專利名稱：一種虎杖中雌激素的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域中的植物雌激素，具體地說是一種虎杖中雌激素的提取方法。
背景技術(shù)：
植物雌激素是指某些能結(jié)合并激活哺乳類動物及人類的雌激素受體，從而具有雌激素樣和/或抗雌激素活性的植物成分，具有廣泛的生物活性。在對植物雌激素進行廣泛研究的過程中，人們發(fā)現(xiàn)與植物雌激素相關(guān)聯(lián)的化學(xué)成分富含在某些中藥之中，而且是中藥發(fā)揮某些藥效作用的生物活性組分。特別是近年來的研究發(fā)現(xiàn)植物雌激素除了對婦女絕經(jīng)后因雌激素減少引起的骨質(zhì)疏松、更年期綜合癥、心血管疾病有明顯療效外，對某些激素倚賴性腫瘤，如乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌等也具有很好的預(yù)防與治療作用，因而引起了藥物研究者的深切關(guān)注。因此，篩選中藥中的植物雌激素成分將具有非常重大的意義。
傳統(tǒng)中藥虎杖廣泛被用于預(yù)防和治療婦女月經(jīng)不調(diào)以及絕經(jīng)后產(chǎn)生的一系列疾病，具有較強的雌激素活性。目前，虎杖的主要雌激素活性成分是其中含量豐富的大黃素，而研究表明，其中一些微量成分有可能具有高的雌激素活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種虎杖中雌激素的提取方法，本發(fā)明利用制備高效液相色譜對虎杖中的雌激素活性部位進行精制，得到了具有較高雌激素活性的化學(xué)組分。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明通過對虎杖藥材飲片的溶劑提取、萃取、硅膠柱層析和高效液相制備色譜精分離，可以得到具有高雌激素活性的化學(xué)組分。
采用的技術(shù)方案如下本發(fā)明提出的虎杖的提取方法是乙醇冷浸法。對提取得到的總提物采用溶劑分配的原理進行萃取。對活性部位-乙酸乙酯部位首先采用硅膠柱實現(xiàn)粗分離，對目標組分進行初步的富集后，再利用高效液相制備色譜對目標組分進行快速切割。整個過程采用高效液相色譜以及質(zhì)譜進行監(jiān)控。
具體提取過程如下，1)將虎杖于乙醇水溶液中常溫浸提(即室溫下采用乙醇冷浸法進行浸提)；2)將步驟(1)得到的虎杖提取液完全濃縮至干后，用水混懸，然后用乙酸乙酯進行萃??；3)對步驟(2)得到的乙酸乙酯部位應(yīng)用硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分；4)對步驟(3)中的餾分利用高效液相色譜進行精制，收集質(zhì)譜檢測其為m/z 286、206和270處的目標組分。
步驟(1)中乙醇水溶液為60～80％乙醇/水(體積比)溶液，藥材虎杖與溶劑的體積比為1∶3～1∶5；重復(fù)提取3～5次；步驟(2)中萃取液中水∶乙酸乙酯的體積比例為1∶1～1∶3；步驟(3)中層析柱填料為硅膠，硅膠的粒徑不限，通常填料的粒徑為5～10μm；流動相選擇甲醇和甲酸水兩相體系，其中添加甲酸的濃度范圍為0.1％～0.5％(體積比)；步驟(4)中所用柱填料為C18；流動相A為甲醇，B為0.5％甲酸水溶液；所用流速為120～150 mL/min；根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割；合并、濃縮、抽干；所述目標組分是通過轉(zhuǎn)基因酵母法檢測，β-半乳糖苷酶的酶活以及樣品的EC50值兩個指標確定該化學(xué)組分具有較高的雌激素活性。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，該方法具有以下優(yōu)點(1)制備方法可控，組分組成簡單清楚，重現(xiàn)性好。由于本發(fā)明采用高效液相制備色譜對硅膠柱層析的餾分進行精制，同時應(yīng)用質(zhì)譜對活性組分進行監(jiān)控，與通常的柱層析技術(shù)或者堿梯度萃取相比，整個過程可控性較高，而且目標組分組成清楚，具有較高的重現(xiàn)性。
(2)目標組分的雌激素活性高，同時來源于植物，具有較低的毒副作用。
(3)本發(fā)明在質(zhì)譜檢測的基礎(chǔ)上，應(yīng)用高效液相制備色譜進行精制分離，從中藥虎杖中篩選出具有高雌激素活性的化學(xué)組分，初步符合國家中藥材二類新藥標準。
具體實施例方式
實驗例1.虎杖活性組分的雌激素活性測試a.雌激素活性測試方法利用轉(zhuǎn)基因酵母的方法測試虎杖樣品的雌激素活性(文獻1Zhang，C.Z.，Wang，S.X.，Zhang，Y.，Chen，J.P.，Liang，X.M.，2005.In vitro estrogenicactivities of Chinese medicinal plants traditionally used for the management ofmenopausal symptoms.Journal of Ethnopharmology 98，295-300.)。它是將含有雌激素受體基因和β-半乳糖苷酶報告基因的轉(zhuǎn)基因酵母菌種(Saccharomyces cerevisiae strain，商品編號BJ3505)在液體培養(yǎng)基(SC培養(yǎng)基，其組成為亮氨酸，3.96‰；組氨酸，0.05‰；酵母氮堿(YNB)，1.7‰；硫酸銨，5‰；葡萄糖20‰)中，30℃恒溫搖床培養(yǎng)過夜。稀釋10倍后在595nm處的光密度為0.15-0.2之間時，用含有10μM CuSO4的液體培養(yǎng)基將酵母菌液稀釋到OD595＝0.75作為工作液。將5μL稀釋成不同濃度的樣品(分別為50mg/ml，5mg/ml，0.5mg/ml，0.05mg/ml，0.005mg/ml，0.0005mg/ml，0.00005mg/ml)分別加到裝有995μL酵母菌液的離心管中，混勻后吸取100μL于96孔板中，每個不同濃度的樣品平行三次。震蕩條件下，在30℃恒溫搖床中暴露2小時，測定OD595(TECAN酶標儀)。加酶反應(yīng)液(60mM Na2HPO4，40mM NaH2PO4，10mM KCl，1mM MgSO4，2mg/mlONPG，38mMβ-mercaptoethanol，0.01‰tritonX-100，15U/mL lyticase)100μL/well，待溶液變黃后，加終止液(1MNa2CO3)100μL/well，測定OD420。
樣品的雌激素活性大小的評價指標一個是β-半乳糖苷酶的酶活力，另外一個是樣品的EC50值。前者是通過間接的測定β-半乳糖苷酶對底物的轉(zhuǎn)化能力來反映外來物質(zhì)的雌激素活性的大小，而后者則直接反映待測物質(zhì)與雌激素受體結(jié)合的能力大小，即作為配體的功能。在本發(fā)明的系統(tǒng)當中，雌二醇(E2)作為不變的陽性參照，其最大β-半乳糖苷酶的酶活視為100％；二甲基亞砜(DMSO)作為陰性對照。β-半乳糖苷酶活性以及EC50值計算方法如公式(1)和(2)所示。
u=100%[A420A595(sample)-A420A595(blank)]50t---(1)]]>式中，u為酶活力，A420為酵母反應(yīng)體系在420nm處的吸光度，A595為酵母反應(yīng)體系在595nm處的吸光度，t為反應(yīng)時間，50為E2反應(yīng)時間。本發(fā)明數(shù)據(jù)處理過程中將E2最大酶活按100％計算。
Y=[A-D]1+[CX]B+D---(2)]]>式中，Y為β-半乳糖苷酶活性，X為樣品在反應(yīng)體系中的濃度，A為β-半乳糖苷酶最大響應(yīng)活性，C為濃度-響應(yīng)曲線中的線性部分的斜率，D為最低檢測限。
b.虎杖化學(xué)成分雌激素活性測試結(jié)果虎杖乙酸乙酯部份硅膠柱分離后得到的餾分，應(yīng)用高效液相制備色譜精制，所得目標組分雌激素活性測試結(jié)果顯示其EC50值可達到10-4g/L(E2的EC50為10-7g/L)。
實驗例2.虎杖活性組分的質(zhì)譜監(jiān)測質(zhì)譜監(jiān)測所用的離子源為APCI源，汽化室溫度為350℃，加熱毛細管溫度為260℃，輔助氣壓力為10～20au，鞘氣壓力為40～60psi，碰撞誘導(dǎo)解離(CID)為30～40V。活性組分的主要分子離子峰為286、206和270。
結(jié)合本發(fā)明的內(nèi)容提供以下實施例實施例1.虎杖中雌激素活性組分的制備a.1公斤虎杖藥材經(jīng)粉碎后按照1∶3的體積比例用體積濃度為60％乙醇冷浸提取三次，每次24小時。抽干的總提物用水混懸后，按照水∶乙酸乙酯＝1∶2的體積比例用乙酸乙酯進行萃取，連續(xù)操作三次，得乙酸乙酯部位82克，用硅膠柱進行粗分離；以體積比，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分。
b.對步驟a收集的餾分利用高效液相制備儀進行精制。所用柱填料為C18(100A，10μm)。流動相A為甲醇，B為0.2％甲酸水溶液。甲醇濃度以線性梯度在17分鐘內(nèi)從50％升到82％，然后在9分鐘內(nèi)升到90％，再在14分鐘內(nèi)升到100％。流速為150mL/min，檢測波長為254nm，進樣體積為10mL，柱溫為室溫。根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割。合并、濃縮、抽干。
實施例2.虎杖中雌激素活性組分的制備a.1公斤虎杖藥材經(jīng)粉碎后按照1∶4的體積比例用體積濃度為60％乙醇冷浸提取三次，每次24小時。抽干的總提物用水混懸后，按照水∶乙酸乙酯＝1∶1的體積比例用乙酸乙酯進行萃取，連續(xù)操作三次，得乙酸乙酯部位95克，用硅膠柱進行粗分離，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分。
b.對步驟a收集的餾分利用高效液相制備儀進行精制。所用柱填料為C18(100A，5μm)。流動相A為甲醇，B為0.5％甲酸水溶液。甲醇濃度以線性梯度在25分鐘內(nèi)從45％升到85％，保持3分鐘，再在14分鐘內(nèi)升到100％。流速為120mL/min，檢測波長為254nm，進樣體積為8mL，柱溫為室溫。根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割。合并、濃縮、抽干。
實施例3.虎杖中雌激素活性組分的制備a.1公斤虎杖藥材經(jīng)粉碎后按照1∶5的體積比例用體積濃度為70％乙醇冷浸提取三次，每次24小時。抽干的總提物用水混懸后，按照水∶乙酸乙酯＝1∶3的體積比例用乙酸乙酯進行萃取，連續(xù)操作三次，得乙酸乙酯部位80克，用硅膠柱進行粗分離，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分。
b.對步驟a收集的餾分利用高效液相制備儀進行精制。所用柱填料為C18(100A，10μm)。流動相A為甲醇，B為0.5％甲酸水溶液。甲醇濃度以線性梯度在16分鐘內(nèi)從45％升到80％，然后在24分鐘內(nèi)升到100％。流速為120 mL/min，檢測波長為254nm，進樣體積為10mL，柱溫為室溫。根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割。合并、濃縮、抽干。
實施例4.虎杖中雌激素活性組分的制備
a.1公斤虎杖藥材經(jīng)粉碎后按照1∶3的體積比例用體積濃度為80％乙醇冷浸提取三次，每次24小時。抽干的總提物用水混懸后，按照水∶乙酸乙酯＝1∶2的體積比例用乙酸乙酯進行萃取，連續(xù)操作三次，得乙酸乙酯部位82克，用硅膠柱進行粗分離，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分。
b.對步驟a收集的餾分利用高效液相制備儀進行精制。所用柱填料為C18(100A，10μm)。流動相A為甲醇，B為0.1％甲酸水溶液。甲醇濃度以線性梯度在40分鐘內(nèi)從30％升到90％，再在15分鐘內(nèi)升到100％。流速為150mL/min，檢測波長為254nm，進樣體積為9mL，柱溫為室溫。根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割。合并、濃縮、抽干。
實施例5.虎杖中雌激素活性組分的制備a.1公斤虎杖藥材經(jīng)粉碎后按照1∶4的體積比例用體積濃度為70％乙醇冷浸提取三次，每次24小時。抽干的總提物用水混懸后，按照水∶乙酸乙酯＝1∶2的體積比例用乙酸乙酯進行萃取，連續(xù)操作三次，得乙酸乙酯部位82克，用硅膠柱進行粗分離，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分。
b.對步驟a收集的餾分利用高效液相制備儀進行精制。所用柱填料為C18(100A，5μm)。流動相A為甲醇，B為0.2％甲酸水溶液。甲醇濃度以線性梯度在20分鐘內(nèi)從50％升到82％，然后在6分鐘內(nèi)升到90％，再在14分鐘內(nèi)升到100％。流速為120mL/min，檢測波長為254nm，進樣體積為10mL，柱溫為室溫。根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割。合并、濃縮、抽干。
權(quán)利要求
1.一種虎杖中雌激素的提取方法，其特征在于1)將虎杖于乙醇水溶液中常溫浸提；2)將步驟(1)得到的虎杖提取液完全濃縮至干后，用水混懸，然后用乙酸乙酯進行萃??；3)對步驟(2)得到的乙酸乙酯部位應(yīng)用硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分；4)對步驟(3)中的餾分利用高效液相色譜進行精制，收集質(zhì)譜檢測其為m/z286、206和270處的目標組分。
2.按照權(quán)利要求1所述的虎杖中雌激素的提取方法，其特征在于步驟(1)中乙醇水溶液為60～80％乙醇/水溶液，藥材虎杖與溶劑的體積比為1∶3～1∶5；重復(fù)提取3～5次。
3.按照權(quán)利要求1所述的虎杖中雌激素的提取方法，其特征在于步驟(2)中萃取液中水∶乙酸乙酯的體積比為1∶1～1∶3。
4.按照權(quán)利要求1所述的虎杖中雌激素的提取方法，其特征在于步驟(3)中層析柱填料為硅膠，填料的粒徑5～10μm；流動相選擇甲醇和甲酸水兩相體系，其中添加甲酸的濃度范圍為0.1％～0.5％。
5.按照權(quán)利要求1所述的虎杖中雌激素的提取方法，其特征在于步驟(4)中所用柱填料為C18；流動相A為甲醇，B為0.5％甲酸水溶液；所用流速為120～150mL/min；根據(jù)質(zhì)譜檢測的目標組分的分子離子峰286、206和270，按照色譜峰進行切割；合并、濃縮、抽干。
6.按照權(quán)利要求1所述的虎杖中雌激素的提取方法，其特征在于所述目標組分是通過轉(zhuǎn)基因酵母法檢測，β-半乳糖苷酶的酶活以及樣品的EC50值兩個指標確定該化學(xué)組分的雌激素活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及制藥領(lǐng)域中的植物雌激素，具體地說是一種虎杖中雌激素的提取方法，1)將虎杖于乙醇水溶液中常溫浸提；2)將步驟(1)得到的虎杖提取液完全濃縮至干后，用水混懸，然后用乙酸乙酯進行萃取；3)對步驟(2)得到的乙酸乙酯部位應(yīng)用硅膠柱層析，石油醚∶乙酸乙酯∶甲酸＝2∶8∶0.5為展開劑，收集0.66＜Rf≤1的餾分；4)對步驟(3)中的餾分利用高效液相色譜進行精制，收集質(zhì)譜檢測其為m/z 286、206和270處的目標組分。本發(fā)明在質(zhì)譜檢測的基礎(chǔ)上，應(yīng)用高效液相制備色譜進行精制分離，從中藥虎杖中篩選出具有高雌激素活性的化學(xué)組分，初步符合國家中藥材二類新藥標準。
文檔編號A61P35/00GK1935195SQ200510047258
公開日2007年3月28日 申請日期2005年9月21日 優(yōu)先權(quán)日2005年9月21日
發(fā)明者張彩寧, 肖紅斌, 張曉哲, 梁鑫淼 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所