專利名稱：天花粉蛋白注射劑的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物蛋白注射劑的生產方法。具體涉及一種天花粉蛋白注射劑及其原料藥天花粉蛋白的生產方法。
背景技術：
天花粉蛋白(Trichosanthin)是從中藥天花粉(栝樓塊根)(trichosanthese kirilowiiMaxim)中提取的植物蛋白，天花粉蛋白由19種氨基酸組成，不含半胱氨酸，其N-端為ASP，C端微觀不均一為Ala和Met。pI為9.4，分子量為27141，不含糖和磷，是一個單鏈堿性簡單蛋白質，含有247(246)個氨基酸殘基，并發(fā)現(xiàn)在巴比妥緩沖液中有獲得結晶(汪猷主編，天花粉蛋白(第二版)，2000，科學出版社，21-28頁)。研究表明，天花粉蛋白是早、中期妊娠引產藥物，對于宮外孕、葡萄胎、惡性葡萄胎等疾病也有良好治療效果。(汪猷主編，天花粉蛋白(第二版)，2000，科學出版社，242-268頁)。1989年美國發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白能抑制人艾滋病病毒(HIV)的復制和繁殖(美國專利4,795,739、美國專利4,985,541)，并用于治療艾滋病，在美國用天花粉蛋白治療艾滋病有統(tǒng)計的病例已達500多例，沒有統(tǒng)計的達數千例，經天花粉蛋白治療后，大多數病人能延長生存期，提高生活質量。
制備天花粉蛋白注射劑的原料藥天花粉蛋白是一種大分子植物蛋白，因其疏水性氨基酸占45％的結構特殊性很容易集聚和沉淀，即發(fā)生變性，使得天花粉蛋白注射劑及其原料藥的生產具有很大的難度。目前報道的天花粉蛋白的提取、分離、純化方法主要包括以下步驟將天花粉生藥洗凈、去皮、切塊、絞碎、離心，得天花粉原汁，調節(jié)pH至4左右，然后經二次丙酮分級沉淀，離心得沉淀物，加水溶解、透析、離心取上清液，冷凍干燥得到精制天花粉蛋白，將精制天花粉蛋白加入緩沖液中進行晶體培養(yǎng)，得到天花粉蛋白晶體，最后經過干燥得到天花粉蛋白(金善煒等，化學學報，1981，39917-925；中國專利申請No.89102920.6)。在天花粉蛋白原料藥的生產工藝中，冷凍干燥制取精制天花粉蛋白是難點之一，天花粉蛋白在冷凍干燥時很容易變性，冷凍干燥條件控制不好會造成原料藥的溶解度下降，而且在制備天花粉蛋白注射劑時，往往會出現(xiàn)一部分原料藥不溶解。
現(xiàn)有技術在制備天花粉蛋白注射劑時，通常采用在置有干燥劑五氧化二磷的干燥器中對結晶天花粉蛋白進行真空干燥，將干燥后的結晶天花粉蛋白作為原料藥。由于天花粉蛋白特殊性質，常規(guī)使用的原料藥在配制注射劑時，用溶液重新溶解有30-50％的結晶天花粉蛋白不能溶解，從而造成大量結晶天花粉蛋白的損失。由于天花粉蛋白的疏水性氨基酸含量較大的結構特殊性，使得保持良好穩(wěn)定性成為天花粉蛋白注射劑生產工藝上的難題。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種天花粉蛋白注射劑的制備方法，該方法在原料藥的生產工藝及使用、穩(wěn)定劑的使用上對現(xiàn)有工藝方法進行改進，以克服現(xiàn)有技術的缺陷。利用本發(fā)明方法制備的天花粉蛋白注射劑穩(wěn)定性良好，配制時原料藥損失小。
本發(fā)明方法對現(xiàn)有的天花粉蛋白注射劑的制備工藝的改進主要集中在以下方面1、原料藥的生產工藝上，優(yōu)化精制天花粉蛋白的冷凍干燥條件，篩選出利于保持天花粉蛋白品質，防止其變性的冷凍干燥時間以及升溫條件；在天花粉蛋白晶體培養(yǎng)中加入無機鹽，從而培養(yǎng)出的結晶質量好，產量高的結晶天花粉蛋白。
2、采用濕的結晶天花粉蛋白為原料配制注射劑，即培養(yǎng)生成的結晶天花粉蛋白經過過濾后，不經過干燥，直接用于配制天花粉蛋白注射劑。
3、配制天花粉蛋白注射劑時，采用多聚乙二醇、人血白蛋白等水溶性大分子化合物作為穩(wěn)定劑。
4、在生產凍干粉針劑時，優(yōu)化冷凍干燥條件。
本發(fā)明中天花粉蛋白注射劑包括常規(guī)使用的水針劑(如注射液、皮試液等)和粉針劑。
本發(fā)明方法包括以下步驟用注射用水溶解結晶天花粉蛋白、調節(jié)pH、加活性炭攪拌、靜置一小時后過濾、濾液中加入穩(wěn)定劑、無菌過濾得到注射液經分裝注射液制成水針劑或經冷凍干燥制成粉針劑。
本發(fā)明方法中，結晶天花粉蛋白可以采用未干燥的濕的結晶天花粉蛋白或干燥的結晶天花粉蛋白，其中優(yōu)選濕的結晶天花粉蛋白，使用濕的結晶天花粉蛋白時95％以上的結晶天花粉蛋白都能溶解；穩(wěn)定劑采用水溶解性大分子化合物，如分子量為5000-20000的多聚乙二醇、人血白蛋白等。穩(wěn)定劑的用量為1-20％(g/v)。濕的結晶天花粉蛋白中天花粉蛋白的含量可用紫外光譜或勞埃法(Lowry)測定，根據注射劑的有效劑量(如注射液為每支1.2mg/ml，皮試液為每支0.05mg/ml，粉針劑為1.2mg/支)及估計損耗率(以可溶蛋白計，為20％左右)計算結晶天花粉蛋白的用量。用酸調節(jié)pH值至3.5-5，所用的酸可以為醋酸、鹽酸、硫酸、磷酸等。在生產粉針劑時，冷凍干燥的時間應控制在45-48小時；干燥過程中升溫速度應控制在每小時升2℃。升溫最高溫度不能超過45℃。在此條件下得到的粉針劑在注射使用時用生理鹽水溶解時溶解度大，澄明度清。
本發(fā)明方法中配制注射劑所用的原料藥結晶天花粉蛋白的制備包括以下步驟將天花粉(栝樓塊根)洗凈、去皮、切塊、絞碎、離心得到天花粉原汁，靜置過夜沉淀，上清液調節(jié)pH值后，經二次丙酮分級沉淀，離心得到沉淀物，加水溶解、透析、離心取上清液，冷凍干燥得到精制天花粉蛋白，將精制天花粉蛋白加入緩沖液中進行晶體培養(yǎng)，得到天花粉蛋白結晶，經過濾得到濕的天花粉蛋白結晶。濕的天花粉蛋白結晶經過真空干燥后得到干燥的天花粉蛋白結晶。
上述制備方法中，上清液的pH值應調節(jié)至4左右。為防止天花粉蛋白在冷凍干燥時變性，冷凍干燥的時間不宜過長或過短，一般在30-45小時，最佳為35-40小時，在干燥過程中升溫速度不宜過快，一般是每小時升2℃。升溫最高溫度不能超過45℃，最佳為40℃。在此冷凍干燥條件下所得到的精制天花粉蛋白進一步制備的天花粉蛋白結晶在配置注射劑時溶解度大，不溶物少。上述方法中緩沖液可采用pH為8-8.8的巴比妥緩沖液，其中優(yōu)選pH為8.6的巴比妥緩沖液，培養(yǎng)天花粉蛋白晶體時在巴比妥緩沖液中加入0.1-0.9％(g/v)的無機鹽，在此條件下培養(yǎng)出的結晶成型好，表觀上具有晶體較大，且在陽光下閃閃發(fā)亮的特點。所得到的天花粉蛋白晶體產量可以比一般方法得到的天花粉蛋白晶體產量高出30％～50％左右。所用的無機鹽可采用氯化鈉、氯化鉀、硝酸鈉、磷酸鈉、醋酸鈉等。
有益效果1、本發(fā)明方法采用濕的結晶天花粉蛋白為原料配制注射劑，原料溶解度大，損失小，可提高注射劑的產量。
2、本發(fā)明方法采用多聚乙二醇、人血白蛋白等水溶性大分子化合物作為穩(wěn)定劑，得到的注射劑穩(wěn)定性好，制備粉針劑時可保證冷凍干燥不變性。利用本發(fā)明方法制備得到的注射劑穩(wěn)定性好，保質期可長達三年。
3、本發(fā)明優(yōu)化了精制天花粉蛋白的冷凍干燥條件，在天花粉蛋白晶體培養(yǎng)中加入無機鹽，從而培養(yǎng)出的晶體純度高，不含雜質多糖、沒有熱原。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明方法作進一步闡述，但不限制本發(fā)明。
實施例1 結晶天花粉蛋白的制備(不使用無機鹽培養(yǎng)晶體)
天花粉100kg洗凈、去皮、切塊、絞碎、離心，得天花粉原汁約20000ml，靜置過夜，沉淀天花粉淀粉，濾除沉淀，得到上清液A。用2mol/LHCL調節(jié)上清液A的pH值至4，使上清液A冷至5℃以下，緩慢加入冷的工業(yè)丙酮16000ml，靜置片刻，用冷凍離心機離心(1500轉/分)15分鐘，棄去沉淀，得到上清液B，冷至5℃以下，緩慢加入冷的丙酮8000ml，靜置片刻，冷凍離心機離心(2500轉/分)20分鐘，收集沉淀，用2000ml純化水溶解并靜置過夜，然后冷凍離心(3500轉/分)20分鐘得到上清液C，對純水透析36-48小時，冷凍離心(3500轉/分)20分鐘得到上清液D，冷凍干燥上清液D得到精制天花粉蛋白136g，冷凍干燥的條件為在-45℃預凍3小時，然后抽真空并緩慢升溫，升溫幅度為每小時升高2℃，冷凍干燥40小時，最后升溫至40℃；將精制天花粉蛋白溶于1360ml純水，冷凍離心(3500轉/分)20分鐘，棄去不溶解沉淀，得到上清液E，用透析紙扎成小袋放入PH為8.6的巴比妥緩沖液(由10.3克巴比妥鈉和1.84克巴比妥溶于1000毫升純水中配制而成)中，在冰箱中(5℃)平衡透析7天，得到濕的結晶天花粉蛋白，從表觀上看，該濕的結晶晶體表觀比較細小，抽濾真空干燥，得到干燥的結晶天花粉蛋白30g。
實施例2 結晶天花粉蛋白的制備(使用無機鹽培養(yǎng)晶體)取天花粉176kg，按照實施例1所述的操作方法，制得精制天花粉蛋白240.5g，將精制天花粉蛋白溶于3550ml純水，冷凍離心(3500轉/分)20分鐘，棄去不溶解沉淀，得到上清液E，用透析紙扎成小袋放入含0.7％(g/v)醋酸鈉的巴比妥緩沖液(PH8.6)，在冰箱中(5℃)平衡透析7天，得到濕的結晶天花粉蛋白，從表觀上看，該濕的結晶晶體較大，且在陽光下閃閃發(fā)光，經抽濾真空干燥，得到干燥的結晶天花粉蛋白80.5克。
與對比例1所述的原料藥生產方法相比，實施例1在晶體培養(yǎng)時使用了0.7％的無機鹽(醋酸鈉)，利用該方法培養(yǎng)得到的結晶成型好，且干燥的結晶天花粉蛋白產量高于未使用無機鹽的實施例1方法。
實施例3 結晶天花粉蛋白的制備(使用無機鹽培養(yǎng)晶體)取天花粉150kg，按照實施例1所述的操作步驟，制得精制天花粉蛋白195g，冷凍干燥的條件為在-45℃預凍3小時，然后抽真空并緩慢升溫，升溫幅度為每小時升高2℃，冷凍干燥35小時，最后升溫至45℃；將精制天花粉蛋白溶于2880ml純水，冷凍離心(3500轉/分)20分鐘，棄去不溶解沉淀，得到上清液E，用透析紙扎成小袋放入含0.1％(g/v)氯化鈉的巴比妥緩沖液(PH8.8)，在冰箱中(5℃)平衡透析7天，得到濕的結晶天花粉蛋白，從表觀上看，該濕的結晶晶體較大，且在陽光下閃閃發(fā)光。經抽濾真空干燥，得到干燥的結晶天花粉蛋白59.6克。
實施例4 天花粉蛋白注射液的制備按照實施例2所述的方法制備得到濕的結晶天花蛋白60g，經紫外光譜法(參照標準方法SOP-ZL-2001-01)測定，含天花粉蛋白27g，加入17400ml注射用水，離心除去不溶物，用鹽酸調pH至4，加入17g活性炭輕輕攪拌，靜置一小時左右，過濾，在濾液中加入1％(g/v)多聚乙二醇(分子量15000)，無菌過濾，以每支1.2mg/ml的量分裝，得到成品16180支注射液。不溶物經干燥后稱量為1.3克，占4.8％。
比較例1天花粉蛋白注射液的制備(常規(guī)方法，不使用穩(wěn)定劑)取實施例1所制備的干燥結晶天花粉蛋白18g，加入7600ml注射用水，離心除去不溶物，用鹽酸調pH至4，加入7.2g活性炭輕輕攪拌，靜置一小時左右，無菌過濾，以每支1.2mg/ml的量分裝，封口得到6130支注射液。不溶物經干燥后稱量為6.4克，占35.56％。
比較例1采用干燥結晶天花粉蛋白為原料藥配制注射液，在配制時有35.56％的結晶天花蛋白不能溶解，而實施例4采用濕的結晶天花粉蛋白為原料藥配制注射液，其結晶天花蛋白的溶解率達到95.2％。此外經穩(wěn)定性實驗表明，利用本發(fā)明方法制備的注射液在37℃保存3個月后，其色澤、澄明度、pH值及生物活性指標仍符合衛(wèi)生部標準WS1-201-87標準的規(guī)定，質量穩(wěn)定；而常規(guī)方法制備的注射液則出現(xiàn)色澤、澄明度變差，生物活性指標降至不符合標準，具體實驗結果見表1。
實施例5 天花粉蛋白粉針劑的制備按照實施例2所述的方法制備得到濕的結晶天花粉蛋白30克，經紫外光譜法(參照標準方法SOP-ZL-2001-01)測定含天花粉蛋白14.5g，加入9200ml注射用水，離心除去不溶物，用鹽酸調pH至4，加入6g活性炭輕輕攪拌，靜置一小時左右，過濾，在濾液中加入1％(g/v)人血白蛋白，無菌過濾，以每支1.2mg/ml的量分裝，冷凍干燥后再封口得天花粉蛋白的粉針劑8150支，冷凍干燥的條件為在-50℃預凍4小時，然后抽真空并緩慢升溫，升溫幅度為每小時升高2℃，冷凍干燥45小時，最后升溫至40℃。濕結晶溶于注射用水時所產生的不溶物經干燥后稱量為0.5克，占3.4％。
實施例6 天花粉蛋白粉針劑的制備按照實施例2所述的方法制備得到濕的結晶天花粉蛋白25g，經紫外光譜法(參照標準方法SOP-ZL-2001-01)測定含天花粉蛋白12.2g，加入7800ml注射用水，離心除去不溶物，用鹽酸調pH至4，加入5g活性炭輕輕攪拌，靜置一小時左右，過濾，在濾液中加入15％(g/v)多聚乙二醇(分子量15000)，無菌過濾，以每支1.2mg/ml的量分裝于安瓿瓶，冷凍干燥后再封口得天花粉蛋白的粉針劑6780支，冷凍干燥的條件為在-50℃預凍4小時，然后抽真空并緩慢升溫，升溫幅度為每小時升高2℃，冷凍干燥45小時，最后升溫至45℃。濕結晶溶于注射用水時所產生的不溶物經干燥后稱量為0.4克，占3.2％。
比較例2天花粉蛋白粉針劑的制備(常規(guī)方法，不使用穩(wěn)定劑)取實施例1所制備的干燥結晶天花粉蛋白22g，加入8900ml注射用水，離心除去不溶物，用鹽酸調pH至4，加入8.8g活性炭輕輕攪拌，靜置一小時左右，無菌過濾，以每支1.2mg/ml的量分裝于安瓿瓶，冷凍干燥后再封口得天花粉蛋白的粉針劑7140支，冷凍干燥的條件為在-50℃預凍4小時，然后抽真空并緩慢升溫，升溫幅度為每小時升高2℃，冷凍干燥45小時，最后升溫至45℃。干燥結晶溶于注射用水時所產生的不溶物經干燥后稱量為8.6克，占39.10％。
比較例2采用干燥結晶天花粉蛋白為原料藥，在用注射用水溶解時有39.10％的結晶天花蛋白不能溶解，而實施例6采用濕的結晶天花粉蛋白為原料藥，其結晶天花蛋白的溶解率達到96.8％。此外經穩(wěn)定性實驗表明，利用本發(fā)明方法制備的粉針劑在37℃保存3個月后，其色澤、水溶性、pH值及生物活性指標仍符合衛(wèi)生部標準WS1-201-87的規(guī)定，質量穩(wěn)定；而常規(guī)方法制備的粉針劑則出現(xiàn)色澤、水溶性變差，生物活性指標降至不符合標準，具體實驗結果見表1。
實施例7 天花粉蛋白皮試液的制備取實施例2所制備的濕的結晶天花粉蛋白0.4g，經紫外光譜法(參照標準方法SOP-ZL-2001-01)測定含天花粉蛋白0.38g，加3700ml注射用水，離心除去不溶物，用鹽酸調pH至4，加3.6g活性炭輕輕攪拌，靜置一小時左右，無菌過濾，分裝每支0.05mg/ml，得到天花粉蛋白皮試注射液3050支。
實施例8注射劑的穩(wěn)定性實驗將天花粉蛋白注射劑置于37℃恒溫恒濕箱中存放3個月，檢查項目如下外觀檢查顏色是否變深；澄明度檢查燈檢是否有沉淀物析出，粉針劑一瓶加1ml生理鹽水溶解后再測定；藥液pH值檢查用25型pH計測定藥液pH值，粉針劑兩瓶加10ml蒸餾水溶解后再測定；生物活性測試取7只懷孕10-12天的小鼠，每只皮下注射天花粉蛋白0.05mg，5天后處死剖腹，計數死胎及吸收點數，按下列公式計算療效百分率

測試注射劑為實施例4和比較例1制備的注射液、實施例6和比較例2制備的粉針劑。
實驗結果見表1。
表1 天花粉蛋白注射劑37℃加速試驗結果

權利要求
1.一種天花粉蛋白注射劑的生產方法，包括如下步驟用注射用水溶解結晶天花粉蛋白、調節(jié)pH、加活性炭攪拌、靜置一小時后過濾、濾液中加入穩(wěn)定劑、無菌過濾得到注射液經分裝注射液制成水針劑或經冷凍干燥制成粉針劑；其特征在于結晶天花粉蛋白可以采用未干燥的濕的結晶天花粉蛋白或干燥的結晶天花粉蛋白；穩(wěn)定劑采用水溶解性大分子化合物。
2.根據權利要求1所述的天花粉蛋白注射劑的生產方法，其特征在于穩(wěn)定劑為分子量為5000-20000的多聚乙二醇或人血白蛋白，其用量為1-20％(重量體積比)。
3.根據權利要求1所述的天花粉蛋白注射劑的生產方法，其特征在于生產粉針劑的冷凍干燥的時間為45-48小時，在干燥過程中升溫速度為每小時升2℃，升溫最高溫度不能超過45℃。
4.權利要求1所述的天花粉蛋白注射劑的原料藥的生產方法，包括如下步驟將天花粉洗凈、去皮、切塊、絞碎、離心得到天花粉原汁，靜置過夜沉淀，上清液調節(jié)pH，經二次丙酮分級沉淀，離心得到沉淀物，加水溶解、透析、離心取上清液，冷凍干燥得到精制天花粉蛋白，將精制天花粉蛋白加入緩沖液中進行晶體培養(yǎng)，得到天花粉蛋白結晶，經過濾得到濕的天花粉蛋白結晶；濕的天花粉蛋白結晶經過真空干燥后得到干燥的天花粉蛋白結晶。
5.根據權利要求4所述的原料藥的生產方法，其特征在于冷凍干燥的時間為30-45小時，在干燥過程中升溫速度為每小時升2℃，升溫最高溫度不能超過45℃。
6.根據權利要求5所述的原料藥的生產方法，其特征在于冷凍干燥的時間為35-40小時，升溫最高溫度為40℃。
7.根據權利要求4所述的原料藥的生產方法，其特征在于培養(yǎng)天花粉蛋白晶體時在巴比妥緩沖液中加入0.1-0.9％(重量體積比)的無機鹽。
8.根據權利要求7所述的原料藥的生產方法，其特征在于無機鹽為氯化鈉或氯化鉀或硝酸鈉或磷酸鈉或醋酸鈉。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種天花粉蛋白注射劑的生產方法。與現(xiàn)有方法相比，該方法的特點在于采用濕的結晶天花粉蛋白為原料藥，采用水溶性大分子化合物作為穩(wěn)定劑。本發(fā)明還提供了原料藥的生產方法，其特點在于優(yōu)化了冷凍干燥條件，晶體培養(yǎng)時使用無機鹽。
文檔編號A61P31/00GK1827161SQ200510024210
公開日2006年9月6日 申請日期2005年3月4日 優(yōu)先權日2005年3月4日
發(fā)明者金善煒, 呂繼湘, 王安文, 謝菊芳, 邱興奎 申請人:上海金山制藥有限公司