專(zhuān)利名稱：人參皂苷c－k在制備治療或預(yù)防肝纖維化的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人參皂苷在預(yù)防或治療肝纖維化中的應(yīng)用，具體地涉及人參皂苷C-K在制備預(yù)防或治療由感染和化學(xué)因素所致的肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肝纖維化是慢性肝病重要的病理特征。病毒、乙醇、自身免疫性疾病等病因均可引起肝細(xì)胞壞死、再生和持續(xù)性纖維增生，最終導(dǎo)致肝硬化?，F(xiàn)已證實(shí)肝纖維化是可逆病變，肝硬化則是不可逆的。因此，在慢性肝病的治療過(guò)程中，肝纖維化的防治占有重要地位人參具有大補(bǔ)元?dú)?，?fù)脈固脫，補(bǔ)脾益肺，生津、安神等功能。人參皂苷是人參的主要活性成分之一。有的治療肝纖維化的藥物中含有人參季光，曹承樓，劉平等.扶正化瘀方影響肝硬化大鼠肝細(xì)胞增殖的病理及免疫組化研究.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2001；7(2)29；人參莖葉皂苷對(duì)肝纖維化具有預(yù)防作用鄒麗宜，吳鐵.小鼠肝硬化導(dǎo)致骨丟失及人參莖葉皂苷的防治作用.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2001；36886-890。
傳統(tǒng)中藥中的人參均為口服，而多種人參皂苷口服后以原型入血的比率很低。日本多項(xiàng)研究表明，多種人參皂苷口服后均在腸道菌代謝下產(chǎn)生人參皂苷C-K，然后再吸收入血，所以在血中檢測(cè)到的人參皂苷的原型量很低，但可以檢到C-K(ODANI T et al，Studies on absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponins.III.the absorption，distribution，excretion of ginsenoside Rb1 in the rats. Chem Pharm Bull 1983，31(3)1059-1066；AKAO T et al，Metabolic activation of crude drug components byintestinal bacterial enzymes.J Med Pharm Soc.WAKEN-YAKU 1992，91-13.(in Japanese)；KARIKURA M et al，Studies on absorption，distribution，excretion and metabolism ofginseng saponins.V.the decomposition products of ginsenoside Rb2 in the large intestineof rats.Chem Pharm Bull 1990，38(9)2859-2861；KARIKURA M et al，Studies on absorption，distribution，excretion and metabolism of ginseng saponins.VII.comparison of thedecomposition modes of ginsenoside-Rb1 and-Rb2 in the digestive tract of rats.ChemPharm Bull 1991，39(9)2357-2361)。這表明C-K可能是傳統(tǒng)中藥人參在發(fā)揮治療用的重要成分之一。研究表明C-K具有抑制新生血管生成、抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的作用。但人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化增生有無(wú)抑制作用未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)大量的研究證明，人參皂苷C-K不論是注射給藥，還是口服給藥，對(duì)肝纖維化增生均有明顯的抑制作用，即人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化具有預(yù)防或治療作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了人參皂苷C-K在制備預(yù)防或治療肝纖維化中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了人參皂苷C-K在制備預(yù)防或治療由感染所致的肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了人參皂苷C-K在制備治療或預(yù)防因化學(xué)因素所致肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供了由人參皂苷C-K和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成的藥物組合物，該藥物組合物可以以藥學(xué)常規(guī)方法制備成片劑、膠囊劑、滴丸劑、注射液、凍干粉針或注射用乳劑，優(yōu)選以片劑、滴丸或凍干粉針形式存在。該組合物可以通過(guò)口服或注射給藥，注射給藥可以靜脈注射或肌肉注射。
目前人參皂苷C-K通常采用不同的手段從天然的人參皂苷降解得到。我們按照中國(guó)公開(kāi)專(zhuān)利CN1417345中的方法制備純化了人參皂苷C-K，分別以藥劑學(xué)常規(guī)方法和我公司的專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)枮?00410002110.8中的方法將其制備成了C-K口服制劑和C-K凍干粉針，并用其進(jìn)行了人參皂苷C-K在預(yù)防或治療肝纖維化中的作用的研究。結(jié)果表明人參皂苷C-K口服和注射給藥均能有效抑制由化學(xué)因素或所致的肝纖維化增生。對(duì)肝纖維化的研究證明，肝纖維化可由感染(病毒、細(xì)菌等)或化學(xué)因素引起。雖然引起肝纖維化的因素不同，但其基本的病理演化過(guò)程卻十分相似，因此在以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究肝纖維化和抗肝纖維化藥物時(shí)，常常以化學(xué)損傷所致的肝纖維化作為感染和化學(xué)因素致肝纖維化的共同代表，并且作為預(yù)防和治療用藥的共同模型。以下以化學(xué)因素所致肝纖維化為模型，證明人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化的作用。
根據(jù)試驗(yàn)例結(jié)果，我們推薦人參皂苷C-K作為注射用藥時(shí)的臨床劑量為1-75mg/日，優(yōu)選5-50mg/日。作為口服用藥時(shí)的臨床劑量為2-200mg/日，優(yōu)選6-54mg/日，更優(yōu)選6-18mg/日。
下面結(jié)合制備例和實(shí)驗(yàn)例對(duì)我們的發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，但不僅限于此。
具體實(shí)施例方式
制備例1 人參皂苷C-K凍干粉針的制備稱取1.00g人參皂苷C-K，加入20ml乙醇使皂苷完全融解，再加入40ml甘油混合均勻。將0.02g的EDTA-2Na加入到40ml注射用水中，使輔料完全溶解。并將上述水溶液加入到藥物溶液中，混合均勻。以0.01mol/L的氫氧化鈉和稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值為5.5±1.0。加入0.1％的針用活性炭85度保溫15分鐘，G3垂熔玻璃漏斗過(guò)濾，0.22um的微孔濾膜過(guò)濾。濾液分裝于7ml西林瓶中，每支裝量2ml。分裝好的注射劑半壓塞，于凍干機(jī)中凍干，壓鋁蓋成凍干粉針劑，20mg/支。
制備例2 人參皂苷C-K軟膠囊的制備稱取明膠100g，甘油30g和水130g。取明膠加入適量的水使其吸水膨脹。另將甘油及余下的水置煮膠鍋中加熱至70～80℃，混合均勻，加入膨脹的明膠攪拌，熔融。保溫1～2小時(shí)，靜置，使泡沫上浮，刮去上浮的泡沫，以洗凈白布過(guò)濾，加入0.0075mgr Fe2O3粉末，混勻，保溫待用。配成的膠液粘度一般為2.8～3.2度。
稱取人參皂苷C-K 10g溶于90g聚乙二醇中，加熱使其充分溶解，放至室溫。
壓制軟膠囊將已制好的明膠甘油和當(dāng)歸油裝入自動(dòng)旋轉(zhuǎn)軋囊機(jī)中，溫度控制在40～50℃，壓制出每囊含100mg藥液油的軟膠囊，每粒軟膠囊含人參皂苷C-K 10mg。
制備例3 人參皂苷C-K 10mg片的制備處方人參皂苷C-K10.0g微晶纖維素 57.0g乳糖 100.0g羧甲基淀粉鈉 10.0g3％PVPK30水溶液 適量硬脂酸鎂 1.0g共制成 1000片操作稱取處方量的人參皂苷C-K、乳糖、微晶纖維素和羧甲基淀粉鈉充分混合均勻，加入3％PVPK30水溶液適量制軟材，28目篩制粒，60℃干燥3小時(shí)，26目篩整粒，加入處方量的硬脂酸鎂，混合均勻后φ8mm淺凹沖壓片，調(diào)節(jié)片重約180mg。
制備例4 人參皂苷C-K 50mg膠囊的制備處方人參皂苷C-K 50.0g淀粉150.0g糊精35.0g3％PVPK30的水溶液 適量共制成 1000粒操作稱取人參皂苷C-K 50.0g與等量(50.0g)的淀粉，充分混合均勻，再加入100.0g淀粉混勻后加入處方量糊精充分混合均勻，將此混合粉末與剩余量的淀粉混合均勻后加入3％的PVPK30水溶液適量制軟材，28目篩制粒，60℃干燥約3小時(shí)，26目篩整粒，裝1號(hào)膠囊，調(diào)節(jié)裝量約230mg，即得。
試驗(yàn)例1人參皂苷C-K注射給藥對(duì)肝纖維化的影響材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組，雄性SD大鼠，山東綠葉制藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，體重170-230g，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、人參皂苷C-K不同劑量組，每組10只。
人參皂苷C-K凍干粉針按制備例方法制備，用前配成注射液。
實(shí)驗(yàn)方法大鼠肝纖維化模型復(fù)制及各組處置方法參考吳孟超等復(fù)制大鼠肝纖維化模型的方法吳孟超，楊廣順.大鼠肝硬變模型復(fù)制的研究.中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，1984，1(4)145-147，每4d每100g體重皮下注射60％四氯化碳油溶液0.3ml，以5％乙醇水溶液作為溶劑。正常對(duì)照組大鼠每4d皮下注射油溶液0.3ml/100g體重，1周后，隔日灌服自來(lái)水0.3ml/100g體重，每日腹腔注射滅菌水0.1ml/100g體重(每周6次)，以自來(lái)水作為飲料；肝纖維化組大鼠按上述方法造模1周后，隔日灌服自來(lái)水0.3ml/100g體重，每日腹腔注射滅菌水0.1ml/100g體重(每周6次)；人參皂苷C-K組大鼠按上述方法造模1周后，隔日灌服自來(lái)水0.3ml/100g體重，每日腹腔注射人參皂苷注射液(每周6次)。第4、8周末，各組隨機(jī)抽取6只動(dòng)物，用25％烏拉坦溶液按150mg/100g體重腹腔注射麻醉，解剖，門(mén)靜脈采血，留取肝組織，部分用10％中性福爾馬林溶液固定，24-48h內(nèi)制石蠟塊。
觀察指標(biāo)及測(cè)定方法肝組織病理學(xué)檢查采用HE染色，纖維增生程度分為0-4級(jí)栗坤，趙玉珍，朱秋霜等.川芎嗪對(duì)老齡小鼠心、肝超氧化物歧化酶活力的影響.黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，1998；214-5。用放射免疫方法測(cè)定血清透明質(zhì)酸含量，透明質(zhì)酸放射免疫分析測(cè)定盒購(gòu)自上海海研醫(yī)學(xué)生物技術(shù)中心，所用儀器為SN-695A型智能放免γ測(cè)量?jī)x。肝組織中羥脯氨酸測(cè)定采用氧化法，檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。
病理學(xué)檢查正常對(duì)照組大鼠肝臟結(jié)構(gòu)正常；模型組大鼠肝臟4周末及8周末均出現(xiàn)明顯的纖維化；C-K各劑量組中纖維化程度均較模型組輕。
大鼠血清中透明質(zhì)酸含量4周末與8周末，除大劑量組8周時(shí)間點(diǎn)外，C-K其他時(shí)間點(diǎn)大鼠血清透明質(zhì)酸含量均較模型組低，差異顯著(表1)。
表1 人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化大鼠血透明質(zhì)酸含量(μg/L)的影響

△，與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；▲，與模型組比較，P＜0.05；▲▲，與模型組比較，P＞0.05。
大鼠肝組織中膠原蛋白含量4周末，C-K各劑量組大鼠肝組織中膠原蛋白含量低于肝纖維化組，差異顯著；8周末時(shí)，較模型組亦低，但大劑量組差異不顯著(見(jiàn)表2)。
表2 人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化大鼠肝組織膠原蛋白含量(mg/g肝粉)的影響

△，與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；▲，與模型組比較，P＜0.05；▲▲，與模型組比較，P＞0.05。
試驗(yàn)例2 人參皂苷C-K口服給藥對(duì)肝纖維化的影響1、實(shí)驗(yàn)分組及處理50只雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型對(duì)照組，人參皂苷C-K組，每組10只大鼠。皮下注射40％四氯化碳(CCl4)造模，劑量為0.3ml/kg(首劑加倍)，每3天1次，共15次。正常對(duì)照組則以同樣方法注射等量的精制橄欖油。造模結(jié)束后第2天起，給予模型治療組不同劑量的人參皂苷C-K灌胃，每天1次，共42次。模型對(duì)照組則予以等量的0.5％羧甲基纖維素灌胃。治療結(jié)束后處死動(dòng)物，分別取血清和肝組織進(jìn)行各項(xiàng)測(cè)定。
2、檢測(cè)(1)肝組織HYP含量測(cè)定方法見(jiàn)文獻(xiàn)鄭少雄，等.血尿羥脯氨酸測(cè)定的方法改進(jìn).中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志，1983，6133-136；(2)血清HA、LN及PCIII含量測(cè)定采用放免法，按HA、LN及PcIII放免分析測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。(3)病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)采用HE常規(guī)染色、VG膠原染色，并進(jìn)行肝纖維化分級(jí)翟為溶，等.慢性肝炎的診斷、分級(jí)和分期.中華消化雜志，1996，16277-281；透射電鏡下觀察比較各組大鼠超微結(jié)構(gòu)變化。
3、結(jié)果3.1 人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化大鼠肝組織HYP含量及血清HA、LN及PCIII含量的影響與正常對(duì)照組相比，肝纖維化模型組肝組織HYP含量及血清HA、LN及PCIII含量均顯著升高(P＜0.01)；人參皂苷C-K各劑量組均能降低這四種指標(biāo)水平，大劑量組作用似不如中、小劑量明顯(表3)。表明大劑量長(zhǎng)時(shí)間用藥時(shí)，在對(duì)抗化學(xué)物質(zhì)引起的肝纖維化的同時(shí)，C-K本身也可能引起肝臟的損傷。提示其用藥劑量不可太大。
表3 人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化大鼠肝組織HYP含量及血清HA、LN及PCIII含量的影響

△，與正常對(duì)照組比較，P＜0.05；▲，與模型組比較，P＜0.05；▲▲，與模型組比較，P＞0.05。
3.2 人參皂苷C-K對(duì)肝纖維化大鼠病理形態(tài)學(xué)的影響3.2.1 光鏡觀察HE常規(guī)染色和VG膠原染色肝組織切片顯示，肝纖維化模型對(duì)照組大鼠肝組織中可見(jiàn)肝細(xì)胞脂肪變性，壞死，炎細(xì)胞浸潤(rùn)；匯管區(qū)內(nèi)膠原纖維沉積，Henny管增生；纖維結(jié)締組織增生明顯，纖維間隔增粗，并有典型假小葉形成。C-K治療組大鼠肝組織纖維結(jié)締組織增生程度減輕，纖維間隔變細(xì)，假小葉形成不明顯，尤以中劑量組明顯，與模型對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。
表4 人參皂苷C-K對(duì)大鼠肝纖維化病理形態(tài)的影響

C-K各治療組與模型組比較，P＜0.05。
3.2.2電鏡觀察正常對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞間緊密相連，細(xì)胞內(nèi)各種細(xì)胞器分布規(guī)整，結(jié)構(gòu)典型。血竇排列整齊，Disse腔內(nèi)可見(jiàn)肝貯脂細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有脂滴。模型對(duì)照組大鼠肝組織中則出現(xiàn)典型的肝細(xì)胞損傷結(jié)構(gòu)，相鄰肝細(xì)胞間隙增寬，肝細(xì)胞變性壞死，核固縮，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大小不等、分布不規(guī)則的脂滴。肝組織中存在輕重不等的纖維化病變。肝竇毛細(xì)血管化，Disse間隙內(nèi)可見(jiàn)較多成纖維細(xì)胞(活化的肝貯脂細(xì)胞)，且周?chē)写罅磕z原纖維沉積。匯管區(qū)內(nèi)可出現(xiàn)大量的膠原纖維。人參皂苷C-K治療組中，肝細(xì)胞損傷有不同程度的減輕，肝細(xì)胞間隙較緊密，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)脂肪小滴減少，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)趨向正常。肝纖維化病變不明顯，肝血竇和Disse間隙內(nèi)膠原纖維沉積及成纖維樣細(xì)胞數(shù)量減少。
權(quán)利要求
1.人參皂苷C-K在制備治療或預(yù)防肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，人參皂苷C-K在制備治療或預(yù)防因感染所致的肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，人參皂苷C-K在制備治療或預(yù)防因化學(xué)因素所致的肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，人參皂苷C-K可以和藥學(xué)上可接受的載體或輔料組成藥物組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，藥物組合物可以制成片劑、膠囊劑、滴丸劑、注射液、凍干粉針或注射用乳劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其可以通過(guò)口服或注射給藥。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，注射給藥可以靜脈注射或肌肉注射。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其口服給藥劑量為2-200mg/日，注射給藥劑量為1-75mg/日。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其口服給藥劑量?jī)?yōu)選為優(yōu)選6-54mg/日，注射給藥劑量?jī)?yōu)選為5-50mg/日。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其口服給藥劑量更優(yōu)選為6-18mg/日。
全文摘要
本發(fā)明提供了人參皂苷C－K在制備治療或預(yù)防肝纖維化的藥物中的應(yīng)用，具體地提供了人參皂苷C－K在制備預(yù)防或治療由感染和化學(xué)因素所致的肝纖維化的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K31/704GK1679600SQ20051005463
公開(kāi)日2005年10月12日 申請(qǐng)日期2005年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月9日
發(fā)明者傅風(fēng)華, 李桂生, 雷慶忠, 劉珂, 張雷鳴, 王天 申請(qǐng)人:山東綠葉天然藥物研究開(kāi)發(fā)有限公司