專利名稱：一種新的真菌蛋白及其編碼核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的具有獨(dú)特催化性質(zhì)的多肽酶及其編碼核酸。具體的是，本發(fā)明涉及一種編碼新的亮氨酸氨肽酶和其他氨基或羧基多肽酶的核酸，本發(fā)明中特指為EXOX，還包括載體、宿主細(xì)胞、抗體，以及制造所述核酸和多肽酶的重組方法。所述基因可以從以下兩種真菌中得到紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus)。
背景技術(shù)：
細(xì)菌、酵母和絲狀菌，還有些特殊的植物細(xì)胞，無脊椎動物和脊椎動物都會表達(dá)一種有利用吸收氨基酸、二肽或三肽的膜蛋白(Lubkowitz，等，Microbiology 143387-396(1997)；Hauser等，Mol.Membr.Biol.18(1)105-112(2001)；Stacey等，Trends PlantSci.7(6)257-263(2002)；Rubio-Aliaga & Daniel，Trends Pharmacol.Sci.23(9)434-440(2002)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如在酵母、絲狀菌和植物細(xì)胞的，也能吸收大的寡肽(4-5個氨基酸)。在食品發(fā)酵工業(yè)中，早已證明微生物參與了蛋白被消化成氨基酸的過程。細(xì)菌屬的乳酸菌(Lactobacillus)(O’Cuinn等，Biochem.Soc.Trans.27(4)730-734(1999))和真菌屬的曲霉菌(Aspergillus)(Doumas等，Appl.Enviorn.Microbiol.644809-4815(1998))分泌內(nèi)部和外部蛋白酶，對蛋白消化很有用。
氨基多肽酶的活性，也能在真菌被感染時發(fā)揮作用，早已證實(shí)通過(De Bersaques &Dockx，Arch.Belg.Dermatol.Syphiligr.29135-140(1973)；Danew & Friedrich，Mykosen 23502-511(1980))菌絲體和培養(yǎng)基，然而，還沒有氨基多肽酶或羧基多肽酶從皮膚真菌中分離并表征過。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于一種分離的多肽的發(fā)明，所述多肽為含有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的成熟多肽。本發(fā)明同時提供一種分離的含有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的多肽，以及含有與上述序列具有90％同源性序列的分離多肽，所述多肽具有氨肽酶或羧肽酶活性。其中，所述多肽是亮氨酸氨肽酶中，如ruLAP2。
本發(fā)明另一方面提供含有一個或多個替換的保守氨基酸的分離多肽，所述多肽也具有氨肽酶活性。
本發(fā)明同時包括自然發(fā)生的等位突變的選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的多肽。所述等位突變包括轉(zhuǎn)錄氨基酸序列的核酸序列有一個或多個核苷酸不同于選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列。在可選序列中任意的氨基酸變化的突變多肽是由保守替換提供的。
本發(fā)明同時提供一種從多肽去除特定氨基酸的方法，例如從重組蛋白去除標(biāo)簽，其中具有去除氨基酸活性的多肽含有至少與選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列90％同源性序列的多肽，或具有類似功能的多肽。
本發(fā)明所述的任一多肽均可天然產(chǎn)生。進(jìn)一步，所述多肽可以包含在含有試劑的組合物中，所述組合物可用在含一個或多個試劑的試劑盒里。
本發(fā)明同時提供一種含有所述多肽的皮膚真菌。例如，適合的真菌包括絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)、奧杜盎小孢子菌(Microsporum audouinii)、鐵銹色小孢子菌(Microsporum ferrugineum)、同心性毛癬菌(Trichophyton concentricum)、卡那毛癬菌(Trichophyton kanei)、麥格尼氏發(fā)癬菌(Trichophyton megninii)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、羅比特斯克毛癬菌(Trichophytonraubitschekii)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭氏毛癬菌(Trichophytonschoenleinii)、蘇丹毛癬菌(Trichophyton soudanense)、斷發(fā)毛癬菌(Trichophytontonsurans)、紫色毛癬菌(Trichophyton violaceum)、楊德氏發(fā)癬菌(Trichophytonyaoundei)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、馬類小孢子菌(Microsporum equinum)、豬小孢子菌(Microsporum nanum)、桃色小孢子菌(Microsporum persicolor)、馬發(fā)癬菌(Trichophyton equinum)、猴類毛癬菌(Trichophyton simii)、疣狀毛癬菌(Trichophyton verrucosum)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、阿耶羅毛癬菌(Trichophyton ajelloi)和土生毛癬菌(Trichophyton terrestre)。
本發(fā)明同時提供一種含有本發(fā)明所述多肽的微生物培養(yǎng)上清夜。
本發(fā)明同時提供一種制備治療相關(guān)病理的人類疾病藥物中的應(yīng)用，所述的治療包括本發(fā)明所述的多肽以及選擇與本發(fā)明所述多肽相關(guān)的病理特征的疾病。
本發(fā)明同時提供一種降解多肽底物的方法。所述方法包括將多肽底物與分離的一種或多種本發(fā)明多肽接觸。其中，多肽底物可以是一個全長的蛋白。進(jìn)一步的說，其中一種或多種分離的多肽可以有序的分解多肽底物。所述的多肽底物可以是變性的酪蛋白、麩朊、谷朊、小牛血清蛋白或功能類似物。其中，分離的多肽優(yōu)選為亮氨酸氨肽酶中的ruLAP2。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種驗(yàn)證具有潛在治療真菌感染的治療物質(zhì)的方法，其中所述真菌感染與本發(fā)明所述的多肽表達(dá)異?；蚺c其異常的生理作用相關(guān)。所述方法包括提供一種能表達(dá)所述多肽且具有所述多肽特性或功能的細(xì)胞，然后將包含候選物質(zhì)的組合物與上述細(xì)胞接觸，再檢測候選物質(zhì)是否引起所述多肽功能特性的改變。其中，當(dāng)在有候選物質(zhì)存在時觀察到改變，而在含有候選物質(zhì)組合物的細(xì)胞接觸時同樣的改變沒有出現(xiàn)，那么該物質(zhì)被證明具有潛在的治療用途。其中，所述功能性特征是多肽具有氨肽酶或羧肽酶活性的特征。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療哺乳動物疾病的方法，所述方法包括向動物給予一定量的多肽，使其病證減輕。特別的是，其中所述多肽為含有的氨基酸序列為選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示至少有90％同源的序列的多肽，或其具有活性片段的多肽。所述的治療病證包括真菌感染、腹部疾病、消化道吸收不良、口炎性腹瀉、過敏反應(yīng)和酶不足。優(yōu)選的，其中所述的過敏反應(yīng)是對麩質(zhì)過敏。
本發(fā)明另外提供一種治療哺乳動物疾病的方法，所述方法包括向動物給予一定量的蛋白酶抑制劑，使其病證減輕。其中所述蛋白酶抑制劑為含有的氨基酸序列為選自SEQ IDNOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示至少有90％同源的序列的多肽，或其具有活性片段的多肽。例如，其中所述的疾病可以是真菌感染。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種分離的含有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的多肽。所述多肽被一種細(xì)胞在誘導(dǎo)表達(dá)所述多肽的環(huán)境下產(chǎn)生。在一些具體實(shí)施方案中，所述細(xì)胞含有已重組了選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示核酸序列的核苷酸分子的載體。進(jìn)一步的，所述細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明同時提供一種分離的含有選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示序列核酸序列的核苷酸分子。其中，所述核苷酸分子可以是自然存在的。
本發(fā)明同時關(guān)于一種不同于一段核苷而是含有選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示序列，且編碼成熟的具有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的多肽的核酸序列。進(jìn)一步，所述核苷酸分子可以是在在嚴(yán)格的條件下與選自下組的核酸序列雜交，所述的組由選自SEQ IDNOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、34或其互補(bǔ)序列物組成。在一些具體實(shí)施例中，所述核酸分子可以包含在載體內(nèi)，進(jìn)一步的可以包括一個與所述核酸分子功能相關(guān)的啟動子。同時也提供含有所述載體的細(xì)胞。
本發(fā)明同時提供制備本發(fā)明所述的多肽的方法。所述方法包括在誘導(dǎo)表達(dá)所述多肽的環(huán)境下培養(yǎng)一種細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中含有已重組了選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示序列的核酸分子的載體。舉某些例子，所述細(xì)胞可以是真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
本發(fā)明同時提供一種制備蛋白的方法，包括在能足夠表達(dá)所述蛋白的環(huán)境下培養(yǎng)皮膚真菌，且從所述皮膚真菌中分離出來。其中，所述的蛋白是分泌型蛋白。同樣的，所述的蛋白可以是氨肽酶或羧肽酶。特別地，所述氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，如ruLAP2。另外，所述的表皮真菌選自如下絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)、奧杜盎小孢子菌(Microsporum audouinii)、鐵銹色小孢子菌(Microsporum ferrugineum)、同心性毛癬菌(Trichophyton concentricum)、卡那毛癬菌(Trichophyton kanei)、麥格尼氏發(fā)癬菌(Trichophyton megninii)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、羅比特斯克毛癬菌(Trichophyton raubitschekii)、紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭氏毛癬菌(Trichophyton schoenleinii)、蘇丹毛癬菌(Trichophyton soudanense)、斷發(fā)毛癬菌(Trichophyton tonsurans)、紫色毛癬菌(Trichophyton violaceum)、楊德氏發(fā)癬菌(Trichophyton yaoundei)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、馬類小孢子菌(Microsporum equinum)、豬小孢子菌(Microsporum nanum)、桃色小孢子菌(Microsporumpersicolor)、馬發(fā)癬菌(Trichophyton equinum)、猴類毛癬菌(Trichophyton simii)、疣狀毛癬菌(Trichophyton verrucosum)、石膏樣小孢子菌(Microsporum gypseum)、阿耶羅毛癬菌(Trichophyton ajelloi)和土生毛癬菌(Trichophyton terrestre)。
所述產(chǎn)物蛋白可以作用于多肽底物。例如，產(chǎn)物蛋白可以降解多肽或可以有序的分解一個全長的多肽底物。優(yōu)選的，多肽底物可以是含有2-200個氨基酸的多肽。
在一些實(shí)例中，所述產(chǎn)物蛋白添加一個或多個氨基酸到多肽底物上。另一些實(shí)例中，產(chǎn)物蛋白從多肽底物去除一個或多個氨基酸，使其成為一種被修飾多肽，然后所述的產(chǎn)物蛋白有序的將一個或多個氨基酸添加到被修飾多肽，這樣形成一種含特殊氨基酸序列多肽產(chǎn)物，與原多肽底物相比。
本發(fā)明另外提供一種治療真菌感染引起的疾病的方法，所述方法包括給予有效劑量的具有EXOX蛋白活性的一種抑制劑，其中抑制劑序列為選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列。例如，其中所述的EXOX蛋白含有SEQ ID NO2所示序列。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種降解多肽底物的方法。所述方法包括將一個或多個本發(fā)明所述的分離的多肽與多肽底物接觸。優(yōu)選的，其中所述的多肽底物為全長的蛋白，其中所述的一個或多個分離的多肽有序的酶解多肽底物。所述的多肽底物選自如下組變性的酪蛋白、麩朊、谷朊、小牛血清蛋白或功能類似物。進(jìn)一步的在一些實(shí)例中，其中所述的分離的多肽是一種氨肽酶。所述的氨肽酶可以是亮氨酸氨肽酶，如ruLAP2。
另外，所述方法還可以用一個或多個蛋白酶與多肽底物接觸。在一些實(shí)例中，所述的蛋白酶選自如下組胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種去除蛋白氨基末端氨基酸的方法。所述方法包括將蛋白與本發(fā)明所述的分離的多肽接觸。在一些實(shí)例中，所述的蛋白氨基末端帶有組氨酸標(biāo)簽。在另一些實(shí)例中，所述的蛋白氨基末端帶有Xaa-Pro標(biāo)簽。優(yōu)選的，所述Xaa是一種含有至少兩個相近親核部位的氨基酸，如絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種具有反蛋白水解活性的多肽。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種添加一個或多個氨基酸到底物多肽上的方法。方法包括將多肽底物與一種或多種本發(fā)明所述的分離的多肽接觸。
除非另有說明，本發(fā)明所述的所有技術(shù)和科學(xué)用語都和本發(fā)明所屬一般技術(shù)人員理解的一樣。盡管有類似或等同的方法和原料可以用來實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，更適合的方法和原料將在以下描述。本發(fā)明引用所有的出版物、專利申請、專利及其他參考文獻(xiàn)均參照其整體。在沖突的情況下，現(xiàn)在的說明書，包括定義將受到限制。另外，所述的原料、方法和實(shí)施例僅限于說明本發(fā)明而不是限制本發(fā)明。


圖1是紅色毛癬菌培養(yǎng)上清夜用抗-A.oryzue Alp(膠板A，左邊)和Mep antisera(膠板C，右邊)Western雜交結(jié)果圖。膠板B顯示用考馬斯亮藍(lán)染色的10％SDS-PAGE膠。泳道1(lane 1)里，0.25ml的紅色毛癬菌培養(yǎng)上清夜中的蛋白在加樣到SDS-PAGE膠前預(yù)先用TCA處理。0.2g純化的A.oryzue重組蛋白ALP和MEP分別加樣在泳道2和3里。標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分子量對照在圖左面。
圖2是顯示P.pastoris產(chǎn)生的重組ruLAP2(1，2)、fuLAP2(3，4)、ruLAP1(5，6)、fruLAP1(7，8)的SDS-PAGE蛋白特征圖。每個純化的重組LAP 1g加到10％SDS-PAGE膠。泳道2、4、6和8表示用N-糖苷酶F處理后的去糖基蛋白。膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色。
圖3是紅色毛癬菌培養(yǎng)上清夜和重組LAPs作為對照探針，和抗-ruLAP2(泳道1-4)、抗-ruLAP1 antisera(泳道5-8)Western雜交結(jié)果圖。泳道1、2、5和6表示0.25ml的紅色毛癬菌培養(yǎng)上清夜中的蛋白在加樣到SDS-PAGE膠前預(yù)先用TCA處理。0.1g純化的重組ruLAP2(泳道3、4)和ruLAP1(泳道7、8)作為對照加樣。N-糖苷酶F用來去蛋白的糖基。標(biāo)準(zhǔn)的蛋白分子量對照在圖左面。
圖4是紅色毛癬菌AMPP(氨肽酶P)在不同pH值下的酶活性圖表。該圖顯示AMPP在很大的一個pH值范圍內(nèi)具有活性，范圍為pH6～11。
圖5是紅色毛癬菌AMPP(氨肽酶P)在不同溫度下的酶活性圖表。該酶在溫度25～60℃間具有活性，優(yōu)選的溫度為50℃。
圖6是顯示在37℃，4h，ruLAP1以E/S比率(w∶w)以1/50分解gliadin 14mer的結(jié)果圖。
圖7是顯示DPPIV單獨(dú)酶解和DPPIV/ruLAP2的酶混和物分解gliadin 14mer的結(jié)果圖。
圖8是顯示在37℃，4h，ruDPPIV1以E/S比率(w∶w)以1/50分解gliadin 33mer的結(jié)果圖。
圖9是顯示DPPIV/ruLAP2的酶混和物分解gliadin 33mer的結(jié)果圖。
圖10A和10B表示ruLAP2分解Gly-Ser-proNPY(A)前和(B)后的質(zhì)譜圖。
圖11A和11B表示ruLAP2分解Ala-proNPY(A)前和(B)后的質(zhì)譜圖。
圖12A和12B表示ruLAP2分解TG47(A)前和(B)后的質(zhì)譜圖。
圖13A和13B表示DPPIV分解desMet-G-CSF(A)前和(B)后的質(zhì)譜圖。
圖14是M28E亞家族氨肽酶的推斷的氨基酸序列比對圖。
圖15是M28E亞家族氨肽酶的推斷的氨基酸序列比對圖。
本發(fā)明的詳細(xì)描述本發(fā)明所述的蛋白酶與肽酶、蛋白水解酶和多肽水解酶同意。所述蛋白酶包括所有能夠?qū)O-NH鍵斷裂，將蛋白降解為多肽或氨基酸的酶。多肽外切酶作用于多肽鏈的氨基(N)或羧基(C)端鄰近的基團(tuán)。那些作用于N端釋放一個氨基酸殘基的酶命名為氨肽酶。許多不同的高級蛋白酶參與了大量的生物生理反應(yīng)。因此，現(xiàn)在選擇新藥的目標(biāo)都放在控制相關(guān)多肽或酶的降解上。
皮膚真菌是人類和動物的致病真菌，導(dǎo)致皮膚感染(Vanbreuseghem等，GUIDEPRATIQUE BE MYCOLOGUE MEDICALEET VETERINAIRE.(1978)；Kwong-Chong & Bennet，NEDICAL MYCOLOGY(1992)；Weitzman & Summerbell，Clin.Microbiol.Rev.8240-259(1995))。皮膚真菌包括但不限于T.ajelloi，A.uncinatum，K ajelloi，T.asteroides，T.mentagrophytes，T.concentricum，T.cruris.E.floccosum，T.dankalienese，G.dankaliensis，T.equinum，T.equinum var.autotrophicum，T.equinum var.equinum，T.erinacei，T.fischeri，T flavescens，T.floccosum，T.gloriae，T.gourvilii，T.granulare，T.granulosum，T.gypseum，T.inguinale，T.interdigitale，T.intertriginis，T.kanei，T.krajdenii，T.longfusum，T.megninii，A.quinckanum，A.benhamiae，A.vanbreuseghemii，T.pedis，T.proliferans，T.quickaneum，T.radiolatum，T.mentrophytes var.erinacei，T.mentagrophytes var.interdigitale，T.mentagrophytes var.mentagrophytes，T.mentagrophytes var.nodulare，T.mentagrophytes var.quinnckeanum，T.niveum，T.nodulare，T.persicolor，M.persicolor，T.phaseolforme，T.proliferans，T.purpureum，T.quinckeanum，T.radiolatum，T.raubitschekii，T rubrum，S.ruber，T schoenleinii，T simii，A.simii，T soudanense，T sulphureum，T tonsurans，A.insingulare，A.lenticularum，A.quadrifidum，T tonsurans，T sulphureum，T terrestre，T.tonsuransvar.sulphureum，T.tonsurans var tonsurans subvar.perforans ，T.vanbreuseghemii，T.verrucosum，T.violaceum，T.yaoundei，E.floccosum，M.audouinii，M.ferrugineum，T.megninii，T.mentragrophytes，T.raubitschekii，T.schoenleinii，T.soudanese，T.violaceum，M.canis，M.equinum，M.nanum，M.persicolor，T.verrucosum，和M.gypseum。在歐洲上述致病菌中，從醫(yī)院和個人實(shí)例中分離得到的真菌，常見的有紅色毛癬菌、須癬毛癬菌(T.mentagrophytes)、犬小孢子菌(Microsporumcanis)(Monod等，Dermatology，205201-203，2002)。實(shí)際上，皮膚真菌專門寄生在角質(zhì)層、指甲或頭發(fā)中，消化角質(zhì)化細(xì)胞膜。至今，所有研究顯示皮膚真菌產(chǎn)生具有體外活性的蛋白水解酶，許多研究者從個別菌種中發(fā)現(xiàn)一個或多個分泌型胞外蛋白酶。相關(guān)綜述參見Monod等，Int.J.Med.Microbiol.293405-419，2002。特別地，犬小孢子菌擁有兩個編碼S8(枯草桿菌蛋白酶)和M36(fungalysin)家族的基因家族，參見MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫(http://merops.sanger.ac.uk/)(Brouta等，Infect.Immun.705676-5683，2002；Descamps等，J Invest.Dermatol.70830-835，2002)。分離的犬小孢子菌基因家族中其中之一編碼從培養(yǎng)上清夜中得到兩個前述特征的胞內(nèi)酶之一。(Mignon等，Med Mycol.36395-404，1998；Brouta等，Med Mycol 39269-275，2001)。兩個酶都在感染的貓中發(fā)現(xiàn)，并表現(xiàn)出角質(zhì)分解能力(Mignon等，Med Mycol.36395-404，1998)。所述蛋白水解酶的活性能使皮膚真菌專門在角質(zhì)層、指甲或頭發(fā)中生長，利用消化的角質(zhì)化細(xì)胞膜，如單個氨基酸或小肽，作為細(xì)胞生長的營養(yǎng)來源。
以下描述來自皮膚真菌紅色毛癬菌的兩個新的亮氨酸氨肽酶ruLAP1和ruLAP2。紅色毛癬菌是發(fā)癬菌素屬的一種，還包括T.ajelloi，T.asteroides，T.mentagrophytes，T.concentricum，T.cruris，T.dankalienese，T.equinum，T.equinum var.autotrophicum，T.equinum var.equinum，T.erinacei，T.f scheri，T.flavescens，T.floccosum，T.gloriae，T.gourvilii，T.granulare，T.granulosum，T gypseum，T inguinale，T interdigitale，T.intertriginis，T.kanei，T krajdenii，T longfusum，Tmegninii，T.pedis，T.proliferans，T.quickaneum，T radiolatum，T mentrophytesvar.erinacei，T.mentagrophytes var.interdigitale，T.mentagrophytes var.mentagrophytes，T.mentagrophytes var.nodulare，T.mentagrophytes var.quinnckeanum，T.niveum，T.nodulare，T.persicolor，T.phaseolforme，T.proliferans，T.purpureum，T.quinckeanum，T.radiolatum，T.raubitschekii，T.orthologues。上述兩個LAPs的特性與那些由機(jī)會型真菌煙曲霉菌的fuLAP1和fuLAP2直系同源性基因編碼的分泌型酶、商業(yè)上可獲得的從豬腎提取的微粒體LAP(MEROPS＞M1family)相近。所有上述的酶具有亮氨酸氨肽酶活性。同時，煙曲霉菌的氨肽酶fuLAP1和fuLAP2表現(xiàn)出70％的氨基酸同源性和米曲霉菌的直系同源性基因，參考本發(fā)明引用的美國專利US 6,127,161和5,994,113。進(jìn)一步，ruLAP2表現(xiàn)出獨(dú)特的性質(zhì)(i)ruLAP1和ruLAP2表現(xiàn)出50％的同源性與煙曲霉菌直系同源性基因編碼的fuLAP1和fuLAP2、美國專利US 6,127,161和5,994,113中報道的米曲霉菌的[xu1]直系同源性基因；(ii)ruLAP2和來源于畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)的類胰蛋白酶胞內(nèi)酶的酶組合物能順序酶解一個全長的多肽鏈，如變性的酪蛋白；(iii)ruLAP2和ruDPPIV(紅色毛癬菌的另一個胞外酶)的酶混合物降解一段麥醇溶蛋白，已知其能抵抗蛋白酶水解，這樣就提供了ruLAP2單獨(dú)或與ruDPPIV組合用于治療腹乳糜瀉疾病或其他消化道疾病的證據(jù)，如吸收不良；(iv)ruLAP2和其他蛋白酶組合(酶組合物)可應(yīng)用于食品工業(yè)中，如降解苦味底物、降解theves、處理肉類、香皂工業(yè)、分解朊病毒、分解病毒、降解有毒或副產(chǎn)物蛋白；(v)和，既然ruLAP2和/或其他真菌分泌的蛋白酶是皮膚真菌在指甲角質(zhì)化底物中生長必須的，那么ruLAP2和/或其他真菌分泌的蛋白酶的抑制劑將是治療霉菌病的一種新方法。
本發(fā)明提供一種新的真菌核酸和蛋白，所述蛋白具有亮氨酸氨肽酶活性。LAPs在很多功能中都起到作用，包括但不限于血液凝固、控制細(xì)胞死亡、組織分化、腫瘤侵襲、一些致病微生物感染過程中等，所述作用使LAPs在新藥領(lǐng)域中成為一種有價值的目標(biāo)和有力的工具。除了在生理上的功能，氨肽酶還有商業(yè)應(yīng)用價值，主要在清潔劑和食品領(lǐng)域。由于微生物有著豐富的生物多樣性和對基因操作來說易于感染，微生物是蛋白酶的極佳來源，例如真菌。微生物降解蛋白并利用降解的產(chǎn)物作為生長的營養(yǎng)來源。因此，本發(fā)明所述的新的LAPs具有廣泛的工業(yè)用途，包括但不限于用于食品工業(yè)中水解蛋白；降解副反應(yīng)產(chǎn)物(如羽毛)；降解朊蛋白；蛋白質(zhì)體學(xué)的降解蛋白；氨基酸分析時的多肽水解反應(yīng)；傷口清洗(如攻擊死組織)；假肢清洗和/或準(zhǔn)備；織物柔軟劑；香皂；對污染的水箱或其他含有要除掉蛋白或消毒的容器(如保鮮桶、瓶子等)進(jìn)行清洗或消毒；外科器械的清洗。
本發(fā)明提供一種新的酶及其組合物，如相比與單個酶水解，多種酶的組合物容易分解不溶蛋白的結(jié)構(gòu)，例如將角質(zhì)細(xì)胞膜分解成小肽或游離氨基酸。事實(shí)上，除了S8和M36家族的胞外酶外，紅色毛癬菌分泌的兩個LAPs都各有不同的底物活性。ruLAP1和ruLAP2都屬于一樣的LAPs家族(MEROPS＞M28)。兩個LAPs的特性與那些由機(jī)會型真菌煙曲霉菌的fuLAP1和fuLAP2直系同源性基因編碼的分泌型酶、商業(yè)上可獲得的從豬腎提取的微粒體LAP(MEROPS＞M1 family)相近。上述酶均具有亮氨酸氨肽酶活性。進(jìn)一步的是，ruLAP2具有獨(dú)特的初級結(jié)構(gòu)，同時具有一個特性和ruDPPIV的酶混合物能有序的降解一段多肽鏈，如麥醇溶蛋白，已知其能抵抗其他蛋白酶的水解。更特別的是，純化的ruLAP2和來源于畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)的類胰蛋白酶胞內(nèi)酶的酶混合物物能順序酶解一個全長的多肽鏈，如變性的酪蛋白。
本發(fā)明部分是基于編碼新的多肽的一段新的核酸序列。所述新的核酸序列和其編碼的多肽指的是ruLAP1、ruLAP2、fuLAP1和fuLAP2。所述核酸及其編碼的多肽，本發(fā)明中統(tǒng)一簡稱為“EXOX”。
本發(fā)明所述新的EXOX核酸包括表1A、1B、2A、2B、3A、3B、4A、4B、5A、5B、6A、6B、7A、7B、8A、8B、9A、9B、10A、10B、11A、11B和12A所示的序列或片段、衍生物、類似物或同源物。本發(fā)明所述新的EXOX蛋白包括表1C、2C、3C、4C、5C、6C、7C、8C、9C、10C、11C和12B所示的蛋白片段序列。下面將具體描述所述EXOX核酸和蛋白。
同時，在本發(fā)明范圍內(nèi)還包括一種方法，所述方法是用蛋白酶抑制劑治療或預(yù)防真菌感染或被真菌、酵母細(xì)胞和/或細(xì)菌感染的機(jī)會。
利用反轉(zhuǎn)錄基因技術(shù)，紅色毛癬菌分泌的兩個亮氨酸氨肽酶的特性通過和真菌煙曲霉菌直系同源性基因編碼的酶、從豬腎提取的微粒體氨酸氨肽酶pkLAP比較，得到了確定。所述四個真菌酶(ruLAP1、ruLAP2、fuLAP1和fuLAP2)被證實(shí)和pkLAP同樣對底物L(fēng)eu-AMC結(jié)構(gòu)優(yōu)先選擇，同樣具有亮氨酸氨肽功能。另外，亮氨酸氨肽酶pkLAP對Leu-AMC結(jié)構(gòu)具有極高的選擇性，因此也被稱為丙胺酸氨肽酶(MEROPS＞M1.001)。
本發(fā)明所述的編碼EXOX蛋白的EXOX核酸，包括本發(fā)明提供的核酸序列及其片段。本[xu2]發(fā)明同時也包括相應(yīng)的突變體或基于所示序列變換的仍可以編碼具有EXOX類似活性或功能的蛋白的核酸，或核酸序列的片段。本發(fā)明進(jìn)一步包括相應(yīng)的與本發(fā)明所示序列互補(bǔ)的核酸，也包括核酸片段與本發(fā)明任意描述的序列互補(bǔ)。本發(fā)明同時包括核酸、核酸片段或其互補(bǔ)片段的化學(xué)修飾。所述修飾包括，但不限于如下所述，基團(tuán)和核酸的糖磷酸骨架的修飾或衍生。運(yùn)用上述修飾至少是為了提高被修飾核酸的化學(xué)穩(wěn)定性，例如，修飾的核酸可以應(yīng)用于相關(guān)治療領(lǐng)域中的反義結(jié)合核酸技術(shù)。
本發(fā)明所述的EXOX蛋白包括含有本發(fā)明所示序列的EXO蛋白。本發(fā)明同時還包括所示蛋白序列的突變體或相應(yīng)殘基的不同蛋白，其仍具有EXO類似活性或功能的蛋白，或蛋白的片段。本發(fā)明進(jìn)一步還包括抗體或抗體片段，如Fab或(Fab2)，所述抗體免疫特性的與本發(fā)明所述的蛋白結(jié)合。
EXOX核酸和蛋白具有潛在的治療應(yīng)用，如治療真菌感染。所述EXOX核酸、蛋白和抑制劑同時具有包括但不限于如下功能(i)改進(jìn)蛋白產(chǎn)物的生物技術(shù)工具，如去除標(biāo)簽、含稀有氨基酸的產(chǎn)物；(ii)某些領(lǐng)域疾病診斷的藥物研發(fā)，如過敏反應(yīng)(麩質(zhì)過敏)；(iii)皮膚病藥物研發(fā)，如抗真菌藥物、疣的治療、傷口愈合等；(iv)美容術(shù)，如去皮、脫毛、磨皮和dermaplaning；(v)食品工業(yè)，如作為營養(yǎng)添加劑、糖精、通過預(yù)分解產(chǎn)生低變應(yīng)原性的食品；(vi)消毒工具，如凈化蛋白污染物如朊蛋白或病毒；(vii)清潔或回收廢棄物，如羽毛、骨頭、頭發(fā)和毛皮；(viii)清洗用品，如香波或液體清潔劑。
EXO蛋白的抑制劑，特別是ruLAP2的抑制劑，可以作為抗真菌感染藥物來治療真菌感染病。LAPs蛋白酶本身也可以作為治療消化道疾病應(yīng)用，如吸收不良或?qū)熾靡疬^敏反應(yīng)。麩[xu3]朊是小麥中發(fā)現(xiàn)的，谷蛋白和醇溶朊(醇溶谷蛋白)的蛋白混合物的專業(yè)名詞。由于其內(nèi)在的物理特性，如粘性和彈性，麩朊經(jīng)常被用作食品添加劑。在食品質(zhì)量控制和選擇上檢測麩朊的含量很重要，尤其是對那些麩朊過敏的個體，如麩朊過敏腸病、乳糜瀉病、口炎性腹瀉和相關(guān)的過敏反應(yīng)，因此來自于小麥、裸麥，以及一些燕麥的食品中去除麩朊是很有必要的。
胞外蛋白酶核酸及多肽本發(fā)明描述的紅色毛癬菌亮氨酸氨肽酶活性及前人所研究的犬小孢子菌分泌的枯草桿菌蛋白酶和金屬蛋白酶顯示皮膚真菌分泌一系列蛋白酶，類似與那些在僅有碳和氮源的蛋白基質(zhì)上的曲霉菌屬。而且，ruDPPIV和ruDPPVEMBL AF082514的編碼二肽-氨肽酶的ruDPPV，與來自煙曲霉菌和米曲霉菌DPPIV和DPPV高度類似(Beauvais等，J Biol.Chem.2726238-6244，1997；Beauvais等，Immun.653042-304，1997；Doumas等，Appl.Environ.Microbiol.644809-4815，1998；Doumas等，J.Food Mycol.2271-279，1999)，從基因組和紅色毛癬菌的cDNA文庫中分離得到。紅色毛癬菌編碼上述蛋白酶的基因中的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)與從煙曲霉菌和米曲霉菌分離的同源基因類似。由于曲霉菌屬與皮膚真菌屬在分類上相近，出現(xiàn)上述結(jié)果就不奇怪了，同時它們屬于同一個分類學(xué)上能產(chǎn)生閉囊殼原子囊(Eurotiomycete分類)的子囊菌群。與編碼枯草桿菌蛋白酶和fungalysins的基因相比，ruLAP1和ruLAP2不是紅色毛癬菌基因組中大基因家族的成員。
ruLAP1顯示50％的氨基酸同源性與fuLAP1和/或LAP1(參見表19A和20)，上述3個酶的結(jié)構(gòu)都屬于M28E亞家族，氣單胞菌屬和弧菌屬的亮氨酰氨肽酶(MEROPS＞M28.002)。另外，ruLAP2顯示50％的氨基酸同源性與fuLAP2和/或LAP2(參見表19B和21)，上述3個酶的結(jié)構(gòu)都屬于M28A亞家族，有液泡的S.cerevisiae的蛋白酶Y(MEROPS＞M28.001)，灰色鏈霉菌分泌的氨肽酶(MEROPS＞M28.00X)。另外，M28A和M28E亞家族的成員表現(xiàn)出很低的相似性。然而，上述氨肽酶中的2個Zn++結(jié)合位點(diǎn)的氨基酸很保守，且在真菌LAPs被證明，具體特征本發(fā)明詳述(表20、21)。在灰色鏈霉菌和Aeromonas proteolytica分泌的氨肽酶中His和Asp殘基結(jié)合一個Zn++離子，另兩個His和Glu殘基結(jié)合第二個Zn++離子，同時第二個Asp殘基與兩個Zn++離子橋聯(lián)(Greenblat等，J.Mol.Biol.265620-636(1997)；Hasselgren等，J.Biol.Inorg.Chem.6120-127(2001))。在灰色鏈霉菌氨肽酶中用不同的二價離子替換Zn++受到Ca++的影響，且具有不同效果(Ben-Meir等，Eur.J.Biochem 212107-112(1993)；Lin等，J.Biol.Inorg.Chem.2744-749(1997)；Hasselgren等，J.Biol.Inorg.Chem.6120-127(2001))。本發(fā)明所述的氨肽酶發(fā)現(xiàn)對不同的離子敏感性不同。與灰色鏈霉菌的氨肽酶一樣，ruLAP2與fuLAP1被Co++高度激活。
盡管有著很高的序列同一性，ruLAP2與fuLAP1具有基本上不同的蛋白水解活性。特別的，ruLAP2能夠有效的水解Asp-和Glu-7-胺-4-甲基香豆素(AMC)，同時ruLAP2到目前為止被證明是單一的LAP，能在ruDPPIV存在下水解能抵抗胃和胰腺的蛋白酶水解的麩朊，或第二方面，以來自P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)的部分純化的含有類胰酶胞外酶的形式消化一段全長多肽鏈，如變性的酪蛋白。LAP降解一段長的多肽的能力不能單獨(dú)的從其分解氨酰-AMC殘基基礎(chǔ)上預(yù)測得到。皮膚真菌酶的部分特性已經(jīng)在犬小孢子菌分泌的胞外酶上觀察得到。與煙曲霉菌和米曲霉菌分泌的同源蛋白酶相比，31.5kDa犬小孢子菌枯草桿菌蛋白酶和43.5kDa犬小孢子菌金屬蛋白酶都能夠水解角朊。由于皮膚真菌從它們的在土壤中的習(xí)性進(jìn)化后，它們已發(fā)展出一套用特殊的蛋白酶分解角質(zhì)組織進(jìn)行感染的策略。ruLAP2獨(dú)特的特征能夠表現(xiàn)在其高度特別的寄生的角質(zhì)層和指甲的組織。
除了上述LAPs，一系列新的從致病的真菌紅色毛癬菌分離得到的蛋白酶將在下面詳述。與LAPs一樣，上述蛋白酶都是胞外蛋白酶。它們包括兩個羧肽酶、一個脯氨酰氨肽酶、一個氨肽酶P、一個脯氨酰氨基酸酶和一個二肽基肽酶IV。另外兩個新的蛋白酶已經(jīng)得到確認(rèn)一個來自犬小孢子菌的亮氨酸氨肽酶(caLAP1)、一個來自須癬毛癬菌的亮氨酸氨肽酶(meLAP1)。
ruLAP2ruLAP2是紅色毛癬菌的亮氨酸氨肽酶。1757核苷酸(SEQ ID NO1)的ruLAP2核酸如表1A所示。


1488個核苷酸的ruLAP2開放閱讀框(ORF)，其中起始子ATG在第一個位置上(表1B中下劃線)。

上述ruLAP2核苷酸序列(SEQ ID NO2)編碼有495個氨基酸殘基(SEQ ID NO3)的蛋白，在表1C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruLAP2具有與表1D、1E和1F中的BLAST氨基酸序列同源性。
軟件操作應(yīng)用如下tblastn-將蛋白“序列1”和核酸“序列2”比較，其中核苷酸序列所有6閱讀框轉(zhuǎn)錄。
blastx-將核酸“序列1”和蛋白“序列2”比較。
blastp-蛋白與蛋白比較。
這里所述的BLAST比對結(jié)果中，“E值”或“期待”值是一種可能性的數(shù)據(jù)顯示，表示比對序列可能在查詢的數(shù)據(jù)庫中與BLAST查詢序列具有偶然的類似性。期待值(E)是一個描述找到可能“期待”看有機(jī)會與查詢的數(shù)據(jù)庫中的特殊位點(diǎn)吻合的參數(shù)。它被分值(S)減少其指數(shù)，S是兩個序列間配對情況。必要的，E值描述了序列間配對存在的隨機(jī)背景誤差。
表1D.ruLAP2 TBLASTN結(jié)果

表1E.ruLAP2 BLASTX結(jié)果

表1F.ruLAP2 BLASTP結(jié)果

ruLAP1ruLAP1是紅色毛癬菌的亮氨酸氨肽酶。1256個核苷酸(SEQ ID NO4)的ruLAP1核酸如表2A所示。

1122個核苷酸的ruLAP1開放閱讀框(ORF)，其中起始子ATG在第一個位置上(表2B中下劃線)。

上述ruLAP1核苷酸序列(SEQ ID NO5)編碼有377個氨基酸殘基(SEQ ID NO6)的蛋白，在表2C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruLAP1具有與表2D、2E和2F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表2D.ruLAP1 TBLASTN結(jié)果


表2E.ruLAP1 BLASTX結(jié)果

表2F.ruLAP1 BLASTP結(jié)果

fuLAP2fuLAP2是煙曲霉菌的亮氨酸氨肽酶。1557個核苷酸(SEQ ID NO7)的fuLAP2核酸如表3A所示。

1497個核苷酸的fuLAP2開放閱讀框(ORF)，其中起始子ATG在第一個位置上(表3B中下劃線)。

上述fuLAP2核苷酸序列(SEQ ID NO8)編碼有498個氨基酸殘基(SEQ ID NO9)的蛋白，在表3C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述fuLAP2具有與表3D、3E和3F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表3D.fuLAP2 TBLASTN結(jié)果

表3E.fuLAP2 BLASTX結(jié)果

表3F.fuLAP2 BLASTP結(jié)果


fuLAP1fuLAP1是煙曲霉菌的亮氨酸氨肽酶。1298個核苷酸(SEQ ID NO10)的ruLAP1核酸如表4A所示。

1167個核苷酸的fuLAP1開放閱讀框(ORF)，其中起始子ATG在第一個位置上(表4B中下劃線)。

上述fuLAP1核苷酸序列(SEQ ID NO11)編碼有388個氨基酸殘基(SEQ ID NO12)的蛋白，在表4C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述fuLAP1具有與表4D、4E和4F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表4D.fuLAP1 TBLASTN結(jié)果

表4E.fuLAP1 BLASTX結(jié)果

表4F.fuLAP1 BLASTP結(jié)果


ruCBPS1ruCBPS1是紅色毛癬菌的羧肽酶。2106個核苷酸(SEQ ID NO13)的ruCBPS1核酸如表5A所示。

1989個核苷酸(SEQ ID NO14)的ruCBPS1開放閱讀框(ORF)見表5B，其中ruCBPS1開放閱讀框(ORF)起始子ATG在第一個位置上(表5B中下劃線)。


上述ruCBPS1核苷酸序列(SEQ ID NO14)編碼含662個氨基酸殘基(SEQ ID NO15)的蛋白，在表5C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruCBPS1具有與表5D、5E和5F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表5D.ruCBPS1 TBLASTN結(jié)果

表5E.ruCBPS1 BLASTX結(jié)果


表5F.ruCBPS1 BLASTP結(jié)果

ruCBPS1’ruCBPS1’是紅色毛癬菌的羧肽酶。2030個核苷酸(SEQ ID NO16)的ruCBPS1’基因組DNA序列如表6A所示。

1959個核苷酸(SEQ ID NO17)的ruCBPS1’見表6B，其中ruCBPS1’開放閱讀框(“ORF”)起始子ATG在第一個位置上(表6B中下劃線)。

上述ruCBPS1’核苷酸序列(SEQ ID NO17)編碼含652個氨基酸殘基(SEQ ID NO18)的蛋白，在表6C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruCBPS1’具有與表6D、6E和6F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表6D.ruCBPS1’TBLASTN結(jié)果

表6E.ruCBPS1’BLASTX結(jié)果

表6F.ruCBPS1’BLASTP結(jié)果

ruPAPruPAP是紅色毛癬菌的脯氨酰氨肽酶。1795個核苷酸(SEQ ID NO19)的ruPAP基因組DNA序列如表7A所示。


1326個核苷酸(SEQ ID NO20)的ruPAP見表7B，其中ruPAP開放閱讀框(“ORF”)起始子ATG在第一個位置上(表7B中下劃線)。

上述ruPAP核苷酸序列(SEQ ID NO20)編碼含441個氨基酸殘基(SEQ ID NO21)的蛋白，在表7C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruPAP具有與表7D、7E和7F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表7D.ruPAP TBLASTN結(jié)果


表7E.ruPAP BLASTX結(jié)果

表7F.ruPAP BLASTP結(jié)果

ruAMPPruAMPP是紅色毛癬菌的氨肽酶P。2418個核苷酸(SEQ ID NO22)的ruAMPP基因組DNA序列如表8A所示。


1878個核苷酸(SEQ ID NO23)的ruAMPP見表8B，其中ruAMPP開放閱讀框(“ORF”)起始子ATG在第一個位置上(表8B中下劃線)。

上述ruAMPP核苷酸序列(SEQ ID NO23)編碼含625個氨基酸殘基(SEQ ID NO24)的蛋白，在表8C中以一個字母的氨基酸代碼表示。


上述ruAMPP具有與表8D、8E和8F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表8D.ruAMPP TBLASTN結(jié)果

表8E.ruAMPP BLASTX結(jié)果

表8F.ruAMPP BLASTP結(jié)果


ruPLDruPLD是紅色毛癬菌的脯氨酰氨基酸酶。2344個核苷酸(SEQ ID NO25)的ruPLD基因組DNA序列如表9A所示。

1401個核苷酸(SEQ ID NO26)的ruPLD見表9B，其中獲得的ruPLD部分開放閱讀框(“ORF”)序列缺失在第一個位置上的起始子ATG。


上述部分ruPLD核苷酸序列(SEQ ID NO26)編碼含466個氨基酸殘基(SEQ ID NO27)部分的蛋白，在表9C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruPLD具有與表9D、9E和9F中的BLAST氨基酸序列同源性。由parawise blast程序分析的數(shù)據(jù)。
表9D.ruPLD TBLASTN結(jié)果

表9E.ruPLD BLASTX結(jié)果

表9F.ruPLD BLASTP結(jié)果

caLAP2caLAP2是犬小孢子菌的亮氨酸氨肽酶。1730個核苷酸(SEQ ID NO28)的caLAP2基因組DNA序列如表10A所示。

1488個核苷酸的caLAP2見表10B，其中起始子ATG在第一個位置上(表10B中下劃線)。


上述caLAP2核苷酸序列(SEQ ID NO29)編碼含495個氨基酸殘基(SEQ ID NO30)的蛋白，在表10C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述caLAP2具有與表10D、10E和10F中的BLAST氨基酸序列同源性。由parawise blast程序分析的數(shù)據(jù)。
表10D.caLAP2 TBLASTN結(jié)果

表10E.caLAP2 BLASTX結(jié)果

表10F.caLAP2B LASTP結(jié)果

meLAP2meLAP2是須癬毛癬菌的亮氨酸氨肽酶。1775個核苷酸(SEQ ID NO31)的meLAP2核酸如表11A所示。

1488個核苷酸的meLAP2開放閱讀框(“ORF”)，其中起始子ATG在第一個位置上(表11B中下劃線)。


上述meLAP2核苷酸序列(SEQ ID NO32)編碼有495個氨基酸殘基(SEQ ID NO33)的蛋白，在表11C中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述meLAP2具有與表11D、11E和11F中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawise blast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表11D.meLAP2 TBLASTN結(jié)果

表11E.meLAP2 BLASTX結(jié)果


表11F.meLAP2 BLASTP結(jié)果

ruDPPIVruDPPIV是紅色毛癬菌的二肽基多肽酶IV。2326個核苷酸序列(SEQ ID NO34)的ruDPPIV核酸如表12A所示。所述的ruDPPIV開放閱讀框(“ORF”)起始子ATG在第一個位置上(表12A中下劃線)。


上述ruDPPIV核苷酸序列(SEQ ID NO34)編碼含775個氨基酸殘基(SEQ ID NO35)的蛋白，在表12B中以一個字母的氨基酸代碼表示。

上述ruDPPIV具有與表10C、10D和10E中的BLAST氨基酸序列同源性。用parawiseblast程序分析上述數(shù)據(jù)。
表12C.ruDPPIV TBLASTN結(jié)果

表12D.ruDPPIV BLASTX結(jié)果


表12E.ruDPPIV BLASTP結(jié)果

本發(fā)明另一方面是關(guān)于分離的編碼EXOX多肽或具有其生物活性部分的核酸分子。同時本發(fā)明也包括能充分應(yīng)用的作為雜交探針證明EXOX編碼核酸(如EXOX mRNAs)的核酸片段，作為擴(kuò)增或突變EXOX核酸分子的PCR引物的核酸片段。所述應(yīng)用，所述術(shù)語“核酸分子”指的是包括DNA分子(如cDNA或基因組DNA)，RNA分子(如mRNA)，利用核酸同源性產(chǎn)生的上述DNA或RNA的類似物、衍生物、片段或功能類似物等。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈。
一個EXOX核酸能編碼一個成熟的EXOX多肽。本發(fā)明所指，“成熟”形式的多肽或蛋白表示自然產(chǎn)生的多肽、前體形式或蛋白前體。所述自然產(chǎn)生的多肽、前體形式或蛋白前體包括但不限于，全長的編碼相關(guān)蛋白的基因產(chǎn)物。同樣的，上述自然產(chǎn)生的多肽、前體形式或蛋白前體也可以被定義為由一段本發(fā)明所述的ORF編碼。所述的產(chǎn)物的“成熟”形式產(chǎn)生于，包括但不限于，一個或多個自然發(fā)生的基因表達(dá)過程，如發(fā)生在細(xì)胞、宿主細(xì)胞里出現(xiàn)基因表達(dá)。上述產(chǎn)生步驟導(dǎo)致“成熟”形式的多肽或蛋白的例子包括去除由ORF開始密碼子編碼的N末端甲硫氨酸殘基，或水解去除一段信號肽或引導(dǎo)序列。上述從具有殘基1到N的多肽或蛋白前體產(chǎn)生的成熟形式，所述殘基1是指N末端甲硫氨酸，去除N末端甲硫氨酸后具有殘基2到N的殘基。另外的，上述從具有殘基1到N的多肽或蛋白前體產(chǎn)生的成熟形式，其中N末端從殘基1到殘基M的信號序列被除去，保留殘基M+1到殘基N的殘基。這里進(jìn)一步引述，多肽或蛋白的“成熟”形式可以從后轉(zhuǎn)錄修飾中產(chǎn)生，而不用蛋白水解去除現(xiàn)象。上述另外的過程包括，但不限于如，糖基化(N-，O-和W型)、十四?；?、磷酸化、硫化、N末端環(huán)化或C末端酰胺化。一般的，成熟的多肽或蛋白可以通過上述一種方法產(chǎn)生，或上述方法的任意組合產(chǎn)生。
所述的術(shù)語“探針”，在本發(fā)明中指的是具有不同長度的核酸序列，可能至少是10個核苷酸(nt)，或到100個，又或到最大的6000個nt，這取決于其相關(guān)作用。探針被用于證明核酸序列的一致性、相關(guān)性或互補(bǔ)性。較長的探針一般來自于天然或重組的，具有高度特異性，同時比起短的探針具有更長的雜交時間。探針可以是單鏈或雙鏈，可以設(shè)計(jì)用于PCR反應(yīng)，膜雜交技術(shù)，或象ELISA技術(shù)[xu4]。
所述術(shù)語“分離的”核酸分子，在本發(fā)明中指的是從自然存在的核酸中分離得到的一種核酸分子。優(yōu)選的，“分離的”核酸不含有該核酸來源生物的基因組DNA中天然位于該核酸側(cè)翼的序列(如位于該核酸的5’和3’端序列)。例如，在不同的實(shí)施方案中，分離的EXOX核酸分子可以含有至少約5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，該核苷酸序列天然位于上述核酸分子來源的細(xì)胞/組織/物種基因組DNA中的核酸分子的側(cè)翼。此外，“分離的”核酸分子，例如cDNA分子，在用重組技術(shù)產(chǎn)生時，可以基本上不含其他細(xì)胞物質(zhì)或培養(yǎng)基；或在用化學(xué)法合成時，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。特別的，其中核酸分子或蛋白的純度至少約50％，進(jìn)一步優(yōu)選為至少約85％，最優(yōu)選為至少約99％。
本發(fā)明所述的術(shù)語“重組體”指的是參考一種細(xì)胞，顯示該細(xì)胞復(fù)制異源核酸或表達(dá)由異源核酸編碼的多肽或蛋白。重組體細(xì)胞可以含有不是天然的(非重組體)細(xì)胞的基因。重組體細(xì)胞也可以含有天然的細(xì)胞里經(jīng)過修飾過的和通過人工手段引入到細(xì)胞里的基因。所述術(shù)語還包括含有內(nèi)生的被修飾過，但沒有去除核酸的細(xì)胞里的核酸；所述修飾包括可以獲得的基因替換、定點(diǎn)突變和其他相關(guān)技術(shù)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的是所述細(xì)胞可以被用作單細(xì)胞或多細(xì)胞轉(zhuǎn)基因組織，例如產(chǎn)生EXOX的轉(zhuǎn)基因真菌。
本發(fā)明提供的一種核酸分子，如含有SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示核酸序列的核酸分子或其互補(bǔ)系列，可以用標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)分離得到，所述序列信息如本發(fā)明所示。用全部或部分SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示核酸序列作為雜交探針，EXOX分子用標(biāo)準(zhǔn)的雜交和克隆技術(shù)被分離得到(如以下文獻(xiàn)描述Sambrook等，(eds)，分子克隆試驗(yàn)操作手冊第二版，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版，冷泉港，NY，1989；Ausubel等，(eds.)，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993)。
本發(fā)明所述的核酸可以通過以cDNA、mRNA或等位基因組DNA作為模板，以合適的寡核苷酸片段為引物，進(jìn)行一定的PCR反應(yīng)得到。所述的核酸擴(kuò)增后可以克隆到合適的載體中，并通過序列分析得到確認(rèn)。進(jìn)一步的，EXOX核苷酸序列對應(yīng)的寡核苷酸可以通過標(biāo)準(zhǔn)的合成技術(shù)制備，如DNA自動合成儀。
本發(fā)明所述的術(shù)語“寡核苷酸”指的是一系列連接在一起的核苷酸殘基，所述寡核苷酸具有足夠多的堿基來保證應(yīng)用于PCR反應(yīng)。一段短的寡核苷酸序列可以基于或來自于一個基因組DNA或cDNA，然后被應(yīng)用于擴(kuò)增、確認(rèn)或揭示在特定細(xì)胞或組織中存在的一種同樣的、類似的或互補(bǔ)的DNA或RNA。寡核苷酸含有部分核酸序列，長度可為10nt、50nt或100nt，優(yōu)選為15nt～30nt。在本發(fā)明一個具體實(shí)施方案中，一段長度小于100nt的寡核苷酸進(jìn)一步的包括了SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34或其互補(bǔ)序列中至少6個鄰近核苷酸。寡核苷酸可以通過化學(xué)合成，作為探針應(yīng)用。
在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的分離的核酸分子包括了一種含有與選自SEQ IDNOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列互補(bǔ)的核酸分子(例如，一段作為探針或引物的核酸片段、一段編碼具有EXOX多肽活性部分的核酸片段)。上述與選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列互補(bǔ)的核酸分子具有與選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列很少或沒有錯配的氫鍵連接，從而形成穩(wěn)定的雙螺旋結(jié)構(gòu)。
在這里，術(shù)語“互補(bǔ)體”指的是核酸分子的核苷酸間為Watson-Crick或Hoogsteen堿基配對。術(shù)語“連接”指的是兩個多肽、化合物、多肽相關(guān)物質(zhì)、組合物或其功能類似物之間的物理或化學(xué)相互作用力。連接包括離子鍵、非離子鍵、范德華引力、氫鍵引力等。物理作用力可以是直接的，也可以是間接的。間接的作用力可以是通過或由另一個多肽或化合物的影響。直接的連接指的是沒有空間的阻隔，或者是由于另一個多肽或化合物作用，但不是指其他具體的化學(xué)反應(yīng)作用。
本發(fā)明提供的片段定義為具有至少6個(相鄰的)核酸或4個(相鄰的)氨基酸，其長度足夠允許嚴(yán)格的核酸雜交或與特殊的抗體結(jié)合，相對的，部分片段的反應(yīng)小于全長反應(yīng)。片段可以從所選擇的核酸或氨基酸序列中相鄰的部分得到。由核酸序列或氨基酸序列形成的衍生物可以是直接從自然獲得的化合物的或被修飾過的或部分替換的。同功物指的是具有類似核酸或氨基酸序列結(jié)構(gòu)，但不限于的是，具有不同的組分或側(cè)鏈。同源或異源是指核酸序列或氨基酸序列從不同物種分離得到的一類特定基因。
如果衍生物或同功物含有被修飾過的本發(fā)明所述核酸或蛋白，所述衍生物和同功物可以是全長或超過全長。本發(fā)明所述的核酸或蛋白的衍生物或同功物包括但不限于在不同的重組體中含有與本發(fā)明所述的核酸或蛋白具有至少約70％、80％或95％同源性的分子(優(yōu)選為具有80-95％同源性的分子)；或是按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的經(jīng)過計(jì)算機(jī)同源程序配對過的線性序列；或是能夠在嚴(yán)格的、溫和的、低度嚴(yán)格的條件下與編碼上述的蛋白的互補(bǔ)序列雜交的編碼的核酸。參見如Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS TN MOLECULARBIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，NY，1993和以下所述。
本發(fā)明中，一種“同源核酸序列”或“同源氨基酸序列”或是其它不同名稱指的是在核苷酸或氨基酸水平上具有同源性特征的序列。同源核酸序列包括那些編碼EXOX多肽的重組異構(gòu)體的序列。重組異構(gòu)體能夠在同樣的組織中表達(dá)，如選擇性剪切的RNA。另一方面，重組異構(gòu)體可以被不同的基因編碼。在本發(fā)明中，同源核酸序列可以是編碼除真菌外的其他物種的EXOX多肽的核酸序列。同源核酸序列也包括但不限于自然發(fā)生的本發(fā)明提供的核酸等位替換或突變。同源核酸序列還包括那些編碼如SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列的保守氨基酸亞單位(參見下面)，一種多肽具有EXOX生物活性。EXOX蛋白的不同生物活性將在下面詳述。
EXOX多肽由EXQX核酸的開放閱讀框(ORF)編碼。ORF被終止子結(jié)束其延伸。一段開放閱讀框代表了一種全長蛋白的編碼序列，由ATG“起始子”開始，到TAA、TAG或TGA三個終止子之一終止。為了本發(fā)明目的，所述ORF可以是編碼序列的任何部分，含有或不含起始子和終止子之一或兩個。作為一個好的編碼真正的細(xì)胞質(zhì)蛋白的ORF，其最小的長度經(jīng)常是編碼50個氨基酸或更多氨基酸蛋白的DNA結(jié)構(gòu)。
經(jīng)來自真菌EXOX基因克隆確認(rèn)的核苷酸序列可以作為探針和引物應(yīng)用，所述探針和引物設(shè)計(jì)用來證明和/或克隆在其他物種的EXOX同源基因，也包括來自其他物種的EXOX同源基因。所述引物/探針一般包括一段基本上純化的寡核苷酸。所述寡核苷酸一般包括核苷酸序列的一個區(qū)，所述核苷酸序列在嚴(yán)格條件下與至少約12、25、50、100、150、200、250、300、350或400連續(xù)的核苷酸序列的核酸雜交，其中雜交的核酸序列為SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34的正義核苷酸序列；或SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34的反義核苷酸序列；或SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34的天然存在的突變體序列。
“具有EXOX多肽部分活性的多肽”指的是多肽具有活性類似，但不限于，本發(fā)明所述多肽活性，包括成熟形式，經(jīng)過特殊的生物檢測，有或沒有劑量依賴。一種編碼“EXOX生物活性部分”的核酸片段可以從SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示的編碼具有EXOX生物活性的多肽(EXOX蛋白生物活性在下面詳述)的部分序列分離得到，表達(dá)EXOX蛋白被編碼部分(如體內(nèi)表達(dá)的重組子)，評價EXOX蛋白被編碼部分活性。
EXOX核酸和多肽的變異體本發(fā)明進(jìn)一步包括不同于SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列的核酸分子，其導(dǎo)致基因編碼的兼并，這樣同樣的編碼如SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列編碼的EXOX蛋白。在另一實(shí)例中，一種本發(fā)明所述分離的核酸分子具有編碼含有SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列多肽的核酸序列。除了SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示的真菌EXOX核酸序列外，核酸序列EXOX多肽的氨基酸序列存在于不同的種群中。上述EXOX基因的多樣性可以存在于不同的由自然等位變異導(dǎo)致的真菌種類中。本發(fā)明中，術(shù)語“基因”和“重組基因”指的是含有編碼EXOX蛋白開放閱讀框(ORF)的核酸分子，優(yōu)選的是一種真菌EXOX蛋白。上述自然等位變異可以是典型的在EXOX基因的核酸序列中發(fā)生1～5％的變異。所述任一和所有EXOX多肽的核酸變異和引起的氨基酸多樣性都屬于本發(fā)明范圍，所述變異和多樣性是自然等位變異的結(jié)果，不會改變EXOX多肽的功能、活性。
更進(jìn)一步的是，其他種類中編碼EXOX多肽的核酸分子，但具有與來自于真菌的SEQ IDNOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列不同的核酸序列，也屬于本發(fā)明范圍。與本發(fā)明EXOX cDNAs同源和相對應(yīng)的自然等位變異的核酸分子可以通過其與本發(fā)明所述真菌EXOX核酸序列同源，用真菌cDNAs或類似部分作為雜交探針通過標(biāo)準(zhǔn)的雜交技術(shù)在嚴(yán)格的雜交條件下分離得到。
同樣的，在另一個實(shí)施方案中，一種本發(fā)明所述的分離核酸分子具有至少6個核苷酸，能夠在嚴(yán)格條件與含有SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列的核酸分子雜交。
在另一個實(shí)施方案中，上述核酸至少具有10、25、50、100、250、500、750、1000、1500或2000核苷酸。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明所述的分離核酸分子與編碼區(qū)雜交。在本發(fā)明中，術(shù)語“在嚴(yán)格條件下雜交”描述的是在核酸序列彼此間至少有60％同源情況下進(jìn)行雜交和清洗，核酸之間仍保持雜交狀態(tài)。
同源或其他相關(guān)序列(如直系同源、側(cè)系同源)可以通過用所有或部分所述真菌的特殊序列作為探針，用本領(lǐng)域常用的核酸雜交和克隆方法，在低的、溫和或高的嚴(yán)格雜交條件下獲得。
本發(fā)明所述術(shù)語“嚴(yán)格雜交條件”指的是探針、引物或寡核苷酸只與目標(biāo)序列雜交，而不是其他序列。嚴(yán)格條件是序列依賴型，根據(jù)不同反應(yīng)而不同。特別的，長序列的雜交溫度比短序列雜交溫度高。一般的，對于特別序列，其嚴(yán)格條件選擇比熱熔點(diǎn)(Tm)低5℃，在一定的離子強(qiáng)度和pH下。所述Tm是指(在一定的離子強(qiáng)度、pH和核酸濃度下)探針50％的與目標(biāo)序列互補(bǔ)的序列和目標(biāo)序列達(dá)到平衡的雜交狀態(tài)時的溫度。既然目標(biāo)序列一般存在過度的，在Tm時，探針的50％序列在平衡狀態(tài)時都被反應(yīng)了。一般的，嚴(yán)格條件中的鹽濃度小于約1.0M鈉離子，一般為約0.01到1.0M鈉離子(或其他鹽)，pH7.0~8.3，對于短的探針、引物或寡核苷酸(如10nt到50nt)溫度至少約30℃，對于長的探針、引物或寡核苷酸溫度至少約60℃。嚴(yán)格條件中還可以添加破壞DNA穩(wěn)定的試劑，例如甲酰胺。
嚴(yán)格條件是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的，而且能在Ausubel等，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6查到。優(yōu)選的，在所述條件下，核酸序列相互之間至少約65％、70％、75％、85％、90％、98％或99％同源性的序列仍能相互雜交。非限定的嚴(yán)格雜交條件例子是在高的鹽緩沖液，包括6×SSC，50mMTris-HCl(pH7.5)，lmM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA，和500mg/ml的變性鮭魚精DNA，在65℃下雜交，隨后在50℃下用0.2×SSC洗一次或多次。本發(fā)明所述的一種分離的核酸分子可以在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列對應(yīng)的自然-存在的核酸分子雜交。在本發(fā)明中，“自然-存在”核酸分子指的是自然存在的一種RNA或DNA分子(如編碼一種天然的蛋白)。
在第二個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提高一種在中度嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列的核酸分子或其片段、同功物或衍生物雜交的核酸分子。非限定的中度嚴(yán)格雜交條件例子是在6×SSC，5×denhardt’溶液，0.5％SDS和100mg/ml的變性鮭魚精DNA，在55℃下雜交，隨后在37℃下用1×SSC、0.1％SDS洗一次或多次。其他的中度嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的，如Ausubel等，1993，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Kriegler，1990，Gene transfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton出版，NY。
在第三個實(shí)施方案中，本發(fā)明還提高一種在低度嚴(yán)格條件下與含有SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列的核酸分子或其片段、同功物或衍生物雜交的核酸分子。非限定的中度嚴(yán)格雜交條件例子是在35％甲酰胺、5×SSC、50mMTris-HCl(pH7.5)、5mM EDTA、0.02％PVP、0.02％Ficoll、0.02％BSA、100mg/ml的變性鮭魚精DNA和10％(w/v)葡聚糖硫酸鹽，在40℃下雜交，隨后在50℃下用2×SSC、25mMTris-HCl(pH7.4)、5mM EDTA和0.1％SDS洗一次或多次。其他的低度嚴(yán)格雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(如種間雜交應(yīng)用)，參見如Ausubel等，1993，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.；Kriegler，1990，Gene transfer andExpression，A Laboratory Manual，Stockton出版，NY；Shilo & Weinberg，Proc Natl AcadSci USA 786789-6792(1981)。
保守的突變除了自然存在的EXOX序列的等位突變可以存在上述生物體中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以得出如下的改變，所述改變由SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列的核酸突變而來，從而導(dǎo)致編碼的EXOX蛋白的氨基酸序列發(fā)生變化，但上述變化不會改變所述EXOX蛋白的功能活性。例如，導(dǎo)致在“非必需”氨基酸殘基上替換氨基酸的核苷酸替換可以發(fā)生在SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示序列中。所述“非必需”氨基酸殘基是指一種在EXOX蛋白序列中野生型序列中的不改變EXOX蛋白生物活性的氨基酸殘基改變，而“必需“的氨基酸是指生物活性需要的基團(tuán)。
本發(fā)明中，術(shù)語“生物活性”或“功能活性”指的是自然或一般的EXO蛋白具有的功能，例如，降解其他蛋白的能力。本發(fā)明所述的EXOX蛋白中的氨基酸殘基可以通過特殊的non-amenable改變來預(yù)測。保守性的氨基酸替換是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。其中一項(xiàng)本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)是通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)，每一個核酸編碼子(除了AUG，一般只對應(yīng)甲硫氨酸)可以被修飾成功能一致的分子。進(jìn)一步的，在一段編碼序列中改變、增加或刪除一個氨基酸或一小部分氨基酸(通常小于5％，更特別的是小于1％)的單獨(dú)的替換、刪除或增加的改變是“保守突變”，所述改變是化學(xué)性類似的氨基酸替換的結(jié)果。
本發(fā)明另一方面還涉及編碼含有對于活性不是必需的氨基酸殘基改變的EXOX蛋白的核酸分子。所述EXOX蛋白的氨基酸序列不同于SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列，但其仍有生物活性。在一個實(shí)施方案中，所述分離的核酸分子包括一種編碼蛋白的核苷酸序列，所述蛋白的氨基酸序列至少與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列有45％的同源性。優(yōu)選的，所述核酸分子編碼的蛋白的氨基酸序列至少與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列有60％的同源性；更優(yōu)選的是至少與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列有70％的同源性；更進(jìn)一步優(yōu)選的是至少與SEQ IDNOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列有80％的同源性；再優(yōu)選的是至少與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列有90％的同源性；最[xu5]優(yōu)選的是至少與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列有95％的同源性。
編碼與含有SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列的蛋白同源的EXOX蛋白的分離的核酸分子可以在SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32或34所示核苷酸序列中通過一個或多個核苷酸替換、增加或刪除得到，這樣一個或多個的氨基酸替換、增加或刪除被引入到所述的被編碼的蛋白。
通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)可以在SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列引入突變，如點(diǎn)突變、PCR介導(dǎo)的突變和DNA移位。優(yōu)選的，保守的氨基酸替換發(fā)生在一個或多個可預(yù)測的、非必需的氨基酸殘基上。在人類DNA中單個堿基的替換是參見的。如果替換是發(fā)生在編碼區(qū)，那么替換可能是保守或非保守替換。所述“保守的氨基酸替換”是具有類似特性的、與被替換的氨基酸具有類似的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)新的氨基酸。非必需替換指的是具有不同特性的新的氨基酸?，F(xiàn)有技術(shù)對具有類似側(cè)鏈的氨基酸家族已有定義。氨基酸家族包括堿性側(cè)鏈的(如賴氨酸、精氨酸、組氨酸)、酸性側(cè)鏈的(如天冬氨酸、谷氨酸)、不帶電的極性側(cè)鏈的(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非極性側(cè)鏈的(如丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分支側(cè)鏈的(如蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸)和芳香族側(cè)鏈的(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)。因此，對于保守替換，在EXOX蛋白中預(yù)測為非必需的氨基酸殘基可以被同一個側(cè)鏈家族的另一個氨基酸替換?？蛇x擇的是，在另一個實(shí)施方案中，突變也可以被隨機(jī)的引入到所有或部分EXOX編碼序列中，如飽和突變，然后對產(chǎn)生的突變體篩選其EXOX生物活性，以鑒定出保持活性的突變體。SEQ IDNOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列發(fā)生突變后，可對其編碼蛋白進(jìn)行重組表達(dá)和蛋白活性的測定。
氨基酸[xu6]家族的相關(guān)性也可以被側(cè)鏈相互作用的基礎(chǔ)決定。替換的氨基酸可以是保守“強(qiáng)”的殘基或完全保守“弱”的殘基。所述保守氨基酸殘基的“強(qiáng)”的組包括以下組STA、NEQK、NHQK、NDEQ、QHRK、MILV、MILF、HY、FYW，其中單個字母的氨基酸代號代表那些可以互相替換的氨基酸。另外，保守氨基酸殘基的“強(qiáng)”的組包括以下組CSA、ATV、SAG、STNK、STPA、SGND、SNDEQK、NDEQHK、NEQHRK、HFY，其中每組中的字母代表單個字母的氨基酸代號。
在一個實(shí)施方案中，突變的EXOX蛋白可以按以下方法檢驗(yàn)(i)形成蛋白的能力和其他EXOX蛋白、其他細(xì)胞表面蛋白或生物活性類似物部分的相互作用；(ii)突變的EXOX蛋白與EXOX配體形成聯(lián)合體形式；或(iii)突變的EXOX蛋白與細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)蛋白或生物活性類似物結(jié)合的能力(如抗生物素蛋白)。
在另一個實(shí)施方案中，突變的EXOX蛋白可以通過調(diào)控特殊的生物功能(如分解蛋白的能力)被檢驗(yàn)。
EXOX多肽本發(fā)明對應(yīng)的多肽包括含有EXOX多肽具有的如SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明還包括從SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示序列對應(yīng)的殘基發(fā)生變化的突變或變異的蛋白，所述蛋白的還具有EXOX蛋白的活性或生理功能，或其功能類似物片段。
一般地，保存了EXOX類似功能的EXOX變異體，包括序列中特殊位置的殘基被其他氨基酸替換的任意的變異體，進(jìn)一步還包括在原蛋白的兩個基團(tuán)中插入一個或多個額外的氨基酸殘基或在原蛋白中刪除一個或多個氨基酸殘基的可能性。任何的氨基酸替換、插入或刪除都屬于本發(fā)明范圍。在有利的條件下，所述替換如本文上面定義。
本發(fā)明另一發(fā)明還涉及分離的EXOX蛋白、其類似生物活性部分或衍生物、片段、異源體或類似同源體。生物活性[xu7]部分指的是EXOX蛋白中對于一般功能必需的部分，如氨肽酶活性。同時也提供多肽片段適合于用于培養(yǎng)抗EXOX抗體的免疫原。在一個實(shí)施方案中，天然的EXOX蛋白可以從細(xì)胞、組織或培養(yǎng)基用適當(dāng)?shù)牡鞍滋峒兎椒ǚ蛛x得到。在另一個實(shí)施方案中，EXOX蛋白可以通過重組DNA技術(shù)得到。EXOX蛋白或多肽還可以通過標(biāo)準(zhǔn)的肽合成技術(shù)，由化學(xué)法合成，而代替重組表達(dá)。
所述“分離的”或“純化的”多肽、蛋白或其類似生物活性部分基本上不含來自EXOX蛋白來源的細(xì)胞或組織的細(xì)胞物質(zhì)或其他雜質(zhì)蛋白，或者用化學(xué)法合成時，基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)。術(shù)語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括EXOX蛋白與細(xì)胞組分分開的EXOX蛋白的前體，其中細(xì)胞是用來分離或重組產(chǎn)生改蛋白的細(xì)胞。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“基本上不含細(xì)胞物質(zhì)”包括含有少于約30％(按干重量)的非EXOX蛋白(這里也稱為“雜質(zhì)蛋白”)的EXOX蛋白前體，優(yōu)選少于約20％的非EXOX蛋白的EXOX蛋白前體，更優(yōu)選為少于約10％的非EXOX蛋白的EXOX蛋白前體，最優(yōu)選為少于約5％的非EXOX蛋白的EXOX蛋白前體。當(dāng)該EXOX蛋白或其類似生物活性部分是由重組方法產(chǎn)生時，還優(yōu)選基本上不含培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基的含量少于約20％，優(yōu)選為少于約10％，更優(yōu)選為少于約5％的EXOX蛋白前體。
術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”是指蛋白與化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)分離的EXOX蛋白前體，其中的化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)參與了蛋白的合成。在一個實(shí)施方案中，術(shù)語“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”包括含有少于約30％(按干重量)的化學(xué)前體或非EXOX化學(xué)物質(zhì)的EXOX蛋白前體，優(yōu)選少于約20％的學(xué)前體或非EXOX化學(xué)物質(zhì)的EXOX蛋白前體，更優(yōu)選為少于約10％的學(xué)前體或非EXOX化學(xué)物質(zhì)的EXOX蛋白前體，最優(yōu)選為少于約5％的學(xué)前體或非EXOX化學(xué)物質(zhì)的EXOX蛋白前體。進(jìn)一步的，“基本上不含化學(xué)前體或其他化學(xué)物質(zhì)”還包括氧化副產(chǎn)物。本[xu8]領(lǐng)域技術(shù)人員都知道如何防止氧化反應(yīng)，如將化學(xué)物質(zhì)置于一個無氧的環(huán)境中。
EXOX蛋白的生物活性部分所包含的肽含有的氨基酸序列與EXOX蛋白的氨基酸序列有足夠的同源性，或來源于EXOX蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示的氨基酸序列)，它包含的氨基酸序列比全長的EXOX蛋白的少，并表現(xiàn)出EXOX蛋白的至少一種活性。通常，生物活性部分包含至少一種EXOX蛋白的活性結(jié)構(gòu)域或片段。EXOX蛋白的生物活性部分可以是多肽，例如，它的長度為10、25、50、100或更多個氨基酸。
此外，其他蛋白區(qū)域缺失的其他生物活性部分可以通過重組技術(shù)得到，并用來評價EXOX蛋白的一種或多種功能活性。
在一個實(shí)施方案中，EXOX蛋白含有SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示的氨基酸序列。在其他實(shí)施方案中，EXOX蛋白基本上與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35同源，并保留了SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35蛋白的變異功能活性，但其氨基酸序列有差別，其原因如下所詳述的，是由于天然的等位基因變異或突變造成的。因此，在另一個實(shí)施方案中，EXOX蛋白是如以下所述的蛋白含有與SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示的氨基酸序列至少約90％同源的氨基酸序列，并保留了SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35的EXOX蛋白的功能活性。本發(fā)明中，術(shù)語“生物活性”或“功能活性”指的是自然或一般的EXO蛋白具有的功能，例如，降解其他蛋白的能力。
兩個或多個序列同源性的測定為了測定兩種氨基酸序列或兩種核酸序列的同源性百分?jǐn)?shù)，可將序列進(jìn)行比對，用于最優(yōu)比較目的(例如，在第一和第二氨基酸或核苷酸序列中之一，或兩者中引入空位，用于最優(yōu)比對，非相同的序列可考慮進(jìn)行比較)。氨基酸殘基、對應(yīng)氨基酸位置的核苷酸或核苷酸位置可以比較。當(dāng)?shù)谝恍蛄械哪硞€位置與第二序列相應(yīng)相同位置具有相同氨基酸殘基或核苷酸時，則此兩個分子在該位置上具有同源性(這里所用的氨基酸或核酸“同源性”與氨基酸或核酸的“同一性”的意義是相同的)。
核酸序列的同源性可用兩個序列間的同源程度衡量。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用計(jì)算機(jī)程序計(jì)算同源性，如GCG軟件包的GAP程序，參見Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48443-453，1970。通過以下操作，利用GCG GAP程序來對比核酸序列空位罰分5.0和空位拓展罰分0.3，對比的核酸序列的編碼區(qū)按照上述參數(shù)，表現(xiàn)一定的至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％，or 99％同源可能性，與SEQ ID NOs2，5，8，11，14，17，20，23，26，29，32，和34所示的序列的CDS(編碼)部分相比。
術(shù)語“序列同源”是指兩個多聚核苷酸或多肽在對比的特定區(qū)內(nèi)具有的殘基對殘基相同性的程度。術(shù)語“序列同源性的百分比”是通過以下方法計(jì)算得出在整個對比區(qū)比較兩個最佳配比的序列，在兩個序列中具有的同樣的核酸堿基(如A、T、C、G、U或I，核酸中的堿基)數(shù)目產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，除以匹配位置整個對比區(qū)的數(shù)目(如整個屏幕)，然后將上述結(jié)果乘以100產(chǎn)生序列同源的百分比。這里所述術(shù)語“基本同源”表示多聚核苷酸序列的一種特征，其中多聚核苷酸包括與參考序列的對比區(qū)相比至少有80％序列同源，優(yōu)選至少85％同源，更優(yōu)選90～95％同源，最優(yōu)選為有至少99％序列同源。嵌合和融合蛋白本發(fā)明還提供EXOX嵌合或融合蛋白。這里所用的EXOX“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括與非EXOX多肽選擇性連接的EXOX多肽?！癊XOX多肽”是指含有相當(dāng)于EXOX蛋白(SEQID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33或35)氨基酸序列的多肽，而“非EXOX多肽”是指該多肽含有的氨基酸序列相當(dāng)于與EXOX蛋白基本上不同源的多肽，例如與EXOX蛋白不同的蛋白，和來源于相同或不同組織的蛋白。在EXOX融合蛋白中，EXOX多肽可以相當(dāng)于全部或部分的[xu9]EXOX蛋白。在一個實(shí)施方案中，EXOX融合蛋白含有EXOX蛋白的至少一個生物活性部分。在另一個實(shí)施方案中，EXOX融合蛋白含有EXOX蛋白的至少二個生物活性部分。在另一個實(shí)施方案中，EXOX融合蛋白含有EXOX蛋白的至少三個生物活性部分。在融合蛋白中，術(shù)語“選擇性連接”是要表明EXOX蛋白和非EXOX蛋白彼此融合在同一開放讀碼序列中。非EXOX多肽可以融合到EXOX多肽的N端或C端。
在一個實(shí)施方案中，該融合蛋白是GST-EXOX融合蛋白，其中EXOX序列融合到GST序列的C端。這種融合蛋白可促進(jìn)重組EXOX蛋白的純化。
在另一個實(shí)施方案中，該融合蛋白是在N端含有異源信號序列的EXOX蛋白。在某些宿主細(xì)胞中(例如哺乳動物宿主細(xì)胞)，通過使用異源信號序列可以提高EXOX的表達(dá)和/或分泌水平。
在另一個實(shí)施方案中，融合蛋白是一種EXOX-免疫球蛋白融合蛋白，其中EXOX基因與來自免疫球蛋白家族的一個基因融合。本發(fā)明所述的EXOX-免疫球蛋白融合蛋白可以作為藥物組合物治療抑制EXOX配體和EXOX蛋白在細(xì)胞表面上的結(jié)合的藥物中的應(yīng)用，這樣抑制生物體內(nèi)EXOX-介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)。EXOX-免疫球蛋白融合蛋白還可以用于影響EXOX相關(guān)的配體的生物利用度。對EXOX配體/EXOX相互作用的抑制在醫(yī)療上有用，可以針對治療增殖和分化的紊亂，調(diào)節(jié)(如促進(jìn)或抑制)細(xì)胞生長。進(jìn)一步，本發(fā)明所述的EXOX-免疫球蛋白融合蛋白可以作為免疫原，在生物體內(nèi)產(chǎn)生抗-EXOX抗體，用來純化EXOX配體，和掃描分析驗(yàn)證抑制EXOX和EXOX配體相互作用的分子。
本發(fā)明所述的EXOX嵌合體或融合蛋白可以通過標(biāo)準(zhǔn)的重組DNA技術(shù)獲得。例如，編碼不同多肽序列的DNA片段通過常規(guī)的技術(shù)連接在一起，如為連接提供平頭末端或粘性末端，用限制酶切提供合適的末端，添加合適的粘性末端，用堿磷酸化處理防止錯配，最后酶連接。在另一個實(shí)施方案中，融合蛋白可以通過常規(guī)的技術(shù)合成獲得，包括DNA自動合成?？晒┻x擇的，基因片段的PCR擴(kuò)增運(yùn)用錨引物，可以在兩個連續(xù)的基因片段上產(chǎn)生互補(bǔ)的突出序列，這樣可以順序的將兩個片段融合和擴(kuò)增，產(chǎn)生一個嵌合體基因序列(參見Ausubel等(eds.)CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，1992)。進(jìn)一步的，許多商業(yè)上可獲得的表達(dá)系統(tǒng)已編碼了融合的一部分(如，GST多肽)。EXOX-編碼的核酸可以克隆到上述表達(dá)載體中，這樣EXOX蛋白與融合的一部分連接在一起。EXOX激動劑和拮抗劑本發(fā)明還包括EXOX蛋白的變體，它可以起EXOX激動劑(模擬物)的功能，或起EXOX拮抗劑的功能。EXOX蛋白的變體可通過誘變產(chǎn)生(例如，EXOX蛋白的不連續(xù)點(diǎn)突變或截短)。EXOX蛋白的激動劑可使其基本上保留與天然存在形式的EXOX蛋白相同、或一部分的生物學(xué)活性。EXOX的拮抗劑可抑制天然存在的EXOX蛋白形式的一種或多種活性，例如，通過競爭性抑制細(xì)胞信號通道的上游或下游，其中包括EXOX蛋白酶。因此，用限定功能的變體治療，可引起特定的生物學(xué)效應(yīng)。在一個實(shí)施方案中，與用天然存在形式的EXOX蛋白治療相比，用具有天然存在形式的EXOX蛋白的生物活性中的一部分的變體治療，對受試者的副作用較少。
作為EXOX蛋白激動劑(模擬物)，或EXOX蛋白拮抗劑的EXOX蛋白的變異體，可用下述方法鑒定對EXOX蛋白的突變體(例如截短突變體的)組合文庫，篩選其EXOX蛋白激動劑或拮抗劑活性。在一個實(shí)施方案中，多樣化的EXOX突變體文庫可通過在核酸水平上的組合誘變來產(chǎn)生，并由多樣化的基因文庫所編碼。多樣化的EXOX變體文庫可以通過下述的方法產(chǎn)生，例如，將合成的寡核苷酸混合物用酶法連接成各種基因序列，從而使一組簡并的潛在EXOX序列可以按單個多肽的形式表達(dá)，或者以包含一組EXOX序列的一組大融合蛋白(如噬菌體表達(dá))的形式表達(dá)。由簡并的寡核苷酸序列生產(chǎn)潛在EXOX變體的方法有很多種?？梢栽谧詣覦NA合成儀中進(jìn)行簡并基因序列的化學(xué)合成，然后將合成的基因連接到適合的表達(dá)載體中。使用一組簡并的基因，可以在一種混合物中提供全部編碼所需要的一組潛在EXOX序列。合成簡并的寡核苷酸的方法在本領(lǐng)域是已知的，參見例如，Narang，Tetrahedron(1983)；Itakura等，Annu.Rev.Biochem.53323(1984)；Itakura等，Science 1981056(1984)；Ike等，Nucleic Acid Res.11477(1983)。
多肽文庫此外，EXOX蛋白編碼序列片段的文庫可以用來產(chǎn)生多樣化的一組EXOX片段，用于篩選和隨后選擇EXOX蛋白的變體。在一個實(shí)施方案中，產(chǎn)生編碼序列片段的文庫的方法如下用核酸酶處理EXOX編碼序列的雙鏈PCR片段，處理的條件是使每個分子僅發(fā)生約一次切口，然后使雙鏈DNA變性，再使DNA復(fù)性形成雙鏈DNA，該DNA可以包括不同切口的產(chǎn)物的正義/反義對，用S1核酸酶處理重新形成的雙鏈體，以除去單鏈部分，再將得到的片段文庫連接到表達(dá)載體中。用這種方法可獲得編碼各種大小的EXOX蛋白的N端、C端和內(nèi)部片段的表達(dá)文庫。
已知在本領(lǐng)域有幾種用于篩選通過點(diǎn)突變或截短制備的組合文庫的基因產(chǎn)物，以及用于對cDNA文庫篩選具有選擇特性的基因產(chǎn)物的技術(shù)。這些技術(shù)適用于對EXOX蛋白組合誘變所產(chǎn)生的基因文庫進(jìn)行快速篩選。能進(jìn)行高通量分析、使用最廣的用于篩選大基因文庫的技術(shù)通常包括將基因文庫克隆到可復(fù)制的表達(dá)載體中，用產(chǎn)生的載體文庫轉(zhuǎn)化適合的細(xì)胞，以及在某種條件下使組合的基因表達(dá)，在該表達(dá)條件下，通過對所需活性的檢測，促進(jìn)了分離出編碼該被測產(chǎn)物基因的載體。Recrusive ensemble誘變(REM)，是一種新的技術(shù)，它可提高文庫中功能突變體的頻度，可以結(jié)合篩選測定用于鑒別EXOX變體，參見例如，Arkin & Yourvan Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897811-7815(1992)；Delgrave等，蛋白Engineering 6327-331(1993)。
文庫也可以通過DNA重排產(chǎn)生。DNA重排采用來自不同種屬或基因的相關(guān)基因，其在功能、片段上相關(guān)，通過重組使其重新組合?？梢源_認(rèn)其中含有有用或潛在令人感興趣的產(chǎn)物的重組基因。所有重組的基因相當(dāng)于片段來說具有用途，可以重新組合形成新的重組基因。來自不同種屬或基因的不同片段經(jīng)過復(fù)性和延伸，在文庫中形成多樣性。篩選出一個令人感興趣的蛋白的過程是合適的。利用DNA重排產(chǎn)生重組基因的重要因素包括復(fù)性時的溫度、基因的相似性和DNA片段的大小。
Stemmer等(Nature 370389-391(1994))、Stemmer(Proc.Natl.Acad.USA 9110747-10751(1994))、美國專利No.5,603,793、No.5,830,721和No.5,811,238，在這里作為具體的參考文獻(xiàn)，描述了如生物體外的蛋白重排方法，如誘變的重復(fù)循環(huán)、重排和選擇，如同一系列的產(chǎn)生displayed多肽和抗體的方法，如同一系列通過DNA片段進(jìn)行的DNA重新組配技術(shù)，以及它們生物體內(nèi)外的誘變復(fù)制。進(jìn)一步的，DNA重排技術(shù)的不同應(yīng)用是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。除了上述引用的公開文獻(xiàn)，美國專利No.5,837,458也提供了在遞歸的重排技術(shù)里新的代謝途徑和生物產(chǎn)率的提高的進(jìn)化，和Crameri等(Nature Medicine 2(1)100-103(1996))描述了抗體重排應(yīng)用于抗體噬菌體文庫。同時也可參考WO95/22625，WO97/20078，WO96/33207，WO97/33957，WO98/27230，WO97/35966，WO98/31837，WO98/13487，WO98/13485和WO989/42832。
表達(dá)載體本發(fā)明的另一個方面是關(guān)于載體，優(yōu)選表達(dá)載體，它含有編碼EXOX蛋白、或衍生物、片段、同一物或其同源物的核酸。這里所用的術(shù)語“載體”是指一種核酸分子，它能轉(zhuǎn)運(yùn)與其連接的另一核酸。載體的一種類型是“質(zhì)?！保侵缚蓪⒘硗獾腄NA片段連接在其中的環(huán)狀雙鏈DNA。另一種類型的載體是病毒載體，在該載體中，另外的DNA片段可與病毒的基因組連接。一些載體能夠在其導(dǎo)入的宿主細(xì)胞中自主復(fù)制(例如具有細(xì)菌復(fù)制起點(diǎn)的細(xì)菌載體和游離型的哺乳動物的載體)。其他的載體(例如，非游離型的哺乳動物載體)是通過導(dǎo)入宿主細(xì)胞而整合到宿主細(xì)胞的基因組中，從而與宿主的基因組一起復(fù)制。此外，某些載體能指導(dǎo)與其選擇性連接的基因的表達(dá)，這種載體在此稱為“表達(dá)載體”。一般，重組DNA技術(shù)中使用的表達(dá)載體常常為質(zhì)粒的形式。本說明書中，“質(zhì)?！焙汀拜d體”可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用的一種載體形式。但是，本發(fā)明還包括其他形式的有同等功能的表達(dá)裁體，例如，病毒載體(例如復(fù)制缺陷逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和腺伴隨病毒)。
功能蛋白的產(chǎn)生與組織產(chǎn)生蛋白的細(xì)胞機(jī)器緊密相關(guān)。在選擇表達(dá)系統(tǒng)時，大腸桿菌是經(jīng)典的“工廠”，因?yàn)樗幕蚪M全部測得；組織容易處理；生長快；只需便宜容易制備的基質(zhì)；分泌蛋白到基質(zhì)中，從而有利于收集蛋白。但是，大腸桿菌是原核細(xì)胞，缺少細(xì)胞器，如真核具有的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，它們能夠修飾產(chǎn)生的蛋白。許多真核蛋白可以在大腸桿菌中表達(dá)得到，但許多是沒有功能的、無用的形式，因?yàn)樘腔蚝筠D(zhuǎn)錄修飾沒有發(fā)生。
這樣，研究者最近轉(zhuǎn)向了真核酵母、哺乳動物核植物蛋白表達(dá)系統(tǒng)。例如，在過去幾年里嗜甲醇酵母P.pastoris成為了不同蛋白表達(dá)系統(tǒng)中的有力的宿主，同時建立了一種選擇性表達(dá)人類蛋白的高產(chǎn)量的真核宿主技術(shù)。
另一個例子，植物也被大量的蛋白表達(dá)系統(tǒng)用作表達(dá)宿主，其提供了潛在的比經(jīng)典的表達(dá)系統(tǒng)更具有經(jīng)濟(jì)價值、可控和安全的優(yōu)勢[xu10]。最近，有系列的植物不同表達(dá)系統(tǒng)出現(xiàn)，包括短期表達(dá)、植物細(xì)胞懸浮液培養(yǎng)、重組植物病毒和葉綠體轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)。當(dāng)在植物里表達(dá)的蛋白與哺乳動物有一些差異時，目前沒有證據(jù)表明這些差異導(dǎo)致在病人身上產(chǎn)生不良反應(yīng)。
另一個適合不同表達(dá)系統(tǒng)利用了昆蟲細(xì)胞，經(jīng)常與桿狀病毒表達(dá)載體結(jié)合。桿狀病毒載體適用于在培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞表達(dá)蛋白，例如，SF9細(xì)胞，包括pAc系列(Smith等，Mol.Cell.Biol.32156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow和Summers，Virology17031-39(1989))。
本發(fā)明的宿主細(xì)胞也可以用于生產(chǎn)除人以外的轉(zhuǎn)基因動物，所述動物的基因組中已經(jīng)轉(zhuǎn)入了外源的序列。轉(zhuǎn)基因動物是除人以外的動物，優(yōu)選哺乳動物，更優(yōu)選嚙齒動物，如大鼠或小鼠，其中該動物的一個或多個細(xì)胞包含轉(zhuǎn)移基因。其他轉(zhuǎn)基因動物的例子包括除人以外的靈長類動物、綿羊、狗、牛、山羊、雞、兩棲類等。通過胚胎的操作和顯微注射而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因動物的方法，特別是對小鼠之類的動物，在本領(lǐng)域中已成為常規(guī)的方法，并在以下文獻(xiàn)中有描述，例如美國專利NOs.4,736,886、4,870,009和4,873,191；Hogan，1986.InManipulating the Mouse Embryo，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.)。類似的方法也用來生產(chǎn)其他的轉(zhuǎn)基因動物。
Pichia pastoris表達(dá)系統(tǒng)真核酵母之一是嗜甲醇Pichia pastoris。P.pastoris已經(jīng)被開發(fā)成一個產(chǎn)生外源蛋白合理的宿主，因它的乙醇氧化啟動子被分離和克隆了。Pichiapastoris轉(zhuǎn)錄在1985年就已經(jīng)有報道了。Pichia pastoris異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)由Phillips Petroleum發(fā)展，參見美國專利NOs.4,855,231，4,857,4674,879,231和4,929,555，本發(fā)明中全面引述上述專利。該系統(tǒng)最近被體外標(biāo)記。與其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比，Pichia具有很多優(yōu)勢，因?yàn)樗鼪]有細(xì)菌相關(guān)的內(nèi)毒素問題，也沒有動物細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的蛋白中含有濾過性毒菌的問題。進(jìn)一步的，P.pastoris可以在缺乏葡萄糖的情況下利用甲醇作為碳源。P.pastois表達(dá)系統(tǒng)利用甲醇介導(dǎo)的乙醇氧化酶(AOX1)啟動子，該啟動子控制乙醇氧化酶的表達(dá)基因，該酶在甲醇代謝過程中第一個啟動。上述啟動子已研究清楚并整合到了一系列P.pastoris表達(dá)系統(tǒng)中。由于P.pastoris產(chǎn)生的蛋白具有正常的結(jié)構(gòu)并能分泌到胞外，基因工程P.pastoris發(fā)酵提供了一種很好的代替大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的選擇。進(jìn)一步的，P.pastoris還有超過大腸桿菌的優(yōu)勢自發(fā)的對產(chǎn)生的蛋白糖基化。該表達(dá)系統(tǒng)已制得了很多的蛋白，包括破傷風(fēng)菌疫苗片段、Brodatella pertussis pertactin、人血清蛋白和溶菌酶。
EXOX蛋白標(biāo)簽去除已經(jīng)開發(fā)了不少系統(tǒng)用來快速有效的純化在細(xì)菌中表達(dá)的重組蛋白。其中大部分依賴與谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)區(qū)域、鈣結(jié)合多肽(CBP)組氨酸標(biāo)簽融合的蛋白表達(dá)。例如，結(jié)合谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)的片段的多肽表達(dá)可以從細(xì)菌粗提取物中在不變性的條件下用谷胱甘肽凝膠親和層析色譜法純化。
進(jìn)一步的，上述載體表達(dá)系統(tǒng)一般引入特殊的蛋白酶水解位點(diǎn)，方便蛋白酶對細(xì)菌融合蛋白進(jìn)行水解，載體引入的水解位點(diǎn)有凝血酶、腸激酶、或Xa蛋白因子。凝血酶專門對包含Leu-Val-Pro-Arg↓Gly-Ser(SEQ ID NO44)序列的目標(biāo)蛋白進(jìn)行酶解。腸激酶的酶切位點(diǎn)是Asp-Asp-Asp-Asp-Lys↓(SEQ ID NO45)。象腸激酶，Xa蛋白因子酶解位點(diǎn)在其結(jié)合序列Ile-Glu-Gly-Arg↓(SEQ ID NO46)的C末端，這樣就可以用來從適當(dāng)設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)中去除所有載體編碼的序列。上述所有蛋白水解酶現(xiàn)在都可以在商業(yè)上獲得高純度的，以避免其包含的其他酶的二次降解。每個試劑盒都提供了所有的適合酶保存、利用在酶解基質(zhì)中去除該酶的生物試劑等工具。最近Qiagen公司開發(fā)了一種TAGZyme系統(tǒng)，能有效的去除從蛋白N末端的組氨酸標(biāo)簽，該蛋白包括能有序的從N末端到“停止點(diǎn)”氨基酸結(jié)構(gòu)域分解雙肽的外肽酶，包括↓Lys-Xaa、↓Arg-Xaa、↓Xaa-Xaa-Pro-Xaa-、↓Xaa-Pro-Xaa-Xaa-或↓Gln-Xaa。
盡管沒有太大的必要去除一個純化后的重組蛋白中短的組氨酸相似標(biāo)簽(不管組氨酸殘基為多少)，但在一些應(yīng)用中需要去除組氨酸，如X射線晶體結(jié)構(gòu)分析或NMR。同樣的對于凝血酶酶切位點(diǎn)Gly-Ser殘基或其他多余的N末端氨基酸殘基也需要上述處理，其存在和所用表達(dá)系統(tǒng)相關(guān)。
最近利用在羰基基團(tuán)和具有兩個相鄰親核基團(tuán)的分子之間濃縮反應(yīng)方法來純化。例如具有兩個相鄰親核基團(tuán)的氨基酸包括絲氨酸、蘇氨酸和半胱氨酸。純化蛋白或多肽包括由如N末端半胱氨酸、蘇氨酸或絲氨酸殘基和樹脂間形成可逆的共價的鍵，參見Villian等，Chem.& Biol.8673-679(2001)。在重組蛋白的N末端增加一對殘基，如Thr-Pro、Cys-Pro或Ser-Pro，或化學(xué)合成的蛋白或多肽，通過以下兩個步驟純化(1)通過共價連接純化；(2)去除二肽標(biāo)簽。該方法有效的回收重組蛋白的成熟形式，而沒有二肽標(biāo)簽序列。
EXOX蛋白的逆蛋白水解活性本發(fā)明的另一個方面是關(guān)于將一個或多個氨基酸接到另一個氨基酸、多肽、寡多肽、多聚肽或任意的可連接的二級胺化合物的方法，該方法是利用EXOX蛋白的逆蛋白水解活性。本發(fā)明中，術(shù)語“逆蛋白水解活性”是指能促進(jìn)將一個或多個氨基酸接到另一個氨基酸、多肽、寡多肽、多聚肽或任意的可連接的二級胺化合物的酶活性。本技術(shù)領(lǐng)域一個公知的技術(shù)是在合適的熱力學(xué)的條件下，蛋白水解酶具有逆蛋白水解活性。
其中一個蛋白水解酶具有逆蛋白水解活性的酶是胰蛋白酶，該酶是胰腺的絲氨酸酶，其專門針對帶正電的賴氨酸和精氨酸側(cè)鏈的底物。胰蛋白酶被廣泛的應(yīng)用于從豬胰島素制備人胰島素，其中豬胰島素除了在B鏈最后一個氨基酸丙胺酸代替了人胰島素的蘇氨酸，其余類似。在胰蛋白酶存在下，將豬胰島素與蘇氨酸酯反應(yīng)，通過去除其末端的丙氨酸后加上蘇氨酸酯，形成人胰島素蘇氨酸酯。隨后將人胰島素蘇氨酸酯用三氟醋酸水解該酯，從而形成人胰島素。
在一些實(shí)施方案中，EXOX蛋白被用來促進(jìn)逆蛋白水解活性。舉些例子，將EXOX蛋白和一個多肽或一個或多個氨基酸在增加一個或多個氨基酸到多肽的環(huán)境里培育。
有很多利用本發(fā)明EXOX蛋白的逆蛋白水解活性的途徑。例如，利用EXOX蛋白的逆蛋白水解活性合成多肽鏈。EXOX蛋白也可以作為一種連接工具，將一個或多個氨基酸接到另一個氨基酸、多肽或任意的可連接的二級胺化合物。
藥物組合物本發(fā)明的EXOX核酸分子、EXOX蛋白、抗EXOX抗體(這里亦稱為活性化合物)和衍生物、片段、同一物和其同源物可以摻入適合于給藥的藥物組合物中。這種組合物通常含有核酸分子、蛋白、抗體，或調(diào)節(jié)化合物和可藥用載體。這里所用的術(shù)語“可藥用載體”是指包括一些和全部的與藥物的給藥相容的溶劑、分散介質(zhì)、包衣、抗細(xì)菌和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等適合于給藥的載體。適合的載體在最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences一書中有描述，該書是本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)的參考，也是本發(fā)明全面引述的。優(yōu)選的載體或稀釋劑包括但不限于水、鹽溶液、Ringer’s溶液、葡萄糖溶液和5％人血清清蛋白。脂質(zhì)體和無水賦形劑，如不揮發(fā)的油，也可以使用。這種介質(zhì)和試劑用于藥物活性物質(zhì)中在本領(lǐng)域來說是眾所周知的。迄今為止除了任何常規(guī)使用的介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容以外，上述介質(zhì)和試劑在組合物中的使用是經(jīng)過仔細(xì)考慮的。補(bǔ)充的活性化合物也可摻入組合物中。
封裝技術(shù)已廣泛應(yīng)用于許多工業(yè)領(lǐng)域中。例子包括控釋藥劑、食品和飲料中的色料、食品中抗氧化劑、農(nóng)業(yè)中控釋外激素。膠囊、微膠囊和微球是小球體微粒，活性成分包含在微?；旌衔镏谢蚋街谖⒘１砻?。例如，封裝在生物可降解的藻酸鹽微粒里。生物封裝技術(shù)趨向于封裝細(xì)胞、酶和生物活性材料。
本發(fā)明的藥物組合物配制成與其給藥途徑相容的形式。給藥途徑的例子包括非腸道的給藥，例如靜脈內(nèi)、真皮內(nèi)、皮下的、口服的(例如吸入)、經(jīng)皮的(局部的)、經(jīng)粘膜的，和直腸的給藥。用于非腸、真皮內(nèi)、或皮下應(yīng)用的溶液或懸浮液可以包括以下組分無菌的稀釋劑，例如注射用水、鹽溶液、不揮發(fā)油類、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成的溶劑；抗細(xì)菌劑，例如苯甲醇或?qū)αu基苯甲酸甲酯；抗氧化劑，例如抗壞血酸或二亞硫酸鈉；螯合劑，如乙二胺四乙酸(EDTA)；緩沖液，例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽緩沖液和調(diào)節(jié)滲透壓的試劑，例如氯化鈉或葡萄糖。pH可用酸或堿調(diào)節(jié)，例如鹽酸或氫氧化鈉。非腸道制劑可以密封入安瓿、一次性注射器或由玻璃或塑料制成的多劑量的小瓶中。
適用于可注射用的藥物組合物包括無菌的含水溶液(水可溶的情況)或分散液，或者，對臨時配制的無菌可注射溶液或分散液的制劑來說，包括無菌的粉末。對于靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水、抑菌水、Cremophor ELTM(BASF，Parsippany，N.J.)或磷酸鹽緩沖液(PBS)。在所有場合，該組合物必須是無菌的，并應(yīng)是流動的，其流動性應(yīng)達(dá)到易于注射的程度。在生產(chǎn)和儲存的條件下，該組合物必須是穩(wěn)定的，并且必須能抗微生物，如細(xì)菌和真菌的污染作用而能保存。該載體可以是溶劑或含有，舉例來說，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液體聚乙烯醇等)，及其它合適的混合物的分散介質(zhì)。適當(dāng)?shù)牧鲃有钥赏ㄟ^以下方法保持例如，使用包衣，如卵磷酯；在分散體的場合，保持所要求的顆粒大小；以及使用表面活性劑。微生物作用的預(yù)防可通過各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑而達(dá)到，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、酚、抗壞血酸、工汞硫代水楊酸鈉等。在很多場合，組合物中最好包括等滲劑，例如蔗糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇、氮化鈉。在組合物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸酯鋁和明膠，可達(dá)到使注射組合物延長吸收的目的。
無菌的注射溶液的制備方法如下將活性化合物(例如，EXOX蛋白或抗mGluR5M抗體)按所要求的量摻入適當(dāng)溶劑中，該溶劑含有以上列舉的組分中的一種或其組合，然后，按照要求通過無菌過濾。一般，分散劑的制備方法是，將活性化合物摻入無菌載體中，該載體含有基本的分散介質(zhì)和選自以上列舉組分中的其他必須組分。對于用于制備無菌注射溶液的無菌粉末，優(yōu)選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，該方法由預(yù)先經(jīng)過無菌過濾的溶液生成含活性組分和其它所需組分的粉末。
從紅色毛癬菌或產(chǎn)生EXOX或從紅色毛癬菌分離的EXOX的轉(zhuǎn)基因真菌的培養(yǎng)基質(zhì)中分離得到的粗提物可以用于口服給藥，因?yàn)榈鞍酌甘前獾摹？诜M合物一般包括惰性稀釋劑或可食的載體.口服組合物可以封裝在明膠膠囊內(nèi)，或壓成片。用于口服治療給藥時，活性化合物中可摻入賦形劑，并以片劑、錠劑或膠囊的形式使用?？诜M合物也可以用流體載體來制備，以便用作嗽口劑，其中在流體載體中的化合物，被經(jīng)口施用并涮洗和吐出，或吞下。藥物相容的粘結(jié)劑，和/或佐劑物質(zhì)也可作為組合物的一部分包括在內(nèi)。片劑、丸劑、膠囊、錠劑等可以含有下列的任一種組分，或類似性質(zhì)的化合物粘結(jié)劑，例如微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑，例如淀粉或乳糖；崩解劑，例如藻朊酸、Primogel或玉米淀粉；潤滑劑，例如硬脂酸鎂或Sterotes；滑動劑，例如膠體的二氧化硅；甜味劑，例如蔗糖或糖精；或調(diào)味劑，例如薄荷、水楊酸甲酯或橙味調(diào)料。
用于吸入給藥時，組合物可以用氣溶膠噴霧的形式由壓力容器或分配器，或者噴霧器來遞送，壓力容器或分配器含有合適的推進(jìn)劑，例如，二氧化碳?xì)怏w。
全身的給藥也可通過經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥的方法。對于經(jīng)粘膜或經(jīng)皮給藥，在該制劑使用適合于需要透過屏障的滲透劑。這種滲透劑在本領(lǐng)域中通常是熟知的，例如，對于經(jīng)粘膜給藥，包括清潔劑、膽鹽，和梭鏈孢酸衍生物。經(jīng)粘膜給藥也可以通過使用鼻的噴霧劑或栓劑來完成。對于經(jīng)皮給藥，如本領(lǐng)域通常所知，可將活性化合物配制在軟膏、油膏、凝膠或霜劑中。
該化合物也可以制成栓劑(例如，用常規(guī)的栓劑基，如可可酯和其他甘油酯)或保留灌腸的形式，用于直腸遞送。
在一個實(shí)施方案中，活性化合物采用能防止該化合物從人體迅速消除的載體來制備，例如控釋制劑，包括植入物和微膠囊化傳遞系統(tǒng).生物可降解的、生物相容的聚合物也可以使用，例如乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯和聚乳酸.制備這種制劑的方法對本領(lǐng)的技術(shù)人員來說是顯而易見的。上述的材料也可從市場上由Alza公司和Nova制藥公司獲得。脂質(zhì)體懸浮液(包括用病毒抗原單克隆抗體導(dǎo)向受感染細(xì)胞的脂質(zhì)體)也可以用作可藥用載體。這些載體可以按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法制備，舉例來說，如美國專利NO.4,522,811中所述。
尤其有利的是，按劑量單位形式來配制口服或非腸道給藥的組合物，以便于給藥和有利于劑量的統(tǒng)一。這里所用的劑量單位形式是指以單元劑量適用于治療受試者的、物理形式上分開的單位；每單位含有預(yù)定量的活性化合物，該量計(jì)算為能與所需藥用載體結(jié)合產(chǎn)生所需療效的量。本發(fā)明的劑量單位形式的規(guī)格根據(jù)以下方面而定，或直接依賴于以下方面活性化合物的特性和要達(dá)到的療效，以及在合成這種用于治療個體的活性化合物的技術(shù)本身存在的限制。
本發(fā)明的核酸分子也可以插入載體中并用作基因治療載體?；蛑委熭d體可以遞送給治療受試者，例如，通過靜脈內(nèi)注射、局部給藥(參見美國專利5,328,470)或通過立體定位注射(參見，例如chen等(1994)PNAS 913054-3057)?；蛑委熭d體的藥物制劑可包括可接受的稀釋劑中的基因治療裁體，或可包括包埋了基因遞送載體的緩釋基質(zhì)。或者，在完整的基因遞送載體可以由重組細(xì)胞，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體完整地產(chǎn)生的場合，該藥物制劑可以包括一種或多種產(chǎn)生基因遞送系統(tǒng)的細(xì)胞。
上述藥物組合物可以連同給藥說明一起包含在容器、小盒或噴霧器內(nèi)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1材料與方法菌株和質(zhì)粒本研究使用的是紅色毛癬菌的一個臨床分離株CHUV 862-00。用大腸桿菌(E.coli)LE392來繁殖噬菌體λEMBL3(Promega，Wallisellen，Switzerland)。所有的質(zhì)粒-亞克隆實(shí)驗(yàn)使用質(zhì)粒pMTL2I在大腸桿菌DH5α中進(jìn)行(Chambers等，Gene 68139-149(1988))。使用P.pastoris GSI15和表達(dá)載體pKJ 113(Borg-Von Zepelin et al，Mol.Microbiol28543-554(1998))來表達(dá)重組肽酶。眾所周知，在本領(lǐng)域P.pastoris可以被用來表達(dá)大量的重組蛋白。
紅色毛癬菌生長培養(yǎng)基紅色毛癬菌在Sabouraud瓊脂糖或液體培養(yǎng)基(Bio-Rad，Munchen，Germany)上生長，或?yàn)榱颂岣弋a(chǎn)物的蛋白水解活性，在含有0.2％大豆蛋白(Supro 1711，Protein TechnologyInternational，St.Lauise.MO)作為唯一氮源和碳源的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。這種培養(yǎng)基中不添加鹽。那些本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的鹽也可以添加到生長培養(yǎng)基。100ml的液體培養(yǎng)基和少量新鮮生長菌絲一起在800ml組織培養(yǎng)瓶中孵育。培養(yǎng)物在30℃下無須震蕩培養(yǎng)10天。
基因組和cDNA文庫從新鮮的生長旺盛的菌絲中分離DNA用于構(gòu)建紅色毛癬菌的基因組DNA文庫(Yeltonet al.PNAS 811470-1474(1984))。用Sau3A部分消化DNA，從低溶點(diǎn)瓊脂糖凝膠中回收12～20kb的DNA片段。使用一個合適的克隆體系(Promega)，將這些DNA片段插入到噬菌體XEMBL3中。
使用一種微量mRNA系統(tǒng)和500ug總RNA，一個紅色毛癬菌的cDNA文庫被制備，cDNA被插入進(jìn)pSPORT6質(zhì)粒中(Invitrogen Life Technologies；Rockville，Maryland，USA)。從大豆蛋白液體培養(yǎng)基的10天培養(yǎng)物(10×100毫升)中制備RNA。用研缽在液氮中將菌絲研磨成細(xì)的粉末，用專供植物和真菌的RNeasy總RNA純化試劑盒(Qiagen，Basel，Switzerland)分離總RNA。
以前已經(jīng)用CHUVI 92-88菌株構(gòu)建了一個煙曲霉菌的cDNA文庫，該煙曲霉菌菌株在含0.2％膠原蛋白作為唯一氮源和碳源的液體培養(yǎng)基中，在30℃的條件下生長40小時(Monod等，1991)?？俁NA依照Applegate和Monod描述的方法提取，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)程序(Sambrook等，1989)用oligo(dT)纖維素膜(Sigma，Buchs，Switzerland)純化獲得mRNA。按照制造商提供的程序，用λ噬菌體gtl1(Promega)和這些mRNA制備一個文庫。
表13.編碼氨肽酶的紅色毛癬菌和煙曲霉菌的基因

LAP基因的克隆基因組文庫的重組噬菌斑(104)被轉(zhuǎn)移到GeneScreen尼龍膜上(NEN Life ScienceProducts，Boston，MA)。在低嚴(yán)格條件條件下，用32P標(biāo)記的探針對這些膜進(jìn)行雜交(Monod等，Mol.Microbiol.13357-368(1994))。采用Grossberger描述的方法，所有的陽性噬菌斑被純化并提取相應(yīng)的噬菌體DNA(Grossberger，Nucleic Acid Res.156737(1987))。按照標(biāo)準(zhǔn)程序，源自EMBL3噬菌體的雜交篩選到的片段被亞克隆進(jìn)pMTL 2I中。用Microsynth(Balgach，Switzerland)進(jìn)行核酸測序。
用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法分離cDNA制備cDNA文庫中106個克隆的DNA，用PCR方法獲得紅色毛癬菌和煙曲霉菌的cDNA。根據(jù)源自不同肽酶基因(表13)的DNA序列設(shè)計(jì)的同源引物，在標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行PCR。200ngDNA、10ul正義和反義寡核苷酸引物(濃度為42mM)、8ul的脫氧核苷酸混合物(每種dNTP為10mM)，溶于100ul PCR緩沖液中(10mM Tris-HCl pH8.3；50mm KCl；1.5Mm MgCL2)。每個反應(yīng)體系加入2.5單位AmpliTAQ DNA聚合酶(PE.，Zurich，Switzerland)。PCR反應(yīng)程序?yàn)榉磻?yīng)混合物先在94℃溫育5分鐘，接著25個循環(huán)(94℃0.5分鐘，55℃0.5分鐘，72℃0.5分鐘)，最后72℃保溫10分鐘。
重組LAPs的制備通過將克隆cDNA的PCR產(chǎn)物連進(jìn)E.coli-P.pastoris穿梭載體pKJ 113的多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒。用PCR純化試劑盒(ROCHE Diagnostics)純化PCR產(chǎn)物，用先前設(shè)計(jì)的5’-引物(表14)上的限制性內(nèi)切酶來消化。用10pg經(jīng)EcoR I或Sma I線性化的質(zhì)粒DNA電激轉(zhuǎn)化P.pastoris GSI 15(Invitrogen)在組氨酸缺陷型培養(yǎng)基(1M山梨糖，1％(W/V)葡萄糖，1.34％(W/V)不含氨基酸酵母YNB，4×10-5％(W/V)生物素，5×10-3％氨基酸(W/V)(例如L-谷氨酸，L-甲硫氨酸，L-亮氨酸，L-異亮氨酸各5×10-3％)，2％(W/V)瓊脂糖)選擇轉(zhuǎn)化株，用最小的甲醇平板(1.34％(W/V)不含氨基酸的YNB、4×10-5％(W/V)生物素、0.5％(V/V)甲醇、2％(W/V)瓊脂糖)篩選插入到AOX1位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)中。轉(zhuǎn)化株不能在含有甲醇作為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長，經(jīng)過在AOX1位點(diǎn)取代AOX1編碼區(qū)域的整合事件，保證了在正確的酵母基因組位置包含上述結(jié)構(gòu)。這些轉(zhuǎn)化株在10ml甘油酵母培養(yǎng)基(0.1M磷酸鉀緩沖液，pH6.0，包括1％(W/V)酵母提取物、2％(W/V)蛋白胨、1.34％(W/V)不含氨基酸的YNB，1％(V/V)甘油和4×1％(W/V)生物素)中，在30℃下，生長至接近飽和(600nm下OD 20)。收集細(xì)胞、將其重新懸浮于2ml培養(yǎng)基中，(除了用0.5％(V/V)甲醇取代甘油外，其他都相同)孵育2天。兩天后，收集上清液，用SDS-PAGE膠檢測蛋白產(chǎn)物。從400ml細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液中獲得大量重組肽酶。
表14.描述了在P.pastoris中表達(dá)不同LAP所用的材料

*插入語表示限制位點(diǎn)序列編碼的氨基酸，并被重組酶加上了N末端點(diǎn)。
￥插入語的數(shù)字表示在LAP和DPPcDNAs中存在的核苷酸位置。
§fuLAP2和ruDPPIV PCR片段與E.coli-P.pastoris穿梭載體首尾相連。
重組LAP的純化使用Amicon cell和Ultracel Amicon YM30膜(30kDa為分離點(diǎn))(Millipore，Volketswil，Switzerland)用超濾的方法濃縮400ml P.pastoris培養(yǎng)物上清液中的分泌蛋白。先用50mM pH7.5的Tris-HCl洗濃縮物，用相同的緩沖液平衡Mono Q-Sepharose柱(Amersham Pharmacia，Switzerland)。用50mM pH7.5的Tris-HCl洗脫后，用0-0.5M線性梯度的NaCl以1ml/min的流速洗脫。從Mono Q-Sepharose柱洗下的不同組分被用于酶活性篩選。用亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素(Leu-AMC)作為底物。含有LAP的組分被匯聚在一起。用含有Ultracel Amincon YM30膜的超濾Amicon cell濃縮后，用20ml pH6.0的Tris-HCl洗脫，LAP提取物上樣到排阻的superose 6 FPLP(Amersham Pharmacia)，用20ml Tris-HCl pH6.0的作為洗脫液以0.2ml/min的流速淋洗。收集洗脫下來的活性組分。在做進(jìn)一步的功能確認(rèn)之前，在4℃條件下，用30kDa的分離點(diǎn)(Millipore)的Centricon濃縮器濃縮LAP酶至終體積0.4-1.0ml。
在一個替代的純化方案中，每一步純化都在4℃下操作。將400ml P.pastoris培養(yǎng)物上清液中的分泌蛋白用Amicon cell和Ultracel Amicon YM30膜(30kDa的分離點(diǎn))(Millipore，Volketswil，Switzerland)超濾的方法濃縮。用100ml 20mM pH6.0的醋酸鉀洗濃縮物，用相同的緩沖液平衡Mono Q-Sepharose柱(Amersham Pharmacia，Switzerland)。用20mM pH6.0的Tris-HCl緩沖液洗脫柱子后，用0-0.2M線性梯度的NaCl以1ml/min流速，以超過142分鐘時間洗脫酶。從Mono Q-Sepharose柱上洗脫下的不同組分用Leu-AMC作為底物來篩選酶活性，含有LAP的組分被匯集在了一起。在帶有ultracelAmicon YM30膜的Amicon cell超濾濃縮后，用PBS緩沖液洗脫。LAP提取物被上樣到一個排除大小的superdex 200 FPLC柱(Amersham Pharmacia)。用20mM pH6.0的醋酸鈉緩沖液以0.2ml/min的流速洗脫。洗脫得到的有活性的片段被收集到一起。在4℃下在30kDa分離點(diǎn)的Centricon濃縮器中將LAP濃縮至0.4-1.0ml以供進(jìn)一步的特征分析。
在Mono Q中含有ruLAP2活性的組分洗脫在30-40分鐘(大約50mM NaCl)，在Superdox200中是在65-70分鐘(峰3)。然而，在用1M NaCl洗脫時，大量LAP2活性沒有保留下來。因此，這個組分在用20mM醋酸鈉脫鹽后樣品被加到相同的MonoQ柱，用更寬的濃度范圍(0-1M)的NaCl以0.5/min的速度洗脫超過142分鐘。第一個活性峰出現(xiàn)在洗脫7-15分鐘時和70-140nM NaCl對應(yīng)，第二個峰出現(xiàn)在150-250mM NaCl洗脫時(具有更強(qiáng)的酶活性)。在Superdex上，洗脫78-80分鐘70-140mM NcCl的組分和它上面提到的峰一起被收集。在Superdex上，150-250mM NaCl的組分提供了兩個有活性的洗脫組分，分別在44-49分鐘(峰1)和50-63分鐘(峰2)。
蛋白質(zhì)提取分析使用12％聚丙烯酰胺分離膠，采用SDS-PAGE方法分析蛋白質(zhì)提取物。用考馬斯亮藍(lán)R-250(Bio-Rad)對膠進(jìn)行染色。N-糖苷酶F的消化按先前描述的方法進(jìn)行(Doumas et al.，Appl.Environ.Microbiol.644809-4815(1998)Western雜交膜先用紅-麗春紅染色，用針標(biāo)記出主要蛋白帶的位置。用兔抗血清和堿性磷酸酶耦聯(lián)的山羊抗-兔IgG(Bio-Rad)或結(jié)合有過氧化物酶的山羊抗-兔IgG(Amersham Pharmacia，Switzerland)作為二次標(biāo)記抗體。針對ruLAP1、ruLAP2、fungalysin家族的A.Oryzae分泌的堿性磷酸酶(ALP)和A.oryzae分泌的中性蛋白酶(NPI)的兔抗血清由Eurogentec(Liege，Belgium)用純化的重組酶制造。
氨肽酶活性檢測用不同多肽的aminoacl-4-methylcoumaryl-7-amide熒光衍生物來確定氨肽酶活性，在內(nèi)部淬滅Lys(Abz)-pro-pro-Pna熒光底物特異性確定氨肽酶P的活性(Stockel et al，Adv Exp.Med.Biol.42131-35(1997)。所有的底物都購自Bachem(Bubendorf，Switzerland)。根據(jù)制造商的建議，底物被制備為0.1M貯存液，在-20℃保存。反應(yīng)混合物包括在25ul 50mH緩沖液中包含濃度為5mM的底物和酶制備物(根據(jù)每種酶對底物的水解活性，每次檢測的用量在56-2662ng)，調(diào)節(jié)pH值到每種LAP的最適值。37℃溫育60分鐘后，加入5ul冰醋酸中止反應(yīng)，用3.5ml稀釋反應(yīng)混合物。用熒光光度計(jì)(Spectrofluorophotometer)(PE，LS-5 fluorometer)檢測釋放的AMC，激發(fā)光波長370nm，發(fā)射波長460nm。根據(jù)用合成的AMC作的標(biāo)準(zhǔn)曲線被用來估計(jì)釋放的AMC的量。在310nm激發(fā)光和410nm發(fā)射光下，測定釋放的diprolyl-p-nitrinanilide。LA活性以釋放的AMC的nmol數(shù)或pNA/分鐘/ug蛋白來表示。
表15

各種化學(xué)試劑對LAP的影響抑制劑和金屬陽離子在37℃下和酶提前溫育15分鐘，然后，加入終濃度為5mM的Leu-AMC。再溫育60分鐘后，依前面描述的方法測定酶活性。試驗(yàn)純化的LAP的抑制劑和它們的濃度分別是500ul amastatin(Bachem)、40um苯甲脒(Sigma)、500ul bestatin(Bachem)、100um E-64(L-trans-epoxysuccinyl-leu-4-guanidinobutylamide)(Bachem)、100um leupeptin(Sigma)、40um PMSF(Sigma)、20um TLCK(RocheDiagnostics)和20um TPCK(Roche Diagnostics)。0.5mM和1mM的CaCl2、MgCl2、CoCl2、ZnCl2、NiCl2和CuCl2被用于試驗(yàn)。
表16詳細(xì)的描述了不同蛋白酶抑制劑存在下不同的EXOXs水解活性，以Leu-MCA作為LAP的底物?；钚砸云渑c沒有抑制劑時的活性百分比來表示。
表16

表17詳細(xì)的描述了不同陽離子存在下不同的EXOXs水解活性，以Leu-MCA作為LAP的底物。活性以其與沒有抑制劑時的活性百分比來表示。
表17

EXOX活性的最適pH值采用Ellis和Morrison緩沖系統(tǒng)來確定酶活性的最適pH值(Ellis & Morrison，Methods Enzymol.87405-426(1982))。緩沖液中含有具有不同pKa值的三種成分，在試驗(yàn)的整個pH值范圍內(nèi)，緩沖液的離子強(qiáng)度保持恒定。緩沖液的pH值可以用1M HCl或1M NaOH以半個pH值單位在6到11的范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)?；贚eu-AMC底物的活性檢測條件，除了Tris/HCl緩沖液被一定pH值的Ellis和Morrison緩沖液取代以外，其他條件和前面描述的一樣。
表18.祥述了內(nèi)源和重組的紅色毛癬菌和煙曲霉菌氨肽酶的特征表18

§NI表示未決定*括號中數(shù)字對應(yīng)不含前序列的全長多肽
EXOX活性的最適溫度每份LAP和Leu-AMC(5mM)在20、30、40、50、60、70和80℃的條件下分別孵育10、30和60分鐘，通過測試酶活性和它們最適的pH來確定最適的溫度條件。
蛋白水解檢驗(yàn)使用resorufin標(biāo)記的酪蛋白在磷酸緩沖液(20mM，pH7.4)中測定蛋白水解活性。反應(yīng)混合物總體積約0.5ml，其中包含0.002％的底物。37℃溫育后，加入三氯乙酸(終濃度為4％)沉淀未被消化的底物，通過離心分離上清液。加入500ul Tris緩沖液(500mM，pH9.4)堿化后，測定上清夜在574nm下的吸光度。為了實(shí)用方便，一個蛋白水解活性單位(U)被定義為每分鐘產(chǎn)生0.001吸光度值的酶量。
實(shí)施例2紅色毛癬菌分泌蛋白的水解酶活性在含有0.2％大豆蛋白作為唯一氮源和碳源的培養(yǎng)基上在30℃的條件下培養(yǎng)紅色毛癬菌。生長14天后，記錄到培養(yǎng)基伴隨有澄清現(xiàn)象，用resorufin標(biāo)記的酪蛋白作為底物檢測真實(shí)的蛋白水解酶活性(400U/ml)。其蛋白水解活性分別被PMSF和鄰-二氮雜菲抑制15％和85％，證明紅色毛癬菌分泌絲氨酸和金屬蛋白酶。對培養(yǎng)物上清夜的Western雜交分析揭示紅色毛癬菌和犬小孢子菌相像，分泌枯草桿菌蛋白酶(subtilisin)家族(MEROPS＞S8)和fungalysin家族(MEROPS＞M36)的內(nèi)源蛋白酶，類似于A.oryzae分泌的堿性磷酸酶ALP和中性的金屬蛋白酶NPI(參見圖1)。另外，在紅色毛癬菌培養(yǎng)物的上清夜中檢測到對象Leu-AMC和Leu-pNA這樣底物的高活性。
實(shí)施例3紅色毛癬菌分泌物的氨肽酶活性犬小孢子菌內(nèi)蛋白酶基因的核苷酸序列和同源基因的相似性為50-70％。這些基因編碼A.oryzae和A.fumigtus分泌的枯草桿菌蛋白酶和fungalysin。另外，犬小孢子菌和Aspergillis的基因具有內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)的線性對應(yīng)關(guān)系。因此，來自A.oryzae和酵母編碼氨肽酶，基因的DNA序列被用來設(shè)計(jì)探針，用于篩選紅色毛癬菌的基因組DNA文庫。使用重組蛋白，通過與機(jī)會致病菌煙曲霉菌分泌的蛋白進(jìn)行比較。確定紅色毛癬菌分泌的氨肽酶的特性。
實(shí)施例4克隆編碼紅色毛癬菌和煙曲霉菌氨肽酶的基因表19A和19B詳述了各種LAP的兩兩比較結(jié)果表19A

表19B


a相似性百分比(上邊右手處)和一致性百分比(下邊左手處)的比值可以通過Gapimplemented in the GCG package of the Genetics Computer Group，University ofWisconsin，Madison程序獲得。
圖14是M28E亞家族氨肽酶推導(dǎo)氨基酸序列的對比結(jié)果。用下劃線表示推定的信號序列加工位點(diǎn)。實(shí)心三角形顯示為ruLAP1推定的KR加工位點(diǎn)。Open箭頭顯示的是S.griseus的氨肽酶以及在其他LAP中的保守的兩個Zn++結(jié)合位點(diǎn)。使用威斯康星大學(xué)GCG軟件包中的經(jīng)Boxshade 3.2改良的對比。AbispLAP1是指Agaricus bisporus的LAP。
圖15是M28A亞家族氧基肽酶推導(dǎo)氨基酸序列的對比結(jié)果。下劃線表示推定的信號序列加工位點(diǎn)。用空心三角表示。兩個氨基酸殘基，His和Asp，在真菌的LAP中保守，在S.griseus氨肽酶中結(jié)合第一個Zn++。實(shí)心菱形表示結(jié)合第二個Zn++離子的另外兩個殘基--His和Glu，空心箭頭表示連接兩個Zn++離子的ASP殘基。*代表僅在ruLAP中發(fā)現(xiàn)的甲硫氨酸殘基。
氨基酸序列GPGINDDGSG(SEQ ID NO36)和DM(Q/M)ASPN(SEQ ID NO37)被發(fā)現(xiàn)存在于A.oryzae分泌的52kDa氨肽酶(美國專利6127161)和酵母氨肽酶中。(Nishizawa，et.al.1994)來自這些數(shù)據(jù)，兩段大致上一致的寡核苷酸(GGXATXAAYGAYGAYGGXTCXGG，SEQ ID NO38)和(TTXGGXGAXGCXATCATRTC，SEQ ID NO39)被分別用來作為正義和反義引物來擴(kuò)增紅色毛癬菌的DNA。獲得一段220bp的PCR片斷被用來作為探針篩選λ噬菌體EMBL 3基因組DNA文庫，找到一條編碼可能的氨肽酶(ruLAP2)的核苷酸序列。從煙曲霉菌基因組序列中找到一條編碼相似分泌型氨肽酶(fuLAP2)的核苷酸序列(參見網(wǎng)站www.TIGR.com)。
使用寡核苷酸GCATTCCTGUGATGCCCGGGCCG(正義)(SEQ ID NO40)和TTACTTAGCAAGCTCAGTGACGAAGCCGAC(反義)(SEQ ID NO41)，通過PCR擴(kuò)增A.oryzae基因組DNA，得到一段1200bp的片段，該片段包含編碼A.oryzae 31kDa氨肽酶(美國專利5994113)基因的核苷酸序列。這個片段被用作探針二次篩選紅色毛癬菌基因組DNA文庫。在紅色毛癬菌基因組文庫的λ噬菌體EMBL3DNA中，發(fā)現(xiàn)了一段核苷酸序列(EMBL)，它和那些編碼A.oryzae30kDa氨肽酶和來自煙曲霉菌基因組序列的其他分泌型氨肽酶(網(wǎng)站www.TIGR.com)相似。這些紅色毛癬菌和煙曲霉菌推定的氨肽酶被分別稱為ruLAP1和fuLAP1。
鑒定的ruLAP1、ruLAP2、fuLAP1和fuLAP2每個都包含一個17～20氨基酸的信號序列。用5’-正向和3’-反向引物PCR擴(kuò)增基因組DNA(參見表14)和包含108個克隆的紅色毛癬菌或煙曲霉菌cDNA文庫的總DNA，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定紅色毛癬菌和煙曲霉菌基因的內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)。RuLAP2的3個內(nèi)含子的第一個在位置上和fuLAP2唯一的內(nèi)含子在位置上相似(參見表13)。基因ruLAP1和fuLAP1具有兩個內(nèi)含子和三個外顯子，有相似的共線性結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例5重組紅色毛癬菌和煙曲霉菌氨肽酶的產(chǎn)生由RT-PCR獲得的紅色毛癬菌和煙曲霉菌的cDNA被克隆進(jìn)pKJ 113，在P.pastoris中表達(dá)。取決于肽酶的產(chǎn)量，在Leu-AMC上得到大約10-80ug/ml有活性的酶(參見表18)。在相同的培養(yǎng)條件下，野生型的P.pastoris不向培養(yǎng)基中分泌任何有亮氨酸氨肽酶活性的物質(zhì)。SDS-PAGE分析P.pastoris轉(zhuǎn)化株分泌的重組ruLAP2、fuLAP1和fuLAP2呈現(xiàn)彌散的帶(圖2)。N-糖苷酶處理后，在膠上只有快遷移率的主帶出現(xiàn)，說明和ruLAP1相反，這三個LAP是糖蛋白(圖2)去糖基化的重組LAP的表現(xiàn)分子量和根據(jù)編碼蛋白酶基因的核苷酸序列推導(dǎo)出的多肽鏈計(jì)算出的分子量接近。表18提供了每個重組酶推導(dǎo)出的初級結(jié)構(gòu)(氨基酸序列)。
實(shí)施例6檢測紅色毛癬菌培養(yǎng)物上清液中的ruLAP1和ruLAP2使用抗ruLAP1的抗血清，在紅色毛癬菌培養(yǎng)物上清液中檢測到LAP1產(chǎn)物的電泳遷移率高于重組ruLAP1的。
使用抗ruLAP2抗血清，對紅色毛癬菌培養(yǎng)物上清液的Western雜交分析結(jié)果顯示紅色毛癬菌分泌的糖基化的LAP2和來自P.pastoris(的重組酶有相同的電泳遷移率。
實(shí)施例7重組LAP的特性氨肽酶ruLAP1、ruLAP2、fuLAP1以及豬腎微粒體氨肽酶(pkLAP)都能有效地水解Leu-AMC。這種底物被用來確定活性最適的溫度和pH值，通過測定(i)各種已知的肽酶抑制劑(參見表16)和(ii)不同的二價離子(參見表17)對酶活性的影響來進(jìn)一步了解它們的特性。每種LAP在20℃時都有水解Leu-AMC的能力，最適的溫度范圍從40℃～50℃。最適的pH在7.0到8.5之間(參見表18)。80℃預(yù)處理10分鐘可使酶不可逆地完全失活。
供試的氨肽酶能被濃度500uM的amastatin(參見表16)強(qiáng)烈或完全抑制。RuLAP1、fuLAP1和pkLAP也被bestatin抑制，但這種抑制劑僅對ruLAP2和fuLAP2有部分抑制效應(yīng)。在螯合劑試驗(yàn)中，鄰二氮雜菲在濃度為1mM和5mM時完全抑制這5種酶。fuLAP1、ruLAP2和ruLAP1比其他LAP對EDTA更敏感。E64和Chloromercuribenzoate(半胱氨酸蛋白酶抑制劑)使ruLAP2的活性減弱。暗示在這種酶的氨基酸序列上存在對于活性關(guān)鍵的巰基殘基。對于供試的所有LAP，Leupeptin(絲氨酸/半胱氨酸蛋白酶抑制劑)、PMSF(絲氨酸蛋白酶抑制劑)、苯甲脒、TLCK和TPCK沒有明顯的抑制效果。令人吃驚的是，fuLAP1和ruLAP1對0.1mM pepstatin(天冬氨酸蛋白酶抑制劑)表現(xiàn)有一些靈敏性。
除了fuLAP1表現(xiàn)對二價離子的一般性敏感，當(dāng)濃度達(dá)到1mM時，Co++可以使LAP活性增加200％到900％，四種真菌的LAP對二價陽離子表現(xiàn)不同的靈敏性。例如fuLAP2被Mn++和Ca++激活，而fuLAP1被相同的離子抑制。不同M28家族的4種真菌LAP1，微粒體的pkLAP被Zn、Ni和Cu++高度活化。
用Leu-AMC作為參照，對這些酶對于不同的aminoacyl-AMC的水解活性進(jìn)行了比較(參見表15)。根據(jù)供試的氨肽酶，檢測不同氨酰殘基的不同參數(shù)選擇。例如，氨肽酶pkLAP和四種真菌的LAP不同之處在于它對Ala-AMC和Arg-AMC有特別高的效率。RuLAP1明顯對Leu-AMC有最強(qiáng)的選擇性。然而，觀察到和ruLAP2、fuLAP1和fuLAP2有關(guān)的其他一些優(yōu)先的水解活性。例如，ser-和pro-AMC被ruLAP2更有效水解，而fuLAP1喜愛Asp-和Glu-AMC。因?yàn)樗鼈儾荒芮虚_Lys(Abz)-pro-pro-pNA，這些酶都不表現(xiàn)氨肽酶P的活性。
實(shí)施例8ruLAP2和ruDPPIV在消化醇溶蛋白多肽中的應(yīng)用Celiac病(CD)是一種消化疾病，它能破壞小腸，干擾從食物中吸收營養(yǎng)?；加衏eliac病的人無法忍受一種叫做麩質(zhì)(gluten)的蛋白質(zhì)，這種蛋白質(zhì)存在于小麥、黑麥和大麥中。當(dāng)患CD的病人攝入含有麩質(zhì)的食物時，他們的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生反應(yīng)，對小腸造成破壞。在大部分世界人群中，這種疾病的發(fā)病率大約是1/200，治療CD的唯一方法是終生都絕不食用含有麩質(zhì)的膳食。對于大部分患者而言，遵循這樣的飲食將會使癥狀消失，已有的腸破壞得到恢復(fù)，并且防止進(jìn)一步惡化。
小麥麩質(zhì)的主要毒性成分是一種叫做醇溶蛋白(gliadin)的富含脯氨酸和Gln的蛋白家族，它們在消化道中不被降解并且飽含許多T-細(xì)胞刺激抗原決定部位。因?yàn)椴煌捏w外系統(tǒng)已被用來進(jìn)行這些研究，關(guān)于有效誘導(dǎo)HLA-DQ2陽性gut-來源和外周T細(xì)胞和免疫活性的抗原決定部位仍然存在一些爭議(Vader et al.，Gastroenterology1221729-1737(2002))。在一種CD器官培養(yǎng)模板中，醇溶蛋白產(chǎn)生毒性的能力和刺激T-細(xì)胞并不一致，反之亦然。(McAdam & Sollid，Gut 47743-745(2000))。而且，許多麩質(zhì)抗原決定部位同HLA-DQ2和HLA-DQ8結(jié)合，但這并不是所有的被脫酰胺作用增強(qiáng)。通過小腸組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶的作用，某些谷氨酰殘基轉(zhuǎn)化為谷氨酸。因?yàn)樗鼈冇锌赡艿拇碳-細(xì)胞的能力。Molberg et al.，Nat.Med.4713-717(1998)。但是，對于T-細(xì)胞激活，脫酰胺作用并不是絕對必要的。(Arentz-Hansen et al.，Gastroenterology123803-809(2002))。
其他治療或預(yù)防CD的措施，最好的方式找到一種替代的“不含麩質(zhì)”食品，在過去幾年里已提出建議，包括用化合物抑制T-細(xì)胞激活來阻止多肽和HLA-DQ2的結(jié)合，抑制組織轉(zhuǎn)谷氨酰酶來阻止麩質(zhì)脫酰胺(Sollid，Nat.Rev.Immunol.2647-655(2002))和口腔肽酶的補(bǔ)充。后面的方法被認(rèn)為對于免疫抑制多肽消化有根本性的作用，具體是含有細(xì)菌脯氨酰胞內(nèi)肽酶，該酶對于含有脯氨酸的多肽有很寬范圍的耐受性(Shan等，Science2972275-2279(2002)；Hausch et al.，Am.J.Physiol.Gastrointest Liver Physiol.283G996-G1003(2002))。相對大片段的醇溶蛋白能抵抗消化酶的降解，而且，這種肽是來自被麩質(zhì)刺激的CD病人腸組織不同的HLA-DQ2-限制性T-細(xì)胞克隆的潛在的刺激物。每個這樣的T-細(xì)胞克隆識別不同的33mer抗原決定部位。脯氨酰胞內(nèi)肽酶，偏愛Pro-Xaa-Pro結(jié)構(gòu)域，能夠切開33mer的醇溶蛋白肽，和刷狀緣的氨肽酶的協(xié)調(diào)效應(yīng)，迅速減少這些肽的T-細(xì)胞刺激潛力。
盡管在大麥和黑麥有穩(wěn)定的同源物，這些已經(jīng)描述的抵抗消化道降解的gluten肽結(jié)構(gòu)域在我們的案例中作為不同LAP的模式底物，單獨(dú)或同ruDPPIV聯(lián)合一起消化對應(yīng)于α/β醇溶蛋白AIV(P04724)82-95片段PQPQLPYPQPQLPY(SEQ ID NO42)(14mer)或?qū)?yīng)于醇溶蛋白MM1(P18573)57-89片段的LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF(SEQ IDNO43)(33mer)。
33mer的N-端乙酰化的形式(Ac-33mer)也被合成作為酶切試驗(yàn)的對照。通過一種雜質(zhì)酶用外肽酶去干擾內(nèi)肽酶的酶切。
被用于評估的酶有ruLAP1(Trichophyton rubrum的氨肽酶I)、ruLAP2(Trichophytonrubrum的氨肽酶II)、或LAP2(Aspergillus orizae的氨肽酶II)、fuLAP2(Aspergillusfumigatus的氨肽酶II)、MicpkLAP(來自豬腎的微粒體亮氨酸氨肽酶，Sigma)、CytpkLAP(來自豬腎的胞質(zhì)亮氨酸氨肽酶，Sigma)和ruDPPIV。
多肽的合成采用固相合成的方法。在Applied Biosystems的custom-modified 430A型態(tài)合成儀上進(jìn)行，用原位neutralization/2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1，1，1，3，3tetramethyluronium hexa fluoro-phosphate(HBTU)activation試劑盒，在standard-O-CHz-phenylacetamidomethyl resin逐步的進(jìn)行Boc化學(xué)鏈延長(Schnlzer等，Int.J.Peptide Protein Res.40180-193(1992))。
在合成結(jié)束時，用無水HF在0℃處理1小時，用5％對-甲酚作為凈化劑，肽被去保護(hù)并被從樹脂上切下。切下后，用冰凍的乙醚沉淀合成的肽，溶解在乙腈水溶液中，凍干。用RP-HPLC的方法純化肽，使用來自Waters的C18柱，線性梯度的緩沖B(99％乙腈/10％H2O/0.1％三氟乙酸)，在緩沖液A(H2O/0.1％三氟乙酸)，214nm下紫外檢測。使用PlatformII設(shè)備(Micromass，Manchester，England)用electrospray質(zhì)譜對樣品進(jìn)行分析。
降解反應(yīng)的條件溫育在37℃，PH7.2的50mM Tris-HCl中進(jìn)行，1mM CoCl2，底物濃度1mg/ml，E/S比例為1∶20。用乙酸酸化中止反應(yīng)，在C8z柱上用RP-HPLC進(jìn)行中點(diǎn)分析，在0.1％TFA中用2％/分鐘乙腈梯度。所有的峰由ESI-MS確認(rèn)。
14mer的消化如圖6所示，在4小時內(nèi)14mer沒有被ruLAP2消化。和對照相比，HPLC譜沒有變化。實(shí)際上，消化僅僅切除了N-末端的脯氨酸。另一方面，補(bǔ)充ruDPPIV導(dǎo)致完全降解成氨基酸和二肽，ruDPPIV自身不能水解肽。(圖7)33mer的消化單獨(dú)用ruLAP2消化33mer導(dǎo)致在4小時內(nèi)肽的部分降解(少于50％)。這個肽不是ruDPPIV的底物(圖8)。然而，當(dāng)兩種酶被混合在一起，33mer被完全消化(圖9)成氨基酸和二肽，其中的一些能夠被ESI-MS鑒定(Y、L、F、P、PY和PF)。
當(dāng)ruDPPIV和ruLAP2或fuLAP2混合時，得到相同的HPLC波形。然而，和ruLAP1混和時，一些高分子量的成分仍然存在，少于10％是初始的底物。
另一方面，和豬腎微粒體氨肽酶一起溫育導(dǎo)致僅僅部分N-末端Leu和C-末端phe被部分除去(由于Carboxypeptidasic污染)，添加DPPIV并不改變HPLC圖譜。胞質(zhì)的豬腎氨肽酶對33mer完全沒有活性。
在LAP或DPPIV單獨(dú)的或混合在一起的消化實(shí)驗(yàn)中，Ac-醇溶蛋白33mer的穩(wěn)定性進(jìn)一步證實(shí)自由的氨基基團(tuán)是醇溶蛋白33mer被這些外肽酶完全降解所必須的。
用其他酶消化用鏈霉蛋白酶(E/S＝1/25)消化超過20小時僅部分(少于40％)水解，加入ruLAP2(兩種酶都以E/S＝1/50的比率)沒有提高水解性。另一方面，在相同條件下加入DPPIV導(dǎo)致肽的完全降解，因?yàn)榘彪拿负投碾拿傅膮f(xié)同作用。Chtmotrypsin單獨(dú)或和ruLAP或DPPIV混和不能降解肽。
實(shí)施例9ruLAP2在表達(dá)融合其他蛋白的重組蛋白的過程中或添加N-末端標(biāo)簽中的應(yīng)用LAP2被鑒定酶切proNPY N末端的Gly-Ser以及同一個肽的N-末端另外一個Ala。為了增加LAP2單獨(dú)或/和其他外肽酶結(jié)合時在加工較大重組蛋白過程中應(yīng)用，一個有N-末端Met-Thr-Pro序列的G-CSF重組蛋白(Cys17→Ser，Lys16，23，34，40→Arg)被依次和ruLAP2和ruDPPIV溫育，從有175個殘基的蛋白上依次除去met和Thr-Pro二肽。
ruLAP2消化Gly-Ser-ProNPY1mg/ml肽加入50mM Tris-HCl，1mM CoCl2緩沖液中和ruLAP2以E/S比率以1∶20和1∶100(W∶W)混合，37℃溫育過夜。用RP-HPLC分離酶切材料，用ESI-MS鑒定。如圖10所示，和ruLAP2溫育結(jié)果是切去N-端的兩個殘基，理論上損失144.1amu(發(fā)現(xiàn)的144.2)E/S比率為1∶100得到相同的結(jié)果。當(dāng)酶到達(dá)Xaa-Pro結(jié)構(gòu)域時酶切停止，在proNPY的結(jié)構(gòu)域是Tyr-Pro。
ruLAP2消化Ala-ProNPY消化條件和Gly-Ser-ProNPY的相同。圖11B顯示N-末端的丙氨酸差不多被全部從ProNPY中除去(分子量損失71amu)。
從C-CSF的N-末端依次切去甲硫氨酸和Thr-Pro被用于這些試驗(yàn)的是名為TG47的一種G-CSF的突變類似物，它是methinoyl-[C17S，K16，23，34，40R]G-CSF，其重新折疊的蛋白質(zhì)理論上的質(zhì)量是18894.90。
用ruLAP2消化將G-CSF的貯備液(在含0.1％Sarcosyl PBS中濃度為1.9mg/ml)稀釋4倍至pH7.2的50mM Tris-HCl中，含1mM CoCl2。和ruLAP2(E/S＝1∶20和1∶100，W∶W)在37℃溫育15小時。用30％(V∶V)乙腈稀釋溶液，乙酸酸化，RP-HPLC分離蛋白質(zhì)，進(jìn)行MS分析。如圖12A和B所示，過夜溫育導(dǎo)致N-末端甲硫氨酸完全切除。理論上質(zhì)量損失131.2amu。在E/S比率為1∶100時，過夜溫育后，仍有痕量未被切開的物質(zhì)存在。
為了從半-制備的RP-HPLC柱上分離截短的物質(zhì)，該實(shí)驗(yàn)在2mg尺度上被重復(fù)。以E/S比率1∶25(W∶W)在37℃條件下消化15小時以上。分離到的物質(zhì)(0.8mg)通過ESI-MS鑒定(圖12B，desMet-G-CSF，計(jì)算分子量為18763.7amu，實(shí)測分子質(zhì)量為18762.5)。
DPPIV消化desMet-G-CSF凍干的材料重新溶于pH7.5的含0.1％Sarcosyl的50mM Tris-HCl中，濃度為1mg/ml。和DPPIV以E/S比率1/20(W∶W)在37℃溫育過夜。像以前一樣用RP-HPLC分離蛋白質(zhì)，用ESI-MS鑒定(圖13A和13B)。DPPIV消化(圖13B)結(jié)果是切除N-末端二肽Thr-Pro(計(jì)算的分子量為18,564.8amu，實(shí)測分子質(zhì)量為18,563)。在反應(yīng)介質(zhì)中，痕量的未消化物質(zhì)仍然存在。
于是，依次應(yīng)用LAP2和DPPIV的結(jié)果是有效地移去重組蛋白N-末端序列。當(dāng)酶到達(dá)一個“停止點(diǎn)結(jié)構(gòu)域”，如Xaa-Pro-Xaa，或Xaa-Pro結(jié)構(gòu)域，它們可能是LAP2特異的停止點(diǎn)，RuLAP2的消化被終止，但可被DPPIV依次切去。
然而，對N-末端殘基切除的起始高度依賴于序列，因?yàn)樵谂cLAP和DPPIV一起溫育時，Met(His)6標(biāo)記沒有從Met(His)6-proPNY中除去。
其他實(shí)施方案盡管以上實(shí)施例詳細(xì)的描述了本發(fā)明，但僅用來說明本發(fā)明目的，而不是用來限制本發(fā)明的權(quán)利要求范圍。特別的是，可預(yù)測到不偏離本發(fā)明精神和范圍的的不同的替換、改變和修飾均屬于本發(fā)明權(quán)利要求范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員知曉的有關(guān)重組的核酸起始原料、涉及的克隆或文庫類型等方面的選擇均認(rèn)為是常規(guī)選擇。其他的方面，如優(yōu)勢和修飾也被認(rèn)為屬于以下權(quán)利要求范圍內(nèi)。
序列表<110>富諾齊梅生物技術(shù)股份有限公司<120>一種新的真菌蛋白及其編碼核酸<130>PFD1060017F-CF<150>US 60/498,398<151>2003-08-25<160>35<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1757<212>DNA<213>紅色毛癬菌(T.rubrum)<400>1atgaagtcgc aactgttgag cctggctgtg gccgtcacaa ccatctccca gggcgttgtt 60ggtcaagagc ccttcggatg gcctttcaag cctatggtca ctcaggtgag ttgctctcaa 120cagatcgatc gatcgatcta cctttgtccc tgtcacatca aactccagca gagccaaaga 180aacagacaca atgttcctgg ggaattctta tgggctaatg taaatgtata ggatgacctg 240caaaacaaga taaagctcaa ggatatcatg gcaggcgtcg agaagctgca aagcttttct 300gatgctcatc ctgaaaagaa ccgagtgttt ggtggtaatg gccacaagga cactgtagag 360tggatctaca atgagatcaa ggccactggc tactacgatg tgaagaagca ggagcaagta 420cacctgtggt ctcatgccga ggctgctctc aatgccaatg gcaaggacct caaggccagc 480gccatgtcct acagccctcc tgccagcaag atcatggctg agcttgttgt tgccaagaac 540aatggctgca atgctgtatg tgccatacac tttctatacg tcacattctc tctagaatga 600agagcacggg agaactaact ttatgtatac agactgatta cccagcgaac actcagggca 660agatcgtcct cgttgagcgt ggtgtctgca gcttcggcga gaagtctgct caggctggtg 720atgcaaaggc tgctggtgcc attgtctaca acaacgtccc cggatccctt gctggcactc 780ttggtggcct tgacaagcgc catgtcccaa ccgctggtct ttcccaggag gatggaaaga 840accttgctac cctcgttgct tctggtaaga ttgatgtcac catgaacgtt atcagtctgt 900
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165 170 175Ala Gly Ala Ile Val Tyr Asn Asn Val Pro Gly Ser Leu Ala Gly Thr180 185 190Leu Gly Gly Leu Asp Lys Arg His Val Pro Thr Ala Gly Leu Ser Gln195 200 205Glu Asp Gly Lys Asn Leu Ala Thr Leu Val Ala Ser Gly Lys Ile Asp210 215 220Val Thr Met Asn Val Ile Ser Leu Phe Glu Asn Arg Thr Thr Trp Asn225 230 235 240Val Ile Ala Glu Thr Lys Gly Gly Asp His Asn Asn Val Ile Met Leu245 250 255Gly Ala His Ser Asp Ser Val Asp Ala Gly Pro Gly Ile Asn Asp Asn260 265 270Gly Ser Gly Ser Ile Gly Ile Met Thr Val Ala Lys Ala Leu Thr Asn275 280 285Phe Lys Leu Asn Asn Ala Val Arg Phe Ala Trp Trp Thr Ala Glu Glu290 295 300Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Phe Tyr Val Asn Ser Leu Asp Asp Arg305 310 315 320Glu Leu His Lys Val Lys Leu Tyr Leu Asn Phe Asp Met Ile Gly Ser325 330 335Pro Asn Phe Ala Asn Gln Ile Tyr Asp Gly Asp Gly Ser Ala Tyr Asn340 345 350Met Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Phe Glu Lys355 360 365Phe Phe Asp Asp Gln Gly Ile Pro His Gln Pro Thr Ala Phe Thr Gly370 375 380Arg Ser Asp Tyr Ser Ala Phe Ile Lys Arg Asn Val Pro Ala Gly Gly385 390 395 400Leu Phe Thr Gly Ala Glu Val Val Lys Thr Pro Glu Gln Val Lys Leu405 410 415Phe Gly Gly Glu Ala Gly Val Ala Tyr Asp Lys Asn Tyr His Arg Lys420 425 430Gly Asp Thr Val Ala Asn Ile Asn Lys Gly Ala Ile Phe Leu Asn Thr435 440 445Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Ile Ala Glu Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Gly450 455 460
Phe Pro Thr Arg Pro Lys Thr Gly Lys Arg Asp Val Asn Pro Gln Tyr465 470 475 480Ser Lys Met Pro Gly Gly Gly Cys Gly His His Thr Val Phe Met485 490 495<210>4<211>1256<212>DNA<213>紅色毛癬菌(T.rubrum)<400>4atgaagctcc tctctgttct tgcgctgagc gctaccgcta cctccgtcct cggagctagc 60attcctgttg atgcccgggc cgagaagttc ctcatcgaac ttgcccctgg tgagactcgc 120tgggttaccg aggaggagaa gtgggagctt aagcgggtat gtaccactat cctacgcaaa 180agttgtattt tcactagata atattggtta ttaacaccca ttctagaagg gtcaagactt 240ctttgacatc actgacgagg aggttggatt cactgctgct gttgcacagc cagccattgc 300ctacccaacc tccatccgcc atgctaatgc tgttaacgcc atgattgcta ccctctccaa 360ggagaacatg cagcgcgatc tgaccaagct cagctcgttc caaaccgctt actataaggt 420tgactttggc aagcagtctg ccacctggct ccaggagcaa gtccaggctg ccatcaatac 480cgctggtgcc aatcgctacg gagccaaggt cgccagcttc cgacacaact tcgctcagca 540cagcatcatt gccactattc ccggccgctc ccctgaagtc gttgtcgtcg gtgctcacca 600agacagcatc aaccaacgca gccccatgac cggccgcgct ccaggtgccg atgacaacgg 660cagtggctcc gtcaccatcc ttgaggccct ccgtggtgtt ctccgggacc agaccatcct 720ccagggcaag gctgccaaca ccattgagtt ccactggtac gccggtgagg aagctggtct 780tctgggctcc caggccatct tcgccaacta caaacagacc ggcaagaagg tcaagggcat 840gctcaaccag gacatgaccg gttacatcaa gggaatggtc gacaagggtc tcaaggtgtc 900cttcggtatc atcaccgaca acgtcaacgc taacttgacc aagttcgtcc gcatggtcat 960caccaaggta agcttcaact cttgataaat atatttttca tcgatgaaat gatgtcctaa1020taatgcttaa gtactgctca atcccaacca tcgacacccg ctgcggctat gcttgctctg1080accacgcctc tgccaaccgc aatggctacc catctgccat ggttgccgag tctcccatcg1140atctcctcga ccctcacctc cacactgact ctgacaacat tagctacctc gacttcgacc1200acatgatcga gcacgctaag ctcattgtcg gcttcgtcac tgagctcgct aagtaa1256<210>5<211>1122<212>DNA<213>紅色毛癬菌(T.rubrum)
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tctggatgaa cggtggcccg ggtagctcgt cgatgtttgg aatgatgact gagaacgggc 420cttgcttcgt caatgcagac tccaattcta ctcgcctgaa ccctcattct tggaacaatg 480aaggtatgcc atcagcttct gatggaaaac taaatattgc taacattgta ctttctgtga 540ctagtcaata tgctgtatat agaccagcca gtgcaggtcg gtctgtccta cgacactttg 600gccaacttca ccaggaatct agtcacggat gagatcacga aactgaaacc cggagaacct 660attccggaac agaatgccac tttcctggta ggtacatatg caagccgcaa tatgaacacc 720actgcacacg gaactaggca tgctgccatg gctctctggc acttcgccca agtctggttc 780caagagttcc caggatatca ccctaggaac aacaagatca gcattgctac cgaatcctac 840ggcggccgtt atggcccggc ctttactgcc ttctttgaag agcagaacca gaagatcaag 900aacggcacat ggaagggaca cgagggaact atgcacgtgc tgcatctcga caccctcatg 960atcgtcaacg gatgcatcga ccgtcttgtc caatggccgg catatccgca aatggcgtac1020aacaacacat atagcatcga ggcagtcaac gccagcattc atgcaggaat gctggatgcc1080ctctaccgcg acggtggctg tcgagacaag attaaccact gccgctccct ctcttctgtg1140ttcgatcctg agaatctcgg catcaactca accgtcaatg atgtctgcaa ggatgccgag1200acattctgct ccaatgatgt tcgcgatccc tacctcaagt tctctggccg caactactat1260gacatcggac agcttgaccc cagcccattc ccagcaccat tttacatggc ctggctaaat1320cagccgcatg tgcaggcagc actgggtgtg ccacttaact ggacacagtc aaacgatgtt1380gtgtctaccg cattccgtgc aattggtgac taccctcggc cagggtggct ggagaacctg1440gcttatttgc tggagaatgg catcaaggtt tcgcttgttt acggtgatcg ggactacgca1500tgcaactggt tcggtggtga gctctcaagt ctgggaatca actacactga cacccacgaa1560ttccataatg ccggctatgc aggtatccag atcaatagca gctacatcgg tggacaggtg1620aggcagtacg gcaacctctc cttcgcccgc gtctacgagg ccggccatga ggtgccatcg1680taccaacccg agactgcact gcagatattc caccgttccc tgttcaacaa ggatatcgct1740actggaacca aggacacgtc atcgcgcatg gacggaggca agttttacgg cacctcgggc1800cctgcggact cgtttggttt caagaacaaa cctccaccgc agcacgtcca cttctgtcat1860atcttagaca ccagcacctg caccaaggag cagatccagt cagttgagaa cggcactgcc1920gccgtacgca gctggatcat tgtcgactcc aactcgacct ctctgttccc cgaggtagtt1980ggctcagggg aacccacgcc aacccctatg cctggagggg ctactacact atctgctcac2040gggttcttgt atggcgtgac attatgggct gttattgttg tagctgttat agagctggca2100atgtaa 2106<210>14<211>1989<212>DNA<213>紅色毛癬菌(T.rubrum)<400>14
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<211>1488<212>DNA<213>須癬毛癬菌(T.mentagrophytes)<400>32atgaagtcgc aactgttgag cctagccgtg gccgtcacca ccatttccca gggcgttgtt 60ggtcaagagc cctttggatg gcccttcaag cctatggtca ctcaggatga cctgcaaaac 120aagattaagc tcaaggatat catggcaggt gtcgagaagc tgcaaagctt ttctgatgct 180catcctgaaa agaaccgagt gttcggtggt aatggccaca aggacactgt cgagtggatc 240tacaatgagc tcaaggccac cggctactac aatgtgaaga agcaggagca ggtacacctg 300tggtctcacg ctgaggccgc tctcagtgcc aatggcaagg acctcaaggc cagcgccatg 360tcgtacagcc ctcctgccaa caagatcatg gccgagcttg tcgttgccaa gaacaatggc 420tgcaatgcta ccgattaccc agagaacact cagggaaaga tagtcctcat tcagcgtggt 480gtctgcagct tcggcgagaa gtcttctcag gctggtgatg cgaaggctat tggtgccgtt 540gtctacaaca acgtccccgg atcccttgct ggcactcttg gtggccttga caagcgccat 600gtcccaaccg ctggtctttc ccaggaggat ggaaagaatc ttgctagcct cgttgcttct 660ggcaaggttg atgtcaccat gaacgttgtc agtctgtttg agaaccgaac cacctggaac 720gtcattgctg agaccaaggg aggagaccac aacaatgttg tcatgcttgg tgctcactcc 780gactccgtcg atgccggccc cggtatcaac gacaacggct ccggctccat tggtatcatg 840accgttgcca aagcccttac taacttcaag ctcaacaacg ccgttcgctt tgcctggtgg 900accgctgagg aattcggtct ccttggaagc accttctacg tcgacagcct tgatgaccgt 960gagctgcaca aggtcaagct gtacctcaac ttcgacatga tcggctctcc caacttcgcc1020aaccagatct acgacggtga cggttcggcc tacaacatga ctggtcccgc tggctctgct1080gaaatcgagt acctgttcga gaagttcttt gacgaccagg gtctcccaca ccagcccact1140gccttcaccg gccgatccga ctactctgca ttcatcaagc gcaacgtccc cgctggaggt1200cttttcactg gtgccgaggt tgtcaagacc cccgagcaag ttaagctgtt cggtggtgag1260gctggcgttg cctatgacaa gaactaccat ggcaagggtg acaccgttgc caacatcaac1320aagggagcta tcttccttaa cactcgagca atcgcctact ctgtggccga gtatgctcga1380tccctcaagg gcttcccaac ccgcccaaag accggcaagc gtgccgtcaa ccctcagtat1440gctaagatgc ctggtggtgg ttgcggacac cacactgtct tcatgtaa 1488<210>33<211>495<212>PRT<213>須癬毛癬菌(T.mentagrophytes)<400>33Met Lys Ser Gln Leu Leu Ser Leu Ala Val Ala Val Thr Thr Ile Ser
1 5 10 15Gln Gly Val Val Gly Gln Glu Pro Phe Gly Trp Pro Phe Lys Pro Met20 25 30Val Thr Gln Asp Asp Leu Gln Asn Lys Ile Lys Leu Lys Asp Ile Met35 40 45Ala Gly Val Glu Lys Leu Gln Ser Phe Ser Asp Ala His Pro Glu Lys50 55 60Asn Arg Val Phe Gly Gly Asn Gly His Lys Asp Thr Val Glu Trp Ile65 70 75 80Tyr Asn Glu Leu Lys Ala Thr Gly Tyr Tyr Asn Val Lys Lys Gln Glu85 90 95Gln Val His Leu Trp Ser His Ala Glu Ala Ala Leu Ser Ala Asn Gly100 105 110Lys Asp Leu Lys Ala Ser Ala Met Ser Tyr Ser Pro Pro Ala Asn Lys115 120 125Ile Met Ala Glu Leu Val Val Ala Lys Asn Asn Gly Cys Asn Ala Thr130 135 140Asp Tyr Pro Glu Asn Thr Gln Gly Lys Ile Val Leu Ile Gln Arg Gly145 150 155 160Val Cys Ser Phe Gly Glu Lys Ser Ser Gln Ala Gly Asp Ala Lys Ala165 170 175Ile Gly Ala Val Val Tyr Asn Asn Val Pro Gly Ser Leu Ala Gly Thr180 185 190Leu Gly Gly Leu Asp Lys Arg His Val Pro Thr Ala Gly Leu Ser Gln195 200 205Glu Asp Gly Lys Asn Leu Ala Ser Leu Val Ala Ser Gly Lys Val Asp210 215 220Val Thr Met Asn Val Val Ser Leu Phe Glu Asn Arg Thr Thr Trp Asn225 230 235 240Val Ile Ala Glu Thr Lys Gly Gly Asp His Asn Asn Val Val Met Leu245 250 255Gly Ala His Ser Asp Ser Val Asp Ala Gly Pro Gly Ile Asn Asp Asn260 265 270Gly Ser Gly Ser Ile Gly Ile Met Thr Val Ala Lys Ala Leu Thr Asn275 280 285Phe Lys Leu Asn Asn Ala Val Arg Phe Ala Trp Trp Thr Ala Glu Glu290 295 300
Phe Gly Leu Leu Gly Ser Thr Phe Tyr Val Asp Ser Leu Asp Asp Arg305 310 315 320Glu Leu His Lys Val Lys Leu Tyr Leu Asn Phe Asp Met Ile Gly Ser325 330 335Pro Asn Phe Ala Asn Gln Ile Tyr Asp Gly Asp Gly Ser Ala Tyr Asn340 345 350Met Thr Gly Pro Ala Gly Ser Ala Glu Ile Glu Tyr Leu Phe Glu Lys355 360 365Phe Phe Asp Asp Gln Gly Leu Pro His Gln Pro Thr Ala Phe Thr Gly370 375 380Arg Ser Asp Tyr Ser Ala Phe Ile Lys Arg Asn Val Pro Ala Gly Gly385 390 395 400Leu Phe Thr Gly Ala Glu Val Val Lys Thr Pro Glu Gln Val Lys Leu405 410 415Phe Gly Gly Glu Ala Gly Val Ala Tyr Asp Lys Asn Tyr His Gly Lys420 425 430Gly Asp Thr Val Ala Asn Ile Asn Lys Gly Ala Ile Phe Leu Asn Thr435 440 445Arg Ala Ile Ala Tyr Ser Val Ala Glu Tyr Ala Arg Ser Leu Lys Gly450 455 460Phe Pro Thr Arg Pro Lys Thr Gly Lys Arg Ala Val Asn Pro Gln Tyr465 470 475 480Ala Lys Met Pro Gly Gly Gly Cys Gly His His Thr Val Phe Met485 490 495<210>34<211>2328<212>DNA<213>紅色毛癬菌(T.rubrum)<400>34atgaagctcc tctcgctact tatgctggcg ggcatcgccc aagccatcgt tcctcctcgt 60gagccccgtt caccaactgg tggcggcaac aagctgttga cctacaagga gtgtgtccct 120agagctacta tctctccaag gtcgacgtcc cttgcctgga ttaacagtga agaagatggc 180cggtacatct cccagtccga cgatggagca ttgatcctcc agaacatcgt cacgaacacc 240aacaagactc tcgtggccgc agacaaggta cccaagggtt actatgacta ctggttcaag 300ccagaccttt ctgctgtctt atgggcaacc aattacacca agcagtaccg tcactcttac 360
tttgccaact acttcattct agacatcaaa aagggatcgt tgacccctct agcccaggac 420caggctggtg acatccagta tgctcaatgg agccccatga acaactctat cgcctatgtc 480cgtggaaacg acctgtatat ctggaacaat ggcaagacca agcgtattac cgaaaatggc 540ggcccggata tcttcaatgg tgtccctgac tgggtatacg aggaagaaat cttcggggac 600cggttcgctc tttggttctc acctgacggt gaataccttg cgtacctccg ctttaacgag 660actggagtcc cgacctacac tattccgtac tacaagaaca agcaaaagat tgcccctgcc 720tacccaaggg agctggagat ccgttaccct aaagtctctg cgaagaaccc aaccgtgcag 780ttccacctgt taaacattgc ttcatcccag gagacaacta tcccagttac tgcgttcccg 840gaaaacgatc ttgtgatcgg tgaggttgct tggctcagca gtggccatga tagtgtagca 900tatcgtgctt tcaaccgtgt ccaggataga gaaaagattg tcagcgtcaa ggttgagtcc 960aaggaatcca aggttattcg cgaaagagat ggcaccgacg gctggatcga caaccttctc1020tccatgtcat atatcggaaa cgttaacggc aaggagtact acgtcgatat atctgatgct1080tctggctggg cacatatcta cctctacccg gttgatggag gaaaggagat tgcactaaca1140aagggagaat gggaagtcgt tgccattctc aaggttgaca cgaagaagaa gctgatctac1200ttcacctcta ccaaatatca cagcaccact cgacacgtct actctgtctc gtatgacaca1260aaggtcatga cccctctcgt caacgataag gaggctgcgt actacactgc atccttctcg1320gccaagggtg gttactatat cttgtcctac caaggtccaa atgttccata ccaagaactt1380tactccacca aggacagtaa gaagcctctc aagacaatca ctagcaatga tgcattgctc1440gagaagctga aggagtacaa gctccccaag gttagcttct ttgagatcaa gcttccatct1500ggtgaaaccc ttaatgttaa gcaacgccta ccacctaact tcaacccaca caagaagtac1560cccgtcctct tcactccgta tggtggccct ggtgcccaag aggtaagcca ggcatggaat1620tcattggact tcaagtccta cattacatct gaccctgagc ttgaatacgt tacctggact1680gttgacaacc gtggaaccgg ctacaagggc cgcaagttcc gcagcgccgt agctaagcgt1740ctcggtttcc tcgaagccca ggaccaggtc tttgctgcta aggaggtgct gaaaaaccgt1800tgggctgata aggaccatat tggaatctgg ggctggagct atggcggctt cctgaccgct1860aagaccctcg agaccgacag tggtgtattc acttttggta tcagtactgc tcctgtctct1920gatttcagac tctacgacag catgtacact gagcgttaca tgaagaccgt tgaactaaac1980gctgacggct acagtgagac cgccgtgcac aaggttgatg gctttaagaa cctcaaaggt2040cattacttca tccagcatgg aaccggtgac gacaacgtcc acttccaaaa cgccgctgtc2100ctttccaaca ccctgatgaa cggcggtgta actgcagaca agttgactac tcagtggttt2160actgactcgg accacggcat cagatacgat atggactcca cttaccagta caagcagctt2220tctaagatgg tctacgacca gaagcaacga aggccagaaa gcccaccaat gcaccaatgg2280agcaagagag ttttggctgc cctgtttggt gagagggcag aggaatga 2328<210>35<211>775<212>PRT
<213>紅色毛癬菌(T.rubrum)<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(162)..(612)<223>X<400>35Met Lys Leu Leu Ser Leu Leu Met Leu Ala Gly Ile Ala Gln Ala Ile1 5 10 15Val Pro Pro Arg Glu Pro Arg Ser Pro Thr Gly Gly Gly Asn Lys Leu20 25 30Leu Thr Tyr Lys Glu Cys Val Pro Arg Ala Thr Ile Ser Pro Arg Ser35 40 45Thr Ser Leu Ala Trp Ile Asn Ser Glu Glu Asp Gly Arg Tyr Ile Ser50 55 60Gln Ser Asp Asp Gly Ala Leu Ile Leu Gln Asn Ile Val Thr Asn Thr65 70 75 80Asn Lys Thr Leu Val Ala Ala Asp Lys Val Pro Lys Gly Tyr Tyr Asp85 90 95Tyr Trp Phe Lys Pro Asp Leu Ser Ala Val Leu Trp Ala Thr Asn Tyr100 105 110Thr Lys Gln Tyr Arg His Ser Tyr Phe Ala Asn Tyr Phe Ile Leu Asp115 120 125Ile Lys Lys Gly Ser Leu Thr Pro Leu Ala Gln Asp Gln Ala Gly Asp130 135 140Ile Gln Tyr Ala Gln Trp Ser Pro Met Asn Asn Ser Ile Ala Tyr Val145 150 155 160Arg Xaa Asn Asp Leu Tyr Ile Trp Asn Asn Gly Lys Thr Lys Arg Ile165 170 175Thr Glu Asn Gly Gly Pro Asp Ile Phe Asn Gly Val Pro Asp Trp Val180 185 190Tyr Glu Glu Glu Ile Phe Gly Asp Arg Phe Ala Leu Trp Phe Ser Pro195 200 205Asp Gly Glu Tyr Leu Ala Tyr Leu Arg Phe Asn Glu Thr Gly Val Pro210 215 220Thr Tyr Thr Ile Pro Tyr Tyr Lys Asn Lys Gln Lys Ile Ala Pro Ala
225 230 235 240Tyr Pro Arg Glu Leu Glu Ile Arg Tyr Pro Lys Val Ser Ala Lys Asn245 250 255Pro Thr Val Gln Phe His Leu Leu Asn Ile Ala Ser Ser Gln Glu Thr260 265 270Thr Ile Pro Val Thr Ala Phe Pro Glu Asn Asp Leu Val Ile Gly Glu275 280 285Val Ala Trp Leu Ser Ser Gly His Asp Ser Val Ala Tyr Arg Ala Phe290 295 300Asn Arg Val Gln Asp Arg Glu Lys Ile Val Ser Val Lys Val Glu Ser305 310 315 320Lys Glu Ser Lys Val Ile Arg Glu Arg Asp Gly Thr Asp Gly Trp Ile325 330 335Asp Asn Leu Leu Ser Met Ser Tyr Ile Gly Asn Val Asn Gly Lys Glu340 345 350Tyr Tyr Val Asp Ile Ser Asp Ala Ser Gly Trp Ala His Ile Tyr Leu355 360 365Tyr Pro Val Asp Gly Gly Lys Glu Ile Ala Leu Thr Lys Gly Glu Trp370 375 380Glu Val Val Ala Ile Leu Lys Val Asp Thr Lys Lys Lys Leu Ile Tyr385 390 395 400Phe Thr Ser Thr Lys Tyr His Ser Thr Thr Arg His Val Tyr Ser Val405 410 415Ser Tyr Asp Thr Lys Val Met Thr Pro Leu Val Asn Asp Lys Glu Ala420 425 430Ala Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Ala Lys Gly Gly Tyr Tyr Ile Leu435 440 445Ser Tyr Gln Gly Pro Asn Val Pro Tyr Gln Glu Leu Tyr Ser Thr Lys450 455 460Asp Ser Lys Lys Pro Leu Lys Thr Ile Thr Ser Asn Asp Ala Leu Leu465 470 475 480Glu Lys Leu Lys Glu Tyr Lys Leu Pro Lys Val Ser Phe Phe Glu Ile485 490 495Lys Leu Pro Ser Gly Glu Thr Leu Asn Val Lys Gln Arg Leu Pro Pro500 505 510Asn Phe Asn Pro His Lys Lys Tyr Pro Val Leu Phe Thr Pro Tyr Gly515 520 525
Gly Pro Gly Ala Gln Glu Val Ser Gln Ala Trp Asn Ser Leu Asp Phe530 535 540Lys Ser Tyr Ile Thr Ser Asp Pro Glu Leu Glu Tyr Val Thr Trp Thr545 550 555 560Val Asp Asn Arg Gly Thr Gly Tyr Lys Gly Arg Lys Phe Arg Ser Ala565 570 575Val Ala Lys Arg Leu Gly Phe Leu Glu Ala Gln Asp Gln Val Phe Ala580 585 590Ala Lys Glu Val Leu Lys Asn Arg Trp Ala Asp Lys Asp His Ile Gly595 600 605Ile Trp Gly Xaa Ser Tyr Gly Gly Phe Leu Thr Ala Lys Thr Leu Glu610 615 620Thr Asp Ser Gly Val Phe Thr Phe Gly Ile Ser Thr Ala Pro Val Ser625 630 635 640Asp Phe Arg Leu Tyr Asp Ser Met Tyr Thr Glu Arg Tyr Met Lys Thr645 650 655Val Glu Leu Asn Ala Asp Gly Tyr Ser Glu Thr Ala Val His Lys Val660 665 670Asp Gly Phe Lys Asn Leu Lys Gly His Tyr Leu Ile Gln His Gly Thr675 680 685Gly Asp Asp Asn Val His Phe Gln Asn Ala Ala Val Leu Ser Asn Thr690 695 700Leu Met Asn Gly Gly Val Thr Ala Asp Lys Leu Thr Thr Gln Trp Phe705 710 715 720Thr Asp Ser Asp His Gly Ile Arg Tyr Asp Met Asp Ser Thr Tyr Gln725 730 735Tyr Lys Gln Leu Ser Lys Met Val Tyr Asp Gln Lys Gln Arg Arg Pro740 745 750Glu Ser Pro Pro Met His Gln Trp Ser Lys Arg Val Leu Ala Ala Leu755 760 765Phe Gly Glu Arg Ala Glu Glu770 77權(quán)利要求
1.一種分離的多肽，含有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的成熟形式。
2.一種分離的多肽，含有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示的氨基酸序列。
3.一段分離的多肽，含有與選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列至少有90％同源的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述分離的多肽還包括與選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列天然發(fā)生等位變異的序列。
5.如權(quán)利要求3所述的多肽，其中所述分離的多肽具有氨肽酶或羧肽酶活性。
6.如權(quán)利要求5所述的多肽，其中所述的多肽是亮氨酸氨肽酶。
7.如權(quán)利要求6所述的多肽，其中所述的多肽是ruLAP2。
8.一種分離的多肽，其含有一個或多個選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的保守替換。
9.如權(quán)利要求8所述的多肽，其中所述的多肽具有氨肽酶活性。
10.如權(quán)利要求1所述的多肽，其中所述的多肽是天然產(chǎn)生的。
11.一種含有權(quán)利要求1所述的多肽和試劑的組合物。
12.一種試劑盒，其中一個或多個試劑內(nèi)含有權(quán)利要求11所述的組合物。
13.一種含有權(quán)利要求1所述的皮膚真菌。
14.如權(quán)利要求13所述的表皮寄生菌，其中所述皮膚真菌選自如下菌種絮狀表皮癬菌，奧杜盎小孢子菌、鐵銹色小孢子菌、同心性毛癬菌、卡那毛癬菌、麥格尼氏發(fā)癬菌、須癬發(fā)癬菌、羅比特斯克毛癬菌、紅色毛癬菌、許蘭氏毛癬菌、蘇丹毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、紫色毛癬菌、楊德氏發(fā)癬菌、犬小芽胞菌、馬類小孢子菌、豬小孢子菌、桃色小孢子菌、馬發(fā)癬菌、猴類毛癬菌、疣狀毛癬菌、石膏樣小孢子菌、阿耶羅毛癬菌和土生毛癬菌。
15.一種含有權(quán)利要求1所述多肽的微生物培養(yǎng)上清夜。
16.權(quán)利要求1所述的多肽在制備治療與其相關(guān)病理的人類疾病藥物中的應(yīng)用。
17.一種驗(yàn)證具有潛在治療真菌感染的治療物質(zhì)的方法，其中所述真菌感染與權(quán)利要求1所述的多肽表達(dá)異常或與其異常的生理相關(guān)作用相聯(lián)系，所述方法包括(a)提供一種能表達(dá)權(quán)利要求1所述多肽且具有所述多肽特性或功能的細(xì)胞；(b)將包含候選物質(zhì)的組合物與上述細(xì)胞接觸；(c)檢測候選物質(zhì)是否引起所述多肽功能特性的改變；其中，當(dāng)在有候選物質(zhì)存在時觀察到改變，而在不含候選物質(zhì)組合物與細(xì)胞接觸時同樣的改變沒有出現(xiàn)，那么該物質(zhì)被證明具有潛在的治療用途。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中所述功能特性是具有氨肽酶或羧肽酶活性。
19.一種治療哺乳動物疾病的方法，所述方法包括向動物給予一定量的多肽，使其病證減輕，其中所述多肽為含有與選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列至少有90％同源的多肽，或其具有活性的片段。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的疾病包括真菌感染、腹部疾病、消化道吸收不良、口炎性腹瀉、過敏反應(yīng)和酶不足。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的過敏反應(yīng)是對麩質(zhì)過敏。
22.一種治療哺乳動物疾病的方法，所述方法包括向動物給予一定量的蛋白酶抑制劑，使其病證減輕，其中所述蛋白酶抑制劑為含有的氨基酸序列為SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示至少有90％同源序列的多肽，或其具有活性的片段。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的疾病為真菌感染。
24.一種分離的核酸分子，含有選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示的核酸序列。
25.如權(quán)利要求24所述的核酸分子，其中所述的核酸分子是天然存在的。
26.一種核酸分子，其中所述核酸分子不是單獨(dú)的核苷，而是一種含有選自SEQ IDNOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示的核酸序列。
27.一種分離的核酸分子，其編碼一種含有選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35所示氨基酸序列的成熟多肽。
28.如權(quán)利要求24所述的核酸分子，其中所述的核酸分子可在嚴(yán)格條件下與選自下組的核酸序列雜交，所述的組由選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32、34或其互補(bǔ)序列物組成。
29.一種含有權(quán)利要求24所述核酸分子的載體。
30.如權(quán)利要求29所述的載體，還可以包含操控所述核酸分子的啟動子。
31.一種含有權(quán)利要求29所述載體的細(xì)胞。
32.一種制備權(quán)利要求1所述多肽的方法，所述方法包括在誘導(dǎo)表達(dá)所述多肽的環(huán)境下培養(yǎng)一種細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中含有已重組了選自SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示序列的核酸分子的載體。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的細(xì)胞選自真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
34.一種制備權(quán)利要求2所述多肽的方法，所述方法包括在能夠表達(dá)所述多肽的環(huán)境下培養(yǎng)一種細(xì)胞，其中所述細(xì)胞中含有已重組了SEQ ID NOs2、5、8、11、14、17、20、23、26、29、32和34所示序列的核酸分子的載體。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述的細(xì)胞選自真菌細(xì)胞、細(xì)菌細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
36.一種制備蛋白的方法，包括(a)在能足夠表達(dá)所述蛋白的環(huán)境下培養(yǎng)權(quán)利要求13所述的表皮膚真菌，(b)且從所述皮膚真菌中分離出來。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的蛋白是分泌型蛋白。
38.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的蛋白是氨肽酶或羧肽酶。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其中所述的蛋白是亮氨酸氨肽酶。
40.如權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的LAP是ruLAP2。
41.如權(quán)利要求36所述的方法，其中所述的表皮寄生菌選自絮狀表皮癬菌，奧杜盎小孢子菌、鐵銹色小孢子菌、同心性毛癬菌、卡那毛癬菌、麥格尼氏發(fā)癬菌、須癬發(fā)癬菌、羅比特斯克毛癬菌、紅色毛癬菌、許蘭氏毛癬菌、蘇丹毛癬菌、斷發(fā)毛癬菌、紫色毛癬菌、楊德氏發(fā)癬菌、犬小芽胞菌、馬類小孢子菌、豬小孢子菌、桃色小孢子菌、馬發(fā)癬菌、猴類毛癬菌、疣狀毛癬菌、石膏樣小孢子菌、阿耶羅毛癬菌和土生毛癬菌。
42.如權(quán)利要求36所述的方法，還可以包括向產(chǎn)物蛋白提供多肽底物。
43.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的產(chǎn)物蛋白降解多肽底物。
44.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的多肽底物的長度為2～200個氨基酸。
45.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的產(chǎn)物蛋白有序的消化一段全長的多肽底物。
46.一種治療真菌感染引起的疾病的方法，所述方法包括給予有效劑量的具有EXOX蛋白活性的一種抑制劑，其中EXOX蛋白選自SEQ ID NOs3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33和35。
47.如權(quán)利要求46所述的方法，其中所述的EXOX蛋白含有SEQ ID NO2。
48.一種降解多肽底物的方法，所述方法包括將一個或多個權(quán)利要求1所述的分離的多肽與多肽底物接觸。
49.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的多肽底物為全長的蛋白。
50.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的一個或多個分離的多肽有序的酶解多肽底物。
51.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的多肽底物選自如下組變性的酪蛋白、麩朊、谷朊、小牛血清蛋白或類似功能物。
52.如權(quán)利要求48所述的方法，其中所述的分離的多肽是一種氨肽酶。
53.如權(quán)利要求52所述的方法，其中所述的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其中所述的亮氨酸氨肽酶是ruLAP2。
55.如權(quán)利要求48所述的方法，還可以用一個或多個蛋白酶與多肽底物接觸。
56.如權(quán)利要求55所述的方法，其中所述的一個或多個蛋白酶選自如下組胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和蛋白酶K。
57.一種去除蛋白氨基末端氨基酸的方法，包括將蛋白與權(quán)利要求3所述的分離的多肽接觸。
58.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的蛋白氨基末端帶有組氨酸標(biāo)簽。
59.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述的蛋白氨基末端帶有Xaa-Pro標(biāo)簽。
60.如權(quán)利要求57所述的方法，其中所述Xaa是一種含有至少兩個相近親核部位的氨基酸。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述的氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸或半胱氨酸。
62.如權(quán)利要求3所述的分離的多肽，其中所述的多肽具有反蛋白水解活性。
63.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的產(chǎn)物蛋白添加一個或多個氨基酸到底物多肽上。
64.如權(quán)利要求42所述的方法，其中所述的產(chǎn)物蛋白去除多肽底物一個或多個氨基酸，使其成為一種被修飾多肽，然后所述的產(chǎn)物蛋白有序的將一個或多個氨基酸添加到被修飾多肽，這樣形成一種含特殊氨基酸序列多肽產(chǎn)物，與多肽底物相比。
65.一種在多肽底物添加一個或多個氨基酸的方法，所述方法包括將多肽底物與一種或多種權(quán)利要求3所述的分離的多肽接觸。
66.如權(quán)利要求48所述的方法，進(jìn)一步包括在充分的有序添加一個或多個氨基酸序列條件下，培育多肽底物與一個或多個分離的多肽一段時間。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種編碼新的多肽酶的真菌核酸序列。同時也提供該核酸序列編碼的多肽及其衍生物、變異體或上述多肽的片段、多聚核苷或抗體。新的亮氨酸氨肽酶(LAP)和其他氨肽酶或羧肽酶多肽是指本發(fā)明所述的EXOX核酸和蛋白，在醫(yī)學(xué)、研究和商業(yè)應(yīng)用上有著廣泛的用途。
文檔編號A61K38/00GK1871351SQ200480031420
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者米歇爾·莫諾, 雷托·斯托克林, 埃里克·格羅茨曼 申請人:富諾齊梅生物技術(shù)股份有限公司