk S et al.，J.Bio.Chem.，2759946-9956，2000；Xie Y et al.，J Bio.Chem，27529868-29874，2000)。這些肽模擬物需要是環(huán)形的，不僅序列類似而且結(jié)構(gòu)也要類似于NGF環(huán)，以具有生物學活性。
發(fā)明概述一方面，本發(fā)明提供了一種重組多肽，其包含一種細胞定向元件和一種核酸結(jié)合元件，其中所述細胞定向元件是選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序。在各種實施方案中，所述多肽均包含神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序。
另一方面，本發(fā)明提供了一種編碼本發(fā)明重組多肽的重組核酸分子。本發(fā)明還提供了包含核酸和本發(fā)明的重組多肽的組合物。
本發(fā)明的多肽可用于定向送遞核酸，包括將DNA送遞至表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的細胞并因此可有利地用于治療神經(jīng)元病變。本發(fā)明因此在不同的方面還提供了一種將核酸送遞至表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的細胞的方法，所述方法包括給予本發(fā)明的組合物，還提供了一種治療對象中神經(jīng)元病變的方法，所述方法包括給予所述對象本發(fā)明的組合物。本發(fā)明在其它方面提供了所述多肽在將核酸送遞至表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的細胞中的應用，提供了所述多肽在治療對象的神經(jīng)元病變中的應用，以及提供了所述多肽在制備治療對象的神經(jīng)元病變的藥物中的應用。
本發(fā)明另一方面提供了一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑，其包含選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序。在各種實施方案中，所述發(fā)夾基序是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序，所述激動劑可進一步有利地包含帶正電的結(jié)構(gòu)域，其可以增強所述激動劑的活性。本發(fā)明的激動劑可用于治療對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療有反應的疾病。因此本發(fā)明在其它方面提供了一種包含本發(fā)明的激動劑和藥物可接受的載體或稀釋劑的組合物，及提供了治療對象中對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療有反應的疾病的方法，所述方法包括給予所述對象有效量的所述激動劑或者包含有效量的所述激動劑的組合物。在其它方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明的激動劑在治療對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療有反應的疾病中的應用或者在制備用于治療所述疾病的藥物中的應用。
附圖簡述

圖1NL4-10K而非NL4與質(zhì)粒DNA結(jié)合，并且在瓊脂糖凝膠電泳中阻滯其遷移。
圖2NL4-10K介導體外靶特異性基因送遞。
(A)NL4-10K被用于將pCAGluc質(zhì)粒DNA送遞至PC12細胞。短肽NL4、10K、及NL4和10K肽的混合物(NL4&10K)用作對照。在24孔平板中將細胞在存在100μM氯喹的情況下用含有1μgpCAGluc/孔的復合物轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后24小時分析螢光素酶表達。結(jié)果以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)±SE表示。**與對照相比P＜0.01。
(B)NGF對NL4-10K介導的基因送遞進PC12中的競爭性抑制。將PC12細胞在存在100μM氯喹的情況下用以肽/DNA(nmol/μg)為1.5(N/P比率為5)制備的NL4-10K/pCAGluc復合物轉(zhuǎn)染，與或不與游離NGF、NL4、10K或NL4-10K共同溫育。與無添加劑的轉(zhuǎn)染相對比*P＜0.05和**P＜0.01。
(C)NL4-10K介導基因送遞進原代神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中。在24孔平板中將來自大鼠皮質(zhì)的原代神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞在存在100μM氯喹的情況下用含有1μg pCAGluc/孔的復合物轉(zhuǎn)染。4小時后，加入等體積的正常培養(yǎng)基并溫育24小時，之后進行螢光素酶表達分析。**與10K對照物相比P＜0.01。
圖3NL4-10K介導體內(nèi)背根神經(jīng)節(jié)(DRG)內(nèi)基因表達。如實施例所述形成含有NL4-10K的三鏈體。對于所有三鏈體而言，肽/DNA(nmol/μg)比率均為1.5(N/P比率為5)。三鏈體經(jīng)鞘內(nèi)給予麻醉的大鼠。在注射后3天收集DRG。結(jié)果以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)±SE表示。
圖4DsbC-NL4-10K介導的基因表達。
(A)和(B)DsbC-NL4-10K/DNA/魚精蛋白三鏈體被用于分別轉(zhuǎn)染PC12(A)和COS7(B)細胞。為形成三鏈體，將DsbC-NL4-10K蛋白和pCAGluc質(zhì)粒(0.1μg/孔于96孔平板中)以各種比率在室溫于20μlOpti-MEM中溫育30分鐘。加入魚精蛋白(2μg/μgDNA)后，將所述復合物另外溫育30分鐘。結(jié)果以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)±SE表示。
(C)NL4-10K預處理對DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600介導的將基因送遞至PC12細胞的抑制。將PC12細胞用DsbC-NL4-10K或牛血清白蛋白預處理之后進行轉(zhuǎn)染。為形成DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600三鏈體，將DsbC-NL4-10K以蛋白質(zhì)/DNA(nmol/μg)為0.3(N/P比率為1)的比率加入DNA中，之后將PEI600以N/P比率為20加入所述復合物中。將細胞在96孔平板中暴露于0.1μg DNA/孔。結(jié)果以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)±SE表示。
圖5SPKR4NL1-2結(jié)合并濃縮質(zhì)粒DNA。
(A)質(zhì)粒DNA在1％瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率由于SPKR4NL1-2結(jié)合而降低。將各種量的肽與0.1μg DNA混和30分鐘，體積為20μl，之后進行電泳。
(B)插入DNA中的溴化乙錠的熒光由于加入置換溴化乙錠的SPKR4NL1-2而降低。將指定量的肽加入與溴化乙錠預先混和的0.8μgDNA中。
(C)&(D)分別為超螺旋質(zhì)粒DNA和SPKR4NL1-2/DNA/PEI600復合物的原子力顯微鏡圖像。肽∶DNA和PEI600∶DNA的N/P比率分別為2∶1和10∶1。這兩個圖像均是在4μm2的視野收集，定標線條代表0.5μm。
圖6SPKR4NL1-2增強PC12細胞的聚陽離子介導的基因轉(zhuǎn)染。為了形成用于48孔平板每個孔中的復合物，將0.5μg pCAGluc質(zhì)粒首先與各種量的肽混和并溫育30分鐘，之后加入聚陽離子并將所述混合物再溫育30分鐘。螢光素酶活性以相對光單位(RLU)/mg總蛋白質(zhì)表示。(A)PEI600，N/P比率為10。(B)聚L-賴氨酸(PLL)，N/P比率為10。
圖7SPKR4NL1-2介導的基因表達的特異性。NGF抑制SPKR4NL1-2介導的基因表達。將PC12細胞在48孔平板中處理。為形成用于每個孔的復合物，將0.5μg pCAGluc質(zhì)粒首先與SPKR4NL1-2或(SPKR)4以N/P比率為2.5進行混和并溫育30分鐘，之后加入PEI600(N/P比率為10)并將所述混合物再溫育30分鐘。在轉(zhuǎn)染期間將NGF(200ng/ml)加入一些孔中。24小時后測定螢光素酶活性并以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)表示。*與用同樣的SPKR4NL1-2/DNA/PEI600復合物但無NGF處理的細胞相對比P＜0.05。
圖8SPKR4NL1-2介導的基因表達的特異性。SPKR4NL1-2介導基因送遞至神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。在48孔平板中，將原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞用SPKR4NL1-2/DNA/PEI600、(SPKR)4/DNA/PEI600或DNA/PEI600復合物轉(zhuǎn)染。所述復合物是用0.25μgDNA與肽(如果存在的話)和PEI600以N/P比率分別為2.5和5混和而制備的。24小時后測定螢光素酶活性并以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)表示。**與用與(SPKR)4和PEI600復合的DNA處理的神經(jīng)元相比P＜0.01。
圖9SPKR4NL1-2介導體內(nèi)基因送遞至背根神經(jīng)節(jié)(DRG)。將4μg pCAGluc與SPKR4NL1-2以N/P比率為2.5、及與PEI600以N/P比率為10形成的復合物經(jīng)鞘內(nèi)注射進大鼠腰部脊髓中。在注射后3天收集DRG和腰部脊髓。結(jié)果以相對光單位(RLU)/mg蛋白質(zhì)表示。**與用與(SPKR)4/PEI600復合的DNA處理的大鼠相比P＜0.01。
圖10SPKR4BL1-2結(jié)合并濃縮DNA。
(A)SPKR4BL1-2與質(zhì)粒DNA結(jié)合并在電泳期間降低其遷移率。所述DNA在N/P比率為2(0.075nmol肽與0.1μgDNA)時被完全阻滯。
(B)-(D)DNA和SPKR4BL1-2的原子力顯微鏡圖像。每一圖像覆蓋2μm×2μm的視野。(B)pCAGluc質(zhì)粒DNA。(C)SPKR4BL1-2肽。(D)SPKR4BL1-2和質(zhì)粒DNA自組裝成濃縮的顆粒。
圖11SPKR4BL1-2介導基因在大鼠神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物中表達。
(A)在48孔平板中，將皮質(zhì)神經(jīng)元用pCAGluc(0.25μg/孔)、PEI600和SPKR4BL1-2的三重復合物轉(zhuǎn)染。24小時后測定螢光素酶活性并以用總蛋白質(zhì)含量標準化的相對光單位(RLU)表示，誤差條表示SD。
(B)在48孔平板中，將原代星形膠質(zhì)細胞用pCAGluc/SPKR4BL1-2或pCAGluc/PEI600復合物轉(zhuǎn)染。每個孔使用0.25μg pCAGluc。24小時后轉(zhuǎn)基因表達以RLU/mg蛋白質(zhì)±SD表示。
圖12NL4-10K激活TrkA、Erk和Akt。
(A)TrkA及其相關(guān)信號傳導途徑的激活。將PC12細胞在含有0.5％FBS和0.25％馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中溫育，并用10ng/mlNGF、5μM NL4、5μM NL4-10K、NL4-10K/DNA復合物(N/P比率為5)或者無添加劑的無血清RPMI-1640處理15分鐘。收集細胞裂解物，使用針對Phospho-TrkA、Phospho-p44/p42MAPK或Phospho-Akt的抗體進行Western印跡。
(B)TrkA抑制劑阻斷NL4-10K誘導的Erk激活。將PC12細胞與或不與100nM K-252a或10μM AG879預溫育10分鐘，然后如(A)所述處理。收集細胞裂解物，使用針對Phospho-p44/p42 MAPK的抗體進行Western印跡分析。
圖13NL4-10K在無血清培養(yǎng)基中促進神經(jīng)元分化的PC12細胞存活。將血清和NGF從分化的PC12細胞被剝奪血清和NGF中4天。在撤除血清和NGF時加入NL4和NL4-10K，并且以10ng/ml NGF作為陽性對照。細胞存活率使用MTT分析評估。多肽介導的細胞存活率以NGF促進的最大存活率百分比表示。
圖14SPKR4NL1-2激活TrkA和Erk。將在含有0.5％FBS和0.25％馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中預溫育2天的PC12細胞用在無血清RPMI-1640中稀釋的NGF或肽處理20分鐘。細胞裂解物通過免疫印跡分析，所述分析使用特異于Phospho-TrkA或磷酸化Erk 1和2的初級抗體進行。
(A)Phospho-TrkA Western印跡。將細胞用NGF(20ng/ml)、SPKR4NL1-2(8μM)、SPKR4NL1-2/DNA復合物(8μM，N/P比率為5)、或者(SPKR)4(8μM)處理。
(B)Phospho-Erk Western印跡。將細胞用NGF(20ng/ml)、從1至8μM各種濃度的SPKR4NL1-2、或者8μM(SPKR)4處理。
(C)TrkA抑制劑阻斷SPKR4NL1-2誘導的Erk激活。將PC12細胞與0、10、20、50和100nM K-252a(TrkA酪氨酸激酶抑制劑)預溫育10分鐘，之后用NGF(20ng/ml)或SPKR4NL1-2(8μM)處理。蛋白質(zhì)標準分子量在左側(cè)示出。
圖15SPKR4NL1-2具有NGF樣生物活性。
(A)&(B)SPKR4NL1-2促進神經(jīng)突生長(outgrowth)。將PC12細胞用8μM(SPKR)4(A)或者SPKR4NL1-2(B)處理3天。
(C)SPKR4NL1-2促進剝奪血清3天的PC12細胞存活。在撤除血清時加入0-16μM不同濃度的SPKR4NL1-2，10ng/ml NGF用作陽性對照。細胞存活率通過MTT分析評估并以NGF促進的最大細胞存活率的百分比表示。
優(yōu)選的實施方案詳述本文所用術(shù)語“多肽”與“蛋白質(zhì)”在指氨基酸的任何聚合物或鏈時是同義的。多肽可以是線性或環(huán)形的。術(shù)語“多肽”和“肽”僅基于聚合物中殘基的數(shù)目而區(qū)別。一般而言，術(shù)語“肽”是指含有大約30個或更少殘基、優(yōu)選20個或更少、最優(yōu)選大約10個或更少殘基的氨基酸聚合物。如本文所用，術(shù)語“氨基酸”是指遺傳編碼的L-氨基酸的標準系列(丙氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、色氨酸和酪氨酸)，及其衍生物。對于通過半合成或化學方法產(chǎn)生的多肽或肽而言，術(shù)語“氨基酸”還指所有非天然的氨基酸，以及遺傳編碼的氨基酸的D-異構(gòu)體。
本發(fā)明部分得自申請人令人驚奇地發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的分離的發(fā)夾基序片段可以選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體并保留全長神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的功能。這些片段當與核酸結(jié)合元件組合時提供一種將核酸選擇性送遞至表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的細胞的方式。因此本發(fā)明一方面提供了一種包含核酸結(jié)合元件和細胞定向元件的重組多肽，所述細胞定向元件是選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序。本發(fā)明另一方面提供了一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑，其包含選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序。
術(shù)語發(fā)夾基序描述了通過一個環(huán)形區(qū)域連接的兩個相鄰的通過氫鍵鍵合的β鏈，該術(shù)語在此還描述了串聯(lián)的兩或多個這種結(jié)構(gòu)。β鏈的長度可以變化但優(yōu)選是足以形成穩(wěn)定的β折疊的長度，意味著β鏈在例如生理溶液中保持氫鍵。因此，該術(shù)語例如描述了形成本文所述發(fā)夾基序的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的片段，但不包括全長的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。術(shù)語“發(fā)夾基序”也包括下述所有功能等價物。術(shù)語“選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體”或其它相似術(shù)語是描述與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合，而與其它類型受體基本上不結(jié)合。細胞定向元件如果不影響受體的生理功能則其基本上不結(jié)合該受體。
根據(jù)其在本領(lǐng)域中的通常定義，術(shù)語神經(jīng)營養(yǎng)蛋白在本領(lǐng)域中用于描述一個結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的代表性實例包括但非限于神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白-3(NT3)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(NT4/5)。如本文所用，術(shù)語神經(jīng)營養(yǎng)蛋白一般是指人神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，但也包括任何物種包括鼠、牛、羊、豬、馬和禽物種的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白。提及的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體包括p75NTR和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白酪氨酸激酶受體TrkA、TrkB和TrkC，及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的所有其它關(guān)連受體。
在不同的實施方案中，細胞定向元件是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序或其功能等價物。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序是由一個環(huán)形序列和該環(huán)形序列的緊鄰上游和緊鄰下游的β鏈序列形成。術(shù)語“功能等價物”用于描述與親代氨基酸結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的氨基酸序列，其與親代氨基酸由于一或多個缺失、取代、修飾或添加而有所不同，但不影響選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體。例如，在β鏈的每一端均可加入氨基酸而不影響所述發(fā)夾基序的形成及與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的選擇性結(jié)合。在一個實施方案中，功能等價物是基本同源的，這是指所述等價物的氨基酸序列與親代氨基酸序列之間基本相應。在特定的實施方案中，所述功能等價物是至少大約50％、75％、90％和95％同源的。
同源性是使用序列分析軟件如the Genetics Computer Group，University of Wisconsin Biotechnology Center，1710 University Avenue，Madison，WI 53705的Sequence Analysis Software Package測定的。將氨基酸序列排列對比以取得最大相同性?？梢詫⑷笨谌斯胄蛄兄幸垣@得適當?shù)呐帕袑Ρ取Ｒ坏┙⒆罴训呐帕袑Ρ?，則同源程度通過記錄兩個序列的氨基酸相同的所有位置相對于位置總數(shù)而確定。
在一個實施方案中，所述功能等價物由于一或多個保守氨基酸取代而與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序序列不同。保守氨基酸取代是同類氨基酸之間的取代。這些類別包括例如具有無電荷極性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸如天冬氨酸和谷氨酸；及具有非極性側(cè)鏈的氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
通常地，所述功能等價物包括在非保守序列中的一或多個缺失、取代、修飾或添加，通常對于結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體重要的氨基酸不被改變。各種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的氨基酸序列及其二級結(jié)構(gòu)元件已經(jīng)加以研究，對于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合重要的氨基酸已經(jīng)被鑒別，例如Wiesmann et al.(Nature，1999，401184-188)對于NGF進行的描述?？梢苑治霾煌锓N的序列之間的同源性以確定保守的序列，使用例如Altschul et al.，Nucleic Acids Res.；253389-3402(1997)的BLAST同源檢索算法進行。
在特定的實施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO1的第26-38位、第41-49位、第17-57位、第69-79位或第81-107位氨基酸；SEQ ID NO2的第33-45位、第48-56位、第22-64位、第76-86位或第88-115位氨基酸；SEQ ID NO3的第25-37位、第40-48位、第16-56位、第68-78位或第80-107位氨基酸；SEQID NO4的第28-40位、第43-52位、第19-60位或第79-89位或第91-118位氨基酸，或者其功能等價物。
在一個實施方案中，所述多肽包含人NGF的第17-67位氨基酸SVSVWVGDKTTATDIKGKEVMVLGEVNINNSVFKQYFFETKCRDPNPVDSG(SEQ ID NO1的第17-67位氨基酸)。
在這個實施方案中，所述細胞定向元件由NGF的第17-57位氨基酸形成的發(fā)夾基序及額外的10個氨基酸組成，所述額外的氨基酸不影響發(fā)夾基序的形成或者與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的選擇性結(jié)合。所述額外的10個氨基酸被包括進來是為了促進重組多肽的表達。
在一個實施方案中，所述多肽包含人NGF的第80-108位氨基酸CTTTHTFVKALTMDGKQAAWRFIRIDTAC(SEQ ID NO1的第80-108位氨基酸)。
在這個實施方案中，細胞定向元件由NGF的第81-107位氨基酸形成的發(fā)夾基序及在每個末端的一個半胱氨酸組成。
在一個實施方案中，所述多肽包含人BDNF的第22-74位氨基酸并具有如下序列SISEWVTAADKKTAVDMSGGTCTVLEKVOVSKGQLKQYFYETKCNPMGYTKEG(SEQ ID NO2的第22-74位氨基酸)。
在這個實施方案中，所述細胞定向元件由BDNF的第22-64位氨基酸形成的發(fā)夾基序和增強所述多肽穩(wěn)定表達的額外10個氨基酸組成。
其它合適的細胞定向元件可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法鑒別，例如通過測試與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的選擇性結(jié)合而鑒別。神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合可以例如使用表達關(guān)連受體的細胞通過置換/競爭結(jié)合分析而測定(見Ilag et al J.Biol.Chem.26919941-19946及其參考文獻；Ruden et al J.Biol.Chem 2175623-5627)。如本文所用，術(shù)語“關(guān)連受體”是指能選擇性結(jié)合特異的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的細胞表面受體。例如，TrkA是NGF的關(guān)連受體，TrkB是BDNF的關(guān)連受體。p75NTR受體是NGF、BDNF、NT-3和NT4/5的低親和性關(guān)連受體。在置換/競爭分析中，細胞定向元件結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的能力通過標記的全長神經(jīng)營養(yǎng)蛋白與其關(guān)連受體的結(jié)合降低而表明。進行競爭/置換分析的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知。例如，大鼠嗜鉻細胞瘤細胞系PC12表達TrkA和p75NTR受體，并可以與標記的NGF和包含推定的受體結(jié)合元件的多肽用于競爭分析中。
或者，在細胞定向元件是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑的情況中，可以圍繞Trk受體的內(nèi)源酪氨酸激酶活性而設(shè)計結(jié)合分析。當表達Trk受體的細胞與細胞定向元件在存在32P磷酸鹽來源的情況下溫育時，配體結(jié)合可以通過放射標記的Phospho-Trk受體的量而測定?；蛘撸錾窠?jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑結(jié)合可以通過Trk信號傳導途徑中任一種下游激酶底物例如Erk1、Erk2或Akt確定。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知怎樣檢測放射標記的磷蛋白，例如通過免疫印跡技術(shù)檢測。
或者，可以篩選表現(xiàn)為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑的推定的細胞定向元件的促進神經(jīng)細胞存活的能力。例如暴露于無血清培養(yǎng)基的接種的PC12細胞的存活率降低，但是可通過在培養(yǎng)基中加入NGF而增加存活率?？梢院Y選推定的激動劑性細胞定向元件促進無血清培養(yǎng)基中細胞存活的能力。
神經(jīng)營養(yǎng)蛋白具有被氧化形成半胱氨酸結(jié)基序的6個半胱氨酸殘基。其它生長因子包括血小板衍生生長因子(PDGF)(Oefner et alEMBO J 113921-26，1994)、轉(zhuǎn)化生長因子-B(TGF-B)(Schlunegger etal Nature 358430-434，1992)、及絨毛膜促性腺激素(Lapthorn et alNature 369455-61，1994)也具有半胱氨酸結(jié)基序。人NGF具有三個二硫鍵，位于半胱氨酸15-80、58-108和68-110之間。BDNF在大腸桿菌中的異源表達產(chǎn)生具有不適當?shù)亩蜴I配對的10種形式，導致生物活性降低(Shimizu et al，Biosci.Bitech.Bichem.60；971-974，1996)。由于本發(fā)明的重組多肽僅包括神經(jīng)營養(yǎng)蛋白序列的一部分，因此不參與受體結(jié)合的殘基，包括任何半胱氨酸殘基可以被缺失，從而避免了與全長神經(jīng)營養(yǎng)蛋白中二硫鍵雜亂(disulfidescrambling)相關(guān)的問題。另外，較小的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白結(jié)合元件的免疫原性可以低于全長神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的免疫原性。
如果發(fā)夾基序含有半胱氨酸殘基，則該序列可以通過常規(guī)技術(shù)被修飾以缺失或取代半胱氨酸，由此在所述發(fā)夾基序中僅存在兩個半胱氨酸殘基。發(fā)夾基序中的一或多個半胱氨酸殘基也可以被除去，或者加入半胱氨酸殘基由此半胱氨酸殘基存在于發(fā)夾基序的氨基和羧基末端以形成分子內(nèi)二硫鍵。在各種實施方案中，兩個半胱氨酸殘基的巰基可以被氧化形成分子內(nèi)二硫鍵。二硫鍵的形成可以通過蛋白質(zhì)化學領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方式實現(xiàn)，例如通過空氣氧化進行。不受限于任何特定理論，據(jù)信分子內(nèi)二硫鍵的形成將穩(wěn)定發(fā)夾基序，并且可以增加所述基序與關(guān)連受體的親和性。錯配的二硫鍵或二硫鍵雜亂的問題可以通過在序列中僅包括兩個半胱氨酸殘基而避免。在一個實施方案中，所述二硫鍵是在β發(fā)夾基序的開放端。
核酸結(jié)合元件可以是以序列特異性或序列非依賴性方式結(jié)合核酸的任何氨基酸序列。在一個實施方案中，所述核酸結(jié)合元件是DNA結(jié)合元件。DNA結(jié)合元件為本領(lǐng)域所已知，包括例如轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。一般而言，轉(zhuǎn)錄因子通常以序列特異性方式結(jié)合DNA?！靶蛄刑禺愋浴笔侵甘荏w選擇性識別特異DNA序列，或者少數(shù)高度相關(guān)的序列。在一些實施方案中，所述DNA結(jié)合元件可以衍生自其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域含有如下任一結(jié)構(gòu)基序的轉(zhuǎn)錄因子螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋蛋白質(zhì)(λCro、λcI、大腸桿菌CAP蛋白質(zhì)、Lac阻抑物、Trp阻抑物(Steisz et al PNAS 793097-3100，1982；Ohlendorf et al J.Mol Bio169757-769，1983；Kaptein et al J.Mol Biol.182179-182，1985；Sheritzet al Nature 317782-786))、同源域(Antennapaedia和MATα2(Qian etall，Cell 59573-580；Wolberger et al Cell 59573-580))、鋅指蛋白(TFIIA、Sp-1、Zif268，見Krizek et al JACS 1134518-4523，1991)、類固醇受體、亮氨酸拉鏈蛋白(C/EBP、c-fos、c-jun、GCN4、CREB(見O′Shea et al Science 24539-544))、螺旋-環(huán)-螺旋蛋白(MyoD和c-myc(Weinrib et al Science 251761-766，1991))及β-折疊(Met J、Arc和Mnt阻抑物(Phillips，Current Opinion in Struc Biol 189-98，1991；Berg et alNature 346586-589，1990))。或者，其它DNA結(jié)合元件包括GAL4阻抑物的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及HIV的RRE(rev應答元件)。
許多轉(zhuǎn)錄因子已被克隆，其序列在公共數(shù)據(jù)庫上可獲得?；蛘撸蛄刑禺愋訢NA結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以衍生自非轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)，例如限制性內(nèi)切酶等等。在各種實施方案中，本發(fā)明涵蓋了全長DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及保留結(jié)合DNA能力的任何DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段的應用。
在各種其它實施方案中，DNA結(jié)合元件以序列非依賴性方式結(jié)合DNA?！靶蛄蟹且蕾囆浴笔侵傅鞍踪|(zhì)對特定的DNA序列幾乎沒有任何特異性地結(jié)合DNA。合適的序列非依賴性結(jié)合元件可以衍生自高度堿性蛋白質(zhì)如組蛋白或魚精蛋白的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列。在一個特定的實施方案中，DNA結(jié)合元件是首次由Fortunati et al(Gene Therapy 2000；71505-15)使用的組蛋白H1的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，具有如下序列SPKRSPKRSPKRSPKR(SEQID NO11)。
在一個實施方案中，所述DNA結(jié)合元件可以是帶正電的結(jié)構(gòu)域，例如陽離子多肽如聚賴氨酸、聚精氨酸、或者具有堿性側(cè)鏈的氨基酸的任何其它聚合物。據(jù)信陽離子聚合物以序列非依賴性方式通過陽離子聚合物與陰離子核酸磷酸酯主鏈之間的靜電相互作用而結(jié)合DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解陽離子聚合物與DNA之間相互作用的強度將反映所述聚合物中陽離子單體的數(shù)目，更特別地反映所述陽離子聚合物的總體凈電荷，以及反映其它事情。在本發(fā)明的一個特定的實施方案中，DNA-結(jié)合元件是十賴氨酸(即KKKKKKKKKK，SEQ IDNO10)。如下文所論述，這種帶正電的結(jié)構(gòu)域也結(jié)合細胞表面，從而增強發(fā)夾基序與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的結(jié)合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于鑒別其它合適的DNA結(jié)合元件。例如，序列特異性DNA結(jié)合可以應用含有一或多個DNA識別序列的核酸通過常規(guī)凝膠阻滯分析而測定?；蛘?，在DNA結(jié)合元件是陽離子性的并且以序列非依賴性方式結(jié)合的情況中，DNA結(jié)合可以通過在有或無推定的DNA結(jié)合元件的情況下測定靶DNA的電泳遷移率而檢測。陽離子聚合物對DNA的結(jié)合減少DNA結(jié)合元件復合物上的凈電荷，并且相對于未結(jié)合的DNA阻滯復合物的電泳遷移。所述復合物的電泳遷移率可以通過常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳確定，通過溴化乙錠染色使DNA顯色。
在一個實施方案中，所述DNA結(jié)合元件和所述細胞定向元件可以是相鄰的，例如核酸結(jié)合元件的羧基末端殘基可以與細胞定向元件的氨基末端殘基共價連接。
在不同的實施方案中，多肽可進一步在DNA結(jié)合元件與細胞定向元件之間包含一個接頭序列，從而通過提供足夠的構(gòu)象柔性而增強DNA結(jié)合和/或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合，使得被連接的元件基本上彼此獨立地發(fā)揮功能。
在一個實施方案中，所述接頭序列是遺傳編碼的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述接頭序列不包括半胱氨酸。
合適的接頭/間隔元件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所已知，包括少于大約20個氨基酸的多肽序列，其含有高百分比小的不帶電荷的氨基酸(即甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)。在這些氨基酸中，特別優(yōu)選具有高百分比絲氨酸和甘氨酸殘基的接頭。
或者，合適的接頭/間隔元件可含有已知形成特定二級結(jié)構(gòu)的序列。在一些實施方案中，所述接頭序列形成α螺旋結(jié)構(gòu)。α螺旋接頭序列可防止連續(xù)的功能元件相互作用和/或聚集。在一個特定的實施方案中，所述接頭序列是H1α螺旋，并且具有如下氨基酸序列TYLSEDELKAAEAAFKRHNPT(SEQ ID NO30)。
在另一個實施方案中，多肽進一步包含二硫鍵異構(gòu)酶。非限于任何特定理論，據(jù)信二硫鍵異構(gòu)酶活性將增強所述多肽的溶解度、穩(wěn)定性和折疊。例如，二硫鍵異構(gòu)酶可通過還原所有分子間二硫鍵而防止多肽聚集。二硫鍵異構(gòu)酶也可以促進二硫鍵交換從而有利于最穩(wěn)定的二硫鍵。在各種實施方案中，所述多肽可包含催化蛋白質(zhì)折疊、穩(wěn)定性和溶解度的其它元件，包括但非限于脯氨酸肽異構(gòu)酶。
在另一個實施方案中，多肽包含一個標記或標簽如促進所述多肽制備、分離或純化的組氨酸標簽。組氨酸標簽是已被示出對二價金屬離子如銅、更優(yōu)選鎳或鈷具有親和性的聚組氨酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知這些組氨酸標簽可以用于進行固定化金屬親和層析(IMAC)蛋白質(zhì)純化步驟。通常地，將加上組氨酸標簽的蛋白質(zhì)在溶液中與固定的金屬離子一起溫育。加上組氨酸標簽的蛋白質(zhì)與所述固定的金屬結(jié)合，而不含有組氨酸標簽的蛋白質(zhì)被洗掉。在洗滌步驟后，加上組氨酸標簽的蛋白質(zhì)通過加入金屬螯合劑如EDTA或者通過高濃度咪唑而從固定的金屬支持物中洗脫。組氨酸標簽的長度優(yōu)選為6個殘基(His6)，更優(yōu)選8或10個殘基(His8或His10)。在一個特定的實施方案中，多肽包含10個殘基的組氨酸標簽(His10)。組氨酸標簽也可以促進基因送遞，因為組氨酸中的咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)具有大約為6的pKa，因此在內(nèi)溶酶體pH范圍具有緩沖能力。這種性質(zhì)可促進DNA通過“質(zhì)子海綿(proton sponge)”機制而從小泡中逃脫。
多肽可包含被可操縱地定位的一或多個細胞定向元件，從而每個細胞定向元件均可結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體。相似地，多肽可含有多個DNA結(jié)合元件。例如，包含一個以上細胞定向元件的多肽可以是特別優(yōu)選的，其中全長配體通常結(jié)合受體二聚體，從而其可以更強地結(jié)合和/或更特異于這種受體(例如Trk家族同源二聚體或p75NTR-Trk異源二聚體)。期望這種增強的結(jié)合可通過受體介導的胞吞而增加融合蛋白的內(nèi)在化效率。
在一個實施方案中，多肽包含如下序列CTTTHTFVKA LTMDGKQAAW RFIRIDTACK KKKKKKKKK(SEQ ID NO5)。
這個29個氨基酸的序列是通過將人NGF的第80-108位氨基酸與可結(jié)合DNA并將DNA濃縮為緊湊結(jié)構(gòu)的10-賴氨酸序列組合而產(chǎn)生。發(fā)夾基序由NGF的L4環(huán)的4個氨基酸殘基和NGF的Cβ鏈和Dβ鏈的部分組成，從而通過兩個β鏈之間形成氫鍵而穩(wěn)定所述環(huán)的天然構(gòu)象。這個三維結(jié)構(gòu)通過氧化后在C80和C108之間形成二硫鍵而進一步穩(wěn)定。
在另一個實施方案中，將DsbC蛋白(一種大腸桿菌二硫鍵異構(gòu)酶)加入發(fā)夾基序的氨基末端，這個實施方案中的多肽包含如下序列MKKGFMLFTL LAAFSGFAQA DDAAIQQTLA KMGIKSSDIQPAPVAGMKTV LTNSGVLYIT DDGKHIIQGP MYDVSGTAPVNVTNKMLLKQ LNALEKEMIV YKAPQEKHVI VFTDITCGYCHKLHEQMAD YNALGITVRY LAFPRQGLDS DAEKEMKAIWCAKDKNKAFD DVMAGKSVAP ASCDVDIADH YALGVQLGVSGTPAVVLSNG TLVPGYQPPK EMKEFLDEHQ KMTSGKGSTSGSGHHHHHHS AGLVPRGSCT TTHTFVKALT MDGKQAAWRFIRIDTACKKK KKKKKKK(SEQ ID NO6)
在另一個實施方案中，多肽包含如下序列MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMSPKRSPKR SPKRSPKRGGTYLSEDELKA AEAAFKRHNP TGSCSVSVWV GDKTTATDIKGKEVMVLGEV NINNSVFKQY FFETKCRDPN PVDSG(SEQ ID NO7)在這個實施方案中，發(fā)夾基序是由NGF的L1和L2環(huán)與衍生自人NGF的第17-67位殘基的Aβ鏈和Bβ鏈一起產(chǎn)生的。得自基于結(jié)合小溝而可以濃縮DNA的組蛋白H1的(SPKR)4用作非特異性核酸結(jié)合成分(Khadake JR and Rao MR，Biochemistry 361041-1051，1997)。這兩個元件由側(cè)翼為柔性甘氨酸序列的α螺旋接頭序列隔斷，從而增強細胞定向元件和核酸結(jié)合元件的獨立作用，特別是增強環(huán)結(jié)構(gòu)與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的柔性相互作用。His10標簽用于肽純化并可以在胞吞的多肽/DNA復合物的逃脫中起作用。為穩(wěn)定多肽構(gòu)象，將一個半胱氨酸殘基加入到緊鄰人NGF的第17-67位氨基酸殘基前面，以促進與NGF的第58位半胱氨酸形成二硫鍵。
在另一個實施方案中，多肽包含BDNF的L1和L2環(huán)的發(fā)夾基序(第22-74位氨基酸)、(SPKR)4及一個α螺旋接頭，并包含如下氨基酸序列MGHHHHHHHH HHSSGHIEGR HMSPKRSPKR SPKRSPKRGGTYLSEDELKA AEAAFKRHNP TGSCSISEWV TAADKKTAVDMSGGTVLEKVPVSKGQLK QUFYETKCNP MGYTKEG(SEQ ID NO8)本發(fā)明的多肽可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，所述方法包括常規(guī)的化學手段，例如應用t-Boc或Fmoc氨基酸衍生物的固相合成方法?；蛘?，多肽可以使用重組DNA技術(shù)和適當?shù)谋磉_系統(tǒng)表達。特別優(yōu)選細胞表達系統(tǒng)，其中編碼本發(fā)明多肽的基因被轉(zhuǎn)錄和翻譯。合適的表達系統(tǒng)包括但非限于在培養(yǎng)的大腸桿菌(E.coli)、釀酒酵母(S.cerevisiae)、甲醇酵母(Pichia pastoris)、桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)和真核細胞中表達。在任何這些系統(tǒng)中的表達可以由組成型或可誘導的啟動子驅(qū)動。
表達的多肽可以通過常規(guī)技術(shù)包括層析、免疫沉淀等技術(shù)從其它生物或化學組分中純化和分離。純化的蛋白質(zhì)的純度可以通過電泳或?qū)游黾夹g(shù)評定。純化的多肽的同一性也可以通過質(zhì)譜技術(shù)證實，而且如果需要的話通過MS/MS測序證實。
在各個方面，本發(fā)明提供了一種重組核酸分子，由其可表達本發(fā)明的多肽。本發(fā)明因此提供了一種編碼本發(fā)明多肽的重組核酸分子。所述核酸可以是RNA或DNA。所述DNA可以是單鏈的，優(yōu)選是雙鏈的，最優(yōu)選是環(huán)狀雙鏈的。編碼本發(fā)明多肽的DNA可以使用本領(lǐng)域已知的方法從已知多肽序列中確定。已知神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的DNA序列并且可以在公共數(shù)據(jù)庫如genbank中獲得。根據(jù)對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白序列的了解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可易于設(shè)計寡核苷酸引物，從而編碼神經(jīng)營養(yǎng)蛋白序列的片段的DNA分子可以通過聚合酶鏈反應從神經(jīng)營養(yǎng)蛋白cDNA或mRNA中擴增。相似地，接頭序列、組氨酸標簽和核酸結(jié)合元件的核苷酸序列可以使用合適的遺傳密碼生成。優(yōu)選地，包含具有高度密碼子偏倚性的密碼子的核酸序列用于防止在任何特定表達宿主中錯誤摻入及用于高水平的蛋白質(zhì)表達(見Calderone et al.JMol Biol 1996，262(4)407-412)。在各種實施方案中，所述核酸分子包含SEQ ID NO14、SEQ ID NO26、SEQ ID NO29和SEQ ID NO31所示序列。
本發(fā)明的重組核酸分子可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的標準技術(shù)構(gòu)建，例如Sambrook et al.在Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Edition，Cold Spring Harbour，Laboratory Press及其它實驗室手冊中所述。核酸分子可以使用如Itakura等的美國專利No.4,598,049；Caruthers等的美國專利No.4,458,066；及Itakura等的美國專利No.4,401,796和4,373,071所述技術(shù)化學合成。
核酸分子也可以分離及組合。分離是指被分離的物質(zhì)基本上與其例如在體內(nèi)關(guān)聯(lián)的其它成分如生物成分分離或從中純化，從而分離的物質(zhì)可自身被操縱或處理。術(shù)語分離的因此包括通過標準純化方法純化的物質(zhì)，以及通過在宿主中重組表達純化的物質(zhì)，以及化學合成的物質(zhì)?？衫酶鞣N策略以組合并連接各個核酸分子并且依賴于要連接的核酸的性質(zhì)或末端，本領(lǐng)域技術(shù)人員將易于明白合適的策略。分子生物學領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見DNA片段必須在適當?shù)目騼?nèi)連接，以保證所得基因編碼所希望的氨基酸序列。
本發(fā)明的另一方面提供了包含本發(fā)明的重組核酸分子的表達載體。所述載體可以是質(zhì)?；虿《净虿《狙苌妮d體。本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知通過標準技術(shù)構(gòu)建這種載體。本發(fā)明的載體也可以含有其它序列元件以促進載體在宿主細胞中增殖和選擇，所述其它序列元件例如是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的選擇標記的編碼序列及報道基因。另外，本發(fā)明的載體可包含一或多個限制性核酸內(nèi)切酶識別位點的核苷酸序列。
本發(fā)明的表達載體可以導入宿主細胞中，所述宿主細胞可包括能表達所述表達載體編碼的蛋白質(zhì)的細胞。因此，本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明的表達載體的宿主細胞。術(shù)語“宿主細胞”不僅是指特定的對象細胞，而且還是指這種細胞的子代或潛在子代。因為某些修飾由于細胞分化、突變或環(huán)境影響而可以在以后的世代中發(fā)生，因此這種子代可能事實上與前代細胞不同，但仍包括在本發(fā)明所用術(shù)語的范圍內(nèi)。
載體DNA可以通過常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)導入細胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”是指將外源核酸導入宿主細胞中的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉(zhuǎn)染、脂轉(zhuǎn)染、電穿孔、微注射和病毒介導的轉(zhuǎn)染。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細胞的方法為本領(lǐng)域所熟知，并可例如見Sambrook et al.(Molecular CloningA LaboratoryManual，3rd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory press(2001))及其它實驗室手冊。
其中已經(jīng)導入外源核酸的細胞、組織、器官或生物體被認為是“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)染的”或“轉(zhuǎn)基因的”。轉(zhuǎn)基因的或轉(zhuǎn)化的細胞或生物體也包括所述細胞或生物體的子代及應用轉(zhuǎn)基因生物體作為親代經(jīng)繁殖程序產(chǎn)生的子代，所述子代呈現(xiàn)由于存在重組核酸構(gòu)建體而產(chǎn)生的表型改變。轉(zhuǎn)基因生物體因此是已經(jīng)用異源核酸轉(zhuǎn)化的生物體，或者包括所述轉(zhuǎn)基因的這種生物體的子代。本發(fā)明在各個方面提供了包含本發(fā)明各個實施例的重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因細胞和非人動物。
為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細胞，基于使用的表達載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，已知僅有少部分細胞可以將外源基因整合進其基因組中。為了鑒別并選擇這些整合體，可以將編碼選擇標記(例如抗生素抗性)的基因與感興趣的基因一起導入宿主細胞中。優(yōu)選的選擇標記包括授予藥物如G418、潮霉素和氨甲喋呤抗性的那些標記。編碼選擇標記的核酸可以在編碼肽化合物的同一載體上導入宿主細胞，或者可以在分開的載體上導入。用導入的核酸穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞可以通過藥物選擇鑒別。
在一個實施方案中，DNA表達載體包含如下序列ATGAAGAAAG GTTTTATGTT GTTTACTTTG TTAGCGGCGT TTTCAGGCTT 50TGCTCAGGCT GATGACGCGG CAATTCAACA AACGTTAGCC AAAATGGGCA 100TCAAAAGCAG CGATATTCAG CCCGCGCCTG TAGCTGGCAT GAAGACAGTT 150CTGACTAACA GCGGCGTGTT GTACATCACC GATGATGGTA AACATATCAT 200TCAGGGGCCA ATGTATGACG TTAGTGGCAC GGCTCCGGTC AATGTCACCA 250ATAAGATGCT GTTAAAGCAG TTGAATGCGC TTGAAAAAGA GATGATCGTT 300TATAAAGCGC CGCAGGAAAA ACACGTCATC ACCGTGTTTA CTGATATTAC 350CTGTGGTTAC TGCCACAAAC TGCATGAGCA AATGGCAGAC TACAACGCGC 400TGGGGATCAC CGTGCGTTAT CTTGCTTTCC CGCGCCAGGG GCTGGACAGC 450GATGCAGAGA AAGAAATGAA AGCTATCTGG TGTGCGAAAG ATAAAAACAA 500AGCGTTTGAT GATGTGATGG CAGGTAAAAG CGTCGCACCA GCCAGTTGCG 550
ACGTGGATAT TGCCGACCAT TACGCACTTG GCGTCCAGCT TGGCGTTAGC 600GGTACTCCGG CAGTTGTGCT GAGCAATGGC ACACTTGTTC CGGGTTACCA 650GCCGCCGAAA GAGATGAAAG AATTTCTCGA CGAACACCAA AAAATGACCA 700GCGGTAAAGG ATCAACTAGT GGTTCTGGTC ATCACCATCA CCATCACTCC 750GCGGGTCTGG TGCCACGCGG TAGTTGTACC ACGACTCACA CCTTTGTCAA 800GGCGCTGACC ATGGATGGCA AGCAGGCTGC CTGGCGGTTT ATCCGGATAG 850ATACGGCCTG TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA ATGA(SEQ ID NO14)在另一個實施方案中，DNA表達載體包含如下序列ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATCATCAT CATCACAGCA GCGGCCATAT 50CGAAGGTCGT CATATGAGTC CGAAACGCAG CCCGAAACGT AGCCCAAAGC 100GTAGCCCGAA GCGTGGCGGT ACCTACCTGT CTGAAGATGA GCTGAAAGCG 150GCGGAGGCGG CATTCAAACG TCACAACCCG ACTGGATCCT GCAGTGTCAG 200CGTGTGGGTT GGGGATAAGA CCACCGCCAC AGACATCAAG GGCAAGGAGG 250TGATGGTGTT GGGAGAGGTG AACATTAACA ACAGTGTATT CAAACAGTAC 300TTTTTTGAGA CCAAGTGCCG GGACCCAAAT CCCGTTGACA GCGGGTGA(SEQ ID NO26)在另一個實施方案中，DNA表達載體包含如下序列ATGGGCCATC ATCATCATCA TCATCATCAT CATCACAGCA GCGGCCATAT 50CGAAGGTCGT CATATGAGTC CGAAACGCAG CCCGAAACGT AGCCCAAAGC 100GTAGCCCGAA GCGTGGCGGT ACCTACCTGT CTGAAGATGA GCTGAAAGCG 150GCGGAGGCGG CATTCAAACG TCACAACCCG ACTGGATCCT GCAGTATTAG 200TGAGTGGGTA ACGGCGGCAG ACAAAAAGAC TGCAGTGGAC ATGTCGGGCG 250GGACGGTCAC AGTCCTTGAA AAGGTCCCTG TATCAAAAGG CCAACTGAAG 300CAATACTTCT ACGAGACCAA GTGCAATCCC ATGGGTTACA CAAAAGAAGG 350CTGA(SEQ ID NO29)本發(fā)明的多肽可用于實現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體介導的核酸送遞，所述核酸如與多肽的核酸結(jié)合元件結(jié)合的DNA。所述核酸也可以是RNA，包括有義RNA、反義RNA或核酶。因此本發(fā)明一方面提供了一種包含本發(fā)明的多肽和一種核酸的組合物。所述多肽和核酸可形成非共價復合物。術(shù)語“非共價”是指所有不是共價鍵(即電子在兩個原子之間共用)的原子或分子間的相互作用。如本文所用，“非共價”包括但非限于如下相互作用靜電或離子鍵、氫鍵、偶極相互作用、疏水相互作用、van der Walls接觸及芳族堆積(aromatic stacking)相互作用。一般而言，非共價鍵的穩(wěn)定性遠遠低于共價鍵，通?？梢钥赡嫘纬珊推茐?。在不同的實施方案中，非共價復合物可以由于核酸的負電荷磷酸主鏈與非特異性DNA結(jié)合元件的正電荷側(cè)鏈之間的相互作用而形成。
在一個實施方案中，所述核酸包含一個編碼基因序列。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述編碼序列是治療性基因序列。治療性基因序列包括但非限于編碼蛋白質(zhì)、有義RNA、反義RNA或核酶的基因，包括具有神經(jīng)營養(yǎng)性、抗程序性細胞死亡或抗氧化劑活性的分子?；蛘?，治療性基因序列可通過代替或補充內(nèi)源缺陷的基因或者通過編碼內(nèi)源或外源基因產(chǎn)物而用于實現(xiàn)基因治療。
在另一個實施方案中，所述編碼基因序列可編碼一種標記基因產(chǎn)物。術(shù)語“標記基因產(chǎn)物”與“報道基因產(chǎn)物”當指其存在可易于鑒別(通常通過肉眼觀察或通過授予細胞對其它胞毒劑或細胞抑制劑抗性而鑒別)的基因產(chǎn)物時可互換使用。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知許多標記基因產(chǎn)物，包括但非限于螢光素酶、綠色熒光蛋白、β-半乳糖苷酶、葡糖醛酸糖苷酶(GUS)和氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。
在各種實施方案中，有利的是本發(fā)明的組合物在生理溶液中是穩(wěn)定的。所述穩(wěn)定性可以通過增加所述多肽與核酸之間形成的復合物的穩(wěn)定性而增加，例如通過增加所述多肽的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域及關(guān)連結(jié)合結(jié)構(gòu)域識別的DNA序列的價態(tài)而進行。所述組合物可以通過在合適的緩沖液中混和所述多肽與所述核酸而形成。所述合適的緩沖液的成分依賴于所述核酸和多肽元件的性質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知使用合適的溶液條件以促進所述組合物中復合物的穩(wěn)定性。例如，如果所述組合物中多肽與核酸之間的結(jié)合主要是通過靜電作用介導的，則本領(lǐng)域技術(shù)人員已知使用相對低鹽濃度的溶液以防止離子屏蔽。穩(wěn)定的非共價復合物的形成可以通過許多基于所述非共價復合物的大小和/或電荷的實驗方法確定。例如，所述復合物可以通過質(zhì)譜、凝膠滲透/大小排阻層析、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠阻滯分析、插入DNA中的溴化乙錠的熒光猝滅、原子力顯微鏡分析、ζ電位分析及動態(tài)光散射分析確定。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述組合物還包含陽離子聚合物。據(jù)信所述陽離子聚合物與核酸的帶負電主鏈相互作用，導致非共價的核酸/多肽復合物濃縮為較小的攜帶較少負電荷的微粒。這些較小的攜帶較少負電荷的陰離子非共價復合物可以通過受體介導的胞吞更有效地內(nèi)在化(Schaffer et al J.Biol.Hem.27328004-28009，1998)。合適的陽離子聚合物包括魚精蛋白、聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸、聚乙烯亞胺或衍生自堿性蛋白如組蛋白的堿性肽序列。優(yōu)選所述聚乙烯亞胺是低分子量聚合物，優(yōu)選平均分子量(重量)為600(PEI600)。PEI600與高分子量PEI不同，如與顯示高度毒性及基因轉(zhuǎn)染效率的PE125K不同(BoussifO，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927297-7302，1995；Abdallah B，et al.，Hum Gene Ther，71947-1954，1996；Goula D，Gene Therapy，5712-7171998)。PEI600顯示低得多的胞毒性但是幾乎無轉(zhuǎn)染效率。由于PEI600含有1°、2°和3°胺，在摻入復合物并胞吞進細胞中后均具有質(zhì)子化潛力，因此該聚合物破壞內(nèi)體(endosome)膜并促進多肽復合物的逃脫或釋放。
本發(fā)明還提供了將核酸定向送遞至細胞的方法，包括將本發(fā)明各實施方案的組合物給予表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的細胞。非限于任何特定理論，據(jù)信多肽-核酸復合物選擇性結(jié)合細胞表面神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體，然后所述復合物由受體介導的胞吞而內(nèi)在化。
表達至少一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的任何細胞均可以被定向，包括表達Trk如Trk A、TrK B和Trk C或p75NTR的細胞。在各種神經(jīng)元中，這些細胞包括基底部前腦-膽堿能神經(jīng)元、紋狀體-膽堿能神經(jīng)元、藍斑神經(jīng)元、脊髓運動神經(jīng)元、交感神經(jīng)感覺神經(jīng)元、神經(jīng)嵴衍生的小、中和大纖維感覺神經(jīng)元、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞等等。神經(jīng)系統(tǒng)中的其它細胞包括星形膠質(zhì)細胞、少突膠質(zhì)細胞、神經(jīng)膜細胞(Schwanncells)、小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)外胚層衍生的細胞。神經(jīng)系統(tǒng)外的細胞包括B淋巴細胞、T淋巴細胞、肥大細胞，單核細胞、巨噬細胞及許多腫瘤細胞。
所述組合物可包含其它非病毒基因載體，包括陽離子聚合物或脂質(zhì)，如Davis ME(Non-viral gene delivery system；Current opinion inbiotechnology 2002，13128-131)、Niidome T and Huang L(Gene therapyprogress and prospectsnonviral vectors.Gene Therapy，2002，91647-1652)及Li S and Huang L(nonviral gene therapypromises andchallenges.Gene Therapy，2000，731-34)所述。多肽在化學綴合或置換內(nèi)源病毒配體后也可以用于病毒載體中。用作基因治療的逆轉(zhuǎn)錄病毒介導的基因送遞已經(jīng)充分鑒定，產(chǎn)生重組逆轉(zhuǎn)錄病毒及用這種病毒在體外或體內(nèi)感染細胞的方案可見于Current Protocols in MolecularBiology，Ausubel，F(xiàn).M.et al.(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)及其它標準實驗室手冊。進行基因治療的其它已知病毒載體包括腺病毒、腺伴隨病毒和桿狀病毒產(chǎn)生的載體(Sarkis C et al，Proc Natl AcadSci U.S.A.9714638-43，2000)，包括如美國專利6,180,613所述的將DNA送遞至神經(jīng)系統(tǒng)細胞的載體。
通過基因治療方法有效治療許多神經(jīng)疾病需要高水平的及細胞特異性的基因表達。本發(fā)明的多肽因此可有利地用于基因治療中以治療神經(jīng)元疾病，包括中風、缺血、癲癇、頭部和脊髓創(chuàng)傷、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、及神經(jīng)遺傳疾病。例如，在帕金森病中，黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的進行性喪失最終導致多巴胺不足及相關(guān)的運動損傷。定向在這組神經(jīng)元的膜表面上表達的Trk B受體的基因送遞系統(tǒng)應可用于推進帕金森病的基因治療方法。同樣在阿爾茨海默病中，具有最主要病變的神經(jīng)元組是應答所有神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的基底部前腦膽堿能神經(jīng)元。定向神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的基因送遞系統(tǒng)可有助于將治療性基因轉(zhuǎn)移進該神經(jīng)元以增加膽堿能功能?？墒褂玫闹委熜曰虬ㄉL因子基因(包括編碼神經(jīng)營養(yǎng)蛋白、成纖維細胞生長因子家族蛋白質(zhì)、胰島素樣生長因子家族蛋白質(zhì)的基因)，及抗程序性細胞死亡的基因(包括bcl-2基因家族的基因)。
本發(fā)明另一方面因此還提供了一種治療對象中神經(jīng)元疾病的方法，包括將本發(fā)明各種實施方案的組合物給予所述對象。所述對象可以是任何哺乳動物，在一個實施方案中所述對象是人。在各種實施方案中，所述神經(jīng)元疾病是中風、缺血、癲癇、頭部和脊髓創(chuàng)傷、帕金森病、亨廷頓病、阿爾茨海默病、或者肌萎縮性側(cè)索硬化癥、或者神經(jīng)疾病。技術(shù)人員顯而易見，所述組合物可以用藥物可接受的載體或稀釋劑適當制備而用于體內(nèi)給藥。
本領(lǐng)域已知將DNA在體內(nèi)導入哺乳動物細胞的方法，并可以用于將與本發(fā)明的多肽復合的DNA給予對象以進行基因治療。在一個實施方案中，靶細胞是神經(jīng)元細胞，所述組合物是通過鞘內(nèi)注射進腦脊液(CSF)中給予的。為將所述組合物特異性送遞至中樞神經(jīng)系統(tǒng)的特定區(qū)域中的神經(jīng)元，如本領(lǐng)域所已知的可通過定向微注射(stereotactic microinjection)進特定的解剖部位而給予。對于人患者，將定向框架基礎(chǔ)固定在頭骨內(nèi)并使用高分辨率MRI對腦部成像。使用合適的定向軟件，將圖像轉(zhuǎn)化為適于DNA定向注射的三維坐標。將與本發(fā)明多肽復合的DNA定向注射進特定的解剖部位也有助于通過逆行軸突轉(zhuǎn)運而定向在不易到達處的特定的神經(jīng)元亞類。還可以在周圍注射所述組合物后利用逆行軸突轉(zhuǎn)運定向至CNS中的神經(jīng)元。一個實例是經(jīng)肌肉注射定向至脊髓內(nèi)的運動神經(jīng)元。這個方案避開血腦屏障，并且提供了對CNS組織無侵害性的一種實際的治療策略。
已經(jīng)在表達Trk A和p75NTR的PC12細胞以及表達Trk A和Trk B的大鼠原代皮質(zhì)神經(jīng)元中測試了本發(fā)明的多肽和組合物的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白樣活性和定向基因送遞。所述多肽使得轉(zhuǎn)染的基因表達增加了幾百至幾千倍。所述組合物對定向于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的特異性在使用神經(jīng)營養(yǎng)蛋白或相關(guān)對照肽作為競爭抑制劑的抑制實驗中已經(jīng)證實。另外，使用本發(fā)明的多肽改良的基因送遞在腰椎注射后已經(jīng)在神經(jīng)系統(tǒng)中證實。在表達神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的背根神經(jīng)節(jié)中觀測到顯著增加的基因表達。特別地，與包含(SPKR)4和His10標簽的多肽復合的DNA可以在體外和體內(nèi)有效地轉(zhuǎn)移細胞而無需使用幫助內(nèi)體逃脫的試劑，如氯喹和PEI。
所述多肽還激活神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導并發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)蛋白樣生物作用，促進神經(jīng)突生長和神經(jīng)元存活。發(fā)夾基序因此是一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑，意味著其能促進與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白相關(guān)的至少一種生物學作用，如神經(jīng)突生長、神經(jīng)元存活及神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導。因此在一方面，本發(fā)明提供了包含選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑。所述發(fā)夾基序可以是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序或者如上述的其功能等價物。在一個實施方案中，所述激動劑進一步包含一個帶正電的結(jié)構(gòu)域，在各種其它實施方案中所述激動劑包含其它元件，包括上述那些元件，例如發(fā)夾基序與帶正電結(jié)構(gòu)域之間的合適接頭/間隔或者增強所述激動劑的穩(wěn)定性、溶解度或折疊的其它元件。
不限于任何特定理論，據(jù)信帶正電的結(jié)構(gòu)域通過結(jié)合帶負電的細胞膜而促進所述激動劑的受體結(jié)合。所述帶正電的結(jié)構(gòu)域可以是如上述氨基酸的任何帶正電荷的聚合物，包括聚賴氨酸和SPKR4結(jié)構(gòu)域。在各種實施方案中，所述激動劑包含SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7和SEQ ID NO8所示序列。
本發(fā)明各種實施方案的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑具有許多用途，這些用途為本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見，包括研究神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體功能。其也可以用于治療對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療有反應的疾病，例如腫瘤或神經(jīng)元疾病包括上述疾病。本發(fā)明因此還提供了治療對象中對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白有反應的疾病的方法，包括給予所述對象有效量的本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑或者包含有效量的本發(fā)明的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑的組合物。所述對象可以是任何哺乳動物，包括人。
本發(fā)明另一方面提供了包含神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑和藥物可接受的稀釋劑或載體的組合物。所述組合物可以以常規(guī)方式生產(chǎn)。通常地，稀釋劑或載體基于給藥模式和途徑及標準藥物實踐而選擇。合適的藥物載體或稀釋劑以及它們在藥物配制品中的應用所需的藥物必需品如本領(lǐng)域的標準參考文獻Remington′s Pharmaceutical Sciences和USP/NF中所述。配制品可以制備為含有有效量(是指足以實現(xiàn)治療疾病或其癥狀的量)，例如合適的日劑量。所述有效量及合適的日劑量根據(jù)治療的對象和疾病及疾病程度而變化，可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)確定。所述有效量與合適的配制品可以與神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療中使用的劑量和配制品相似，例如RT Thorne and WH Frey″Delivery ofneurotrophin factor to the central nervous systemPharmacokineticconsiderations″，Clin.Pharmacokinet，40(12)907-946，2001所述。在一個實施方案中，如果是通過注射給予對象，則所述有效量是大約0.03-1μg所述激動劑/kg對象體重。
本文引用的所有文獻均以全文并入?yún)⒖肌?br> 盡管本文揭示了本發(fā)明的各種實施方案，但在本發(fā)明范圍內(nèi)根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的共識可以對本發(fā)明進行一些改變和修改。這些修改包括用等價物取代本發(fā)明任一方面以便以基本相同的方式達到相同的結(jié)果。除非特別說明，本文所用所有技術(shù)和學術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域技術(shù)人員共識的含義。
單詞“包含”作為開放式術(shù)語使用，基本上與短語“包括但非限于”的含義相同。短語“根據(jù)本發(fā)明”或“根據(jù)本發(fā)明的各種實施方案”是指包括本發(fā)明范圍內(nèi)的所有實施方案。如下實施例例證了本發(fā)明的各個方面，無限制本發(fā)明的范圍之意。
實施例材料和方法多肽生產(chǎn)細胞系PC12(大鼠嗜鉻細胞瘤)細胞系得自ATCC(美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA))，在補加10％胎牛血清(FBS)和5％馬血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。已知PC12細胞表達TrkA和p75NTR受體。COS7(非洲綠猴腎成纖維細胞)細胞系得自ATCC，在補加10％胎牛血清、50U/ml青霉素和50μg/ml鏈霉素的Dulbecco改進的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。將細胞保持在37℃、5％CO2、增濕的溫育器中。
原代細胞培養(yǎng)物神經(jīng)元的原代培養(yǎng)物從妊娠20天的Wistar大鼠胚胎的皮質(zhì)中確立。切開被剝離腦膜的皮質(zhì)并將單個細胞通過將組織糜在補加2％FBS的3ml DMEM培養(yǎng)基中研磨而機械分散。將懸浮液置入離心管中。通過離心收集上清中的細胞并輕輕再懸浮于具有10％FBS的DMEM中。評價細胞的存活性之后使用臺盼藍鋪板。將細胞鋪板于用聚L賴氨酸/層粘連蛋白預先包被的微量培養(yǎng)板上，密度為7.5×105個活細胞/cm2。在溫育2小時使得神經(jīng)元附著后，除去培養(yǎng)基和未附著的細胞并更換為具有1％N2補充物(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)的無血清DMEM/F12培養(yǎng)基。然后將細胞在37℃在5％CO2中在增濕的溫育器中溫育。培養(yǎng)2-5天后，所述神經(jīng)元細胞用于轉(zhuǎn)染實驗。
神經(jīng)膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物從20天齡的Wistar大鼠胚胎的皮質(zhì)中確立。如上述收集單個細胞。將所述細胞以4×105個存活細胞/cm2密度鋪板于聚L賴氨酸/層粘連蛋白包被的平皿上，并在補加10％FCS的DMEM/F12培養(yǎng)基中生長7天至鋪滿。在轉(zhuǎn)染前一天，分離所述細胞并鋪板進包被的微量滴定板中，密度為2.5×104個細胞/孔。
N/P比率氮/磷(N/P)比率通常用于測定聚陽離子-核酸或多肽-核酸復合物中的電荷平衡。對于陽離子聚合物，這是指聚陽離子中氮原子與核酸中磷酸根的比率。對于計算本發(fā)明的多肽的N/P比率，我們采用DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域中堿性氨基酸殘基的數(shù)目為每個多肽分子的“N”成分的數(shù)目。
DNA阻滯分析這種分析定性地評價了多肽或聚陽離子結(jié)合DNA并因此阻滯其在電泳條件下通過瓊脂糖凝膠遷移(通過降低其電荷/質(zhì)量比)的能力。對于N/P比率的范圍，將多肽加入0.1μg質(zhì)粒DNA中并用HEPES緩沖鹽水(HBS，150mM NaCl，29mM HEPES，pH 7.3)或5％葡萄糖溶液定容至20μl。將該混合物進行渦旋(vortex)并在室溫溫育30分鐘，之后在用溴化乙錠染色的0.8-1.0％Tris-硼酸鹽-EDTA瓊脂糖凝膠中進行電泳，在紫外光下顯色。
溴化乙錠置換分析在這種分析中，摻入DNA中的溴化乙錠的熒光猝滅用于測定結(jié)合和濃縮DNA的能力。將溴化乙錠(153μl的0.01％溶液)加入96μg質(zhì)粒DNA中并用水稀釋至終體積為6ml。在96孔微量培養(yǎng)板的孔中，將各種量的多肽置于50μlDNA-溴化乙錠溶液中?；旌秃?分鐘加入100μl水。使用485nm激發(fā)波長和593nm發(fā)射波長在SPECTRAFluorPlus微量培養(yǎng)板閱讀儀(TECAN，Maennedorf，Switzerland)上讀出熒光。
原子力顯微鏡分析制備DNA樣品、多肽-DNA復合物、及多肽-聚陽離子-DNA復合物，其中DNA濃度為0.02mg/ml。將樣品在HPLC級的水中稀釋10倍，并將每種樣品20μl沉積在云母片上。1分鐘后，將所述云母片用HPLC級的水洗滌并在過濾的氣流中干燥。在Nanoscope IIIa原子力顯微鏡(Digital Instruments，Santa Barbara，CA，USA)上獲得圖像，顯微鏡使用Nanoprobe Silicon針尖(Digital Instruments)在空氣中以輕敲模式(tapping mode)操作。
報道基因質(zhì)粒為確定本發(fā)明核酸送遞系統(tǒng)的轉(zhuǎn)染效率，應用在合成的啟動子CAG控制下的編碼螢火蟲螢光素酶的報道質(zhì)粒pCAGluc(YoshiharuMatsuura，National Institute of Infectious Diseases，Tokyo，Japan惠贈)。CAG包含雞β-肌動蛋白啟動子和巨細胞病毒立即早期增強子。
體外基因送遞在PC12(TrkA和p75NTR陽性)細胞和COS7(神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體陰性)細胞中體外測試TrkA定向基因送遞復合物的轉(zhuǎn)染效率。將所述細胞在微量培養(yǎng)板(24、48或96孔板)的孔中生長至50-70％鋪滿。所述基因送遞復合物根據(jù)每個實施例的說明所述而制備。轉(zhuǎn)染通過用一半體積的減少血清的培養(yǎng)基置換富含血清的培養(yǎng)基而實現(xiàn)，所述減少血清的培養(yǎng)基為含有所述基因送遞復合物的Opti-MEM(Invitrogen)。特別提及的是，也要加入100μM氯喹以幫助復合物從內(nèi)體中逃脫。溫育4小時后，將細胞恢復至正常培養(yǎng)基體積和血清濃度中，通過用含有兩倍血清濃度的培養(yǎng)基(對于PC12為具有20％FBS和10％馬血清的RPMI-1640)加滿或者通過完全更換培養(yǎng)基而恢復。
以相似方式在皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物上測試基因送遞復合物。然而，由于培養(yǎng)神經(jīng)元的DMEM-F12/N2培養(yǎng)基不含有血清，因此將所述復合物簡單地直接加入到體積為通常體積一半的DMEM-F12/N2中。4小時后，加入等體積的DMEM-F12/N2。
轉(zhuǎn)染后1-2天，除去細胞培養(yǎng)基并將細胞在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中漂洗。向每個孔中加入足以覆蓋底部表面的報道基因裂解緩沖液(Reporter Lysis Buffer)(Promega，Wisconsin，MD，USA)(50μl/孔，48孔平板)。在一次冷凍-解凍循環(huán)后，使用螢光素酶分析系統(tǒng)(Luciferase Assay System)(Promega)和單管光度計(Berthold Lumat LB9507，Bad Wildbad，Germany)測試所述裂解物的螢光素酶活性。每種裂解物的總蛋白質(zhì)濃度使用DC Protein分析(Bio-Rad，Hercules，CA，USA)確定。結(jié)果以相對光單位(RLU)/mg總蛋白質(zhì)表示。
體內(nèi)基因送遞體內(nèi)基因送遞通過鞘內(nèi)注射成年Wistar大鼠(8周齡，180-200g)進行研究。將所述大鼠經(jīng)腹膜內(nèi)注射戊巴比妥鈉麻醉。在暴露L4-L5周圍的皮膚后，用注射器將基因送遞復合物緩慢注射進蛛網(wǎng)膜下隙中。伴隨注射針的正確放置有輕微的尾部擺動。注射后，將注射器原位留置5分鐘以限制由于逆流壓力所致的擴散。有時需要多次注射以送遞全部體積的所述復合物。注射后，將皮膚用手術(shù)夾子封閉并將動物保持溫暖直至它們蘇醒。
2天后，將所述大鼠麻醉并穿心灌注PBS。切離脊髓的腰部節(jié)段和腰部背根神經(jīng)節(jié)。將所述組織根據(jù)大小在100-400μl報道基因裂解緩沖液(Promega)中勻漿，并進行三次冷凍-解凍循環(huán)。將裂解物在4℃在14000g離心5分鐘。使用螢光素酶分析系統(tǒng)(Promega)在單管光度計(Berthold Lumat LB 9507)中測試上清的螢光素酶活性。將讀數(shù)用通過DC Protein分析(Bio-Rad)測定的裂解物的總蛋白質(zhì)含量標準化。
TrkA和信號轉(zhuǎn)導途徑激活的檢測進行免疫印跡實驗測試嵌合多肽是否如NGF一樣可誘導TrkA自身磷酸化及其信號轉(zhuǎn)導途徑的激活。將PC12細胞以2×106個細胞/孔的密度接種在6孔平板中，并在含有0.5％FBS和0.25％馬血清的RPMI 1640中培養(yǎng)2天。低濃度的血清對于降低磷酸化的基本水平是必需的。將培養(yǎng)基在開始處理之前2小時更換。將細胞與所述多肽或NGF在無血清培養(yǎng)基中溫育15-20分鐘。然后將細胞在PBS中洗滌、裂解并超聲處理。細胞裂解物通過SDS-PAGE解離并移至硝化纖維素膜進行免疫印跡。所用的初級抗體包括Phospho-TrkA(Tyr490)抗體、Phospho-p44/p42 MAPK(Thr202/Tyr204)單克隆抗體、及Phospho-Akt(Ser473)單克隆抗體，所有抗體均得自Cell SignalingTechnology(Beverly，MA，USA)。在使用辣根過氧化物酶綴合的二級抗體后通過標準技術(shù)進行比色檢測。在一些實驗中，使用TrkA酪氨酸激酶抑制劑K-252a或AG879(均得自Calbiochem，La Jolla，CA，USA)。在這些情況中，將PC12細胞與100nM K-252a或10μMAG879溫育，之后加入多肽或NGF。
PC12細胞存活分析將接種在膠原包被的96孔平板上的未分化或分化的(用10ng/mlNGF處理6天)PC12細胞接觸含有NGF或各種濃度的嵌合多肽的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基。溫育3-4天后，細胞存活性通過標準MTT分析測定。細胞存活率以與NGF處理的對照組存活力的百分比表示。
PC12神經(jīng)突生長分析測試嵌合多肽在PC12細胞中誘導神經(jīng)突生長的能力。將不同濃度的多肽加入到在富含血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)的PC12細胞中。將細胞溫育3天，每24小時照像一次。
實施例1NL4-10K的設(shè)計NL4-10K包含NGF的第4環(huán)及側(cè)翼的β折疊序列(NL4，第80-108位氨基酸)，所述NL4連接至由10個連續(xù)賴氨酸殘基組成的一個C末端核酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域(10K)。NL4的第一個和最后一個氨基酸殘基是半胱氨酸殘基，其形成分子內(nèi)二硫鍵以穩(wěn)定TrkA-結(jié)合區(qū)域的環(huán)形結(jié)構(gòu)。NL4-10K、NL4和10K的氨基酸序列分別如SEQ ID NO5、9和10所示。
肽合成NL4-10K、NL4和10K是通過常規(guī)的肽合成技術(shù)化學合成的。NL4-10K和NL4由Cambridge Research Biochemicals(Cleveland，UK)合成、環(huán)化及純化。10K得自Bio-Synthesis(Lewisville，Texas，USA)。NL4-10K結(jié)合DNANL4-10K肽結(jié)合DNA的能力通過在電泳期間DNA阻滯而監(jiān)測。NL4-10K與質(zhì)粒DNA的結(jié)合降低了DNA的電荷-質(zhì)量比。圖1示出質(zhì)粒DNA的遷移率隨著肽濃度增加而降低。在N/P比率為1-5之間復合物變得不能移動，表明所述DNA完全的電荷中和。相反，不含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的NL4不阻滯DNA遷移。
NL4-10K介導基因送遞至PC12細胞為檢測NL4-10K作為基因送遞載體的效力，使用以不同比率的肽和報道質(zhì)粒pCAGluc自身裝配形成的復合物轉(zhuǎn)染PC12細胞。所述復合物是將肽滴加至渦旋中的(vortexing)DNA，使得這兩種成分均溶解在Opti-MEM培養(yǎng)基中而形成。轉(zhuǎn)染之前在室溫使得復合物形成進行30分鐘。向24孔平板的每個孔中加入含有1μg質(zhì)粒DNA的50μl復合物。由于NL4-10K缺少內(nèi)體破壞結(jié)構(gòu)域，因此在轉(zhuǎn)染期間使用氯喹(100μM)。
圖2A示出由0.3nmol的NL4-10K與1μg的pCAGluc(N/P比率為1)形成的復合物產(chǎn)生中度基因送遞，但是轉(zhuǎn)染效率隨著NL4-10K量增加而顯著增加。NL4(僅有定向結(jié)構(gòu)域)或10K(僅有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或者二者的混合物均不呈現(xiàn)這種劑量響應趨勢。使用1.5nmol的NL4-10K/μg DNA(N/P比率為5)與使用NL4和10K肽的混合物相比達到的轉(zhuǎn)染效率高110倍。
NL4-10K介導的基因送遞至PC12細胞是特異性的為進一步證明NL4-10K介導的基因送遞特異性定向于NGF受體，使用過量的NGF、NL4和NL4-10K與NL4-10K/pCAGluc復合物競爭接觸TrkA而進行競爭性分析。在轉(zhuǎn)染期間這些分子每一種的存在均使得基因送遞降低74-90％(圖2B)。然而，過量的10K肽的存在不具有顯著作用。這些結(jié)果提示NL4-10K介導的基因送遞至PC12細胞是NGF受體特異性的。
NL4-10K介導基因送遞至神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物皮質(zhì)神經(jīng)元中TrkA表達已經(jīng)充分確定，而在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中TrkA的存在仍有爭論(Sofroniew et al.，Annu.Rev.Neurosci.2001；241217-281)。如果確實存在，則TrkA在少量的神經(jīng)膠質(zhì)細胞中低水平表達。我們檢測了NL4-10K將送遞pCAGluc質(zhì)粒送遞至分離自20天齡大鼠胚胎的神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物的能力。
使用通過肽/DNA(nmol/μg)比率為0.75(N/P比率為2.5)的NL4-10K和報道質(zhì)粒pCAGLuc經(jīng)自身裝配形成的復合物轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。圖2C示出在存在氯喹的情況下，NL4-10K肽/pCAGLuci復合物與非定向的對照組相比將基因轉(zhuǎn)移至原代神經(jīng)元中的效力高22倍。然而，在原代神經(jīng)膠質(zhì)細胞中，NL4-10K和10K的轉(zhuǎn)染效率之間的差異不顯著。
NL4-10K介導基因送遞至背根神經(jīng)節(jié)已知背根神經(jīng)節(jié)(DRG)的神經(jīng)元表達TrkA。對大鼠進行基因送遞復合物的腰椎內(nèi)注射，以評價NL4-10K在體內(nèi)的效力。在體外使用氯喹以幫助NL4-10K/DNA復合物從內(nèi)體中逃脫，但在體內(nèi)則不用，因為所需要的濃度是毒性的。因此，向肽-DNA復合物中加入聚陽離子低分子量聚乙烯亞胺(MW 600Da，PEI600)，其具有內(nèi)體破壞能力并且是低毒性的。在形成這些三重復合物的過程中，首先將PEI600與DNA混和30分鐘，之后加入肽并將混合物在室溫再溫育30分鐘。每只大鼠均注射60μl復合物，所述復合物含有溶解于5％葡萄糖中的3μg的pCAGluc、N/P比率為5的PEI600、及N/P比率為5的肽(NL4-10K或10K對照)。3天后收集脊髓腰段和DRG，分析螢光素酶活性。在接近腰部注射部位的脊髓中，NL4-10K介導的轉(zhuǎn)染相對于10K對照組降低。相反，得自PEI600/pCAGluc/NL4-10K介導的DRG中螢光素酶基因表達與PEI600/pCAGluc/10K介導的相比高至2倍(圖3)。這些結(jié)果表明體內(nèi)NL4-10K增強基因送遞的特殊性質(zhì)。
實施例22.1DsbC-NL4-10K重組蛋白的設(shè)計與重組產(chǎn)生的蛋白質(zhì)相比，通過化學方法進行肽合成是昂貴的并面臨鏈長度限制。我們希望顯示出當摻入至重組蛋白質(zhì)時，NL4-10K的氨基酸序列仍保留介導TrkA定向基因送遞的能力。嵌合蛋白DsbC-NL4-10K(SEQ ID NO6)由附著于DsbC的C末端的NL4-10K組成，DsbC是大腸桿菌二硫鍵異構(gòu)酶，其應增強蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、溶解度和折疊。
質(zhì)粒構(gòu)建使用引物D1-a(SEQ ID NO12)和D1-b(SEQ ID NO13)，將編碼NL4的DNA序列從含有NGF基因的pcDNA3.1/GS質(zhì)粒(InvitrogenH-X52599M)中經(jīng)PCR擴增。下游引物D1-b包括所述10K尾部的符合讀框的密碼子。這個序列符合讀框地插入pET-40b(+)(Invitrogen)的ScaI和HindIII位點之間，這是在DsbC和His6標簽的編碼序列下游。所述構(gòu)建體的序列(D1-cSEQ ID NO14)通過常規(guī)DNA測序技術(shù)證實。
蛋白質(zhì)表達和純化將pET-40b(+)-NL4-10K轉(zhuǎn)化進大腸桿菌表達宿主菌株BL21(DE3)中。將新鮮轉(zhuǎn)化的細菌的一個集落懸浮于200μl水中，再次鋪板并溫育過夜。收集所得菌落并用于接種含有30μg/ml卡那霉素的400ml Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基。在30℃快速搖動5小時后，收獲細胞并在冰上在含有1mg/ml雞卵溶菌酶的20mM Na2HPO4、0.5MNaCl、10mM咪唑、pH 7.9中裂解30分鐘。在超聲和離心后，將上清通過鎳螯合親和層析在KTAexplorer FPLC(AmershamBiosciences，Buckinghamshire，UK)上純化。使用1ml HisTrap柱(Amersham Biosciences)，通過增加咪唑濃度進行洗滌和洗脫。收集含有純化的蛋白質(zhì)的級分，在4℃用HBS透析。
DsbC-NL4-10K增強魚精蛋白介導的基因送遞至PC12細胞而非COS7細胞DsbC-NL4-10K由于大體積的DsbC結(jié)構(gòu)域而能結(jié)合DNA但不能使其完全濃縮。然而，與富含精氨酸的堿性蛋白質(zhì)魚精蛋白組合，則DsbC-NL4-10K能定向?qū)⒒蛩瓦f定向至TrkA受體。將在96孔平板中生長的PC12和COS7細胞用三重復合物轉(zhuǎn)染，所述復合物含有0.1μg/孔pCAGluc、0.2μg/孔魚精蛋白、及各種量的DsbC-NL4-10K。為形成這些三重復合物，首先將魚精蛋白與DNA混和30分鐘，之后加入DsbC-NL4-10K并將混合物在室溫再溫育30分鐘。
在表達TrkA的PC12細胞中，隨著DsbC-NL4-10K量增加而表現(xiàn)劑量響應趨勢，最大轉(zhuǎn)染效率在蛋白質(zhì)/DNA(nmol/g)比率為0.3(＝N/P為1)時出現(xiàn)(圖4A)。在更高的蛋白質(zhì)/DNA比率，過量的未結(jié)合的DsbC-NL4-10K可引起競爭性抑制或毒性作用。然而，在COS7細胞中，DsbC-NL4-10K不改善基因送遞(圖4B)，提示在PC12細胞中的增強作用是NGF受體特異性的。
DsbC-NL4-10K預處理抑制DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600轉(zhuǎn)染為獲得DsbC-NL4-10K介導的基因送遞的特殊性質(zhì)的進一步證據(jù)，將PC12細胞與游離DsbC-NL4-10K在轉(zhuǎn)染之前溫育30分鐘。與用牛血清白蛋白預處理的細胞相比，這種預處理明顯降低DsbC-NL4-10K/DNA/PEI600復合物的轉(zhuǎn)染效率(圖4C)。相反，用DsbC-NL4-10K或牛血清白蛋白預處理，當使用PEI600/DNA復合物時產(chǎn)生相似的轉(zhuǎn)基因表達。這提示DsbC-NL4-10K介導的基因送遞通過受體結(jié)合而發(fā)生，因為用游離DsbC-NL4-10K預處理使得受體飽和。
實施例3SPKR4NL1-2的設(shè)計SPKR4NL1-2(SEQ ID NO7)是一種嵌合蛋白，含有一個在N末端附近的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域SPKRSPKRSPKRSPKR(SEQ ID NO11)，其通過α螺旋接頭TYLSEDELKAAEAAFKRHNPT(SEQ ID NO30)與包括NGF的環(huán)1和環(huán)2的定向結(jié)構(gòu)域連接。組蛋白H1-衍生的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述接頭的序列首先由Fortunati等應用(Gene Therapy2000；71505-15)。所述接頭側(cè)翼是柔性甘氨酸殘基，其使得DNA結(jié)合和定向結(jié)構(gòu)域獨立起作用。所述定向結(jié)構(gòu)域包含一個Cys殘基，后接人NGF的第17-67位氨基酸，從而與相應于NGF中C58的Cys殘基可以形成二硫鍵?；贜GF的晶體結(jié)構(gòu)(Wiesmann et al.，Nature1999；401184-8)，我們判斷這種二硫鍵幫助定向結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)環(huán)1和2的天然構(gòu)象。
質(zhì)粒構(gòu)建在先前的研究中(未公布)，我們已經(jīng)通過PCR介導的基因裝配方法(Jayaraman & Puccini，BioTechniques 1992；12(3)392-8)構(gòu)建了編碼(SPKR)4和與第三個結(jié)構(gòu)域連接的α螺旋接頭的DNA片段。簡要而言，將組成編碼鏈的三個長寡核苷酸(D2-a，D2-b，D2-c，分別為SEQID NO15、16、17)、互補于連接處(junction)的兩個短寡核苷酸(D2-d，D2-e分別為SEQ ID NO18、19)及兩個末端引物(D2-f，D2-g分別為SEQ ID NO20、21)在一個PCR反應中混和。使用該產(chǎn)物作為模板，將相應于DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述接頭的序列使用引物D2-h和D2-i(SEQ ID NO22和23)通過PCR擴增。將該PCR產(chǎn)物用NdeI和BamHI消化并連接進被類似消化的pET-16b表達載體(Novagen)中位于His10標簽下游，產(chǎn)生pET16-SPKR4linker。將編碼全長NGF的DNA序列首先通過PCR擴增人腦cDNA(得自Clontech，Palo Alto，CA，USA)而克隆進TA載體中。將相應于NGF的第17-67位氨基酸的DNA序列使用引物D2-j和D2-k(SEQ ID NO24和25)擴增。這些引物在兩端導入BamHI限制位點，使得消化的片段與所述α螺旋接頭序列符合讀框地連接。另外，正向引物導入上述額外的Cys密碼子。檢測所述構(gòu)建體正確的插入方向并通過常規(guī)方法測序。編碼序列如SEQ IDNO26所述。
蛋白質(zhì)表達和純化將用pET16-SPKR4NL1-2轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS在37℃在LB培養(yǎng)基(含有50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素)中強力搖動直至光密度達到0.7。然后在30℃通過加入1mM異丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG，Bio-Rad)誘導重組蛋白表達。隨后通過離心90分鐘收獲細菌并冷凍。將細胞沉淀再懸浮于補加了無EDTA的蛋白酶抑制劑(Calbiochem，San Diego，CA，USA)的裂解緩沖液(20mM Tris-HCl pH 7.9、0.5M NaCl、20mM咪唑)中。將細胞裂解物超聲處理直至不再粘性并通過離心澄清。將上清通過鎳螯合親和層析在KTAexplorer FPLC(Amersham Biosciences)上純化。使用裂解緩沖液平衡的1ml HisTrap柱(Amersham Biosciences)從1.6L培養(yǎng)物中純化裂解物，通過增加咪唑濃度進行洗滌和洗脫。收集含有純化的蛋白質(zhì)的級分并在4℃用蒸餾水透析。
SPKR4NL1-2結(jié)合質(zhì)粒DNASPKR4NL1-2的DNA結(jié)合活性在DNA阻滯分析中評價。當與質(zhì)粒DNA混和時，SPKR4NL1-2降低DNA在電泳條件下通過瓊脂糖凝膠的遷移率，表明所述肽已經(jīng)結(jié)合DNA并降低其電荷/質(zhì)量比(圖5A)。
SPKR4NL1-2結(jié)合并濃縮DNA的能力也通過測定當插入的溴化乙錠被取代時熒光的猝滅而鑒定。在N/P比率為大約10時熒光急劇下降表明DNA濃縮需要的SPKR4NL1-2量(圖5B)。溴化乙錠取代分析與DNA阻滯分析的結(jié)果相似。
然而，原子力顯微鏡分析表明所述肽僅部分濃縮質(zhì)粒DNA(結(jié)果未示出)。當加入PEI600(N/P比率為5)時，形成緊密的納米顆粒(圖5D)。
SPKR4NL1-2增強聚陽離子介導的基因送遞至PC12細胞只是由SPKR4NL1-2和DNA組成的復合物具有相對弱的轉(zhuǎn)染效率，但是加入聚陽離子聚合物充分濃縮DNA產(chǎn)生了有效的基因送遞系統(tǒng)。根據(jù)其DNA濃縮能力和低背景轉(zhuǎn)染效率，選擇PEI600和低分子量聚L賴氨酸(PLL，MW 1000)。在48孔平板中，將PC12細胞用含有0.25μg pCAGluc報道質(zhì)粒、PEI600或PLL(N/P為5)及各種量的SPKR4NL1-2的三重復合物轉(zhuǎn)染。將所述蛋白質(zhì)加入于Opti-MEM培養(yǎng)基中的DNA中，在室溫溫育30分鐘，之后加入聚陽離子并將混合物進一步溫育30分鐘。含有PLL的復合物還使用氯喹。
圖6A示出PEI600介導的基因轉(zhuǎn)移通過增加SPKR4NL1-2的量而顯著增強。使用最高量SPKR4NL1-2的轉(zhuǎn)基因表達比單獨使用PEI600的轉(zhuǎn)基因表達高5000倍。相似地，對于PLL介導的基因送遞，使用最佳量的SPKR4NL1-2的轉(zhuǎn)染效率比無SPKR4NL1-2的轉(zhuǎn)染效率高1000倍(圖6B)。
SPKR4NL1-2介導的基因送遞是NGF受體特異性的為確定SPKR4NL1-2介導的基因送遞是否是TrkA特異性的，我們研究了在用SPKR4NL1-2/DNA/PEI600復合物轉(zhuǎn)染期間加入NGF(200ng/ml)的作用。從圖7可見加入NGF明顯降低SPKR4NL1-2/DNA/PEI600的轉(zhuǎn)染效率。然而，當用對照的合成肽(SPKR)4代替SPKR4NL1-2時，NGF預處理無顯著作用。由于NGF是SPKR4NL1-2-介導的基因送遞的競爭性抑制劑，因此可推斷SPKR4NL1-2的作用是定向及受體特異性的。同樣，(SPKR)4與SPKR4NL1-2組之間的差異表明使用含有NGF的環(huán)L1和L2的多肽導致基因表達增加1400倍。
SPKR4NL1-2特異性介導基因送遞至原代神經(jīng)元培養(yǎng)物對于分離自20天齡大鼠胚胎的表達TrkA的皮質(zhì)神經(jīng)元和TrkA缺乏的神經(jīng)膠質(zhì)細胞的原代培養(yǎng)物也測試了SPKR4NL1-2對PEI600介導的基因送遞的作用。將48孔平板中皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞用含有0.25μg/孔pCAGluc和肽(N/P比率為5)的SPKR4NL1-2/PEI600/DNA或(SPKR)4/PEI600/DNA復合物轉(zhuǎn)染。所述復合物是在Opti-MEM培養(yǎng)基中通過向DNA中加入SPKR4NL1-2、等待30分鐘、加入PEI600、在室溫再溫育30分鐘而形成的。
圖8示出單獨通過PEI600的基因送遞在神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞中可忽略不計。當將對照肽(SPKR)4加入所述復合物中時，額外的DNA濃縮能力在這兩種類型細胞中均增強轉(zhuǎn)基因表達，但在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中影響高于在神經(jīng)元中。然而，含有SPKR4NL1-2的三重復合物在神經(jīng)元中效力比(SPKR)4三重復合物高9倍，而在神經(jīng)膠質(zhì)細胞中SPKR4NL1-2與(SPKR)4之間基本無差異。
SPKR4NL1-2介導基因送遞至背根神經(jīng)節(jié)為評價在體內(nèi)SPKR4NL1-2介導的轉(zhuǎn)染效率，將基因送遞復合物經(jīng)鞘內(nèi)注射進Wistar大鼠的腰部。所述復合物是在5％葡萄糖中以上述順序形成的，用20μl體積的4μg pCAGluc、PEI600(N/P比率為5)及32nmol肽注射每只大鼠。3天后解剖含有表達TrkA的神經(jīng)元的腰部DRG，分析螢光素酶活性。SPKR4NL1-2/PEI600/pCAGluc復合物所致轉(zhuǎn)基因表達是PEI600/pCAGluc對照組的9倍(圖9)。
實施例4SPKR4BL1-2的設(shè)計嵌合蛋白SPKR4BL1-2(SEQ ID NO8)的設(shè)計與SPKR4NL1-2相似，其中定向結(jié)構(gòu)域通過摻入BDNF而不是NGF的環(huán)1和環(huán)2被改變，從而結(jié)合TrkB。這個定向結(jié)構(gòu)域由一個Cys殘基后接人BDNF的第22-74位氨基酸組成，由此與BDNF的C65形成分子內(nèi)二硫鍵。所述二硫鍵和環(huán)-側(cè)翼β折疊用于穩(wěn)定受體結(jié)合環(huán)的構(gòu)象。在C末端的定向結(jié)構(gòu)域與N末端附近的(SPKR)4DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域被一個α-螺旋接頭TYLSEDELKAAEAAFKRHNPT間隔。
質(zhì)粒構(gòu)建在構(gòu)建編碼SPKR4NL1-2的質(zhì)粒期間，產(chǎn)生含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和α-螺旋接頭的編碼序列的中間質(zhì)粒pET16-SPKR4linker。恰位于接頭序列3’端的獨特的BamHI限制位點使得定向結(jié)構(gòu)域插入。使用引物D3-a和D3-b(SEQ ID NO27和28)，從攜帶克隆自人腦cDNA文庫(Clontech)的BDNF基因的質(zhì)粒中擴增編碼BDNF的環(huán)1和2的序列。這個引物對在每一端均導入BamHI位點以符合讀框地連接進pET16-SPKR4linker。檢測所得構(gòu)建體的正確插入方向并送出進行序列確認。pET16-SPKR4BL1-2的編碼序列如SEQ ID NO29所示。
蛋白質(zhì)表達和純化將攜帶pET16-SPKR4BL1-2質(zhì)粒的大腸桿菌菌株BL21(DE3)pLysS在37℃在搖瓶中的LB培養(yǎng)基(含有50μg/ml氨芐青霉素和34μg/ml氯霉素)中培養(yǎng)直至光密度達到0.7。在等待15分鐘使培養(yǎng)瓶冷卻后將培養(yǎng)瓶移至室溫搖床并用1mM IPTG誘導。隨后細菌通過離心90分鐘沉淀并冷凍。將細胞解凍并在1/10培養(yǎng)體積的具有無EDTA的蛋白酶抑制劑(Roche Applied Science，Penzberg，Germany)的50mM Na2HPO4、1M NaCl、10mM咪唑、0.1％TritonX-100、pH 8.0中裂解。將裂解物超聲處理直至不再粘性并通過離心澄清。SPKR4BL1-2通過在KTAexplorer FPLC(AmershamBiosciences)上經(jīng)鎳螯合親和層析從上清中純化。對于1.6L培養(yǎng)物，將4ml Ni-NTA Superflow(Qiagen，Hilden，Germany)樹脂在50mMNa2HPO4、0.3M NaCl、10mM咪唑、pH 8.0中平衡，通過增加咪唑濃度進行洗滌和洗脫。收集含有純化的蛋白質(zhì)的級分，在4℃用蒸餾水透析并濃縮。
SPKR4BL1-2結(jié)合并濃縮DNASPKR4BL1-2結(jié)合DNA的能力通過DNA阻滯分析檢測。圖10A示出在N/P比率為2(等于0.8nmol/μg DNA)時，SPKR4BL1-2能完全阻止DNA電泳遷移。原子力顯微鏡分析(圖10B-10D)也表明N/P比率為10時，SPKR4BL1-2能將質(zhì)粒DNA濃縮為直徑200nm以下的粒子。
SPKR4BL1-2介導基因送遞至皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞由于沒有可商購的表達TrkB的細胞系，因此在體外測試SPKR4BL1-2對得自20天齡大鼠胚胎皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)物的轉(zhuǎn)染能力。熟知皮質(zhì)神經(jīng)元表達全長TrkB受體。長期以來認為星形膠質(zhì)細胞僅表達TrkB的截短異構(gòu)體，但Climent et al.(Neurosci.Letters 2000；28853-56)示出其也表達一些全長TrkB。
將48孔平板中的皮質(zhì)神經(jīng)元用SPKR4BL1-2/PEI600/DNA復合物轉(zhuǎn)染，所述復合物含有每孔0.25μgpCAGluc。所述復合物是在5％葡萄糖中通過向DNA中加入SPKR4BL1-2、等待30分鐘、加入PEI600、并在室溫再溫育30分鐘而產(chǎn)生的。對于N/P比率固定為10的PEI600，增加SPKR4BL1-2的量顯著增加轉(zhuǎn)基因表達，在所用最高比率可達到500倍(圖11A)。也表明PEI600對于有效轉(zhuǎn)染不是必需的。
在對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的實驗中，不使用三重復合物。將0.25μg/孔pCAGluc與SPKR4BL1-2或PEI600復合(不是與這兩者同時復合)。當使用更多的SPKR4BL1-2時，基因送遞愈加有效，轉(zhuǎn)基因表達達到裸DNA的180倍，及達到PEI600/DNA的50倍(圖11B)。
實施例55.1NL4-10K激活TrkA及其信號傳導途徑NGF結(jié)合并誘導TrkA的磷酸化，其反過來激發(fā)信號傳導級聯(lián)(signal cascades)產(chǎn)生NGF的生物活性。所包含的蛋白質(zhì)包括Erk1和Erk2、部分Ras-MAP激酶途徑、及Akt，Akt在細胞存活中起重要作用(Sofroniew et al.，Annu.Rev.Neurosci.2001；241217-281)。在用5μM NL4-10K或NL4處理20分鐘的PC12細胞中TrkA、Erk1、Erk2和Akt的激活通過使用特異性識別磷酸化異構(gòu)體的抗體進行免疫印跡而檢測。如圖12A所示，NL4和NL4-10K處理誘導TrkA、Erk1和Erk2、及Akt激活。另外，當與DNA復合時，NL4-10K保留其活性。
為進一步評價NL4(加入或不加入10K)通過TrkA起作用的假說，使用兩種抑制劑K-252a和AG879阻斷TrkA蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性。正如所期望的，用這些抑制劑預處理顯著降低NL4-和NL4-10K誘導的Erk1和Erk2的磷酸化程度(圖12B)。這些生物化學分析表明NL4(有或無10K結(jié)構(gòu)域)可通過TrkA起作用以激活與NGF激活的相同的一些信號轉(zhuǎn)導途徑。
5.2NL4-10K促進撤除血清的PC12細胞存活NGF的促進存活的生物活性的一個表現(xiàn)是其促進在無血清培養(yǎng)基中生長的PC12細胞的存活，否則此生長條件導致細胞生存能力喪失。將分化的PC12細胞在含有各種濃度NL4或NL4-10K的無血清培養(yǎng)基中生長。將通過MTT分析測定的細胞存活率與NGF(10ng/ml，最佳濃度)促進的存活率相對比。在0.125-2.5μM濃度范圍內(nèi)，增加的NL4濃度導致細胞存活率增加至最佳NGF促進的存活率的68-109％(圖13)。對于NL4-10K在0.125-5μM之間觀測到相似的劑量響應。
5.3SPKR4NL1-2激活TrkA及其信號傳導途徑將6孔平板中的PC12細胞用濃度為1-8μM的SPKR4NL1-2處理15分鐘。在所有這些濃度，SPKR4NL1-2誘導比8μM的(SPKR)4對照肽誘導的更高水平的Erk1和Erk2激活(圖14B)。為示出Erk激活是通過TrkA磷酸化特異性發(fā)生的，將細胞用K-252a TrkA酪氨酸激酶抑制劑預處理以觀測Erk磷酸化是否降低。圖14C示出由8μMSPKR4NL1-2誘導的Erk磷酸化降低，并且最終隨著K-252a濃度增加而消除。
5.4SPKR4NL1-2促進PC12細胞中神經(jīng)突生長應答NGF，PC12細胞停止增殖并分化為交感神經(jīng)元樣細胞。在NGF處理的2-3天內(nèi)，可以見到細胞形態(tài)改變和神經(jīng)突從細胞突出。我們測試了SPKR4NL1-2以觀察其是否也促進PC12細胞中神經(jīng)突生長。將所述細胞用8μM(SPKR)4或SPKRR4NL1-2處理3天。對比(SPKR)4處理的細胞(圖15A)與SPKR4NL1-2處理的細胞(圖15B)的照片，可以看出SPKR4NL 1-2具有NGF樣生物活性并促進神經(jīng)突生長。
5.5SPKR4NL1-2促進撤除血清的PC12細胞存活我們還評價了SPKR4NL1-2促進撤除了血清和NGF3天的PC12細胞的存活能力。向無血清培養(yǎng)基中加入SPKR4NL1-2(8μM)使PC12存活率保持在由20ng/ml NGF促進的最大存活率的80％(圖15C)。所述存活促進作用在2-8μM SPKR4NL1-2范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量響應趨勢。
序列表<110>新加坡科技研究局<120>用于神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體介導的基因送遞及作為神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑的重組多肽<130>93231-8<160>31<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>119<212>PRT<213>Nerve growth factor(NGF)from human<400>1Ser Ser Ser His Pro Ile Phe His Arg Gly Glu Phe Ser Val Cys Asp1 5 10 15Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys20 25 30Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val35 40 45Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val50 55 60Asp Ser Gly Cys Arg Gly Ile Asp Ser Lys His Trp Asn Ser Tyr Cys65 70 75 80Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys Gln85 90 95Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Val Leu100 105 110Ser Arg Lys Ala Val Arg Arg115<210>2<211>126<212>PRT<213>Brain-derived neurotrophic factor(BDNF)from human
<400>2His Ser Asp Pro Ala Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu1 5 10 15Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys20 25 30Lys Thr Ala Val Asp Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys35 40 45Val Pro Val Ser Lys Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys50 55 60Cys Asn Pro Met Gly Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys65 70 75 80Arg His Trp Asn Ser Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala85 90 95Leu Thr Met Asp Ser Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile100 105 110Asp Thr Ser Cys Val Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg115 120 125<210>3<211>119<212>PRT<213>Neurotrophin 3(NT3)from human<400>3Tyr Ala Glu His Lys Ser His Arg Gly Glu Tyr Ser Val Cys Asp Ser1 5 10 15Glu Ser Leu Trp Val Thr Asp Lys Ser Ser Ala Ile Asp Ile Arg Gly20 25 30His Gln Val Thr Val Leu Gly Glu Ile Lys Thr Gly Asn Ser Pro Val35 40 45Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Arg Cys Lys Glu Ala Arg Pro Val Lys50 55 60
Asn Gly Cys Arg Gly Ile Asp Asp Lys His Trp Asn Ser Gln Cys Lys65 70 75 80Thr Ser Gln Thr Tyr Val Arg Ala Leu Thr Ser Glu Asn Asn Lys Leu85 90 95Val Gly Trp Arg Trp Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val Cys Ala Leu100 105 110Ser Arg Lys Ile Gly Arg Thr115<210>4<211>130<212>PRT<213>Neurotrophin 4/5(NT4/5)from human<400>4Gly Val Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Val1 5 10 15Cys Asp Ala Val Ser Gly Trp Val Thr Asp Arg Arg Thr Ala Val Asp20 25 30Leu Arg Gly Arg Glu Val Glu Val Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Gly35 40 45Gly Ser Pro Leu Arg Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Arg Cys Lys Ala Asp50 55 60Asn Ala Glu Glu Gly Gly Pro Gly Ala Gly Gly Gly Gly Cys Arg Gly65 70 75 80Val Asp Arg Arg His Trp Val Ser Glu Cys Lys Ala Lys Gln Ser Tyr85 90 95Val Arg Ala Leu Thr Ala Asp Ala Gln Gly Arg Val Gly Trp Arg Trp100 105 110Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Val Cys Thr Leu Leu Ser Arg Thr Gly115 120 125Arg Ala130
<210>5<211>39<212>PRT<213>artificial<220>
<223>NL4-10K<220>
<223>residues 1-29 correspond to residues 80-108 of nerve growth factor(NGF)and include loop 4 a known receptor binding region<220>
<223>C1 and C29 form a disulfide bridge<220>
<223>residues 30-39 form a nucleic acid binding domain<400>5Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Lys Lys Lys20 25 30Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys35<210>6<211>297<212>PRT<213>artificial<220>
<223>DsbC-NL4-10K<220>
<223>residues 1-236DsbC<220>
<223>residues 244-249His6 tag<220>
<223>residues 259-297NL4-10K<400>6Met Lys Lys Gly Phe Met Leu Phe Thr Leu Leu Ala Ala Phe Ser Gly1 5 10 15
Phe Ala Gln Ala Asp Asp Ala Ala Ile Gln Gln Thr Leu Ala Lys Met20 25 30Gly Ile Lys Ser Ser Asp Ile Gln Pro Ala Pro Val Ala Gly Met Lys35 40 45Thr Val Leu Thr Asn Ser Gly Val Leu Tyr Ile Thr Asp Asp Gly Lys50 55 60His Ile Ile Gln Gly Pro Met Tyr Asp Val Ser Gly Thr Ala Pro Val65 70 75 80Asn Val Thr Asn Lys Met Leu Leu Lys Gln Leu Asn Ala Leu Glu Lys85 90 95Glu Met Ile Val Tyr Lys Ala Pro Gln Glu Lys His Val Ile Thr Val100 105 110Phe Thr Asp Ile Thr Cys Gly Tyr Cys His Lys Leu His Glu Gln Met115 120 125Ala Asp Tyr Asn Ala Leu Gly Ile Thr Val Arg Tyr Leu Ala Phe Pro130 135 140Arg Gln Gly Leu Asp Ser Asp Ala Glu Lys Glu Met Lys Ala Ile Trp145 150 l55 160Cys Ala Lys Asp Lys Asn Lys Ala Phe Asp Asp Val Met Ala Gly Lys165 170 175Ser Val Ala Pro Ala Ser Cys Asp Val Asp Ile Ala Asp His Tyr Ala180 185 190Leu Gly Val Gln Leu Gly Val Ser Gly Thr Pro Ala Val Val Leu Ser195 200 205Asn Gly Thr Leu Val Pro Gly Tyr Gln Pro Pro Lys Glu Met Lys Glu210 215 220Phe Leu Asp Glu His Gln Lys Met Thr Ser Gly Lys Gly Ser Thr Ser225 230 235 240Gly Ser Gly His His His His His His Ser Ala Gly Leu Val Pro Arg
245 250 255Gly Ser Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp260 265 270Gly Lys Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys Lys275 280 285Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys290 295<210>7<211>115<212>PRT<213>artificial<220>
<223>SPKR4NL1-2<220>
<223>residues 3-12His10 tag<220>
<223>residues 23-38(SPKR)4 DNA-binding domain<220>
<223>residues 41-61alpha-helical linker<220>
<223>residues 65-115 correspond to aa 17-67 of human NGF，includingloops 1 and 2 and the flanking beta-sheet sequences<220>
<223>C64 and C106 form a disulfide bridge<400>7Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His1 5 10 15Ile Glu Gly Arg His Met Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro20 25 30Lys Arg Ser Pro Lys Arg Gly Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Leu35 40 45Lys Ala Ala Glu Ala Ala Phe Lys Arg His Asn Pro Thr Gly Ser Cys50 55 60
Ser Val Ser Val Trp Val Gly Asp Lys Thr Thr Ala Thr Asp Ile Lys65 70 75 80Gly Lys Glu Val Met Val Leu Gly Glu Val Asn Ile Asn Asn Ser Val85 90 95Phe Lys Gln Tyr Phe Phe Glu Thr Lys Cys Arg Asp Pro Asn Pro Val100 105 110Asp Ser Gly115<210>8<211>117<212>PRT<213>artificial<220>
<223>SPKR4BL1-2<220>
<223>residues 3-12His10 tag<220>
<223>residues 23-38(SPKR)4 DNA-binding domain<220>
<223>residues 41-61alpha-helical linker<220>
<223>residues 65-117 correspond to aa 22-74 of human BDNF，includingloops 1 and 2 and the flanking beta-sheet sequences<220>
<223>C64 and C108 form a disulfide bridge<400>8Met Gly His His His His His His His His His His Ser Ser Gly His15 10 15Ile Glu Gly Arg His Met Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro20 25 30Lys Arg Ser Pro Lys Arg Gly Gly Thr Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Leu35 40 45Lys Ala Ala Glu Ala Ala Phe Lys Arg His Asn Pro Thr Gly Ser Cys50 55 60
Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp65 70 75 80Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys85 90 95Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly100 105 110Tyr Thr Lys Glu Gly115<210>9<211>29<212>PRT<213>Nerve growth factor(NGF)from human<400>9Cys Thr Thr Thr His Thr Phe Val Lys Ala Leu Thr Met Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Ala Ala Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ala Cys20 25<210>10<211>10<212>PRT<213>artificial<220>
<223>artificial sequencelysine 10<400>10Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys1 5 10<210>11<211>16<212>PRT<213>ARTIFICIAL<220>
<223>artificial sequenceSPKR4<400>11Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg Ser Pro Lys Arg
1 5 10 15<210>12<211>18<212>DNA<213>artificial<220>
<223>forward primer for NL4-10K<400>12tgtaccacga ctcacacc 18<210>13<211>59<212>DNA<213>artificial<220>
<223>reverse primer for NL4-10K<400>13gcaagctttc attttttttt tttttttttt tttttttttt tacaggccgt atctatccg 59<210>14<211>894<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Coding sequence for DsbC-NL4-10K<400>14atgaagaaag gttttatgtt gtttactttg ttagcggcgt tttcaggctt tgctcaggct 60gatgacgcgg caattcaaca aacgttagcc aaaatgggca tcaaaagcag cgatattcag120cccgcgcctg tagctggcat gaagacagtt ctgactaaca gcggcgtgtt gtacatcacc180gatgatggta aacatatcat tcaggggcca atgtatgacg ttagtggcac ggctccggtc240aatgtcacca ataagatgct gttaaagcag ttgaatgcgc ttgaaaaaga gatgatcgtt300tataaagcgc cgcaggaaaa acacgtcatc accgtgttta ctgatattac ctgtggttac360tgccacaaac tgcatgagca aatggcagac tacaacgcgc tggggatcac cgtgcgttat420cttgctttcc cgcgccaggg gctggacagc gatgcagaga aagaaatgaa agctatctgg480tgtgcgaaag ataaaaacaa agcgtttgat gatgtgatgg caggtaaaag cgtcgcacca540gccagttgcg acgtggatat tgccgaccat tacgcacttg gcgtccagct tggcgttagc600ggtactccgg cagttgtgct gagcaatggc acacttgttc cgggttacca gccgccgaaa660
gagatgaaag aatttctcga cgaacaccaa aaaatgacca gcggtaaagg atcaactagt720ggttctggtc atcaccatca ccatcactcc gcgggtctgg tgccacgcgg tagttgtacc780acgactcaca cctttgtcaa ggcgctgacc atggatggca agcaggctgc ctggcggttt840atccggatag atacggcctg taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa atga 894<210>15<211>59<212>DNA<213>artificial<220>
<223>First of three long oligonucleotides used in assembly of asequence encoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>15cgcagtacta gtccgaaacg cagcccgaaa cgtagcccaa agcgtagccc gaagcgtgg59<210>16<211>59<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Second of three long oligonucleotides used in assembly of asequence encoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>16cggtacctac ctgtctgaag atgagctgaa agcggcggag gcggcattca aacgtcaca59<210>17<211>57<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Third of three long oligonucleotides used in assembly of asequence encoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>17acccgactgg atccggttgt gtgcctgtgt ctaaaggtca actgtgctaa gcttggc57<210>18<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>First bridging oligonucleotide used in assembly of a sequenceencoding(SPKR)4 and an a-helix linker
<400>18gtaggtaccg ccacgcttcg20<210>19<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Second bridging oligonucleotide used in assembly of a sequenceencoding(SPKR)4 and an a-helix linker<400>19ccagtcgggt tgtgacgttt20<210>20<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>20cgcagtacta gcccgaaacg20<210>21<211>20<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>21gccaagctta gcacagttga20<210>22<211>25<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>22ccagacatat gagtccgaaa cgcag 25<210>23<211>20<212>DNA
<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>23ccggatccag tcgggttgtg20<210>24<211>26<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>24ctggatcctg cagtgtcagc gtgtgg 26<210>25<211>24<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>25atggatcctc acccgctgtc aacg 24<210>26<211>348<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Coding sequence of SPKR4NL1-2<400>26atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgaaggtcgt60catatgagtc cgaaacgcag cccgaaacgt agcccaaagc gtagcccgaa gcgtggcggt 120acctacctgt ctgaagatga gctgaaagcg gcggaggcgg cattcaaacg tcacaacccg 180actggatcct gcagtgtcag cgtgtgggtt ggggataaga ccaccgccac agacatcaag 240ggcaaggagg tgatggtgtt gggagaggtg aacattaaca acagtgtatt caaacagtac 300ttttttgaga ccaagtgccg ggacccaaat cccgttgaca gcgggtga348<210>27<211>31
<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>27ctggatcctg cagtattagt gagtgggtaa c 31<210>28<211>29<212>DNA<213>artificial<220>
<223>artificial primer<400>28atggatcctc agccttcttt tgtgtaacc 29<210>29<211>354<212>DNA<213>artificial<220>
<223>Coding sequence for SPKR4BL1-2<400>29atgggccatc atcatcatca tcatcatcat catcacagca gcggccatat cgaaggtcgt 60catatgagtc cgaaacgcag cccgaaacgt agcccaaagc gtagcccgaa gcgtggcggt120acctacctgt ctgaagatga gctgaaagcg gcggaggcgg cattcaaacg tcacaacccg180actggatcct gcagtattag tgagtgggta acggcggcag acaaaaagac tgcagtggac240atgtcgggcg ggacggtcac agtccttgaa aaggtccctg tatcaaaagg ccaactgaag300caatacttct acgagaccaa gtgcaatccc atgggttaca caaaagaagg ctga 354<210>30<211>21<212>PRT<213>artificial<220>
<223>H1 alpha helix<400>30Thr Tyr Leu Ser Glu Asp Glu Leu Lys Ala Ala Glu Ala Ala Phe Lys1 5 10 15
Arg His Asn Pro Thr20<210>31<211>120<212>DNA<213>artificial<220>
<223>NL4-10K coding sequence<400>31tgtaccacga ctcacacctt tgtcaaggcg ctgaccatgg atggcaagca ggctgcctgg 60cggtttatcc ggatagatac ggcctgtaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaatga120
權(quán)利要求
1.一種重組多肽，其包含一種細胞定向元件和一種核酸結(jié)合元件，其中所述細胞定向元件是選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序。
2.權(quán)利要求1的多肽，其中所述細胞定向元件是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白的發(fā)夾基序或其功能等價物。
3.權(quán)利要求2的多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白是神經(jīng)生長因子(NGF)、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(NT3)或神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5(NT4/5)。
4.權(quán)利要求1-3任一項的多肽，其包含a)人NGF(SEQ ID NO1)的第26-38位、第41-49位、第17-57位、第69-79位或第81-107位氨基酸；b)人BDNF(SEQ ID NO2)的第33-45位、第48-56位、第22-64位、第76-86位或第88-115位氨基酸；c)人NT3(SEQ ID NO3)的第25-37位、第40-48位、第16-56位、第68-78位或第80-107位氨基酸；d)人NT4/5(SEQ ID NO4)的第28-40位、第43-52位、第19-60位、第79-89位或第91-118位氨基酸；或者其功能等價物。
5.權(quán)利要求1-4任一項的多肽，其中所述神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體是TrkA、TrkB、TrkC或P75NTR。
6.權(quán)利要求5的多肽，其中所述受體是TrkA。
7.權(quán)利要求1-6任一項的多肽，其包含人NGF(SEQ ID NO1)的第17-67位氨基酸、人NGF(SEQ ID NO1)的第80-108位氨基酸、或者人BDNF(SEQ ID NO2)的第22-64位氨基酸。
8.權(quán)利要求1-7任一項的多肽，其中所述核酸結(jié)合元件是DNA結(jié)合元件。
9.權(quán)利要求8的多肽，其中所述DNA結(jié)合元件是非特異性DNA結(jié)合元件。
10.權(quán)利要求8或9的多肽，其中所述DNA結(jié)合元件是帶正電荷的。
11.權(quán)利要求10的多肽，其中所述非特異性DNA結(jié)合元件是(SPKR)4結(jié)構(gòu)域或者聚L-賴氨酸。
12.權(quán)利要求11的多肽，其中所述聚L-賴氨酸是十-L-賴氨酸。
13.權(quán)利要求1-12任一項的多肽，其進一步包含在所述發(fā)夾基序的氨基和羧基末端的半胱氨酸。
14.權(quán)利要求1-13任一項的多肽，其包含在所述核酸結(jié)合元件與所述細胞定向元件之間的一個接頭序列。
15.權(quán)利要求1-14任一項的多肽，其包含SEQ ID NO5、SEQ IDNO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示序列。
16.權(quán)利要求7-14任一項的多肽，其是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑。
17.權(quán)利要求16的多肽，其包含SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ ID NO7或SEQ ID NO8所示序列。
18.編碼權(quán)利要求1-17任一項的重組多肽的重組核酸分子。
19.權(quán)利要求18的重組核酸分子，其中所述核酸是DNA。
20.權(quán)利要求19的重組核酸，其包含SEQ ID NO14、SEQ IDNO26、SEQ ID NO29或SEQ ID NO31所示序列。
21.權(quán)利要求18-20任一項的重組核酸分子，其是一種表達載體。
22.一種包含核酸和權(quán)利要求1-17任一項的重組多肽的組合物。
23.權(quán)利要求22的組合物，其中所述核酸是DNA。
24.權(quán)利要求23的組合物，其中所述DNA包含一種編碼基因序列。
25.權(quán)利要求24的組合物，其中所述編碼基因序列是一種治療性基因序列。
26.權(quán)利要求22-25任一項的組合物，其進一步包含一種陽離子聚合物。
27.權(quán)利要求26的組合物，其中所述陽離子聚合物是聚賴氨酸、聚乙烯亞胺或魚精蛋白。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的重組多肽，其包含一種核酸結(jié)合元件及與一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體結(jié)合的發(fā)夾基序。所述重組多肽可用于與其結(jié)合的核酸，包括治療性DNA的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體介導的送遞。在一個實施方案中，所述發(fā)夾基序是神經(jīng)營養(yǎng)蛋白如神經(jīng)生長因子、腦衍生神經(jīng)營養(yǎng)因子、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白4/5的發(fā)夾基序。所述發(fā)夾基序也是一種神經(jīng)營養(yǎng)蛋白激動劑，因此可用于治療對神經(jīng)營養(yǎng)蛋白治療有反應的任何疾病，如神經(jīng)系統(tǒng)疾病和腫瘤。在一個實施方案中，所述激動劑包含一種選擇性結(jié)合神經(jīng)營養(yǎng)蛋白受體的發(fā)夾基序及一種據(jù)信通過與帶負電的細胞膜結(jié)合而增強受體結(jié)合的帶正電的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。
文檔編號A61K38/12GK1852980SQ200480024797
公開日2006年10月25日 申請日期2004年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月28日
發(fā)明者王朔, 吳珊珊, 曾潔銘, 馬楠 申請人:新加坡科技研究局