專利名稱：干擾素－β復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有聚乙二醇的干擾素-β復(fù)合體，所述聚乙二醇特異性結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列第19或134位上的賴氨酸，并且涉及其生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
已知水溶性聚合物如聚乙二醇，當(dāng)結(jié)合以蛋白質(zhì)藥物為典型例子的生物分子時，以帶來如下效應(yīng)的方式賦予臨床用途，如提高的物理學(xué)和熱穩(wěn)定性、對蛋白酶的耐受性和溶解性，以及體內(nèi)分布體積的減少和血液中滯留的增強(qiáng)(見Inada等，J.Bioact and CompatiblePolymers 5，343(1990)；Delgado等，Critical Reviews in TherapeuticDrug Carrier Systems 9，249(1992)；和Katre，Advanced DrugDelivery Systems 10，91(1993))。
現(xiàn)有多種方法將天然干擾素-β或具有與天然干擾素-β相同一級結(jié)構(gòu)的干擾素-β結(jié)合到水溶性聚合物聚乙二醇(PEG)上。例如，Katre等已將賴氨酸等的氨基修飾應(yīng)用到干擾素-β的PEG化作用中(見美國專利號4766106和4917888和國際公開號WO87/00056)。具體地，他們報道了一種通過將具有300-100,000分子量的水溶性聚合物(PEG)結(jié)合到重組干擾素-β或IL-2上而獲得的綴合物，所述結(jié)合是通過其氨基酸序列中的1-10個賴氨酸殘基進(jìn)行的。備選地，在“Chemically modifiedlymphokine and production thereof”中已經(jīng)報道了將PEG結(jié)合到淋巴因子的氨基上的技術(shù)(見日本專利公開(Kokai)號60-226821A(1985))。不過，實(shí)際上，通過這些方法制得的結(jié)合PEG的干擾素-β具有減少到小于10％的干擾素-β活性并且不能進(jìn)行實(shí)際應(yīng)用。
以往尚無報道描述過將PEG選擇性地結(jié)合到干擾素-β中特定賴氨酸的氨基上的技術(shù)。如果可能選擇并且特異性修飾賴氨酸，使得由PEG結(jié)合引起的干擾素-β生物學(xué)活性的減弱比率最小化，則作為藥物給藥的蛋白質(zhì)總量的減少會導(dǎo)致對患者更少的副作用并且進(jìn)一步導(dǎo)致更容易的質(zhì)量控制。
另一方面，還已知一種方法，其使用不涉及賴氨酸殘基的還原性烷基化作用以便通過在適于所述干擾素的氨基端α氨基的選擇性活化的pH下的反應(yīng)，將水溶性聚合物選擇性地結(jié)合到干擾素的氨基端上(見日本專利公開(Kokai)號9-25298A(1997))。不過，實(shí)際上，通過這種方法進(jìn)行的干擾素-β的PEG化作用并不給出單-PEG化作用并且在任何賴氨酸殘基上或N末端都帶來非選擇性的PEG化作用，導(dǎo)致生成沒有充分抗病毒活性和細(xì)胞生長抑制活性的異質(zhì)混合物。
更重要的是，如Pepinsky等所報道的，還已知當(dāng)PEG具有高于20,000的分子量時純化的N末端結(jié)合PEG的干擾素-β具有顯著降低的殘留活性(相對于結(jié)合前干擾素-β活性的比率)，并且當(dāng)所述PEG具有40,000的分子量時完全缺失活性(見Pepinsky等，The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，vol.297，p1059-1066，(2001))。
對于干擾素-α，Bailon等曾生產(chǎn)出在賴氨酸殘基上用分枝的聚合物PEG非選擇性單-PEG化的干擾素-α，所述分枝的聚合物PEG具有40,000的分子量(Bailon等，Bioconjugate Chem.12，195(2001))。不過，他們報道如N末端結(jié)合PEG的干擾素-β的情形一樣，結(jié)合具有高達(dá)40,000分子量的PEG的干擾素-α的殘留活性顯著降低，為7％。
也就是說，直接應(yīng)用技術(shù)是困難的，所述技術(shù)是為了以低分子量PEG乃至高分子量PEG進(jìn)行修飾而發(fā)展出來的(結(jié)合的PEG的數(shù)目和位置)。因而，需要一種新技術(shù)來生產(chǎn)結(jié)合一定分子量PEG的高活性干擾素-β復(fù)合物，所述PEG具有足夠獲得諸如延長的體內(nèi)循環(huán)半壽期和減小的清除值的效應(yīng)所必需的分子量(20,000或更高)，所述延長的體內(nèi)循環(huán)半壽期和減小的清除值帶來作為藥物的用途。
如上所述，到目前為止尚無對賴氨酸殘基的選擇的報道，所述賴氨酸殘基有待進(jìn)行修飾以避免結(jié)合高分子量水溶性聚合物的干擾素-β活性的減弱，以及對于為此目的的技術(shù)的報道。而且，尚無高分子量水溶性聚合物如PEG選擇性結(jié)合到存在于干擾素-β中11個賴氨酸殘基中的任一個上產(chǎn)生高度活性干擾素-β復(fù)合物的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是發(fā)現(xiàn)一種干擾素-β復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，即使以高分子量物質(zhì)如聚乙二醇進(jìn)行修飾它也沒有生物學(xué)活性的損害，并且提供高效生產(chǎn)這種復(fù)合物的方法。特別地，本發(fā)明的一個目的是獲得即使結(jié)合具有高達(dá)40,000的分子量的PEG也會保留10％或更高的干擾素-β活性的干擾素-β復(fù)合物。
本發(fā)明人已經(jīng)進(jìn)行了許多種研究以達(dá)到所述目的并且因此發(fā)現(xiàn)天然干擾素-β在第80位上具有糖鏈連接的天冬酰胺，使其活性的減少最小化的方法是用高分子量物質(zhì)選擇性地修飾位于第19或134位上的賴氨酸殘基，從三維結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來看所述賴氨酸殘基最接近此天冬酰胺。即使當(dāng)使用具有超過10,000的分子量的聚合物(例如，PEG)時，所述聚合物選擇性結(jié)合到位于第19或134位上的賴氨酸也能夠最小化干擾素-β活性的減弱。
以往將位于第19位上的賴氨酸殘基列為應(yīng)當(dāng)在PEG結(jié)合到干擾素-β的氨基上時被去除的賴氨酸殘基之一(見國際公開號WO01/15736)。所以，這一結(jié)合位點(diǎn)不能由傳統(tǒng)技術(shù)所預(yù)期。至于位于第134位上的賴氨酸殘基，到目前為止尚無報道高分子量修飾物質(zhì)選擇性結(jié)合到這一位點(diǎn)上使得干擾素-β活性的減弱最小化。
也就是說，本發(fā)明提供一種方法來生產(chǎn)干擾素-β復(fù)合物，包括在至少一種選自由具有5個或更少糖單元的寡糖、單糖、其相應(yīng)的糖醇和C2-6多羥基醇構(gòu)成的組的添加劑存在的情況下，將干擾素-β結(jié)合到聚乙二醇上。本發(fā)明還提供由所述方法生產(chǎn)的干擾素-β復(fù)合物，特別是一種干擾素-β復(fù)合物，其特征在于所述復(fù)合物是通過將聚乙二醇特異性結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸殘基來生產(chǎn)的。
本發(fā)明的干擾素-β復(fù)合物具有高度血溶性、干擾素-β活性和物理學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性，并且可用作在干擾素-β應(yīng)用到的全部癥狀和疾病的治療、預(yù)防和緩解中的藥物。
附圖簡述

圖1是顯示干擾素-β復(fù)合物的Poros HS柱分離和純化的圖示，所述干擾素-β復(fù)合物具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的氨基的聚乙二醇。在該圖示中，上面的箭頭表示混合的溶劑B的比例，而下面的箭頭表示280nm上的吸光度；
圖2是顯示對通過干擾素-β復(fù)合物的Poros HS柱分離和純化所獲得的峰1-4(在附圖中為(i)-(iv))的組分進(jìn)行分析的結(jié)果的圖示，所述干擾素-β復(fù)合物具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的氨基的聚乙二醇，其中所述組分通過SDS-PAGE進(jìn)行分離并且隨后通過銀染進(jìn)行分析；圖3是顯示干擾素-β復(fù)合物的SP-5PW柱分離和純化的圖示，所述干擾素-β復(fù)合物具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的氨基的聚乙二醇；圖4是顯示干擾素-β復(fù)合物的氨基酸序列以及其中預(yù)測的賴氨酰基內(nèi)肽酶剪切位點(diǎn)的圖示；圖5是顯示在與具有40K分子量的PEG結(jié)合反應(yīng)之后用SP-5PW柱分離的峰2-4(在附圖中，用圓圈中的數(shù)字表示)的洗脫組分的肽圖譜(用賴氨?；鶅?nèi)肽酶處理)，以及在與PEG反應(yīng)之前干擾素-β的肽圖譜(在附圖中，用最下部分的Pre表示)的圖示；圖6是顯示干擾素-β在兔血液中滯留的圖示，所述干擾素-β具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的40K分子量的PEG；圖7是顯示干擾素-β在兔中誘導(dǎo)藥效標(biāo)記(2-5A合成酶活性)的時間進(jìn)程的圖示，所述干擾素-β具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的40K分子量的PEG；圖8是顯示分析由TOYOPEARL CM 650柱分離干擾素-β復(fù)合物獲得的峰級分的結(jié)果的圖示，所述干擾素-β復(fù)合物具有結(jié)合位于第134位上的賴氨酸的氨基的聚乙二醇，其中通過SDS-PAGE分析所述級分(A)，用SP-5PW柱進(jìn)一步分析峰3(在附圖中為(iii))的級分(B)(以洗脫的順序從下到上列出每次層析)；圖9是顯示具有2個或多個PEG分子的非選擇性多-PEG化的干擾素-β復(fù)合物以及具有選擇性結(jié)合位于第19或134位上的賴氨酸的PEG的單-PEG化的干擾素-β復(fù)合物的活性。在該圖中，用TOYOPEARL CM 650(S)柱(Tosoh)(B)獲得的層析圖，相應(yīng)于每種分離級分的SDS-PAGE分析的結(jié)果(A)，和抗病毒活性值/每種級分的蛋白的量以及相對于PEG結(jié)合前IFN-β比活性的活性保持率(C)彼此相關(guān)地進(jìn)行顯示；和圖10是顯示靜脈內(nèi)給藥到兔中的結(jié)合20,000(20K)-或40,000(40K)-分子量PEG的IFN-β復(fù)合物在血液中滯留的圖示。
本說明書包括在日本專利申請?zhí)?003-299850的說明書中所述的內(nèi)容，其作為本申請優(yōu)先權(quán)的基礎(chǔ)而起作用。
實(shí)施發(fā)明的最佳方式如上所述，本發(fā)明的方法能夠有效地將聚乙二醇結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列第19或第134位上的賴氨酸并且從中分離未結(jié)合的產(chǎn)物和副產(chǎn)物。
可以將天然干擾素-β，改自天然干擾素-β的具有糖鏈的干擾素-β，或者有或無糖鏈的重組干擾素-β用作實(shí)施本發(fā)明方法的干擾素-β。在本發(fā)明的方法中，可以將商業(yè)上現(xiàn)有的產(chǎn)品用作這種干擾素-β。天然干擾素-β在第80位上具有糖鏈連接的天冬酰胺，從三維結(jié)構(gòu)的觀點(diǎn)來看其最接近位于第19位上的賴氨酸。當(dāng)高分子量的PEG結(jié)合于其上時，優(yōu)選使用無糖鏈的重組干擾素-β，因?yàn)榭赡艿奈蛔铚p弱反應(yīng)效率。任何具有伴隨著一個或幾個氨基酸的刪除、取代或添加的天然干擾素-β氨基酸序列的干擾素-β都可以用作實(shí)施本發(fā)明方法的干擾素-β。
本發(fā)明的干擾素-β還包括天然干擾素-β，重組干擾素-β，及其變化形式。所述變化形式意指通過改變或修飾如上所述的天然干擾素的氨基酸序列或糖鏈而獲得的任何形式。在本說明書中，位于第19或第134位上的賴氨酸由這種天然干擾素-β的氨基酸序列的氨基酸號碼來表示(圖4和SEQ ID NO1)。所述變化形式的這種賴氨酸的氨基酸號碼以對應(yīng)于天然干擾素-β氨基酸序列中的賴氨酸的位置的方式改變。
任何這些形式的干擾素-β都可以通過任何方法，如從組織中提取，蛋白質(zhì)合成，和利用天然或重組細(xì)胞的生物學(xué)生產(chǎn)來獲得。遺傳工程化的無糖鏈的干擾素-β是商業(yè)上現(xiàn)有的，并且這種商業(yè)上現(xiàn)有的干擾素-β也可以用在本發(fā)明的方法中。
聚乙二醇(PEG)對于人體是無害的，并且當(dāng)作為結(jié)合到其上的干擾素-β復(fù)合物而進(jìn)行施用時，在使所述復(fù)合物溶解于血液中所必需的水平上賦予水溶性。本領(lǐng)域已知PEG結(jié)合到生理活性物質(zhì)上允許活體中的生理活性物質(zhì)獲得提高的物理和熱穩(wěn)定性，對抗酶降解的保護(hù)作用，增強(qiáng)的溶解性，延長的體內(nèi)循環(huán)半壽期，和降低的清除值。根據(jù)這些效果，PEG可以優(yōu)選用于本發(fā)明中。
在PEG末端激活中可以使用任何方法以便將PEG結(jié)合到干擾素-β中的賴氨酸殘基的氨基上。例如，可以采用在末端具有氨基反應(yīng)性結(jié)構(gòu)如羥基琥珀酰亞胺酯或硝基苯磺酸酯結(jié)構(gòu)的PEG。在本說明書中，任何這些末端結(jié)構(gòu)都稱作“氨基反應(yīng)性官能團(tuán)”，而具有任何這些末端結(jié)構(gòu)的PEG都稱作“用氨基反應(yīng)性官能團(tuán)活化的聚乙二醇”。具有任何這些結(jié)構(gòu)的PEG被常規(guī)地廣泛用于和氨基結(jié)合，并且可以通過公知的或商業(yè)上現(xiàn)有的合成方法輕易地進(jìn)行生產(chǎn)。在本發(fā)明中，這種商業(yè)上現(xiàn)有的產(chǎn)品也可以優(yōu)選地進(jìn)行使用。
對所述PEG的平均分子量并不進(jìn)行特別限定，不過，從允許活體中的干擾素-β獲得物理和熱穩(wěn)定性，對抗酶降解的保護(hù)作用，增強(qiáng)的溶解性，延長的體內(nèi)循環(huán)半壽期，和降低的清除值的觀點(diǎn)來看，優(yōu)選大約10,000-60,000，更優(yōu)選大約20,000-40,000。
可以通過將干擾素-β與PEG在pH 5.0-8.5，優(yōu)選pH 5.5-8.0，以及在針對干擾素-β的活性的抗還原劑存在的情況下，優(yōu)選在緩沖溶液如磷酸鹽或檸檬酸鹽緩沖溶液中反應(yīng)來進(jìn)行干擾素-β和PEG之間的結(jié)合反應(yīng)。所述針對干擾素-β的活性的抗還原劑不僅抑制由干擾素-β被置于適于反應(yīng)的pH5.0-8.5的環(huán)境中而引發(fā)的干擾素-β的積聚，還有助于PEG與位于第19位或第134位上的靶向賴氨酸或其鄰近位點(diǎn)的特異性結(jié)合反應(yīng)。針對干擾素-β的活性以便有效地將PEG結(jié)合到預(yù)期位點(diǎn)并保持干擾素-β活性的抗還原劑的例子可以包括糖類等，具有5個或更少糖單元的寡糖，單糖，其對應(yīng)的糖醇，C2-6多羥基醇。特別優(yōu)選的是二糖或單糖如葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖或海藻糖，其對應(yīng)的糖醇，和C2-3多羥基醇如乙二醇或甘油。這些針對干擾素-β的活性的抗還原劑可以單獨(dú)使用或以其中兩個或多個的任意組合形式使用。
對用在本發(fā)明方法中的針對干擾素-β的活性的抗還原劑的濃度并不作特別限定，不過，相關(guān)于反應(yīng)混合物的總重，大約為1-90％(當(dāng)使用多種針對干擾素-β的活性的抗還原劑時為合計；下文中，以相同方式進(jìn)行指定)，更加優(yōu)選大約1-50％，還要更加優(yōu)選大約10-30％。對干擾素-β∶PEG混合物的比例并不作特別限定，不過，對于用琥珀酰亞胺酯活化的PEG來說，一般是大約1∶1-1∶400摩爾比，并且優(yōu)選大約1∶4-1∶100摩爾比。適于本發(fā)明的方法的反應(yīng)溫度一般是4-40℃，優(yōu)選4-25℃。盡管反應(yīng)時間是根據(jù)反應(yīng)溫度等進(jìn)行適當(dāng)確定的，但是一般大約1小時-24小時是足夠的。
通過所述反應(yīng)方法可以將聚乙二醇特異性地結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19位或第134位上的賴氨酸或其空間鄰近位點(diǎn)。所述“其空間鄰近位點(diǎn)”指在干擾素-β活性構(gòu)象中的鄰近位點(diǎn)，具體地，是對于位于第19位的賴氨酸來說位于第17位的半胱氨酸或位于第80位的天冬酰胺(具體是連接于其上的糖鏈)。另外，術(shù)語“特異性的”或“特異性地”指聚乙二醇與位于第19位或第134位上的賴氨酸或其空間鄰近位點(diǎn)的選擇性和優(yōu)先性結(jié)合。這種特異性結(jié)合給出均一的單-PEG化的干擾素-β。
將在末端具有巰基反應(yīng)性結(jié)構(gòu)如正吡啶基(orthopyridyl)二硫化物、乙烯基砜(vinyl sulfone)、馬來酰亞胺或碘乙酰胺(iodoacetamide)結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物，優(yōu)選將具有馬來酰亞胺結(jié)構(gòu)的水溶性聚合物用在與半胱氨酸巰基的結(jié)合反應(yīng)中。對于將具有特別需要的10,000-60,000分子量的PEG結(jié)合到干擾素-β氨基酸序列中的半胱氨酸殘基上來說，優(yōu)選使用具有小于天然糖鏈的糖鏈的干擾素-β，去除了糖鏈的干擾素-β，或最初沒有糖鏈的干擾素-β。使用這種干擾素-β允許無還原性解離的結(jié)合反應(yīng)以便在單一步驟中高效進(jìn)行。
在結(jié)合反應(yīng)后，可以通過任何方法或方法的組合去除未反應(yīng)的干擾素-β和PEG以及副產(chǎn)物，所述方法如使用離子交換載體、凝膠過濾載體、或疏水性或親水性載體的層析譜，以便純化或濃縮具有結(jié)合位于第19或第134位上賴氨酸的PEG的所需干擾素-β復(fù)合物。
最有效純化或濃縮具有結(jié)合位于第19或第134位上賴氨酸的PEG的干擾素-β復(fù)合物的方法之一是使用離子交換載體的層析。所用的離子交換載體優(yōu)選是陽離子交換載體，更加優(yōu)選將磺丙基、磺酸或羧甲基附于基底物質(zhì)上的載體，任何這些離子交換載體都是商業(yè)上現(xiàn)有的。例如，當(dāng)使用HiTrap SP HP(Amersham Pharmacia)，Poros HS(Applied Biosystems)，或SP-5PW(Tosoh)時，通過鹽濃度梯度將痕量存在于反應(yīng)溶液中的二-PEG化的干擾素-β復(fù)合物最先洗脫。隨后，以全部洗脫級分的40％或更大的比例將具有結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19位上賴氨酸的PEG的所需干擾素-β復(fù)合物洗脫，接著是具有結(jié)合N末端氨基或位于第33、46或108位上的賴氨酸作為PEG結(jié)合位點(diǎn)的少量異構(gòu)體的復(fù)合物以及未反應(yīng)的干擾素-β的洗脫和分級。在此過程中，可以同時分離具有結(jié)合位于第134位上賴氨酸的PEG的干擾素-β復(fù)合物。
通過將反應(yīng)溶液調(diào)節(jié)到適于在pH3.0-8.0結(jié)合的離子強(qiáng)度來實(shí)施結(jié)合到陽離子交換載體上。在此情況下，所述陽離子交換載體可以加載到柱上或懸浮于反應(yīng)溶液中。不過，當(dāng)所述陽離子交換載體中的未反應(yīng)的親水性聚合物的積聚減小所需復(fù)合物的分離效率時，優(yōu)選在懸浮和結(jié)合后將所述載體加載到柱上進(jìn)行洗脫。通過用不斷提高的鹽濃度或pH在由檸檬酸鹽、醋酸鹽、磷酸鹽等組成的緩沖溶液中實(shí)施逐步的梯度或無梯度洗脫可以進(jìn)行由陽離子交換載體的洗脫。
如實(shí)施例3中所述，通過繪制肽圖譜，接著進(jìn)行獲得的PEG結(jié)合片段的氨基酸分析或測序，可以分析分級和洗脫的干擾素-β復(fù)合物的PEG結(jié)合位點(diǎn)。
通過本領(lǐng)域已知的方法可以輕易測量由此產(chǎn)生的具有PEG的干擾素-β復(fù)合物的抗病毒活性，所述PEG結(jié)合位于第19或第134位上的賴氨酸(例如，Armstrong，J.A.，Methods In Enzymology，78，381-387，(1981)；Rubinstein等，J.Virol.37，755(1981)；和Borden等，Canc.Res.42，4948(1982))。具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的40,000分子量PEG的干擾素-β保持了結(jié)合前10％或更高的活性，這一活性等同于結(jié)合具有20,000分子量PEG的干擾素-β的活性?；蛘?，具有結(jié)合位于第134位上賴氨酸的40,000分子量PEG的干擾素-β保持了結(jié)合前70-100％的活性。以往曾經(jīng)報道過具有結(jié)合干擾素-βN末端的40,000分子量PEG的復(fù)合物的殘留活性為0％(Pepinsky等，The Journal ofPharmacology and Experimental Therapeutics，vol.297，p1059-1066，(2001))。因此，這顯示位于第19或134位上的賴氨酸用作干擾素-β的高分子量PEG結(jié)合位點(diǎn)是非常有用的。
還可以將本發(fā)明的方法應(yīng)用到除了PEG之外的物質(zhì)作為生產(chǎn)不會減弱干擾素-β活性的復(fù)合物的方法。優(yōu)選地，所述除了PEG之外的物質(zhì)具有氨基反應(yīng)性結(jié)構(gòu)，如羥基琥珀酰亞胺酯或硝基苯磺酸酯結(jié)構(gòu)。這種第二分子不限于賦予體內(nèi)穩(wěn)定性的分子如PEG和血清蛋白并且可以是具有完全不同功能的生理活性物質(zhì)，如酶、細(xì)胞因子、抗體分子或其片段。衍生自任何這些物質(zhì)的復(fù)合物都可用于構(gòu)建也具有干擾素-β活性的融合分子或標(biāo)記試劑。
此外，可以應(yīng)用本發(fā)明的方法來將干擾素-β固定到多種支持物上，例如，糖、玻璃或樹脂材料的平坦表面或顆粒。也就是說，位于第19或134位上的賴氨酸用作干擾素-β和多種支持物中任一種之間的結(jié)合點(diǎn)允許干擾素-β的固定而不會減弱其活性。這種固定方法需要引入具有類似氨基反應(yīng)性官能團(tuán)的交聯(lián)劑或預(yù)先將所述交聯(lián)劑結(jié)合到支持物上。
可以將本發(fā)明的干擾素-β與PEG之間的復(fù)合物用于治療多種涉及IFN生物學(xué)活性的疾病。例如，所述復(fù)合物可以用于治療慢性活性乙型肝炎、慢性丙型肝炎和其它病毒性疾?。欢喾N惡性瘤如成膠質(zhì)細(xì)胞瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、星細(xì)胞瘤和皮膚惡性黑素瘤；以及自身免疫疾病如發(fā)性硬化癥。另外，它可以用于治療伴隨血管生成的疾病，例如，炎性疾病(例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或牛皮癬)，眼科疾病(例如，糖尿病性視網(wǎng)膜病、早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼(neovascularglaucoma)、Stevens-Johnson綜合征及其相關(guān)疾病、眼類天皰瘡及其相關(guān)疾病、角膜化學(xué)灼傷，或沙眼)，以及癌癥(例如、乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤、腎癌、腦腫瘤，或卡波西肉瘤)。
可以通過口服或腸胃外途徑，將本發(fā)明的干擾素-β復(fù)合物直接給藥或者作為通過將所述復(fù)合物與本領(lǐng)域已知的可藥用載體或賦形劑相混合制備的藥物組合物進(jìn)行給藥。不過，優(yōu)選通過皮下、肌內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進(jìn)行給藥。
對于口服給藥的劑型的具體例子包括片劑、丸劑、膠囊、顆粒、糖漿、乳劑和懸浮液。這些劑型是通過本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)的并且包含一般用于藥學(xué)領(lǐng)域的載體或賦形劑。
片劑的載體或賦形劑的例子包括乳糖、麥芽糖、蔗糖、淀粉和硬脂酸鎂。腸胃外給藥的劑型的例子包括眼藥水、軟膏、注射劑、泥罨劑、栓劑、經(jīng)鼻吸收劑、經(jīng)肺吸收劑、經(jīng)皮吸收劑和局部持續(xù)釋放劑。
液體制品可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如，通過將干擾素-β復(fù)合物溶解或懸浮于一般用于注射的無菌水性溶液中或者通過干擾素-β復(fù)合物的乳化作用或包埋入脂質(zhì)體。
固體制品可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如，通過將賦形劑如甘露糖、海藻糖、山梨糖、乳糖或葡萄糖加到干擾素-β復(fù)合物中以制成凍干產(chǎn)品。這種凍干產(chǎn)品可以進(jìn)一步粉末化，或者，可以將這種粉末與聚乳酸或羥基乙酸混合和固化以便使用。
凝膠劑可以通過本領(lǐng)域已知的方法制備，例如，通過將干擾素-β復(fù)合物溶于增稠劑或多糖如甘油、聚乙二醇、甲基纖維素、羧甲基纖維素、透明質(zhì)酸或硫酸軟骨素中。任何這些制品都可以添加以人血清白蛋白、人免疫球蛋白、α2-巨球蛋白、氨基酸等作為穩(wěn)定劑，并且可以添加以醇、糖醇、離子表面活性劑、非離子表面活性劑等作為在不損害IFN生物學(xué)活性范圍內(nèi)的分散劑或吸收促進(jìn)劑?；蛘撸梢匀芜x地向其中加入痕量金屬或有機(jī)酸鹽。
根據(jù)患者的年齡和體重，要治療的疾病或癥狀，給藥形式和途徑，PEG的分子量等適當(dāng)?shù)卮_定本發(fā)明的復(fù)合物的劑量。不過，通常，在一次劑量/月到一次劑量/天的范圍內(nèi)給藥本發(fā)明的復(fù)合物，優(yōu)選一次劑量/月到一次劑量/周，1,000單位-100百萬單位/劑量，優(yōu)選10,000單位-18百萬單位/劑量。
實(shí)施例下文中，參照實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更充分地描述。
添加劑對于羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇與重組干擾素-β的氨基的結(jié)合反應(yīng)的作用將葡萄糖、甘油或乙二醇以每種終濃度1，5，10，和20％加入到保存于0.5M氯化鈉和100mM醋酸鹽緩沖溶液(pH 5.0)中的重組人干擾素-β中(終濃度200μg/ml；其是根據(jù)Goeddel等，Nucleic Acid.Res.Vol.8，4057-4074(1980)的方法用重組大腸桿菌(Escherichia coli)表達(dá)和純化的)。用1M的磷酸氫二鈉溶液將這些溶液和無添加劑的對照的pH調(diào)節(jié)到7.8。以大約10/摩爾干擾素-β的摩爾比將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量40K；Shearwater Polymers，INC生產(chǎn)，購自NOF Corp)與每種得到的溶液相混合，隨后于4℃過夜進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。反應(yīng)后，去除未反應(yīng)的干擾素-β，測量在每種制備的反應(yīng)溶液中的干擾素-β活性。
利用酶抗體技術(shù)(夾心法免疫測定)(見Eiji Ishikawa，“EnzymeImmunoassay”3rd Ed.，p.180，Igaku-shoin)進(jìn)行所述活性的測量。具體地，將兔抗干擾素-β抗體固定于免疫板上，隨后與樣品一起向其中加入只識別活性干擾素-β結(jié)構(gòu)的酶標(biāo)記的小鼠單克隆抗體。在洗去未結(jié)合的產(chǎn)物后，向免疫板上加入著色底物以通過與標(biāo)準(zhǔn)的著色值相比較來計算樣品的干擾素-β活性(確證干擾素-β活性的結(jié)果等同于由基于培養(yǎng)細(xì)胞的抗病毒活性的生物學(xué)活性測量方法獲得的結(jié)果)。同時，以與上面相同的方式加入表面活性劑Tween 80或HCO-60抑制干擾素-β的積聚，不過，還在很大程度上抑制PEG的結(jié)合反應(yīng)的進(jìn)行，導(dǎo)致所述綴合物活性的不成功的測量。
如表1中所示，與對照(通過在缺失添加劑情況下的PEG的結(jié)合反應(yīng)獲得的PEG-干擾素-β復(fù)合物的活性)相比，在含有適量葡萄糖、甘油或乙二醇的反應(yīng)溶液中觀察到提高活性的明顯效果。

具有結(jié)合位于第19位上的賴氨酸的氨基的聚乙二醇的干擾素-β復(fù)合物的分離和純化以20％的終濃度將乙二醇加入到保存于0.5M氯化鈉和100mM醋酸鹽緩沖溶液(pH5.0)中的重組人干擾素-β中(終濃度200μg/ml)，隨后用1M的磷酸二氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH到7.6。將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量40K；購自NOF Corp)與得到的溶液相混合，隨后于4℃過夜進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。相對于含有10mM NaCl-0.05％Tween 20的20mM醋酸鹽緩沖溶液(pH4.5)于4℃過夜透析反應(yīng)溶液。將透析溶液應(yīng)用到陽離子交換柱Poros HS 1.7mL-gel(由AppliedBiosystems生產(chǎn))或SP-5PW(Tosoh)。通過提高與溶劑A(含有10mMNaCl的20mM醋酸鹽緩沖溶液(pH4.5-4.7))混合的溶劑B(含有1MNaCl的20mM醋酸鹽緩沖溶液(pH4.5-4.7))來進(jìn)行洗脫。具體地，通過逐步將溶劑B的比例提高到Poros HS柱中的30，40，50，和100％和通過在SP-5PW柱中使用0-100％的連續(xù)梯度來進(jìn)行洗脫。通過用Poros HS柱進(jìn)行的洗脫獲得的吸光度層析譜顯示于圖1中。將通過逐步提高溶劑B的比例到30，40，50，和100％洗脫的吸光度層析譜上的組分分別叫做峰1-4(在附圖中為(i)-(iv))。
在SDS-PAGE分離后通過銀染分析每種峰組分(1-4)的結(jié)果顯示于圖2中。在峰2中可以獲得所需的具有結(jié)合位于第19位上的賴氨酸殘基的40K分子量PEG的干擾素-β復(fù)合物。可以將不能完全被反應(yīng)所控制的PEG結(jié)合位點(diǎn)的少量異構(gòu)體(minor isomers)分離為副產(chǎn)物，其包括具有結(jié)合位于第33位上的賴氨酸殘基的PEG的干擾素-β復(fù)合物(在峰3中)，和具有結(jié)合N末端氨基或位于第108或134位上的賴氨酸殘基的PEG的干擾素-β復(fù)合物(在峰4中)。在峰4和1中可以分別分離出未反應(yīng)的干擾素-β和二-PEG化的干擾素-β。
通過用SP-5PW柱進(jìn)行的洗脫獲得的吸光度層析譜顯示于圖3中。所述SP-5PW柱能夠進(jìn)行類似于Poros HS柱的分離。作為峰2，所需的具有結(jié)合位于第19位上的賴氨酸殘基的40K分子量PEG的干擾素-β復(fù)合物占蛋白質(zhì)總量的大約65％(相對于除了未反應(yīng)干擾素-β的全部PEG化復(fù)合物其比例為65％或更大)。
重組干擾素-β的聚乙二醇結(jié)合位點(diǎn)的確認(rèn)將實(shí)施例2中用SP-5PW柱分離的每種峰級分脫鹽并用固相抽提柱(OASIS HLB；Waters)進(jìn)行濃縮，隨后用離心蒸發(fā)器進(jìn)行干燥。將得到的產(chǎn)物溶于含有6mol/L胍的Tris緩沖溶液(pH9)中，隨后進(jìn)行二硫蘇糖醇的Cys還原和碘乙酰胺的酰胺甲基化作用。加入賴氨酰基內(nèi)肽酶后，將得到的混合物于37℃溫育5小時以進(jìn)行結(jié)構(gòu)特異性消化。用醋酸終止酶反應(yīng)以制成預(yù)處理的樣品進(jìn)行分析。
將這種樣品在下列條件下進(jìn)行反相HPLC分析柱Cadenza CD-C(184.6×150)；檢測波長214nm(UV)；柱溫度40℃；流速0.8mL/min；流動相A醋酸/TFA/蒸餾水(1/0.2/1000)；流動相B醋酸/TFA/乙腈/蒸餾水(0.9/0.2/800/200)；梯度在80分鐘內(nèi)5％-70％的流動相B，接下來為在5分鐘內(nèi)的70％-100％的流動相B；分析循環(huán)120min。
相應(yīng)于PEG結(jié)合反應(yīng)之前的干擾素-β的賴氨?；鶅?nèi)肽酶消化片段的HPLC層析譜中的峰(K1至K12)顯示于圖4和5-βre中。圖4中的箭頭表示賴氨?；鶅?nèi)肽酶剪切位點(diǎn)。由剪切產(chǎn)生的肽片段命名為K1到K12。圖5中的符號K1到K12分別對應(yīng)于圖4中的肽片段K1到K12。相反地，如圖5-2(在附圖中為(ii)；下文中，以相同方式指定)中所示，在峰2的肽圖譜中觀察到肽片段K1和K2的明顯缺失。這可能是因?yàn)镻EG導(dǎo)入位于第19位上賴氨酸的側(cè)鏈上的氨基使得這一位點(diǎn)阻遏賴氨?；鶅?nèi)肽酶消化，導(dǎo)致不生成肽片段K1和K2。由這一結(jié)果，估計導(dǎo)入PEG的位點(diǎn)是位于第19位上的賴氨酸。
峰3的肽圖譜產(chǎn)生顯示于圖5-3中的結(jié)果，其中觀察到肽片段K2的明顯缺失。這可能是因?yàn)镻EG導(dǎo)入位于第33位上賴氨酸的側(cè)鏈上的氨基使得這一位點(diǎn)阻遏賴氨?；鶅?nèi)肽酶消化，導(dǎo)致不生成肽片段K2。由這一結(jié)果，估計導(dǎo)入PEG的主要位點(diǎn)是Lys33。
因?yàn)樵谌鐖D5-4中所示的峰4中觀察到肽片段K1的減少，估計存在N-末端綴合物。此外，肽片段K10減少一半，提示可能包含Lys 134或Lys 123異構(gòu)體。
接下來，將作為在峰的反相HPLC分析中75分鐘左右的峰出現(xiàn)的PEG-肽綴合物片段進(jìn)行氨基酸序列分析。這一結(jié)果和由肽圖譜獲得的信息顯示峰2，主要的反應(yīng)產(chǎn)物，是所需的具有結(jié)合位于第19位上賴氨酸的PEG的復(fù)合物。分別在峰3和4中分離具有結(jié)合位于第33位上賴氨酸的PEG的位置異構(gòu)體和具有結(jié)合位于第134或108位上賴氨酸或N端的PEG的位置異構(gòu)體，作為少量副產(chǎn)物。
具有選擇性結(jié)合位于第19位上賴氨酸殘基的40K或20K分子量PEG的干擾素-β復(fù)合物殘留活性的測量通過實(shí)施例2的方法對具有選擇性結(jié)合位于第19位上賴氨酸殘基的40K或20K分子量PEG的重組人干擾素-β復(fù)合物進(jìn)行合成、分離和純化，隨后與PEG結(jié)合之前的重組人干擾素-β進(jìn)行活性比較。通過測量抗病毒活性來進(jìn)行干擾素-β活性的比較。具體地，通過利用人羊水細(xì)胞FL細(xì)胞組合以辛德畢斯病毒或水泡性口炎病毒(VSV)的生物分析來進(jìn)行評估(Armstrong，J.A.，Methods In Enzymology，78，381-387，(1981))。
作為結(jié)果，PEG結(jié)合前的重組人干擾素-β的活性為1.22×108MIU/mg，而具有40K PEG的綴合物則具有5.5×107MIU/mg的抗病毒活性和高達(dá)45％的殘留活性。以相同方式測量的具有20K PEG的綴合物的殘留活性為38.7％。
具有選擇性結(jié)合位于第19位上賴氨酸殘基的40K分子量PEG的干擾素-β復(fù)合物的藥物動力學(xué)分析及其誘導(dǎo)藥效標(biāo)記活性的評估通過實(shí)施例2的方法對具有選擇性結(jié)合位于第19位上賴氨酸殘基的40K分子量PEG的重組人干擾素-β復(fù)合物進(jìn)行合成、分離和純化。以9MIU/kg向兔(NZW，雄性)施用這種干擾素-β復(fù)合物。在給藥前和在給藥后15分鐘，1.5小時，3.5小時，8小時，1天，2天，3天，4天，5天，6天，和7天由所述兔收集血液以測量血漿中的抗病毒活性和全血中的2-5AS合成酶活性?？共《净钚酝ㄟ^實(shí)施例1中所述的方法測量，而2-5AS合成酶活性是利用2-5A試劑盒“Eiken”(Eiken Chemical)根據(jù)特定的方案進(jìn)行測量的。基于抗病毒活性測量的血液中干擾素-β殘留活性的時間過程在圖6中以圖表形式表示。作為藥效標(biāo)記而起作用的2-5AS合成酶活性的時間過程在圖7中以圖表形式表示。具有40K分子量的PEG的結(jié)合導(dǎo)致血液中干擾素-β殘留活性(AUC)的20.8倍的提高。這種提高導(dǎo)致誘導(dǎo)藥效標(biāo)記的活性的提高(AUC由PEG的結(jié)合提高7.6倍并且超過了由未修飾的干擾素-β進(jìn)行的藥效標(biāo)記誘導(dǎo)的最高值，即使在給藥7天之后)。
具有結(jié)合位于第134位上的賴氨酸的氨基的聚乙二醇的干擾素-β復(fù)合物的分離和純化將以與實(shí)施例2中相同方式獲得的重組人干擾素-β和PEG之間結(jié)合的反應(yīng)溶液添加以5倍體積的10mM醋酸鹽緩沖液(pH4.5)，并應(yīng)用到以相同緩沖溶液平衡的陽離子交換柱(TOYOPEARL CM 650(S)(Tosoh))上。
通過提高從0-65％以連續(xù)梯度混合的緩沖溶液的比例來用含有1M氯化鈉的相同緩沖溶液洗脫蛋白質(zhì)，并且隨后進(jìn)行分級。通過SDS-PAGE以及用SP-5PW柱(Tosoh)對洗脫的級分進(jìn)行分析。相應(yīng)結(jié)果示于圖8-A和8-B中。
作為結(jié)果，如實(shí)施例2中一樣獲得三個峰。不過，當(dāng)用SP-5PW柱單獨(dú)分析第三個峰(圖8-A中的峰(iii))中包含的級分時，所述級分顯示為進(jìn)一步分離成幾種組分(圖8-B)。在這些組分中，以與實(shí)施例3中相同的方式對含有組成第三個峰最高百分比的和最后洗脫的峰的級分進(jìn)行分析。作為結(jié)果，從其中分離出具有結(jié)合位于第134位上的賴氨酸的PEG的干擾素-β復(fù)合物。
由PEG與賴氨酸的非選擇性結(jié)合反應(yīng)獲得的PEG干擾素-β復(fù)合物和由其選擇性結(jié)合反應(yīng)獲得的PEG干擾素-β復(fù)合物之間活性的比較以20％的終濃度將乙二醇加入到保存于0.5M氯化鈉和100mM醋酸鹽緩沖溶液(pH5.0)中的重組人干擾素-β或天然干擾素中，隨后以與實(shí)施例2中相同的方式利用1M磷酸氫二鈉溶液將pH調(diào)節(jié)到5.5(反應(yīng)條件1)或大約7.6(反應(yīng)條件2)。以相對于一個干擾素-β分子的45倍的量將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量10K，20K，或40K；由Shearwater Polymers，INC生產(chǎn)，購自NOF Corp)與得到的溶液混合，隨后于4℃過夜進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。
同時，以0.1％的終濃度將SDS加入到重組人干擾素-β或天然干擾素-β溶液中，隨后將反應(yīng)溶液的pH調(diào)節(jié)到9.0(反應(yīng)條件3)。以相對于一個干擾素-β分子的45倍的量將羥基琥珀酰亞胺酯活化的聚乙二醇(平均分子量10K，20K，或40K)與得到的溶液混合，隨后于4℃過夜進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)。
通過與實(shí)施例4中相同的抗病毒活性測量方法對反應(yīng)后每種溶液中的干擾素-β活性進(jìn)行評估。通過SDS-PAGE確認(rèn)每種溶液中結(jié)合反應(yīng)的進(jìn)程。
如表2中所示，在不確保PEG與賴氨酸的結(jié)合選擇性的反應(yīng)條件3下，不論P(yáng)EG的分子量如何，干擾素-β活性都降至10％或更低。在另一方面，在提高PEG與位于第19或134位上賴氨酸的結(jié)合選擇性的反應(yīng)條件1和2下，不論P(yáng)EG的分子量如何，都確認(rèn)至少10％或更高的干擾素-β活性得以保留。

具有2或多個PEG分子的非選擇性多PEG化的干擾素-β復(fù)合物和具有選擇性結(jié)合位于第19或134位上賴氨酸的PEG的單PEG化的干擾素-β復(fù)合物之間活性的比較在與實(shí)施例6中相同方式的PEG結(jié)合反應(yīng)之后，用TOYOPEARLCM 650(S)柱(Tosoh)分離包含具有2或多個PEG分子的非選擇性多PEG化的干擾素-β復(fù)合物的級分和包含具有選擇性結(jié)合位于第19或134位上賴氨酸的PEG的單PEG化的干擾素-β復(fù)合物的級分以通過實(shí)施例4中所述的測量抗病毒活性的方法測量它們的干擾素-β活性。作為結(jié)果，如圖9所示，具有2或多個PEG分子的非選擇性多PEG化的干擾素-β復(fù)合物僅保留了大約1％的活性，而具有選擇性結(jié)合位于第19或134位上賴氨酸的40K PEG的單PEG化的干擾素-β復(fù)合物則保留了10％或更多的活性。
結(jié)合20,000分子量PEG的IFN-β復(fù)合物與結(jié)合40,000分子量PEG的IFN-β復(fù)合物之間在血液中滯留的比較用125I對結(jié)合20,000-或40,000-分子量PEG的IFN-β和非PEG化的IFN-β進(jìn)行標(biāo)記并向兔進(jìn)行靜脈給藥。按照時間先后從兔中收集血液，一直持續(xù)6天。通過用γ計數(shù)器測量放射活性來測量血液中殘留的每種干擾素-β的量。血液中殘留的干擾素-β量的時間過程顯示于圖10中，給藥時的放射活性為100％。在長達(dá)6天中對于結(jié)合40,000分子量PEG的IFN-β來說血液中殘留的干擾素-β的量的積分是非PEG化的IFN-β的量的5.5倍。對于結(jié)合20,000分子量PEG的IFN-β來說血液中殘留的干擾素-β的量的積分是非PEG化的IFN-β的量的1.5倍。這一結(jié)果顯示對于血液中IFN-β復(fù)合物的滯留來說將20,000或更高分子量PEG結(jié)合到IFN-β上是重要的，活性得以保持。
在此將本文引用的所有出版物、專利和專利申請的全部內(nèi)容并入作為參考。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明，可以將聚乙二醇特異性結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸。通過本發(fā)明的方法生產(chǎn)的干擾素-β復(fù)合物保持高度活性，同時在活體內(nèi)具有充分的溶解性與物理和生物學(xué)穩(wěn)定性以及極佳的循環(huán)半壽期和清除值。因而，本發(fā)明的干擾素-β復(fù)合物產(chǎn)生更少的副作用并且可以用作高效藥物。
序列表<110>Toray Industries Inc.
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65 70 75 80Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn85 90 95His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr100 105 110Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg115 120 125Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr130 135 140Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu145 150 155 160Thr Gly Tyr Leu Arg Asn16權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)干擾素-β復(fù)合物的方法，包括在至少一種添加劑存在的情況下，將干擾素-β結(jié)合到聚乙二醇上，所述添加劑選自由具有5個或更少糖單元的寡糖、單糖、其相應(yīng)的糖醇和C2-6多羥基醇構(gòu)成的組。
2.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述添加劑選自由二糖、單糖、其相應(yīng)的糖醇和C2-3多羥基醇構(gòu)成的組。
3.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中所述添加劑選自由葡萄糖、甘露糖、山梨糖、蔗糖、海藻糖、乙二醇和甘油構(gòu)成的組。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述干擾素-β是天然的或重組的干擾素-β或其變化形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中所述聚乙二醇具有10,000-60,000的平均分子量。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，包括將聚乙二醇特異性結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸或其空間鄰近位點(diǎn)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項的方法，包括將聚乙二醇特異性結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項的方法，包括在pH5.0-8.5將干擾素-β與聚乙二醇反應(yīng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項的方法，包括在pH5.0-8.5將干擾素-β與用氨基反應(yīng)性官能團(tuán)活化的聚乙二醇反應(yīng)，隨后利用離子交換載體將得到的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行濃縮和純化步驟，由此獲得具有聚乙二醇的干擾素-β復(fù)合物，所述聚乙二醇特異性結(jié)合位于干擾素-β氨基酸序列中第19或134位上的賴氨酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，包括用具有羥基琥珀酰亞胺酯或硝基苯磺酸酯結(jié)構(gòu)的化合物活化聚乙二醇。
11.由根據(jù)權(quán)利要求1-10任一項的方法生產(chǎn)的干擾素-β復(fù)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的干擾素-β復(fù)合物，特征是所述復(fù)合物在抗病毒分析中顯示干擾素-β活性保留了結(jié)合前干擾素-β活性的10％或更高。
13.一種藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求11或12的干擾素-β復(fù)合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有高度生物學(xué)活性的干擾素－β和聚乙二醇之間的復(fù)合物，并且涉及高效生產(chǎn)所述復(fù)合物的方法。也就是說，本發(fā)明涉及生產(chǎn)干擾素－β復(fù)合物的方法，包括在至少一種添加劑存在的情況下，將干擾素－β結(jié)合到聚乙二醇上，所述添加劑選自具有5個或更少糖單元的寡糖、單糖、其相應(yīng)的糖醇和C
文檔編號A61K38/21GK1871257SQ20048003130
公開日2006年11月29日 申請日期2004年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月25日
發(fā)明者成見英樹, 津島義明, 山下浩志, 曾根三郎, 佐藤美由紀(jì) 申請人:東麗株式會社, 谷口雄紹