專利名稱：對病毒感染性疾病有治療作用的單鏈脫氧核苷酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一批對病毒感染性疾病包括但不限于對由乙型肝炎病毒感染引起的乙型肝炎有治療作用的單鏈脫氧核苷酸(oligonucleotide，以下簡稱oligo)這些單鏈脫氧核苷酸能刺激人的細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒的物質(zhì)，這些抗病毒物質(zhì)能夠抑制病毒包括但不限于乙型肝炎病毒的復(fù)制，因而對病毒感染性疾病包括但不限于由乙型肝炎病毒引起的乙型肝炎有治療作用。
背景技術(shù)：
病毒是一類體積微小，結(jié)構(gòu)相對簡單，只能在活細(xì)胞內(nèi)以復(fù)制方式增殖的非細(xì)胞型微生物。病毒的結(jié)構(gòu)包括核酸、殼粒和包膜。病毒的核酸，即病毒的基因組是病毒的核心，決定病毒遺傳、變異和復(fù)制。殼粒和胞膜起到保護(hù)病毒核心的作用，并具有抗原性。根據(jù)病毒核酸的類型，將病毒分為DNA病毒、RNA病毒。DNA病毒包括雙鏈DNA病毒和單鏈DNA病毒；RNA病毒包括單正鏈RNA病毒、單負(fù)鏈RNA病毒和雙鏈RNA病毒及逆轉(zhuǎn)錄病毒。DNA病毒包括但不限于乙型肝炎病毒、TTV病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、帶狀皰疹病毒、天花病毒和牛痘病毒等。RNA病毒包括但不限于流感病毒、豬瘟病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、腸道病毒和人免疫缺陷病毒等。
病毒性肝炎是由肝炎病毒(Hepatitis Virus)所引起的傳染性肝臟炎癥性疾病。引起病毒性肝炎的病毒有七種類型，即甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus，HAV)、乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)、丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)、丁型肝炎病毒(Hepatitis D virus，HDV)、戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus，HEV)、庚型肝炎病毒(Hepatitis G virus，HGV)以及TTV(即輸血傳播病毒性肝炎病毒)，它們能夠分別引起甲型、乙型、丙型、丁型、戊型、庚型和TTV肝炎。
甲型肝炎病毒(HAV)為球形、無包膜、單鏈RNA病毒。甲型病毒性肝炎簡稱甲型肝炎，是由HAV引起的一種腸道傳染病(Atmar，R.L.，et al.Detection of enteric viruses inoyster by using the polymerase chain reaction.Appl.Environ.Microbiol.1993，59631-635.)。急性甲型肝炎發(fā)病的癥狀有發(fā)燒、食欲下降、無力、肝腫大及肝功能異常等。只有少數(shù)急性甲型肝炎患者出現(xiàn)黃疸。甲型病毒性肝炎一般不轉(zhuǎn)為慢性和病原攜帶狀態(tài)。甲型肝炎病人自潛伏末期至發(fā)病后10天內(nèi)傳染性最大。甲型肝炎一般發(fā)生于兒童和青少年，在成人中較少見，一般潛伏期為2～6周。冬春兩季節(jié)是甲型肝炎發(fā)病的高峰期(JENNIFER A.CUTHBERT et al.Hepatitis AOld and New.CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS，Jan.2001，p.38-58)。
丙型肝炎病毒(HCV)是直徑約50～60nm，有脂類包膜的黃病毒屬，單股正鏈RNA病毒。丙型肝炎主要通過血液和血液制品傳播。有資料表明，90％因輸血而感染的肝炎都屬丙型肝炎(JANICE M.MATTHEWS-GREER，et al.Comparison of Hepatitis C Viral Loads in Patientswith or without Human Immunodeficiency Virus.CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORYIMMUNOLOGY，July 2001，p.690-694；駱抗先等，丙型肝炎病毒的亞型及其可能的含義。臨床肝膽病雜志，1994，10(2)61-62。)丙型肝炎與肝硬化和肝細(xì)胞癌的發(fā)生密切相關(guān)(NIZARN.ZEIN.Clinical Significance of Hepatitis C Virus Genotypes.CLINICAL MICROBIOLOGYREVIEWS，2000，p.223-235；楊永平等，從中國病人克隆丙型肝炎病毒基因組C區(qū)基因及其在大腸桿菌中的表達(dá)。病毒學(xué)報(bào)，1994，10(2)109-117)。
丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷病毒，其核酸為單負(fù)鏈環(huán)狀RNA(Theo Heller and Jay H.Hoofnagle.Denying the wolf access to sheep’s clothing.J.Clin.Invest.2003.112319-321)。HDV作為一種缺陷病毒需要嗜肝DNA病毒(如HBV)的幫助才能完成其生活周期。丁型肝炎病毒的傳播方式與乙型肝炎病毒相似，以垂直傳播、性接觸和體液傳播等為主要的傳播方式(Rizzetto，M.，et al.1980.Transmission of the hepatitis B virus-associated deltaantigen to chimpanzees.J.Infect.Dis.141590-602)。感染HDV能夠加重HBV感染者的臨床癥狀(Hadler，S.C.et al．Delta virus infection and severe hepatitis.An epidemicin the Yucpa Indians of Venezuela.Ann.Intern.Med.1984.100339-344.)。
戊型肝炎病毒(HEV)是球形無包膜病毒，直徑為32-34nm，其核酸為單正鏈RNA，含有3個(gè)閱讀框架(Reyes，G.R.，et al.Isolation of a cDNA from the virus responsible forenterically transmitted non-A，non-B hepatitis.Science.1990，2471335-1339；Reyes，G.R.，et al.Hepatitis E virus(HEV)the novel agent responsible for entericallytransmitted non-A，non-B hepatitis.Gastroenterol.Jpn.1991，26(Suppl.3)142-147.)。戊型肝炎與甲型肝炎一樣，都是通過糞口途徑傳播，因?yàn)樗幢晃廴径鸫笮捅l(fā)及流行。戊型肝炎產(chǎn)生的病理損害比甲型肝炎明顯，恢復(fù)緩慢。
庚型肝炎病毒(HGV/GBV-C)是黃病毒科有包膜的、單股正鏈RNA病毒，主要在肝內(nèi)復(fù)制，主要通過血液制品、靜脈注射毒品、性接觸及母嬰垂直傳播，庚型肝炎病毒能夠引起急慢性肝炎，甚至與肝癌和肝硬化的發(fā)生密切相關(guān)(Schmidt，B.，K.Korn，and B.Fleckenstein.Molecular evidence for transmission of hepatitis G virus by blood transfusion.Lancet.1996，347909；Iban~ez，A.，M.Gime′nez-Barcons，et al.Prevalence and genotypes ofGB virus C/hepatitis G virus(GBV-C/HGV)and hepatitis C virus(HCV)among humanimmunodeficiency virus(HIV)infected patientsevidence of GBV-C/HGV sexualtransmission.J.Med.Virol.1998，55293-299；王詠梅，庚型肝炎的研究現(xiàn)狀。預(yù)防醫(yī)學(xué)情報(bào)雜志，2001，17(4)257-258；孫柯兒等，庚型病毒肝炎研究近況。國外醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分冊，1997，4(2)33-36.)。
病毒性肝炎輸血傳播病毒(transfusion transmitted virus，TTV)是無包膜的、單鏈的DNA病毒(C.-L.lin，et al.Fecal Excretion of a Novel Human Circovirus，TT Virus，inHealthy Children.Clinical and diagnostic laboratory immunology，2000，p.960-963)。TTV病毒的基因組為環(huán)狀的DNA(Isa k.Mushahwar，et al.Molecular and biophysicalcharacterization of TT virusEvidence for a new virus family infecting humans.Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.96，pp.3177-3182，March 1999.Microbiology)。TTV病毒可以通過性接觸、垂直傳播等方式進(jìn)行傳播，TTV感染者的臨床癥狀較輕(Claudia Fornai，et al.High Prevalence of TT Virus(TTV)and TTV-Like Minivirus in Cervical Swabs.JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY，2001，p.2022-2024)。
乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)屬嗜肝DNA病毒科的一種DNA病毒。完整的HBV由包膜與核心兩部分組成。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是包膜的主要成分。HBsAg在肝細(xì)胞內(nèi)合成，大量釋放入血液循環(huán)中，本身并無傳染性。核心部分含有不完全環(huán)狀雙股的DNA、DNA聚合酶、核心抗原(HBcAg)和e抗原(HBeAg)，具有傳染性。乙型病毒肝炎是由乙型肝炎病毒引起的嚴(yán)重威脅人類健康的、肝臟炎性損害疾病。截止到2004年，全球范圍內(nèi)已經(jīng)有4億人感染了乙型肝炎病毒(Lin KW，Kirchner JT.Hepatitis B.Am FamPhysician，2004 Jan 1，69(1)75-82.)，其中，亞洲人占多數(shù)。
為了在細(xì)胞水平研制對乙型肝炎病毒感染有治療作用的藥物，Mary ann sells等人構(gòu)建了HepG2.2.15細(xì)胞。HepG2.2.15細(xì)胞是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了HBV基因組的肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)，能夠穩(wěn)定分泌HBsAg、HBeAg及Dane顆粒。HepG2細(xì)胞在長期的傳代培養(yǎng)過程中，仍能較好地保持了正常肝細(xì)胞的許多功能，如能夠保證HBV在其中的正常復(fù)制，表達(dá)干擾素、Toll樣受體等多種受體(Volker Mersch-Sundermann.Use of a human-derived liver cell line for thedetection of cytoprotective，antigenotoxic and cogenotoxic agents.Toxicology，2004，198329-340；Mary ann sells，Mei-long chen，and George_acs.Production of hepatitisB virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1987，841005-1009)。研究表明，抗病毒物質(zhì)包括但不限于干擾素能夠與HepG2.2.15細(xì)胞的相應(yīng)受體結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒的作用。干擾素在作用于HepG2.2.15細(xì)胞表面的相應(yīng)受體后可通過復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生干擾素調(diào)節(jié)因子1(IFNregulatory factor 1，IFN-1)、RNA酶L(RNase L)和雙鏈RNA激活的蛋白激酶(double-strandedRNA activated protein kinase，PKR)等的表達(dá)來發(fā)揮抗病毒包括但不限于HBV的活性(Bachmaier，K.et al.IiNOS expression and nitrotyrosine formation in the myocardiumin response to inflammation is controlled by the interferon regulatory transcriptionfactor 1.Circula tion，1997，96585-591；Pitha，P.M.，et al.Role of the interferonregulatory factors in virus-mediated signaling and regulation of cell growth.Biochimie，1998，80651-658；Zhou，A.et al.Expression cloning of2-5A-dependentRNAaseuniquely regulated mediator of interferon action.Cell，1993，72753-765)。采用HepG2.2.15細(xì)胞做體外實(shí)驗(yàn)，抗病毒物質(zhì)的活性可表現(xiàn)為細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg、HBeAg及HBV核酸的含量下降。因此，HepG2.2.15細(xì)胞是一種研究抗HBV藥物、制劑的較好的細(xì)胞模型。在本發(fā)明中，我們采用單鏈脫氧核苷酸誘導(dǎo)的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)培養(yǎng)上清和HepG2.2.15細(xì)胞作用，根據(jù)在上清中檢測到的HBsAg、HbeAg和HBV核酸的含量來判定單鏈脫氧核苷酸的抗肝炎病毒的的生物學(xué)作用。
本發(fā)明中所述的單鏈脫氧核苷酸可經(jīng)多種化學(xué)修飾。這些化學(xué)修飾包括但不限于磷酸骨架修飾、糖環(huán)修飾和堿基修飾。磷酸骨架的修飾可以是硫代修飾。硫代修飾是指核苷酸片段中磷酸二酯鍵中的非橋氧原子被硫原子取代(Ekambar R.Kandimalla et al.Mixed backboneantisense oligonucleotidesdesign，biochemical and biological properties ofoligonucleotides containing 2-5-ribo-and3-5-deoxyribonucleotide segments.Nucleic Acids Research，1997，25(2)370-378)，這種取代可發(fā)生脫氧核苷酸部分或全部的磷酸二酯鍵。磷酸骨架的修飾可以是通過形成其它類型的磷酸脂鍵實(shí)現(xiàn)，這些磷酸脂包括但不限于甲基磷酸酯、硒代磷酸酯、甲硼基磷酸酯和雙硫代磷酸酯。糖環(huán)修飾可以是對戊糖的2′位進(jìn)行修飾。戊糖的2′位修飾包括但不限于甲氧基、甲氧乙氧基、丙烯氧基和氟代修飾(Ernst Urban，Christian R.Noe.Structural modifications of antisenseoligonucleotides.Il Farmaco.2003，58243_258)。堿基修飾主要指單鏈脫氧核苷酸中包含稀有堿基(Xiaolan Chen，Nancy Dudgeon，Long Shen and Jui H.Wang.Drug DiscoveryTarget，2005，10(8)587-593)，稀有堿基是指除A、G、C、U外的一些堿基，包括雙氫尿嘧啶(DHU)、假尿嘧啶(Ψ，pseudouridine)和甲基化的嘌呤(mG，mA)等。一般的嘧啶核苷以雜環(huán)上N-1與糖環(huán)的C-1’連成糖苷鍵，假尿嘧啶核苷則用雜環(huán)上的C-5與糖環(huán)的C-1’相連。
單鏈脫氧核苷酸堿基的添加是指在本發(fā)明所提供的單鏈脫氧核苷酸的一端或兩端添加了1到10個(gè)堿基所形成的單鏈脫氧核苷酸。兩端的刪切是指在本發(fā)明所提供的單鏈脫氧核苷酸的一端或兩端刪切一個(gè)或數(shù)個(gè)堿基所形成的單鏈脫氧核苷酸。
單鏈脫氧核苷酸堿基的改變是指將本發(fā)明所提供的單鏈脫氧核苷酸的堿基改變形成的單鏈脫氧核苷酸。
單鏈脫氧核苷酸包括但不限于附序列表所示的序列和實(shí)施例2所出示的序列及其根據(jù)實(shí)施例2所示公式所能推出的序列。
本研究證明單鏈核苷酸刺激人PBMC的培養(yǎng)上清能夠抑制HepG2.2.15細(xì)胞產(chǎn)生HBsAg，HBeAg和HBV的核酸。因而本發(fā)明提供的結(jié)果表明，單鏈核苷酸可抑制病毒的復(fù)制，對病毒感染有治療作用，這些病毒包括但不限于HBV。
本發(fā)明的單鏈脫氧核苷酸可用于病毒感染性疾病的治療，引起這些病毒感染性疾病的病毒包括但不限于乙型肝炎病毒、TTV病毒、腺病毒、乳頭瘤病毒、帶狀皰疹病毒、天花病毒和牛痘病毒、流感病毒、豬瘟病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、狂犬病毒、埃博拉病毒、腸道病毒和人免疫缺陷病毒。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供人工合成的單鏈脫氧核苷酸，這些單鏈脫氧核苷酸可用于治療病毒感染性疾病，引起這類病毒感染的病毒包括但不限于乙型肝炎病毒。
本發(fā)明的目的之二是提供用任何單鏈脫氧核苷酸治療治療病毒感染性疾病的技術(shù)方法和技術(shù)設(shè)想，引起這類病毒感染的病毒包括但不限于乙型肝炎病毒。
本發(fā)明的目的之三是提供用對病毒感染性疾病有治療作用的單鏈脫氧核苷酸序列，病毒感染性疾病包括但不限于乙型肝炎病毒引起的病毒感染性疾病，這些序列是可經(jīng)化學(xué)修飾的核心序列，這些化學(xué)修飾包括但不限于磷酸骨架修飾、糖環(huán)修飾和堿基修飾。這些單鏈脫氧核苷酸是兩端和中間可加上/入或改動(dòng)堿基所產(chǎn)生的單鏈脫氧核苷酸的核心結(jié)構(gòu)。
下面結(jié)合具體的制備實(shí)施例和生物學(xué)效果實(shí)施例，并參照附圖
進(jìn)一步詳細(xì)地描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例只是為了舉例說明本發(fā)明，而非以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例在如下實(shí)施例中，未詳細(xì)描述的各種過程和方法是本領(lǐng)域中公知的常規(guī)方法，例如合成采用固相亞磷酰胺三酯法。
在如下實(shí)施例中，所用試劑的來源、商品名和/或有必要列出其組成成分者，均只標(biāo)明一次。在其后所用相同試劑如無特殊說明，不在贅述上述內(nèi)容。
實(shí)施例1、單鏈脫氧核苷酸的合成采用固相亞磷酰胺三酯法合成DNA片段，此方法具有高效、快速等優(yōu)點(diǎn)，已在DNA化學(xué)合成中廣泛使用。
DNA化學(xué)合成不同于酶促的DNA合成，酶促的DNA合成過程是從5’→3’方向延伸，而DNA化學(xué)合成是由3’端開始。具體的反應(yīng)步驟如下一、脫保護(hù)基用三氯乙酸脫去連結(jié)在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保護(hù)基團(tuán)DMT(二甲氧基三苯甲基)，獲得游離的5’-羥基端，以供下一步縮合反應(yīng)使用。
二、活化將亞磷酰胺保護(hù)的核苷酸單體與四氮唑活化劑混合并進(jìn)入合成柱，形成亞磷酰胺四唑活性中間體(其3’-端已被活化，但5’-端仍受DMT保護(hù))，此中間體將與GPG上的已脫保護(hù)基的核苷酸發(fā)生縮合反應(yīng)。
三、連接亞磷酰胺四唑活性中間體遇到CPG上已脫保護(hù)基的核苷酸時(shí)，將與其5’-羥基發(fā)生親合反應(yīng)，縮合并脫去四唑，此時(shí)合成的寡核苷酸鏈向前延長一個(gè)堿基。
四、封閉縮合反應(yīng)后為了防止連在CPG上的未參與反應(yīng)的5’-羥基在隨后的循環(huán)反應(yīng)中被延伸，常通過乙?；瘉矸忾]此端羥基，一般乙?；噭┦怯靡宜狒蚇-甲基咪唑等混合形成的。
五、氧化縮合反應(yīng)時(shí)核苷酸單體是通過亞磷酯鍵與連在CPG上的寡核苷酸連接，而亞磷酯鍵不穩(wěn)定，易被酸、堿水解，此時(shí)常用碘的四氫呋喃溶液將亞磷酰轉(zhuǎn)化為磷酸三酯，從而得到穩(wěn)定的寡核苷酸。
經(jīng)過以上五個(gè)步驟后，一個(gè)脫氧核苷酸就被連到CPG的核苷酸上，同樣再用三氯乙酸脫去新連上的脫氧核苷酸5’-羥基上的保護(hù)基團(tuán)DMT后，重復(fù)以上的活化、連接、封閉、氧化過程即可得到一個(gè)DNA片段粗品。最后對其進(jìn)行切割、脫保護(hù)基(一般對A、C堿基采用苯甲?；Ｗo(hù)；G堿基用異丁?；Ｗo(hù)；T堿基不必保護(hù)；亞磷酸用腈乙基保護(hù))、純化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后處理即可得到符合實(shí)驗(yàn)要求的寡核苷酸片段。
實(shí)施例2、程序設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)序列如下1、符合(G)n(L)n X1X2CGY1Y2(M)n(G)N公式的人工合成的單鏈脫氧核苷酸(X1＝A，T，G；X2＝A，T；Y1＝A，T；Y2＝A，T，C；L，M＝A，T，C，G；n為0-6)1. 5’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’2. 5’-ggggATAACgTTgCgggggg-3’3. 5’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’4. 5’-ggggTCCTACgTAggAgggggg-3’5. 5’-ggggTCCATgACgTTCCTgAAgggggg-3’6. 5’-gggggACgTCgCCggggggg-3’7. 5’-ggATCCgTACgCATgggggg-3’8. 5′-gggggAATCgATTCgggggg-3′9. 5′-gggATgCATCgATgCATCgggggg-3′10. 5′-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3′11. 5′-gggACgTACgTCgggggg-3′12. 5′-gggggATCgACgTCgATCgggggg-3’13. 5′-ggCgATCgATCgATCggggggg-3′14. 5’-ggggTCgATCgATCgAgggggg-3′15. 5’-ggTCgCgATCgCgAgggggg-3’16. 5’-ggGGTCAACGTTGAgggggG-3’17. 5’-gTCgTTTTCgTCgACgAATTgggggggg-3’18. 5’-gTCgTTATCgTTTTTTCgTAgggggg-3’19. 5’-ggCgTTAACgACgggggg-3’20. 5’-gTCggCACgCgACgggggg-3’21. 5’-ggTgCgACgTCgCAgggggg-3’22. 5’-gTCTATTTTgTACgTACgTgggg-3’23. 5’-gACgTCgACgTCgACgTCAggggg-3’24. 5’-ggggTCgATCgTTgCTAgCgggggg-3’25. 5’-gggggACgTTATCgTATTggggggg-3’26. 5’-ggggTCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTTgggggg-3’27. 5’-ACgATCgATCgATCgggggg-3’28. 5’-AgACgTCTAACgTCggggg-3’29. 5’-ggggTgCTggCCgTCgTTgggggg-3’30. 5’-ggggTCgTTgCCgTCgggggg-3’31. 5’-ACCggTATCgATgCCggTgggggg-3’32. 5’-TTCgTTgCATCgATgCATCgTTgggggg-3’
2、符合(G)n(L)nCG(XY)nCG(M)n(G)n公式的人工合成的單鏈脫氧核苷酸(X＝A，T；Y＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n為0-6)33. 5’-ggggACgATACgTCggggggg-3’34. 5’-ggggACgATATCgATgggggg-3’35. 5′-ggACgATCgATCgTgggggg-3′36. 5′-TCggggACgATCgTCgggggg-3′37. 5′-gggggATCgATATCgATCgggggg-3′38. 5′-ggATCgATCgATCgATgggggg-3′39. 5′-ggTgCATCgATCgATgCAgggggg-3′40. 5′-ggTgCATCgTACgATgCAgggggg-3′41. 5’-ggTgCgATCgATCgCAgggggg-3′42. 5’-gggggggTCgATCgATgggggg-3’43. 5’-ggggTCgTCgAACgTTgggggg-3’44. 5’-TgTCgTTCCTTgTCgTT-3’45. 5’-TTCgCTTCgCTTTTCgCTTCgCTT-3’-3’46. 5’-ACCgCCAAggAgAAgCCgCAggAggg-3’47. 5’-TACAACggCgAggAATACC-3’48. 5’-gTACAACggCgAggAATACCT-3’49. 5’-ACCgTCgTTgCCgTCggCCC-3’50. 5’-TgCTggCCgTCgTT-3’51. 5’-gTCggCACgCgACg-3’52. 5’-gTCggCACgCgACgCCCCCC-3’53. 5’-TCCCgCTggACgTT-3’54. 5’-TTACCggTTAACgTTggCCggCC-3’55. 5’-ACCggTTAACgTTgTCCCCgggg-3’56. 5’-CgTTgACgATCgTCCCATggCggg-3’57. 5’-TCTgCggCCTTCgTCg-3’58. 5’-TAgTAACCggTCCggCgCCCCC-3’59. 5’-TTgCAgCgCTgCCggTggg-3’60. 5’-CggCCCATCgAgggCgACggC-3’61. 5’-TCATCgACTCTCgAgCgTTC-3’62. 5’-ATCgTCgACTCTCgTgTTCTC-3’63. 5’-TgCAgCTTgCTgCTTgCTgCTTC-3’64. 5’-ggTgCgACgTCgCAgATgAT-3’65. 5’-ggTCgAACgTTCgAgATgAT-3’66. 5’-gggggCgTCgTTTTCgTCgACgAATT-3’67. 5’-actcgagacgcccgttgatagctt-3’68. 5’-AACgTTggCgTCgACgTCAgCgCC-3’69. 5’-gACgTCgACgTTgACgCT-3’70. 5’-ggCgTTAACgTTAgCgCT-3’71. 5’-AgCgCTAgCgCTgACgTT-3’72. 5’-CTAgACgTTCAAgCgTT-3’73. 5’-gACgATCgTCgACgATCgTC-3’74. 5’-gTCgTTCgTAgTCgACTACgAgTT-3’75. 5’-AAAAgACgTCgACgTCgACgTCTTTT-3’76. 5’-TgCgACgATCgTCgCACgATCggAT-3’
77. 5’-TgCgACgTCgCACAgCgT-3’3、符合(TCG)n(L)nCG(M)n(G)n公式的人工合成的單鏈脫氧核苷酸(L，M＝A，T，C，G；n為0-6)78. 5’-TCgTTgCCgTCgg-3’79. 5’-TCgTTgCCgTCggg-3’80. 5’-TCgTTgCCgTCgggg-3’81. 5’-TCgTTgCCgTCggggg-3’82. 5’-TCgTTgCCgTCgggggg-3’83. 5’-TCgTTgCCgTCggggggg-3’84. 5’-TCgTTgCCgTCgggggggg-3’85. 5’-TCgTTgCCgTCggggggggg-3’86. 5′-TCgTCgggTgCATCgATgCAgggggg-3′87. 5’-TCgTCgggTgCAACgTTgCAgggggg-3’88. 5’-TCgTCgggTgCgTCgACgCAgggggg-3’89. 5’-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3’90. 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’91. 5’-TCgTCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’92. 5’-TCgTCgCAgAACgTTCTgggggg-3’93. 5’-TCgTgCgACgTCgCAgggggg-3’94. 5’-TCgTgCgACgATCgTCgCAgggggg-3’95. 5’-TCgTATgCATCgATgCATAgggAgg-3’96. 5’-TCgTgCATCgATgCAgggggg-3’97. 5’-TCgAAACgTTTCgggggg-3’98. 5’-TCggACgATCgTCgggggg-3’99. 5’-TCgAgCgATCgCTCgAgggggg-3’100. 5’-TCgTCgCTTTgTCgTTgggg-3’101. 5’-TCgTCgTTTTgTCgTTgggg-3’102. 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAg-3’103. 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgg-3’104. 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAggg-3’105. 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggg-3’106. 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAggggg-3’107. 5’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’108. 5’-TCgTCgggTgCgACgATCgTCgggggg-3’109. 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAggggggg-3’110. 5’-TCgTCgTTTTgACgATCgTCgggggg-3’111. 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’112. 5’-TCgTTCggggTACCgATgggg-3’113. 5’-TCgTTgCgCTCCCATgCCgggggg-3’114. 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTgggg-3’115. 5’-TCgTTgTCgTTTCgCTgCCggCggggg-3’116. 5’-TgCTTgggTggCAgCTgCCAgggggg-3’117. 5’-TgCTgCTTTgCTgCTTgggg-3’118. 5’-AACgTTCgACgTCgAACggggggg-3’119. 5’-AACgACgACgTTggggg-3’
4、符合(TCG)n(L)nX1X2CG(M)n公式的人工合成的單鏈脫氧核苷酸(X1＝A，T，G；X2＝A，T；L，M＝A，T，C，G；n為0-6)120. 5’-TCgTAACgTTgTTTTTAACgTT-3’121. 5’-TCgTCgTATACgACgATCgTT-3’122. 5’-TCgTCgTTTgCgTTgTCgTT-3’123. 5’-TCCTgTCgTTTTgTCgTT-3’124. 5’-TCgTCgTTgTCgTTCgCT-3’125. 5’-TCgTCgTTACCgATgACgTCgCCgT-3’126. 5’-TCgTCgTTTgCATCgATgCAgTCgTCgTT-3’127. 5’-TCgCCTCgTCgCCTTCgAgC-3’g-3’128. 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’T-3’129. 5’-TCgTCgAgggCgCCggTgAC-3’130. 5’-TCgTCgCCggTgggggTgTg-3’131. 5’-TCgTCgTACgCAATTgTCTT-3’132. 5’-TCgCCCACCggTgggggggg-3’133. 5’-TCgTCgCAgACCggTCTgggg-3’134. 5’-TCgTCgCggCCggCgCCCCC-3’135. 5’-TCgTCgCggCCgCgAggggg-3’136. 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgC-3’137. 5’-TCgAggACAAgATTCTCgTgCAggCC-3’138. 5’-TCgTgCAggCCAACgAggCCg-3’139. 5’-TCgTTgCCgTCggCCC-3’140. 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTTTCC-3’141. 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCCCC-3’142. 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCC-3’143. 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCC-3’144. 5’-TCgTTgCCgTCggCCCC-3’145. 5’-TCgTTgCCgTCggCCCCCCC-3’146. 5’-TCgAggACAAgATTCTCgT-3’147. 5’-TCggCACgCgACgTgCTggCCgTCgTT-3’148. 5’-TCgTCgCgCCgTCACgggggg-3’149. 5’-TCgTgTgCgTgCCgTTggg-3’150. 5’-TCgTCgCCgTTgggCggg-3’151. 5’-TCgTCgACgTCgTTgggCggg-3’152. 5’-TCgCAgTTgTCgTAACgTTgggCggg-3’153. 5’-TCgTCgTTggTATgTT-3’154. 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTT-3’155. 5’-TCgTCgTCgTCgTTgTCgTTgggg-3’156. 5’-TCgTTCggggTgCCg-3’157. 5’-TCgTTCggggTAACgATT-3’158. 5’-TCgTTCggggTAACgTT-3’159. 5’-TCgTTCggggTACCgAT-3’160. 5’-TCgTACggCCgCCgTACggCggg-3’161. 5’-TCgCgTCgACTCCCCTCgAgggg-3’
162. 5’-TCgTCgTCgACTCgTggTCggggg-3’163. 5’-TCgggCgCCCgATCgggggg-3’164. 5’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’165. 5’-TCgTgACgTCCTCgAgTT-3’166. 5’-TCgTCTTTCgACTCgTTCTC-3’167. 5’-TCgTCgTTTTgCgTTCTC-3’168. 5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’169. 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’170. 5’-tcgtcgggtgcgacgtcgca-3’171. 5’-TCgTTCTCgACTCgTTCTC-3’172. 5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’173. 5’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’174. 5’-TCgTgCgACgTCgCAgATgAT-3’175. 5’-TCgTCgAgCgCTCgATCggAT-3’176. 5’-TCgTCgTTTCgTAgTCgTTgACgTCggg-3’177. 5’-TCgTCggACgTTTTCCgACgTTCT-3’178. 5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’179. 5’-TCgTCgTTTgTCgTgTgTCgTT-3；180. 5’-TCgTCgTTggTCggggTCgTTggggTCgTT-3’181. 5’-TCgTCgTTTCgTCTCTCgTT-3’182. 5’-TCgTCgTTTTgCTgCgTCgTT-3’183. 5’-TCgAgCgTTTTCgCTCgAATT-3’4、包含TTCGTCG的序列公式的人工合成的單鏈脫氧核苷酸184. 5’-TTCgTCgTTTgATCgATgTTCgTTgggggg-3’185. 5’-TTCgTCgTTgTgATCgATgggggg-3’-3’186. 5’-TATCgATgTTTTCgTCgTCgTTgggggg-3’187. 5’-TCgACTTTCgTCgTTCTgTT-3’188. 5’-TCgTCgTTTCgTCgTTCTC-3’189. 5’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’190. 5’-TCgTCgTTTTCgTCgTTTTCgTCgTT-3’在實(shí)施例3，4，5中應(yīng)用的單鏈脫氧核苷酸(Oligo)的序列如下所示Oligo1 Seq No 895’-TCgTCgggTgCgATCgCAgggggg-3’Oligo2 seq No 925’-TCgTCgCAgAACgTTCTgggggg-3’Oligo4 seq No 955’-TCgTATgCATCgATgCATAgggAgg-3’Oligo3 seq No 1745’-TCgTgCgACgTCgCAgATgAT-3’Oligo5 seq No 1645’-TCgTCggTCTTTCgAAATT-3’Oligo6 seq No 365′-TCggggACgATCgTCgggggg-3′Oligo7 seq No 1725’-TCgACgTTCgTCgTTCgTCgTTC-3’Oligo8 seq No 1735’-TCgTCgACgTCgTTCgTTCTC-3’Oligo9 seq No 985’-TCggACgATCgTCgggggg-3’Oligo10 seq No 995’-TCgAgCgATCgCTCgAgggggg-3’Oligo11 seq No 1075’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggggg-3’Oligo12 seq No 1705’-TCgTCgggTgCgACgTCgCA-3’Oligo13 seq No 1025’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAg-3’
Oligo14 seq No 1035’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgg-3’Oligo15 seq No 1045’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAggg-3’Oligo16 seq No 1055’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAgggg-3’Oligo17 seq No 1065’-TCgTCgggTgCgACgTCgCAggggg-3’Oligo18 seq No 35’-ggggTgCAACgTTCAgggggg-3’Oligo19 seq No 15’-ggggTCgTTCgTCgTTgggggg-3’Oligo20 seq No 665’-gggggCgTCgTTTTCgTCgACgAATT-3’實(shí)施例3、單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用1.人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離1)儀器設(shè)備和器材低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規(guī)格的吸管、加樣器、滴管、血球計(jì)數(shù)板、水平式離心機(jī)等。
2)試劑和材料肝素抗凝的人全血購自長春市中心血站。聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，碳酸氫鈉2.0克，慶大霉素10萬單位，加三蒸水至1000毫升，0.22微米的濾膜抽濾除菌、分裝。
3)方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分層液分離人外周血的單個(gè)核細(xì)胞。分層液與肝素抗凝外周血的體積比約為1∶2。水平離心(1,000×g，20min)。用吸管吸取含單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞層，置入另離心管中。加入等體積的無血清培養(yǎng)液。1,000×g離心15min，棄上清。重復(fù)洗滌兩次。棄上清，用2ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2.單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清的收集用10％FBS IMDM稀釋分離的PBMC(淋巴細(xì)胞)至終濃度3×106個(gè)/ml，往12孔板中每孔加入2ml，即6×106個(gè)/2ml/孔；加入各單鏈脫氧核苷酸至終濃度6μg/ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將12孔板置于37℃5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)上清，3個(gè)復(fù)孔收集的培養(yǎng)上清混合到一起，分裝，-20℃貯存。
3.單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC培養(yǎng)上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用1)將1×105個(gè)/ml HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃5％CO2培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的第24h，加入單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC培養(yǎng)上清使其稀釋倍數(shù)為1∶64。
2)在培養(yǎng)后的48h、72h、96h，分別收集培養(yǎng)上清，用試劑盒(蘇州新波生物技術(shù)有限公司)檢測HBsAg的含量，HBsAg含量的測定按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。
3)計(jì)算HBsAg分泌抑制率抑制率＝(對照孔濃度-實(shí)驗(yàn)孔濃度)/對照孔濃度×100％
4.結(jié)果單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC培養(yǎng)上清能夠有效地抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg(表1)。
5.結(jié)論單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC培養(yǎng)上清能夠抑制HBV的復(fù)制，因而本發(fā)明提供的單鏈脫氧核苷酸具有抗病毒的生物學(xué)活性。
實(shí)施例4、單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用1.人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離1)儀器設(shè)備和器材低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規(guī)格的吸管、加樣器、滴管、血球計(jì)數(shù)板、水平式離心機(jī)等。
2)試劑和材料肝素抗凝的人全血購自長春市中心血站。聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，碳酸氫鈉2.0克，慶大霉素10萬單位，加三蒸水至1000毫升，0.22微米的濾膜抽濾除菌、分裝。
3)方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分層液分離人外周血的單個(gè)核細(xì)胞。分層液與肝素抗凝外周血的體積比約為1∶2。水平離心(1,000×g，20min)。用吸管吸取含單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞層，置入另離心管中。加入等體積的無血清培養(yǎng)液。1,000×g離心15min，棄上清。重復(fù)洗滌兩次。棄上清，用2ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2.單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清的收集用10％FBS IMDM稀釋分離的PBMC(淋巴細(xì)胞)至終濃度3×106個(gè)/ml，往12孔板中每孔加入2ml，即6×106個(gè)/2ml/孔；加入各單鏈脫氧核苷酸至終濃度6μg/ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將12孔板置于37℃5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)上清，3個(gè)復(fù)孔收集的培養(yǎng)上清混合到一起，分裝，-20℃貯存。
3.單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC培養(yǎng)上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用1)將1×105個(gè)/ml HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃5％CO2培養(yǎng)，在培養(yǎng)后的第24h，加入單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清使其稀釋倍數(shù)為1∶64。
2)在培養(yǎng)后的48h、72h、96h，分別收集不同時(shí)間段的各組的培養(yǎng)上清，用試劑盒(蘇州新波生物技術(shù)有限公司)檢測HBeAg的含量，HbeAg含量的測定按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。
3)計(jì)算HBeAg分泌抑制率抑制率＝(對照孔濃度-實(shí)驗(yàn)孔濃度)/對照孔濃度×100％4.結(jié)果各種單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清在1∶64稀釋度下，能夠有效地抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg(表2)。
5.結(jié)論單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清能夠抑制HBV的復(fù)制，因而本發(fā)明提供的單鏈脫氧核苷酸具有抗病毒的生物學(xué)活性。
實(shí)施例5、單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用1.人外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離1)儀器設(shè)備和器材低溫冰箱、二氧化碳孵箱、超凈工作臺、倒置顯微鏡、液氮罐、蒸餾水器、真空泵、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、濾菌器、濾過瓶、各種規(guī)格的吸管、加樣器、滴管、血球計(jì)數(shù)板、水平式離心機(jī)等。
2)試劑和材料肝素抗凝的人全血購自長春市中心血站。聚蔗糖-泛影葡胺比重1.077±0.001，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司。RPMI1640培養(yǎng)液L-谷氨酰胺的RPMI1640(GIBCOBRL)10.4克，碳酸氫鈉2.0克，慶大霉素10萬單位，加三蒸水至1000毫升，0.22微米的濾膜抽濾除菌、分裝。
3)方法用聚蔗糖-泛影葡胺淋巴細(xì)胞分層液分離人外周血的單個(gè)核細(xì)胞。分層液與肝素抗凝外周血的體積比約為1∶2。水平離心(1,000×g，20min)。用吸管吸取含單個(gè)核細(xì)胞的細(xì)胞層，置入另離心管中。加入等體積的無血清培養(yǎng)液。1,000×g離心15min，棄上清。重復(fù)洗滌兩次。棄上清，用2ml培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
2.單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清的收集用10％FBS IMDM稀釋分離的PBMC(淋巴細(xì)胞)至終濃度3×106個(gè)/ml，往12孔板中每孔加入2ml，即6×106個(gè)/2ml/孔；加入各單鏈脫氧核苷酸至終濃度6μg/ml，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將12孔板置于37℃5％CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)48h，收集培養(yǎng)上清，3個(gè)復(fù)孔收集的培養(yǎng)上清混合到一起，分裝，-20℃貯存。
3.單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC培養(yǎng)上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用1)將1×105個(gè)/ml HepG2.2.15細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔1ml，在培養(yǎng)后的第24h，加入單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清使其稀釋倍數(shù)為1∶64。
2)在培養(yǎng)后的48h、72h、96h，分別收集不同時(shí)間段的各組的培養(yǎng)上清，用HBV DNA熒光定量PCR試劑盒(上海申友生物技術(shù)有限公司)檢測HBV DNA的含量，HBV DNA含量的測定按照試劑盒提供的說明書進(jìn)行操作。
3)計(jì)算HBV DNA分泌抑制率抑制率＝(對照孔log(拷貝數(shù))-實(shí)驗(yàn)孔log(拷貝數(shù)))/對照孔log(拷貝數(shù))×100％4.結(jié)果各單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清在1∶64稀釋度能夠有效地抑制HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA(表3)。
5.結(jié)論單鏈脫氧核苷酸刺激人PBMC培養(yǎng)上清能夠抑制HBV的復(fù)制，因而本發(fā)明提供的單鏈脫氧核苷酸具有抗病毒的生物學(xué)活性。
表1單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBsAg的抑制作用

表2單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBeAg的抑制作用

表3單鏈脫氧核苷酸刺激的人PBMC上清對HepG2.2.15細(xì)胞分泌HBV DNA的抑制作用

序列表<110>OrganizationName長春華普生物技術(shù)有限公司<120>Title對病毒感染性疾病有治療作用的單鏈脫氧核苷酸<210>1<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>1ggggtcgttc gtcgttgggg gg 22<210>2<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>2ggggataacg ttgcgggggg 20<210>3<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>3ggggtgcaac gttcaggggg g21<210>4<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>4ggggtcctac gtaggagggg gg 22<210>5<211>27<212>DNA<213>Artificial<400>5ggggtccatg acgttcctga agggggg 27<210>6<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>6gggggacgtc gccggggggg 20
<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>7ggatccgtac gcatgggggg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>8gggggaatcg attcgggggg 20<210>9<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>9gggatgcatc gatgcatcgg gggg 24<210>10<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>10ggtgcgacgt cgcagggggg 20<210>11<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>11gggacgtacg tcgggggg18<210>12<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>12gggggatcga cgtcgatcgg gggg 24<210>13<211>22<212>DNA
<213>Artificial<400>13ggcgatcgat cgatcggggg gg 22<210>14<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>14ggggtcgatc gatcgagggg gg 22<210>15<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>15ggtcgcgatc gcgagggggg 20<210>16<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>16ggggtcaacg ttgagggggg 20<210>17<211>28<212>DNA<213>Artificial<400>17gtcgttttcg tcgacgaatt gggggggg 28<210>18<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>18gtcgttatcg ttttttcgta gggggg 26<210>19<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>19ggcgttaacg acgggggg18
<210>20<211>19<212>DNA<213>Artificial<400>20gtcggcacgc gacgggggg 19<210>21<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>21ggtgcgacgt cgcagggggg 20<210>22<211>23<212>DNA<213>Artificial<400>22gtctattttg tacgtacgtg ggg 23<210>23<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>23gacgtcgacg tcgacgtcag gggg 24<210>24<211>25<212>DNA<213>Artificial<400>24ggggtcgatc gttgctagcg ggggg25<210>25<211>25<212>DNA<213>Artificial<400>25gggggacgtt atcgtattgg ggggg25<210>26<211>32<212>DNA<213>Artificial
<400>26ggggtcgtcg tttgtcgtgt gtcgttgggg gg32<210>27<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>27acgatcgatc gatcgggggg 20<210>28<211>19<212>DNA<213>Artificial<400>28agacgtctaa cgtcggggg 19<210>29<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>29ggggtgctgg ccgtcgttgg gggg 24<210>30<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>30ggggtcgttg ccgtcggggg g21<210>31<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>31accggtatcg atgccggtgg gggg 24<210>32<211>28<212>DNA<213>Artificial<400>32ttcgttgcat cgatgcatcg ttgggggg 28<210>33
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ggtgcatcga tcgatgcagg gggg 24<210>40<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>40ggtgcatcgt acgatgcagg gggg 24<210>41<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>41ggtgcgatcg atcgcagggg gg 22<210>42<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>42gggggggtcg atcgatgggg gg 22<210>43<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>43ggggtcgtcg aacgttgggg gg 22<210>44<211>17<212>DNA<213>Artificial<400>44tgtcgtcct tgtcgtt 17<210>45<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>45ttcgcttcgc ttttcgcttc gctt 24<210>46<211>26
<212>DNA<213>Artificial<400>46accgccaagg agaagccgca ggaggg 26<210>47<211>19<212>DNA<213>Artificial<400>47tacaacggcg aggaatacc 19<210>48<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>48gtacaacggc gaggaatacc t21<210>49<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>49accgtcgttg ccgtcggccc 20<210>50<211>14<212>DNA<213>Artificial<400>50tgctggccgt cgtt14<210>51<211>14<212>DNA<213>Artificial<400>51gtcggcacgc gacg14<210>52<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>52gtcggcacgc gacgcccccc 20
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<400>72ctagacgttc aagcgtt 17<210>73<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>73gacgatcgtc gacgatcgtc 20<210>74<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>74gtcgttcgta gtcgactacg agtt 24<210>75<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>75aaaagacgtc gacgtcgacg tctttt 26<210>76<211>25<212>DNA<213>Artificial<400>76tgcgacgatc gtcgcacgat cggat25<210>77<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>77tgcgacgtcg cacagcgt18<210>78<211>13<212>DNA<213>Artificial<400>78tcgttgccgt cgg 13<210>79
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<400>118aacgttcgac gtcgaacggg gggg 24<210>119<211>17<212>DNA<213>Artificial<400>119aacgacgacg ttggggg 17<210>120<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>120tcgtaacgtt gtttttaacg tt 22<210>121<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>121tcgtcgtata cgacgatcgt t21<210>122<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>122tcgtcgtttg cgttgtcgtt 20<210>123<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>123tcctgtcgtt ttgtcgtt18<210>124<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>124tcgtcgttgt cgttcgct18<210>125
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<210>145<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>145tcgttgccgt cggccccccc 20<210>146<211>19<212>DNA<213>Artificial<400>146tcgaggacaa gattctcgt 19<210>147<211>27<212>DNA<213>Artificial<400>147tcggcacgcg acgtgctggc cgtcgtt 27<210>148<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>148tcgtcgcgcc gtcacggggg g21<210>149<211>19<212>DNA<213>Artificial<400>149tcgtgtgcgt gccgttggg 19<210>150<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>150tcgtcgccgt tgggcggg18<210>151<211>21<212>DNA<213>Artificial
<400>151tcgtcgacgt cgttgggcgg g21<210>152<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>152tcgcagttgt cgtaacgttg ggcggg 26<210>153<211>16<212>DNA<213>Artificial<400>153tcgtcgttgg tatgtt 16<210>154<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>154tcgtcgtcgt cgttgtcgtt 20<210>155<211>24<212>DNA<213>Artificial<400>155tcgtcgtcgt cgttgtcgtt gggg 24<210>156<211>15<212>DNA<213>Artificial<400>156tcgttcgggg tgccg 15<210>157<211>18<212>DNA<213>Artificial<400>157tcgttcgggg taacgatt18<210>158
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<210>178<211>26<212>DNA<213>Artificial<400>178tcgtcgtttt cgtcgttttc gtcgtt 26<210>179<211>22<212>DNA<213>Artificial<400>179tcgtcgtttg tcgtgtgtcg tt 22<210>180<211>30<212>DNA<213>Artificial<400>180tcgtcgttgg tcggggtcgt tggggtcgtt 30<210>181<211>20<212>DNA<213>Artificial<400>181tcgtcgtttc gtctctcgtt 20<210>182<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>182tcgtcgtttt gctgcgtcgtt 21<210>183<211>21<212>DNA<213>Artificial<400>183tcgagcgttt tcgctcgaat t21<210>184<211>30<212>DNA
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1.單鏈脫氧核苷酸是單鏈的DNA分子，其長度為6-50個(gè)堿基。
2.按照權(quán)利要求1所述的單鏈脫氧核苷酸，其磷酸二酯鍵可以是非硫化、部分硫化或完全硫化的，也可以是其它形式的磷酸二酯鍵。
3.按照權(quán)利要求1-2所述的單鏈脫氧核苷酸包括但不限于附序列表所示的序列和根據(jù)實(shí)施例2所出示的序列及其由實(shí)施例2所示公式所能推出的序列。
4.單鏈脫氧核苷酸包括但不限于實(shí)施例中Oligo1-20所示的序列。
5.按照權(quán)利要求1-4所述的單鏈脫氧核苷酸，其結(jié)構(gòu)可以是經(jīng)化學(xué)修飾的。
6.按照權(quán)利要求1-4所述的單鏈脫氧核苷酸，其結(jié)構(gòu)可以是其它相關(guān)單鏈脫氧核苷酸的核心結(jié)構(gòu)。
7.按照權(quán)利要求1-4所述的單鏈脫氧核苷酸以及以其為核心結(jié)構(gòu)的改變或添加了一到數(shù)個(gè)堿基的單鏈脫氧核苷酸。
8.按照權(quán)利要求1-4所述的單鏈脫氧核苷酸以及以其為核心結(jié)構(gòu)的在兩端添加了1到10個(gè)堿基的單鏈脫氧核苷酸。
9.按照權(quán)利要求1-4所述的單鏈脫氧核苷酸以及以其為核心結(jié)構(gòu)的在兩端刪切數(shù)個(gè)堿基的單鏈脫氧核苷酸。
10.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們能夠刺激人的細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒物質(zhì)。
11.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們能夠刺激人的細(xì)胞產(chǎn)生抗DNA病毒的物質(zhì)。
12.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們能夠刺激人細(xì)胞產(chǎn)生抗RNA病毒物質(zhì)。
13.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們能夠刺激人細(xì)胞產(chǎn)生抗肝炎病毒的物質(zhì)。
14.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們能夠刺激人細(xì)胞產(chǎn)生抗乙型肝炎病毒的物質(zhì)。
15.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們刺激人細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制病毒的復(fù)制。
16.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們刺激人細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制DNA病毒的復(fù)制。
17.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們刺激人細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制RNA病毒的復(fù)制。
18.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們刺激人細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制肝炎病毒的復(fù)制。
19.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們刺激人細(xì)胞產(chǎn)生的物質(zhì)能抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制。
20.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們具有抗病毒的作用，可治療病毒感染性疾病。
21.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們具有抗DNA病毒的作用，可治療DNA病毒感染性疾病。
22.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們具有抗RNA病毒的作用，可治療RNA病毒感染性疾病。
23.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們具有抗肝炎病毒的作用，可治療肝炎病毒感染性疾病。
24.按照權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的單鏈脫氧核苷酸，它們具有抗乙型肝炎病毒的作用，可治療由乙型肝炎病毒感染引起的乙型肝炎。
全文摘要
本發(fā)明提供了一批單鏈脫氧核苷酸，該脫氧核苷酸可刺激人的細(xì)胞產(chǎn)生抑制病毒包括但不限于乙型肝炎病毒復(fù)制的物質(zhì)，因而對病毒感染性疾病包括但不限于乙型肝炎病毒引起的乙型肝炎有治療作用。
文檔編號A61K48/00GK1903870SQ20051008556
公開日2007年1月31日 申請日期2005年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月28日
發(fā)明者王麗穎, 包木勝, 于永利 申請人:長春華普生物技術(shù)有限公司