專利名稱：β天花粉蛋白的快速純化及其結(jié)晶技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到β天花粉蛋白的快速純化及其結(jié)晶技術(shù)。
背景技術(shù)：
天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)是從葫蘆科植物括樓(Trichosantheskirilowii)的塊根——中藥天花粉原生材料中分離純化得到的一種堿性蛋白質(zhì)。天花粉蛋白的化學(xué)本質(zhì)是一種分子量為27kDa的不含糖的單鏈多肽、屬于1型核糖體失活蛋白(Ribosome Inactivating Protein，RIP)，具有RNA N-糖苷酶活性以及多種酶學(xué)和藥理活性(潘克楨等人.，Structure-FunctionRelationship of Trichosanthin，Pure and Appl.Chem.66，57-64，1994；Shaw PC，et al，Resent advances in trichosanthin，Toxicon，45，683-689，2005)。1989年，McGrath等人發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白能抑制人類免疫缺陷病毒(HIV)在急性感染的T淋巴細(xì)胞和慢性感染的巨噬細(xì)胞中復(fù)制(McGrath et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，862844-2848，1989)，不久，美國(guó)FDA批準(zhǔn)天花粉蛋白進(jìn)行臨床試驗(yàn)。天花粉蛋白的引產(chǎn)活性，抗腫瘤，抗病毒，特別是抗艾滋病毒活性引起了廣泛的重視。
中國(guó)科學(xué)家首先分離純化并結(jié)晶了天花粉蛋白(王亞輝等人，天花粉蛋白的純化及其性質(zhì)的初步研究，動(dòng)物學(xué)報(bào)，22，117-143，1976；金善煒等人，天花粉蛋白的化學(xué)I結(jié)晶天花粉蛋白的制備及其物理化學(xué)性質(zhì)，化學(xué)學(xué)報(bào)，39，917-925，1981；中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所等，天花粉蛋白的晶體培養(yǎng)及其晶胞基本參數(shù)，科學(xué)通報(bào)，176-178，1977；王家槐等人，一種新晶型天花粉蛋白晶體，科學(xué)通報(bào)，943-944，1985)，而國(guó)外，Maraganore等人1987年才首次報(bào)道分離到天花粉蛋白(Maraganore etal.J.Biol.Chem.262，116280，1987)。同時(shí)，從天花粉塊根種陸續(xù)報(bào)道分離出括樓蛋白(金善煒等人，化學(xué)快報(bào)15 160-168 1997)，TAP29(Lee-Huang et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88 6570-6574 1991)和αβγ-Trichosanthin(Narayanna etal.，Plant Science 162 79-85 2002)。這些工作表明，這些蛋白都屬于1型核糖體失活蛋白，具有RNA-N糖苷酶活性，以及抗腫瘤、抗病毒，特別是抗艾滋病毒活性。
現(xiàn)有技術(shù)是按照金善煒的方法，用丙酮分級(jí)沉淀的方法，經(jīng)冷凍干燥制備精制天花粉蛋白，精制天花粉蛋白在巴比妥緩沖液中，以NaNO3為沉淀劑長(zhǎng)出單斜晶體(C2空間群，a＝75.60埃，b＝75.44埃，c＝88.36埃，β＝99.50°；及P21空間群，a＝73.4埃，b＝74.7埃，c＝87.9埃，β＝97.7°)；在檸檬酸緩沖液中，以KCl為沉淀劑，長(zhǎng)出正交晶體(P212121空間群，a＝38.305埃，b＝76.225埃，c＝79.213埃)。上海金山制藥廠生產(chǎn)的天花粉蛋白注射液商品，就是結(jié)晶天花粉蛋白溶液。
金善煒等人從壓榨去汁的天花粉塊根中，經(jīng)生理鹽水抽提、硫酸銨沉淀、透析、冷凍干燥后，經(jīng)Sephadex G-75分離，再經(jīng)陽離子交換劑梯度洗脫獲得括樓蛋白(trichobitacin)，質(zhì)譜(ES-MS)測(cè)定的分子量為27228，氨基酸組成和部分順序與天花粉蛋白相似。Narayanan等人從天花粉塊根中，經(jīng)PBS抽提，冷凍干燥后，經(jīng)陽離子交換劑梯度洗脫獲得天花粉蛋白粗品(凍干粉)，然后再上Mono-S柱少量分離出α β γ天花粉蛋白，β天花粉蛋白在分子量(26kDa)，氨基酸組成和部分順序與天花粉蛋白相似。Lee-Huang等人從天花粉塊根中經(jīng)PBS抽提，透析，陽離子交換劑梯度洗脫后，透析并濃縮后經(jīng)Sephadex G-75分離獲得TAP29，它在分子量(29kDa)和部分氨基酸順序上與天花粉蛋白有差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)，從天花粉蛋白注射液和天花粉蛋白晶體中經(jīng)高分辨率的陽離子交換柱層析分離出2個(gè)等位蛋白，根據(jù)含量的多少和習(xí)慣，分別命名為α天花粉蛋白和β天花粉蛋白，根據(jù)β天花粉蛋白在離子交換柱上的層析行為，本發(fā)明同時(shí)提供從天花粉原生材料制備β天花粉蛋白的方法及其晶體生長(zhǎng)技術(shù)。該蛋白在檸檬酸緩沖液中以2M KCl為沉淀劑結(jié)晶條件下，生長(zhǎng)成正交晶體，經(jīng)X-射線衍射和用同步輻射數(shù)據(jù)分析，該晶體屬于P212121空間群，晶胞參數(shù)為a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。與原來的天花粉蛋白的正交晶體晶胞參數(shù)不同。
上海金山制藥廠生產(chǎn)的天花粉蛋白注射液，在SDS-PAGE中表現(xiàn)為一條帶，分子量為27kDa，在FPLC上，用MonoS HR5/5柱(購(gòu)自Pharmacia公司)分析，當(dāng)條件設(shè)置為A液為10mM磷酸鹽緩沖液pH7.5，B液為A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加樣，A液洗柱5ml，0-50％B液線性梯度洗脫10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。天花粉蛋白在洗脫液達(dá)8.67ml即NaCl濃度為0.183M時(shí)出峰(見圖1)。
但我們注意到，在該峰之前有一個(gè)約為8.5ml的肩峰。于是我們降緩洗脫梯度，其他條件不變，僅將洗脫梯度設(shè)置為0-10％B液線性梯度洗脫10ml，先前條件的肩峰就在11.29ml處出峰，主要的成分在12.07ml處出峰。11.29ml峰就是β天花粉蛋白，12.07ml峰就是α天花粉蛋白，兩者峰面積比為1∶4.5(見圖2)。
用丙酮分級(jí)沉淀后經(jīng)冷凍干燥得到的精制天花粉蛋白，在0.75M檸檬酸緩沖液中，以2M KCl為沉淀劑，長(zhǎng)成天花粉蛋白晶體，將該蛋白晶體洗凈后，搗碎，溶解，離心后上樣Mono-S柱，條件設(shè)置為A液為10mM磷酸鹽緩沖液pH7.5，B液為A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加樣，A液洗柱5ml，0-10％B液線性梯度洗脫10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。(同上述一樣，但由于配置的A液，B液濃度略有差別，故出峰時(shí)間稍有變化)，在10.91ml和11.84ml時(shí)出峰，10.91ml峰就是β天花粉蛋白，11.84ml峰就是α天花粉蛋白，兩者峰面積比為1∶7.6(見圖3)。
基于上述2項(xiàng)工作，本發(fā)明還提供了從天花粉原生材料制備β天花粉蛋白的技術(shù)，本發(fā)明的技術(shù)方案是天花粉原生材料去皮洗凈，切碎，加5mM，pH4.5醋酸緩沖液，抽提，勻漿，加50％冰醋酸調(diào)pH4.0，然后在4℃條件下，16000×g離心30min，上清液加樣到20mM，pH4.5醋酸緩沖液平衡的強(qiáng)陽離子交換樹脂(S-Sepharose Fast Flow或SP-Sepharose Fast Flow)的柱上，柱長(zhǎng)要求在20cm以上，280nm實(shí)時(shí)檢測(cè)，用20mM，pH4.5醋酸緩沖液洗至基線，再用20mM，pH6.5磷酸緩沖液洗至基線，然后用15-20倍柱床體積緩沖液緩梯度洗脫，一般會(huì)出3個(gè)峰(見圖4)。收集第2峰，用50％冰醋酸調(diào)pH4.0，加兩倍體積的醋酸緩沖液，再用陽離子交換樹脂進(jìn)行梯度洗脫，主要的峰就是β天花粉蛋白(見圖5)。
本發(fā)明所分離純化的β天花粉蛋白，在SDS-PAGE上呈現(xiàn)一條帶，分子量為27kDa，在強(qiáng)陽離子預(yù)裝柱Mono-S柱(購(gòu)自Pharmacia公司)表現(xiàn)為一個(gè)峰(見圖6)，在凝膠過濾預(yù)裝柱Superdex-75(購(gòu)自Pharmacia公司)上表現(xiàn)為一個(gè)峰(見圖7)。經(jīng)質(zhì)譜(ES-MS)分析，β天花粉蛋白分子量為27163.0和27102.0。相同條件下測(cè)得α天花粉蛋白的分子量為27173.0和27103.0，可以認(rèn)為二者的分子量是相同的。
本發(fā)明所制備的β天花粉蛋白采用懸滴法技術(shù)，母液濃度為20mg/ml，在0.075M，pH 5.4檸檬酸緩沖液中，以2M KCl為沉淀劑，就可以長(zhǎng)出β天花粉蛋白正交晶體。經(jīng)X-射線衍射分析或同步輻射衍射分析，晶體屬于P212121空間群，其晶胞參數(shù)為a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃，與以前報(bào)道的結(jié)晶天花粉的晶型(晶胞參數(shù))皆不同(P212121空間群，a＝38.305埃，b＝76.225埃，c＝79.213埃；C2空間群，a＝75.60埃，b＝75.44埃，c＝88.36埃，β＝99.50°；及P21空間群，a＝73.4埃，b＝74.7埃，c＝87.9埃，β＝97.7°)。我們已收集到一套1.6埃的數(shù)據(jù)。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下積極效果1.本發(fā)明證實(shí)天花粉蛋白注射液和天花粉蛋白晶體中含有兩個(gè)等位蛋白α天花粉蛋白和β天花粉蛋白，他們?cè)诜肿恿?、氨基酸組成和順序上均相同，都具有N-糖苷酶活性和抗HIV活性，僅在高靈敏度、高分辨率層析技術(shù)上出峰時(shí)間稍有差異，生成的蛋白質(zhì)晶體的晶胞參數(shù)不同。
2.本發(fā)明采用2步陽離子交換樹脂洗脫技術(shù)，不經(jīng)丙酮或硫酸銨分級(jí)沉淀及透析，冷凍干燥等步驟，避免了許多引起蛋白變性的繁瑣操作，可以從天花粉蛋白原生材料中快速分離出β天花粉蛋白。
3.本發(fā)明優(yōu)選用于分離純化的緩沖液濃度、pH值，洗脫梯度，提高了分離效果。
4.本發(fā)明所得出的β天花粉蛋白，在檸檬酸緩沖液中以2M KCl為沉淀劑可以培養(yǎng)出β天花粉蛋白晶體，晶體屬于P212121空間群，其晶胞參數(shù)為a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。為該蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究提供了重要的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)。


現(xiàn)在對(duì)附圖作簡(jiǎn)要說明圖1.天花粉蛋白注射液在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為mAU，天花粉蛋白在洗脫液達(dá)8.76ml處即在0.188 M NaCl(pH7.5，10mM磷酸鹽緩沖液)時(shí)出峰，圖中折線為鹽濃度，滿標(biāo)為1MNaCl。
圖2.天花粉蛋白注射液在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為mAU，β天花粉蛋白在洗脫液達(dá)11.29ml處即在0.629 MNaCl(pH7.5，10mM磷酸鹽緩沖液)時(shí)出峰，α天花粉蛋白在12.07ml處出峰，圖中折線為鹽濃度，滿標(biāo)為1M NaCl。
圖3.天花粉蛋白晶體在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為mAU，β天花粉蛋白在洗脫液達(dá)10.91ml處即在0.591MNaCl(pH7.5，10mM磷酸鹽緩沖液)時(shí)出峰，α天花粉蛋白在11.84ml處出峰，圖中折線為鹽濃度，滿標(biāo)為1M NaCl。
圖4.β天花粉蛋白在S-Sepharose Fast Flow柱上洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為AU，即A280檢測(cè)值，圖中虛線為在20mM，pH6.5磷酸緩沖液條件下，NaCl濃度的線性梯度線，β天花粉蛋白約在0.1M NaCl處出峰，α天花粉蛋白約在0.15M NaCl處出峰。
圖5.β天花粉蛋白在S-Sepharose Fast Flow柱上再洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為AU，即A280檢測(cè)值，圖中虛線為在10mM，pH7.5磷酸緩沖液條件下，NaCl濃度的線性梯度線，β天花粉蛋白約在0.175M NaCl處出峰。
圖6.β天花粉蛋白在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為mAU，β天花粉蛋白在洗脫液達(dá)10.91ml處即在0.0591M NaCl(pH7.5，10mM磷酸鹽緩沖液)時(shí)出峰，α天花粉蛋白在11.89ml處出峰。圖中折線為鹽濃度，滿標(biāo)為1M NaCl。
圖7.天花粉蛋白在Supedex-75柱上洗脫圖。橫坐標(biāo)為洗脫液ml數(shù)，縱坐標(biāo)為mAU，β天花粉蛋白在洗脫液達(dá)13.34ml處出峰。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，通過實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明。
實(shí)施例1快速分離純化β天花粉蛋白取去皮洗凈的天花粉，加100ml pH4.5，10mM醋酸緩沖液浸泡，在勻漿機(jī)上勻漿二次，然后用50％的冰醋酸調(diào)pH4.0，再在4℃條件下16000×g，離心30’，收集上清液，上清液加樣到1.6×23cm的Sp-Sepharose Fast Flow柱上(該柱已用pH 4.5，20mM醋酸緩沖液平衡)，繼續(xù)用pH 4.5，20mM醋酸緩沖液洗出一個(gè)雜峰后，用pH6.5，20mM磷酸鹽緩沖液繼續(xù)洗柱，又會(huì)洗出一個(gè)雜峰，然后用0-0.3M NaCl(在pH6.5，20mM磷酸鹽緩沖液中)梯度洗脫，收集第2峰(見圖4)。
合并第2峰，加50％冰醋酸調(diào)pH4，再加2倍體積的pH4.5，20mM醋酸緩沖液，上樣到已用相同醋酸緩沖液平衡的Sp-Sepharose Fact Flow柱上，繼續(xù)用pH4.5，20mM醋酸緩沖液洗柱，再用pH7.5，10mM磷酸緩沖液洗柱，然后用0-0.4M NaCl(在pH7.5，10mM磷酸緩沖液中)梯度洗脫，收集主要的峰，該峰就是β天花粉蛋白(見圖5)。
實(shí)施例2強(qiáng)陽離子預(yù)裝柱Mono-S分析本發(fā)明制備的β天花粉蛋白在Mono-S HR5/5柱上洗脫圖(見圖6)A液為10mM磷酸鹽緩沖液pH7.5，B液為A液+1M NaCl，流速1ml/min，Mono-S柱用A液平衡后，加樣，A液洗柱5ml，0-10％B液線性梯度洗脫10ml，然后100％B液洗5ml后，再用A液平衡5ml。β天花粉蛋白在洗脫液達(dá)10.91ml即NaCl濃度為0.0591M時(shí)出一單峰。
實(shí)施例3凝膠過濾預(yù)裝柱Superdex-75分析圖7是本發(fā)明制備的β天花粉蛋白在Superdex-75柱上洗脫圖，洗脫緩沖液為0.1M NH4HCO3，pH8，流速0.4ml/min，β天花粉蛋白在洗脫液達(dá)13.34ml時(shí)出一單峰。
實(shí)施例4β天花粉蛋白的晶體生長(zhǎng)本發(fā)明制備的β天花粉蛋白作為母液，蛋白濃度20mg/ml，池液用0.075M，pH 5.4檸檬酸緩沖液，2M KCl為沉淀劑，用懸滴法培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體，2天后可見晶體，1周左右晶體長(zhǎng)大，經(jīng)X-射線衍射分析或同步輻射衍射分析，晶體屬于P212121空間群，其晶飽參數(shù)為a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。
權(quán)利要求
1.一種β天花粉蛋白的快速純化技術(shù)，將天花粉原生材料去皮洗凈，切碎，加5mM，pH4.5醋酸緩沖液抽提，勻漿，加50％冰醋酸調(diào)pH4.0，然后在4℃條件下，16000×g離心30min，上清液加樣到20mM，pH4.5醋酸緩沖液平衡的強(qiáng)陽離子交換樹脂的柱上，柱長(zhǎng)要求在20cm以上，280nm實(shí)時(shí)檢測(cè)，用20mM，pH4.5醋酸緩沖液洗至基線，再用20mM，pH6.5磷酸緩沖液洗至基線，然后用15-20倍柱床體積緩沖液緩梯度洗脫，一般會(huì)出3個(gè)峰；收集第2峰，用50％冰醋酸調(diào)pH4.0，加兩倍體積的醋酸緩沖液，再用陽離子交換樹脂進(jìn)行梯度洗脫，即可獲得β天花粉蛋白，其特征在于在緩沖液抽提后，經(jīng)過2步強(qiáng)陽離子交換柱梯度洗脫，就可以得到β天花粉蛋白。
2.一種權(quán)利要求1的β天花粉蛋白的晶體生長(zhǎng)，其特征在于β天花粉蛋白，在檸檬酸緩沖液中，以2M KCl為沉淀劑時(shí)，長(zhǎng)成β天花粉蛋白的正交晶體，晶體屬于P212121空間群，其晶胞參數(shù)為a＝38.244埃，b＝86.934埃，c＝135.785埃。
全文摘要
本發(fā)明涉及β天花粉蛋白快速純化及其結(jié)晶技術(shù)。天花粉原生材料去皮洗凈，切碎，加緩沖液抽提，經(jīng)陽離子交換樹脂2次梯度洗脫，就可以獲得β天花粉蛋白。β天花粉蛋白在檸檬酸緩沖液中以2M KCl為沉淀劑，可以長(zhǎng)成β天花粉蛋白的正交晶體，晶體屬于P文檔編號(hào)C07K14/415GK101081862SQ200610084960
公開日2007年12月5日 申請(qǐng)日期2006年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月31日
發(fā)明者陳明晃 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所