基于羅丹明b和氨乙基硫醚的化合物在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用，該化合物原料易得，合成方法簡(jiǎn)單，分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單；對(duì)Hg2+選擇性好、靈敏度高；可以檢測(cè)接近中性的幾乎純水緩沖溶液中的Hg2+；可以檢測(cè)HgCl2中的Hg2+；特別是對(duì)活細(xì)胞毒性低，可以用于活細(xì)胞成像，檢測(cè)活細(xì)胞中的Hg2+濃度。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
基于羅丹明B和氨乙基硫離的化合物在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于活細(xì)胞成像技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化 合物在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] Hgh是一種極具生理毒性的化學(xué)物質(zhì)，它對(duì)人體的危害主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)、 消化系統(tǒng)和內(nèi)臟器官，對(duì)呼吸系統(tǒng)、皮膚、血液及眼睛也有一定的影響。Hg2+中毒的機(jī)理尚未 完全清楚，目前被廣泛接受的虹+產(chǎn)生毒性的基礎(chǔ)是Hg-S反應(yīng)。虹+對(duì)生物體內(nèi)蛋白質(zhì)和酶 中的琉基有高親和力，一旦與蛋白質(zhì)中的琉基結(jié)合，就會(huì)使細(xì)胞內(nèi)許多代謝（如能量的生 成、蛋白質(zhì)和核酸的合成等)受到影響，從而影響細(xì)胞的功能和生長(zhǎng)。而且化具有持久性、 易遷移性和高度的生物富集性，運(yùn)使其成為目前全球最引人關(guān)注的環(huán)境污染物之一。隸離 子所帶來(lái)的健康問(wèn)題已經(jīng)促使科學(xué)家探索更有效的方法來(lái)檢測(cè)生物體內(nèi)和細(xì)胞樣品中的 隸。
[0003] 巧光探針由于操作簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高、可W進(jìn)行原位實(shí)時(shí)無(wú)損檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn) 而在重金屬離子檢測(cè)領(lǐng)域備受關(guān)注。羅丹明類(lèi)巧光探針由于摩爾吸收系數(shù)大、巧光量子產(chǎn) 率高、吸收和發(fā)射波長(zhǎng)長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)而成為巧光探針中最重要的品種。但是目前已報(bào)道的羅丹 明類(lèi)巧光探針有些原料難得、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、合成困難，有些只能在純有機(jī)溶劑(比如無(wú)水乙醇） 下檢測(cè)化2+，尤其是能用于活性胞成像的很少(參見(jiàn):Xu L, Wang S, Lv YN, Son YA, Cao DR. A highly selective and sensitive photo switchable fluorescent probe for Hg2+ based on bisthienylethene-rhodamine 6G dyad and for live cells imaging. Spectrochim. Acta 化rt A 2014; 128: 567-574;I3halla V, Tejpal R, Kumar M. Rhodamine appended terphenyl: A reversible "off-on" fluorescent chemosensor for mercury ions. Sens. Actuators B 2010; 151: 180-185;Zhang X, Zhu YY. A new fluorescent chemodosimeter for Hg^^-selective detection in aqueous solution based on Hg^^-promoted hydrolysis of rhodamine-glyoxylic acid conjugate. Sens. Actuators B 2014; 202: 609-614)。因此，研究開(kāi)發(fā)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、合成容易、能應(yīng)用于生理介 質(zhì)體系(類(lèi)似緩沖液)的、不對(duì)細(xì)胞造成損傷的新型羅丹明類(lèi)Hg2+巧光探針?lè)浅１匾?br>
【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物在活細(xì)胞成像中的 應(yīng)用。
[0005] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化 合物在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用?；诹_丹明B和氨乙基硫酸的化合物的制備方法為，氮?dú)猸h(huán)境 下，有機(jī)溶劑中，W羅丹明B和氨乙基硫酸為原料，W乙胺化合物為添加劑，攬拌反應(yīng)得到基 于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物;簡(jiǎn)稱(chēng)為RMTE。
[0006] 上述技術(shù)方案中，有機(jī)溶劑為乙臘、乙醇、二氯甲燒中的一種或者幾種，本發(fā)明公 開(kāi)的溶劑體系有利于原料的分散，增加羅丹明B和氨乙基硫酸的反應(yīng)性，提高產(chǎn)物收率。
[0007]上述技術(shù)方案中，添加劑為N，N-二異丙基乙胺;與反應(yīng)體系具有良好的相容性，有 利于提高羅丹明B和氨乙基硫酸的反應(yīng)性，提高產(chǎn)物收率。
[000引上述技術(shù)方案中，反應(yīng)溫度為20~60°C，反應(yīng)時(shí)間為18~36 h;羅丹明B和氨乙基 硫酸的摩爾比為1: (1~7)。優(yōu)選的，所述添加劑與羅丹明B的摩爾比為7:1;反應(yīng)溫度為30~ 50°C，反應(yīng)時(shí)間為20~30 h;羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1: (3~5)。本發(fā)明首次利用 氨乙基硫酸改性羅丹明B，在公開(kāi)的條件下，僅需要一步反應(yīng)，即可W較高收率得到產(chǎn)物 RMTE，取得了意想不到的技術(shù)效果。
[0009] 優(yōu)選的，在反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，進(jìn)行柱層析分離，真空干燥后得到基 于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物。柱層析分離時(shí)淋洗液為甲醇/Ξ氯甲燒/石油酸混合液， 優(yōu)選的體積比為甲醇氯甲燒:石油酸為1:12:2。得到的產(chǎn)物RMTE為黃色固體粉末，產(chǎn)率 為 35.1 ~54.4%，烙點(diǎn)為 167.4°C。
[0010] 具體合成方法比如，W乙臘，或乙醇，或二氯甲燒為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添 加劑，與羅丹明B的摩爾比為7:1，摩爾比為1:(1~7)的羅丹明B和氨乙基硫酸，在化保護(hù)下， 在溫度為20~60°C，攬拌反應(yīng)18~36 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，進(jìn)行柱層析分離， 淋洗液為甲醇/Ξ氯甲燒/石油酸，1/12/2 (v/v/v)，真空干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物 RMTE，烙點(diǎn)為167.4°C，提純前收率最高到約80%，提純后產(chǎn)率最高到約55%，達(dá)到本領(lǐng)域羅丹 明B類(lèi)化合物的較高收率。
[0011] 上述基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：
[0012] 反應(yīng)方程式可表示為：
通過(guò)紫外-可見(jiàn)吸收光譜和巧光光譜分析證實(shí)，本發(fā)明的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的 化合物對(duì)于化具有非常高的靈敏度W及優(yōu)異的選擇性。不但可W從比色和巧光雙通道檢 巧帖2%而且可W有效檢測(cè)來(lái)自于HgCl2中的Hgh;解決了現(xiàn)有Hgh探針對(duì)HgCl2中的Hgh檢測(cè) 效果差甚至不能檢測(cè)的缺陷，有效檢測(cè)來(lái)自于HgCl2中的化更加具有工業(yè)實(shí)用性。
[001引根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，發(fā)現(xiàn)多種金屬離子中只有Hg2可使RMTE在561 nm處的吸光 度和在578 nm處的巧光大大增強(qiáng)，其巧光增強(qiáng)達(dá)到170倍，眾多其他離子對(duì)RMTE的紫外-可 見(jiàn)吸收光譜和巧光光譜基本沒(méi)影響，表明在C曲CN/肥PES緩沖溶液（1/99, v/v，pH=7.05) 中RMTE對(duì)Hgh有很好的選擇性和靈敏度；同時(shí)表明本發(fā)明的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化 合物適用于接近人體體液體系，克服了現(xiàn)有探針需要在純有機(jī)溶劑中才能檢測(cè)而無(wú)法應(yīng)用 于活體檢測(cè)的缺陷。
[0014]特別的，本發(fā)明的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物對(duì)細(xì)胞毒性很低，經(jīng)過(guò)含有 20、30和4〇4]\11??'6的培養(yǎng)液培養(yǎng)24}1后細(xì)胞存活率分別為98.72 %、94.54 %和96.92 〇/〇; 運(yùn)說(shuō)明RMTE沒(méi)有對(duì)sf-9細(xì)胞的存活率產(chǎn)生很大影響。因此RMTE是一個(gè)毒性很低的物質(zhì)，可 W在活體細(xì)胞中應(yīng)用，用于活細(xì)胞成像。
[001引通過(guò)活細(xì)胞成像結(jié)果可W檢測(cè)出活細(xì)胞中隸離子的含量，比如制備標(biāo)準(zhǔn)Hgh濃度 梯度對(duì)應(yīng)的活細(xì)胞成像圖，作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，對(duì)比待檢測(cè)活細(xì)胞的成像圖，可W簡(jiǎn)易地得出待 檢測(cè)活細(xì)胞中化濃度。特別是本發(fā)明不僅在接近人體體液的體系中（C曲CN/皿PES緩沖溶 液（1/99, v/v，pH=7.05))驗(yàn)證了基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物的高靈敏度與精確 性，還驗(yàn)證了基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物的低毒性，運(yùn)是探針能否應(yīng)用活細(xì)胞檢測(cè) 的關(guān)鍵與基礎(chǔ);很多現(xiàn)有探針雖然在緩沖液體系中可W檢測(cè)隸離子，但一旦接觸細(xì)胞則會(huì) 導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡或者異變，導(dǎo)致無(wú)法真正應(yīng)用到生理活性細(xì)胞檢測(cè)中。因此本發(fā)明還公開(kāi)了 基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物在檢測(cè)活細(xì)胞中Hgh中的應(yīng)用。
[0016] 由于上述技術(shù)方案的運(yùn)用，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)： 1.本發(fā)明采用一步法，從羅丹明B和氨乙基硫酸出發(fā)，簡(jiǎn)單地合成了一種結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的 新型羅丹明衍生物RMTE，克服了現(xiàn)有羅丹明B化合物制備需要多步反應(yīng)(至少兩步）、需要毒 性很大的原料(氯化亞諷、Ξ氯氧憐等）等一系列缺陷；而且得到的產(chǎn)物提純簡(jiǎn)單、收率較 高，取得了意想不到的技術(shù)效果。
[0017] 2.本發(fā)明公開(kāi)的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物具有很低的細(xì)胞毒性，能夠 用于活細(xì)胞成像，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，經(jīng)過(guò)含有20、30和40 μΜ RMTE的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后細(xì) 胞存活率分別為98.72 %、94.54 %和96.92 %;運(yùn)說(shuō)明RMTE沒(méi)有對(duì)sf-9細(xì)胞的存活率產(chǎn)生很 大影響，因此RMTE是一個(gè)毒性很低的物質(zhì)，可W在活體細(xì)胞中應(yīng)用。
[0018] 3.本發(fā)明公開(kāi)的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物可W從比色和巧光雙通道 檢測(cè)化2+，特別是可W檢測(cè)化Cl2中的化2+，比檢測(cè)來(lái)自化(Cl〇4)2的Hgh具有更好的實(shí)用性； 成功解決了現(xiàn)有羅丹明B類(lèi)隸離子探針無(wú)法檢出或者無(wú)法準(zhǔn)確檢出來(lái)自化Cl2中的Hgh的問(wèn) 題，為推進(jìn)羅丹明B類(lèi)隸離子探針實(shí)用化作出重大貢獻(xiàn)。
[0019] 4.本發(fā)明公開(kāi)的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物克服了現(xiàn)有技術(shù)需要在大 量有機(jī)溶劑中甚至在無(wú)水乙醇中才能檢測(cè)隸離子的缺陷，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，在畑3CN/ 肥PES緩沖溶液（1/99, v/v，pH=7.05,接近人體體液）中RMTE對(duì)Hgh有很好的選擇性和靈 敏度;取得了意想不到的技術(shù)效果。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為在RMTE的C出CN/肥陽(yáng)S緩沖溶液（1/99，v/v，抑=7.05)中，加入金屬離子 前后的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和巧光光譜圖； 圖2為RMTE檢測(cè)Hgh的可逆性的巧光光譜圖； 圖3為RMTE對(duì)sf-9細(xì)胞的毒性圖； 圖4為RMTE活細(xì)胞成像圖； 圖5為不同虹+從及!》?濃度下活細(xì)胞成像圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021] 實(shí)施例一:Hgh探針RMTE的制備 羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1:3, W二氯甲燒為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添加 劑，與羅丹明B摩爾比為7:1，在化保護(hù)下，在30 °C條件下攬拌反應(yīng)20 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)除去溶劑，得到黃色固體粉末粗產(chǎn)物，產(chǎn)率為49.8%。進(jìn)行柱層析分離，淋洗液為甲醇/ Ξ氯甲燒/石油酸，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物RMTE，產(chǎn)率為35.1%。
[0022] 核磁，1h 醒R (400 MHz, CDC13), δ /卵m: 1.16 ( ?, 12H, J=6.8 Hz), 2.23 (i, 2H, J=8 Hz), 2.50 (i, 2H, J=6.4 Hz), 2.77 (i, 2H, J=6.4 Hz), 3.27- 2.37 (ffl, lOH), 3.66 (s, 2H), 6.27 {d, 2H, J=6.4 Hz), 6.37 {d, 2H, J=2.4 Hz), 6.44 (s, 2H), 7.08-7.10 (m, IH), 7.43-7.46 (m, 2H), 7.89-7.91 (ffi, 1H)，UC 醒R (300 MHz, CDCb), δ /卵m: 12.35，29.37，34.71，40.24，40.83， 44.31, 64.69, 97.34, 105.62, 107.96, 122.63, 123.74, 128.02, 128.89, 131.11, 132.33，148.82，153.13，167.90;質(zhì)譜，LC-MS: [M+H]+= 545.2944，[M+Na]+ = 567.2755;紅外光譜，F(xiàn)TIR (cm-i): K(NH) 3431; k(CH3,畑2) 2972，2925，2854; ^C = 0) 1695; K(ArH) 1548，1519，1463; ^C-O-C) 1118;元素分析， C3油40N4O2S3 (〇/〇):計(jì)算值C, 70.55; N, 10.28; Η, 7.40,實(shí)驗(yàn)值 C, 70.34; N, 10.04; H, 7.42。
[0023] 實(shí)施例二:Hgh探針RMTE的制備 羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1:7, W乙醇為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添加劑，與 羅丹明B摩爾比為7:1，在化保護(hù)下，在40 °C條件下攬拌反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去溶劑，得到黃色固體粉末粗產(chǎn)物，產(chǎn)率為63.2%。進(jìn)行柱層析分離，淋洗液為甲醇/Ξ氯甲 燒/石油酸，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物RMTE，產(chǎn)率為42.8%。
[0024] 實(shí)施例云虹+探針RMTE的制備 羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1:5, W乙臘為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添加劑，與 羅丹明B摩爾比為7:1，在化保護(hù)下，在20 °C條件下攬拌反應(yīng)18 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去溶劑，得到黃色固體粉末粗產(chǎn)物，產(chǎn)率為49.8%。進(jìn)行柱層析分離，淋洗液為甲醇/Ξ氯甲 燒/石油酸，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物RMTE，產(chǎn)率為36.3%。
[0025] 實(shí)施例四：Hgh探針RMTE的制備 羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1:5, W乙臘為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添加劑，與 羅丹明B摩爾比為7:1，在化保護(hù)下，在30 °C條件下攬拌反應(yīng)36 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去溶劑，得到黃色固體粉末粗產(chǎn)物，產(chǎn)率為79.6%。進(jìn)行柱層析分離，淋洗液為甲醇/Ξ氯甲 燒/石油酸，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物RMTE，產(chǎn)率為51.9%。
[0026] 實(shí)施例五:Hgh探針RMTE的制備 羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1:3, W乙醇為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添加劑，與 羅丹明B摩爾比為7:1，在化保護(hù)下，在60 °C條件下攬拌反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去溶劑，得到黃色固體粉末粗產(chǎn)物，產(chǎn)率為64.2%。進(jìn)行柱層析分離，淋洗液為甲醇/Ξ氯甲 燒/石油酸，1/12/2 (v/v/v)，干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物RMTE，產(chǎn)率為41.0%。
[0027] 實(shí)施例六:Hgh探針RMTE的制備 羅丹明B和氨乙基硫酸的摩爾比為1:5, W乙臘為溶劑，N，N-二異丙基乙胺為添加劑，與 羅丹明B摩爾比為7:1，在化保護(hù)下，在40 °C條件下攬拌反應(yīng)24 h，冷卻至室溫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除 去溶劑，得到黃色固體粉末粗產(chǎn)物，產(chǎn)率為80.2%。進(jìn)行柱層析分離，淋洗液為甲醇/Ξ氯甲 燒/石油酸，1/12/2 (v/v/ν)，干燥，得到黃色固體粉末目標(biāo)產(chǎn)物RMTE，產(chǎn)率為54.4%。
[002引實(shí)施例屯:水溶液中RMTE對(duì)Hgh的響應(yīng) 在RMTE的CH3CN/肥陽(yáng)S緩沖溶液（1/99，v/v, pH=7.05)中，加入Na+、r、Ag+、Ca2+、Mg2 + Je3+、Cu2\ai2+、Cr3\饑 2\Ni2+、Fe2\Mn2+、Co2+、Cd 2+ 和 Hg2% 測(cè)定加入離子前后的紫外-可 見(jiàn)吸收光譜和巧光光譜，結(jié)果如圖1，紫外-可見(jiàn)吸收光譜（左）和巧光光譜（右），溶劑： C出CN/肥陽(yáng)S緩沖溶液（1/99，v/v，pH=7.05)，濃度：20 μΜ (RMTE)，200 μΜ (金屬離子）， 激發(fā)波長(zhǎng):520皿，狹縫寬度:5皿。發(fā)現(xiàn)只有化可使RMTE在561 nm處的吸光度（圖1左）和 在578皿處的巧光（圖1右)大大增強(qiáng)，其巧光增強(qiáng)達(dá)到170倍，眾多其他離子對(duì)RMTE的紫外- 可見(jiàn)吸收光譜和巧光光譜基本沒(méi)影響。表明在C出CN/皿PES緩沖溶液（1/99，v/v，pH= 7.05)中RMTE對(duì)Hgh有很好的選擇性和靈敏度。
[0029] 實(shí)施例八:RMTE檢測(cè)Hgh的可逆性 用化2S研究RMTE檢測(cè)化的可逆性。圖2為RMTE檢測(cè)化的可逆性的巧光光譜，溶劑： C曲CN/肥PES緩沖溶液（1/99，v/v，pH=7.05)，濃度：20 μΜ (RMTE)，200 μΜ (金屬離子）， 激發(fā)波長(zhǎng):520皿，狹縫寬度:5 nm;由圖2可見(jiàn)，不加化時(shí)的RMTE的C曲CN/皿PES緩沖溶液 (1/99, v/v，pH=7.05)呈現(xiàn)無(wú)巧光狀態(tài)，加入Hgh后，溶液的巧光明顯增強(qiáng)，但是，繼續(xù)加入 過(guò)量的NasS，溶液幾乎恢復(fù)到無(wú)巧光狀態(tài)，說(shuō)明RMTE檢測(cè)化是一個(gè)可逆過(guò)程。
[0030] 實(shí)施例九:RMTE的細(xì)胞毒性 在27°C條件下，W含有10 %胎牛血清的TC-100作為培養(yǎng)液，將sf-9細(xì)胞置于24孔板中 培養(yǎng)24 h，保證每一個(gè)孔中細(xì)胞的密度為IX 104。然后將12個(gè)孔平均分為4組，每組3個(gè)平行 樣品。第1組作為參照組;第2、3、4組分別加入20、30、40 μΜ RMTE，培養(yǎng)24 h后，用Muse智能 觸控細(xì)胞分析儀自動(dòng)分析RMTE對(duì)sf-9細(xì)胞的毒性，結(jié)果如圖3所示，把不加 RMTE處理的細(xì)胞 的存活率視作100%，經(jīng)過(guò)含有20、30和40 μΜ RMTE的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后細(xì)胞存活率分別為 98.72 %、94.54 %和96.92 %。運(yùn)說(shuō)明RMTE沒(méi)有對(duì)sf-9細(xì)胞的存活率產(chǎn)生很大影響。因此 RMTE是一個(gè)毒性很低的物質(zhì)，可W在活體細(xì)胞中應(yīng)用。
[0031] 實(shí)施例十:MTE用于活細(xì)胞成像 在27°C條件下，W含有10 %胎牛血清的TC-100作為培養(yǎng)液，將sf-9細(xì)胞置于24孔板中 培養(yǎng)24 h，保證每一個(gè)孔中細(xì)胞的密度為IX 104。然后將8個(gè)孔平均分為4組，每組2個(gè)平行 樣品。第1組作為參照組(a，aO;第2組加入8 μΜ化2+(b，bO;第3組加入40 μΜ RMTE(c，c/); 第4組同時(shí)加入4 μΜ Hg2%染毒40 min,再加入20 μΜ RMTE,培養(yǎng)1 h后，將細(xì)胞置于尼康EOS 700D倒置巧光顯微鏡上用綠光激發(fā)觀察并且照相，見(jiàn)圖4。
[0032] 由圖4可W看出，不經(jīng)處理的參照組細(xì)胞(a和曰/ )和只含有Hgh(b和b/ )或是RMTE(c 和^ )的細(xì)胞不發(fā)巧光。但是當(dāng)在細(xì)胞中同時(shí)存在RMTE和化時(shí)，細(xì)胞發(fā)出明顯的紅色巧光 (d和dO。從自然光下細(xì)胞照片可W看出整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞都處于正常狀態(tài)，說(shuō)明RMTE可 W用于活細(xì)胞成像。
[0033] 將第4組樣品中的化及RMTE濃度更換為20 μΜ的RMTE和6 μΜ的化2+、20 μΜ的 RMTE和8 μΜ的Hg2+、30 μΜ的RMTE和4 μΜ的Hg2+、30 μΜ的RMTE和6 μΜ的Hg2+、30 μΜ的RMTE和8 μΜ的Hg2+、40 μΜ的RMTE和4 μΜ的Hg2+、4〇 μΜ的RMTE和6 μΜ的Hg2+、40 μΜ的RMTE和8 μΜ的Hgh 時(shí)，得到圖5:分別為紅色巧光(eO、自然光下細(xì)胞照片(e);紅色巧光(f/)、自然光下細(xì)胞照 片（f);紅色巧光(g/)、自然光下細(xì)胞照片（g);紅色巧光(ho、自然光下細(xì)胞照片(h);紅色 巧光（iO、自然光下細(xì)胞照片（i);紅色巧光（j/)、自然光下細(xì)胞照片（j);紅色巧光化/)、自 然光下細(xì)胞照片化）；紅色巧光（1〇、自然光下細(xì)胞照片（1)。細(xì)胞發(fā)出的紅色巧光可W看出 RMTE可W通過(guò)巧光顯微鏡觀察或成像用于檢測(cè)活細(xì)胞內(nèi)的Hg2%在RMTE濃度為20~40 μΜ范 圍內(nèi)，細(xì)胞巧光隨著RMTE濃度增大而增強(qiáng);在化濃度為4~8 μΜ范圍內(nèi)，細(xì)胞巧光隨著化 濃度增大而明顯增強(qiáng)。因此，RMTE不但可W檢測(cè)較低濃度的化2+，而且Hg2+濃度的很小變化 就能引起細(xì)胞巧光強(qiáng)度的靈敏變化;從自然光下細(xì)胞照片可W看出整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)胞都 處于正常狀態(tài)，說(shuō)明RMTE可W用于活細(xì)胞成像。
[0034]綜上所述，本申請(qǐng)公開(kāi)的基于羅丹明B和氨乙基硫酸的化合物，原料易得，合成方 法簡(jiǎn)單，分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單;對(duì)Hgh選擇性好、靈敏度高;可W檢測(cè)接近中性的幾乎純水緩沖溶液 中的Hgh;可W檢測(cè)HgCl2中的化;特別是對(duì)活細(xì)胞毒性低，可W用于活細(xì)胞成像，檢測(cè)活細(xì) 胞中的Hg2+濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物 的制備方法，包括以下步驟，氮?dú)猸h(huán)境下，有機(jī)溶劑中，以羅丹明B和氨乙基硫醚為原料，以 乙胺化合物為添加劑，攪拌反應(yīng)得到基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述有機(jī)溶劑為乙腈、乙醇、二氯甲烷中的 一種或者幾種；所述添加劑為N，N-二異丙基乙胺；反應(yīng)溫度為20~60°C，反應(yīng)時(shí)間為18~ 36h;羅丹明B和氨乙基硫醚的摩爾比為1:(1~7)。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述添加劑用量為羅丹明B摩爾量的7倍； 反應(yīng)溫度為30~50°C，反應(yīng)時(shí)間為20~30 h;羅丹明B和氨乙基硫醚的摩爾比為1: (3~5)。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:在反應(yīng)結(jié)束后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，進(jìn)行柱 層析分離，真空干燥后得到基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:所述基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下：7. 權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于:基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物的濃度為 10~50 μΜ〇8. 基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物在檢測(cè)活細(xì)胞中Hg2+中的應(yīng)用。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:所述基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物 的制備方法，包括以下步驟，氮?dú)猸h(huán)境下，有機(jī)溶劑中，以羅丹明B和氨乙基硫醚為原料，以 乙胺化合物為添加劑，攪拌反應(yīng)得到基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物。10. 權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于:基于羅丹明B和氨乙基硫醚的化合物的濃度為 10~50 μΜ〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/02GK106011217SQ201610335655
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月19日
【發(fā)明人】徐冬梅, 洪苗苗
【申請(qǐng)人】蘇州大學(xué)