專利名稱：一種開口箭提取物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥領(lǐng)域，特別涉及一種中藥提取物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及開口箭提取物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
開口箭屬(Tupistra)植物隸屬于百合科(Liliaceae)鈴蘭族(Convallarieae)。開口箭屬植物共有20多種，我國是世界開口箭屬植物分布的中心，種類約占全球的70％。開口箭是中國特有成分很高的植物屬，主要分布于我國四川、湖北、云南、浙江、廣西、江西、福建等南方地區(qū)。
開口箭屬植物為我國民間用藥，多以根莖及全株入藥。中醫(yī)傳統(tǒng)理論認(rèn)為該屬植物苦、辛，性寒，有毒，具有清熱解毒、祛風(fēng)除濕、散瘀止痛等功效，主治白喉、咽喉腫痛、風(fēng)濕痹痛、跌打損傷、胃痛、癰腫瘡毒、毒蛇狂犬咬傷等。
目前已有研究報道的開口箭屬植物有開口箭(Tupistra chinensis Baker)、彎蕊開口箭(Tupistra wattii Hook.f.)、齒瓣開口箭(Tupistra fimbriata Hand.-Mazz.)和黃花開口箭(Tupistra aurantiaca Wall.)等10多種。研究表明開口箭屬植物所含化學(xué)成分多為甾體化合物，均含有甾體皂甙(《中國野生植物資源》，1999，19(5)59-62)。沈平等對彎蕊開口箭的乙醇提取物進(jìn)行了分離、純化，并用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞K562和A2780a測定得到的化合物的細(xì)胞毒活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)彎蕊皂甙元B(wattigenin B)、彎蕊皂甙元C(Wattigenin C)、甾體皂甙元(kitigenin)和鈴蘭皂甙元B(convallagenin B)，以及強(qiáng)心甙rhodexin A、wattoside F、wattoside E等有細(xì)胞毒活性(《時珍國醫(yī)國藥》2005，15(12)860-861)。臺灣學(xué)者潘文彬(Pan WB)等對大陸產(chǎn)開口箭進(jìn)行了類似的研究，發(fā)現(xiàn)甾體皂甙元Δ25(27)-pentrogenin、ranmogenin A等對培養(yǎng)的人胃癌細(xì)胞(NUGC)有細(xì)胞毒活性(J.Nat.Prod.，2003，66(2)161-168)。然而，這些開口箭屬植物的化合物的抗腫瘤作用均為體外細(xì)胞毒活性測定的結(jié)果，體內(nèi)是否有抗腫瘤作用目前尚無實(shí)驗(yàn)研究的結(jié)果予以證實(shí)。陳國才等曾以開口箭為主藥，組成方劑QE-8407，進(jìn)行了抗癌藥理和臨床試驗(yàn)，證實(shí)對W256等瘤株有抑制作用(《云南大學(xué)學(xué)報》(自然科學(xué)版)，1989，1∶55)。但對于開口箭單獨(dú)使用是否有抗腫瘤作用，以及什么化合物有抗腫瘤作用等問題未做進(jìn)一步的研究。另外，還有研究表明開口箭有祛痰、抗炎和抑菌(《中國民間醫(yī)藥雜志》，2005，2103-106)，以及抗真菌等作用(《長江大學(xué)學(xué)報》(自然科學(xué)版)，2005，2(2)77-82)。這些研究均以開口箭的甲醇粗提取物為對象，未確定開口箭活性成分的化合物性質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種開口箭提取物。
本發(fā)明另一目的是提供一種開口箭提取物的制備方法。
本發(fā)明另一目的是提供一種含有開口箭提取物的藥物組合物。
本發(fā)明另一目的是提供開口箭提取物在制備治療抗腫瘤、抗炎以及抑制血小板聚集藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所述的開口箭提取物，是從百合科(Liliaceae)開口箭屬(Tupistra)植物開口箭(Tupistra chinenese，Baker)提取得到的。
本發(fā)明所述的開口箭可以是其根莖、葉或全草。
本發(fā)明所述的開口箭提取物為甾體皂甙類化合物，呈棕黃色粉末狀。其化學(xué)鑒定的特征為Liebermann-Burchard反應(yīng)、Molish反應(yīng)均呈陽性；泡沫試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，堿液管的泡沫高度較酸液管的泡沫高；Rosen-Heimer反應(yīng)在60℃時即呈現(xiàn)紫紅色顯色反應(yīng)。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法，可采用常用的皂甙類化合物分離提取方法。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法含有以下步驟a制備粗提取物；b純化。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法步驟a可以使用常用的中藥粗提取物制備方法。例如可以將開口箭用水煎煮，或用不同濃度的1-4碳醇溶液加熱回流開口箭得到含皂甙的開口箭粗提取液。本發(fā)明所述的1-4碳醇可以是甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、正丁醇其中一種或兩種以上，最好是甲醇和乙醇其中一種。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法中，開口箭可以使用其根莖、葉或全草。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法步驟b可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常用的皂甙純化方法。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法，純化方法可以采用萃取法將開口箭粗提取液濃縮得到的浸膏溶解在水中，用4或5碳醇進(jìn)行萃取；萃取液回收溶劑后干燥得到含總皂甙的開口箭提取物。本發(fā)明所述的4或5碳醇可以是正丁醇、異丁醇、正戊醇其中一種或兩種以上，最好是正丁醇。
在上述萃取純化方法中，開口箭粗提取物浸膏水溶液可以先用有機(jī)溶劑脫脂。所述的有機(jī)溶劑可以是氯仿、乙酸乙酯、乙醚、石油醚其中一種或兩種以上。
在上述萃取純化方法中，得到提取物可用丙酮或乙醚等進(jìn)行沉淀，回收沉淀物，以此得到純度更高的總皂甙。
本發(fā)明開口箭提取物制備方法，純化方法還可以采用色譜法。本發(fā)明所述色譜法可以是大孔樹脂層析法、硅膠層析法、氧化鋁層析法其中一種。本發(fā)明所述色譜法最好是大孔樹脂層析法本發(fā)明所述的大孔樹脂層析法具體步驟為開口箭粗提取液上大孔樹脂層析柱后，先用水洗脫至苯酚-硫酸法測定無多糖顯色反應(yīng)后，然后用乙醇進(jìn)行洗脫，收集皂甙顯色反應(yīng)陽性的部位，濃縮干燥得到開口箭提取物。
本發(fā)明所述的大孔樹脂是非極性或弱極性聚苯乙烯大孔樹脂，例如HPD-100、D-101、AB-8、HP-20、HPD-300等。本發(fā)明所述的大孔樹脂最好是HPD-100大孔樹脂。
本發(fā)明所述的含有開口箭提取物的藥物組合物，含有治療有效量的開口箭提取物和常用的輔劑或賦型劑?？梢愿鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法得到開口箭提取物優(yōu)選的使用用量和形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法得到所用的輔劑、賦型劑的使用形式和用量。
本發(fā)明所述的含有開口箭提取物的藥物組合物，采用本領(lǐng)域常用的制備方法。例如將上述開口箭提取物和藥物輔劑混合均勻即得。
本發(fā)明所述的含有開口箭提取物的藥物組合物，其劑型可以是注射劑、片劑、丸劑、膠囊劑、沖劑、口服液、混懸液、噴霧劑、外用搽劑、透皮吸收劑中的任何一種。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以依據(jù)本領(lǐng)域已知的方法得到所用的劑型。
本發(fā)明開口箭提取物具有抗腫瘤作用、抗炎作用、以及抑制血小板聚集、抗血栓作用。為了更好的理解本發(fā)明，下面用本發(fā)明的相關(guān)藥理試驗(yàn)及結(jié)果來說明其用途。
一、抗腫瘤作用1.開口箭總皂甙體外腫瘤的活性實(shí)施例1制備的開口箭總皂甙I用磷酸緩沖溶液(PBS)配制成2mg/mL溶液，過濾除菌后，再用無菌PBS稀釋至20μg/mL、40μg/mL、80μg/μL、160μg/mL、320μg/mL。
K562人白血病細(xì)胞；HepG2人肝癌細(xì)胞；LoVo人大腸癌細(xì)胞；C6大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞；MCF7人乳腺癌細(xì)胞；均用添加10％新生牛血清的DMEM培養(yǎng)，按2.0×103個/孔接種于96孔板，體積90μL。培養(yǎng)48小時后，每孔加入不同濃度的提取物10μL，即終濃度分別為2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、16μg/mL、32μg/mL?？瞻讓φ諡镻BS，對照組與藥物組均設(shè)6個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)48小時，加入體積比為1∶10的CCK-8試劑，孵育2.5小時，酶標(biāo)儀上測定450nm吸光度(OD值)，參比波長為630nm。按下式計(jì)算抑制率抑制率(％)＝[1-(用藥組平均OD值/空白對照組平均OD值)]×100％，并根據(jù)抑制率計(jì)算開口箭總皂甙對各種腫瘤的半數(shù)抑制濃度(IC50)，結(jié)果見表1。
表1.開口箭總皂甙I對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

實(shí)施例2制備的開口箭總皂甙II和實(shí)施例3制備的總皂甙Ⅲ及分離部位B、C、D(部位A因難溶解，且含量少，未進(jìn)行此項(xiàng)試驗(yàn))用磷酸緩沖溶液配制成2mg/mL溶液，過濾除菌后，再用無菌PBS稀釋至20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL。同上方法測定各樣品抑制HepG2細(xì)胞增殖的活性。結(jié)果見表2。結(jié)果表明開口箭總皂甙及其各分離部位對HepG2腫瘤細(xì)胞增殖均有抑制作用，并以極性偏低的部位B的作用為強(qiáng)。
表2.開口箭總皂甙及分離部位對HepG2腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

2、開口箭總皂甙體內(nèi)腫瘤的活性實(shí)施例1制備的開口箭總皂甙I用生理鹽水溶解，配制成0.1g/mL和0.2g/mL的溶液，過濾除菌，分裝后-20℃保存，臨用前解凍。
將已接種7天的S180肉瘤小鼠的腹水與生理鹽水按1∶1的比例進(jìn)行稀釋，小鼠右腹股溝皮下注射0.2mL稀釋液，按體重隨機(jī)分組生理鹽水對照組11只，另兩組的動物數(shù)均為10只。
給藥方法與抑瘤率的計(jì)算小鼠接種腫瘤后第2天開始給藥，每天一次，連續(xù)8天。給藥劑量分別為環(huán)磷酰銨(CTX)組20mg/kg腹腔注射，開口箭總皂甙按0.2mL/10g體重灌胃給藥，給藥量分別為2.0g/kg和4.0g/kg。末次給藥后的第2天處死小鼠，剝離瘤塊稱重。按“抑瘤率＝(1-給藥組瘤重/生理鹽水對照組瘤重)×100％”公式計(jì)算抑瘤率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。
表3.開口箭總皂甙對S180荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

注與生理鹽水對照組比較，**p＜0.01。
二、抗炎作用實(shí)施例3制備的開口箭總皂甙Ⅲ用生理鹽水溶解，配制成0.1g/mL和0.2g/mL的溶液，過濾除菌，分裝后-20℃保存，臨用前解凍。
以二甲苯誘發(fā)小鼠耳廓腫脹的炎癥模型檢驗(yàn)開口箭總皂甙的抗炎作用小鼠48只，雌雄各半，隨機(jī)分成4組。陽性對照組腹腔注射阿司匹林150mg/kg，開口箭總皂甙Ⅲ以0.2ml/10g體重灌胃給藥，陰性對照組給同體積生理鹽水灌胃。每日1次，連續(xù)7天。末次給藥后2小時，將各組小鼠右耳上、下兩面分別涂抹二甲苯20μl，左耳不涂作為對照，1小時后處死小鼠，剪下雙耳，用8mm直徑的打孔器沖下耳片，天平稱重。用右耳重量減去左耳重量作為腫脹度，按以下公式計(jì)算腫脹抑制率腫脹抑制率＝(陰性對照組差值-給藥組差值)/陰性對照組差值×100％。結(jié)果見表4。結(jié)果表明開口箭總皂甙可抑制二甲苯致小鼠耳廓腫脹，有顯著的抗炎作用。
表4.開口箭總皂甙III對二甲苯致小鼠耳廓腫脹的影響

注與生理鹽水對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
三、抗血小板聚集作用實(shí)施例1制備的開口箭總皂甙I用生理鹽水溶解，配制成5mg/mL、10mg/mL、20mg/mL、40mg/mL的溶液。
體外抗血小板凝聚作用家兔耳緣靜脈取血，3.8％枸櫞酸鈉1∶9抗凝。900轉(zhuǎn)/分鐘離心8分鐘，取上層富含血小板血漿備用。將已吸取過PRP的血漿繼續(xù)離心，3000轉(zhuǎn)/分鐘離心20分鐘，取貧血小板血漿。用比濁法測定血小板聚集率。取富含血小板血漿0.27mL加入測試杯中，加入30μL開口箭總皂甙I，對照組用10μL生理鹽水代替，37℃孵育2分鐘后，加入二磷酸腺(ADP)誘導(dǎo)血小板聚集。
結(jié)果表明，開口箭總皂甙具有明顯的抗血小板聚集作用，并且呈量效關(guān)系。以血小板最大聚集率計(jì)算血小板聚集抑制率，按以下公式計(jì)算抑制率＝(對照組聚集率-給藥組聚集率)/對照組聚集率×100％。結(jié)果見表5。開口箭總皂甙抑制血小板聚集的IC50為3.18mg/mL。
表5.開口箭總皂甙I抗血小板聚集作用

注與生理鹽水對照組比較，*p＜0.05，**p＜0.01。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)有1.本發(fā)明提供的開口箭總皂甙具有確切的抗腫瘤、抗炎、以及抑制血小板聚集等作用，有較好的臨床實(shí)用價值。
2.本發(fā)明的開口箭總皂甙的制備可采用萃取和樹脂層析等方法，操作簡便易行，反應(yīng)條件溫和，宜于推廣應(yīng)用。
3.本發(fā)明所述的開口箭原料藥材在我國南方省份較為常見，藥源較廣，易于實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1開口箭根莖薄片(2～4mm)0.2公斤，加1.5升水，浸泡6小時后，加熱煎煮2小時，傾出水煎液；然后加水1.5升，繼續(xù)煎煮1.5小時，傾出水煎液，再加水1.5升，同樣方法煎煮1.5小時；合并3次水煎液，過濾，備用。
HPD-100大孔樹脂柱層析HPD-100大孔樹脂柱床體積為4.5cm(內(nèi)徑)×58cm(高)，約920mL。上述開口箭水煎液上樣，用蒸餾水洗脫，流速約1.8升/小時。約5升蒸餾水沖洗后，流出液用硫酸-苯酚法檢測多糖反應(yīng)呈淺黃色；接著用20％乙醇2.5升洗脫，再用3升70％乙醇洗脫。收集70％乙醇洗脫的部位，檢測Liebermann-Burchard反應(yīng)、Molish反應(yīng)均呈陽性，說明為皂甙類物質(zhì)。70％乙醇洗脫的部位加熱干燥，得到總皂甙I，稱重約20.1克，得率為10.0％。
含開口箭提取物的藥物組合物配方及其制備方法片劑1000片量(200mg/片)(1)配方上述開口箭提取物 200g淀粉 40g糊精 40g硬脂酸 6.4g(2)制備方法依據(jù)上述配方混勻→過篩→加適量乙醇制?！?0-80℃烘干→壓片每片重約300mg。
實(shí)施例2開口箭根莖薄片(2～4mm)0.2公斤，分別依次用1.5升的95％乙醇、75％乙醇和50％乙醇，加熱回流提取2小時，合并提取液，減壓蒸餾回收乙醇，所得到的浸膏加400毫升蒸餾水溶解，置于分液漏斗內(nèi)，加200毫升石油醚萃取3次，每次振蕩5分鐘，靜置0.5小時；下層水溶液用200毫升水飽和正丁醇萃取4次，每次振蕩5分鐘，靜置1小時。合并正丁醇萃取溶液，減壓蒸餾回收正丁醇，殘留物用50毫升甲醇溶解，加500毫升丙酮，靜置過夜，小心傾出上層溶液，沉淀物經(jīng)檢測Liebermann-Burchard反應(yīng)、Molish反應(yīng)均呈陽性，為皂甙類物質(zhì)。沉淀物60℃真空干燥，得到總皂甙II，稱重22.8克，得率為11.4％。
含開口箭提取物的藥物組合物配方及其制備方法凍干粉針(針劑)1000瓶量(100mg/支)(1)配方上述開口箭提取物 100g活性炭 25g注射用水至 5000ml
(2)制備方法用注射用水將總皂甙溶解加入活性炭→混勻→加熱至80℃×30min→布氏漏斗過濾→0.2μm濾膜過濾除菌→分裝，每瓶5ml→半蓋膠塞→冷凍干燥→壓蓋。
實(shí)施例3開口箭根莖薄片(2～4mm)0.2公斤，加甲醇1.5升，加熱回流提取2小時，反復(fù)提取4次，合并提取液，減壓蒸餾回收甲醇，所得到的浸膏加400毫升蒸餾水溶解，置于分液漏斗內(nèi)，加200毫升石油醚萃取3次，每次振蕩5分鐘，靜置0.5小時；下層水溶液用200毫升水飽和正丁醇萃取4次，每次振蕩5分鐘，靜置1小時。合并正丁醇萃取溶液，減壓蒸餾回收正丁醇，殘余物經(jīng)檢測Liebermann-Burchard反應(yīng)、Molish反應(yīng)均呈陽性，為皂甙類物質(zhì)，即得到總皂甙，稱重25.4g。取12g總皂甙用甲醇溶解，與H型薄層層析硅膠攪拌均勻，風(fēng)干備用。
取上述拌樣的硅膠，置于H型薄層層析硅膠干柱(2.6×73cm)頂部，高度約5.3cm。用水飽和正丁醇層析洗脫，根據(jù)流出液的薄層層析結(jié)果，按流出的順序(極性由弱到強(qiáng))收集了A、B、C、D四個部位，經(jīng)檢測四個部位的Liebermann-Burchard反應(yīng)、Molish反應(yīng)均呈陽性，均為皂甙類物質(zhì)。減壓蒸餾回收正丁醇，殘留物稱重，A為0.17g，B為0.87g、C為5.29g、D為2.60g?？傊貫?.93g。
含開口箭提取物的藥物組合物配方及其制備方法膠囊1000粒量(200mg/粒)(1)制備方法上述開口箭提取物200g(2)制法將原料分裝成膠囊，每粒約300mg。
權(quán)利要求
1.一種開口箭提取物，是從百合科(Liliaceae)開口箭屬(Tupistra)植物開口箭(Tupistra chinensis，Baker)根莖、葉或全草經(jīng)提取得到的中藥提取物，其特征在于中藥提取物是甾體皂甙類化合物，所述的提取物通過以下步驟制備首先對開口箭的根莖、葉或全草經(jīng)醇加熱回流或水煎后得到粗提取液；然后將開口箭粗提取液濃縮得到的浸膏溶解在水中，用4或5碳醇進(jìn)行萃取，萃取液回收溶劑后得到開口箭提取物，或?qū)㈤_口箭粗提取液上大孔樹脂層析柱后，先用水洗脫至苯酚-硫酸法測定無多糖顯色反應(yīng)，然后用乙醇進(jìn)行洗脫，收集皂甙顯色反應(yīng)陽性的部位濃縮干燥后得到開口箭提取物。
2.依據(jù)權(quán)利要求1所述的開口箭提取物，其特征在于制備開口箭粗提取液所用的醇是乙醇或甲醇。
3.依據(jù)權(quán)利要求1所述的開口箭提取物，其特征在于萃取所用醇是正丁醇。
4.依據(jù)權(quán)利要求1所述的開口箭提取物，其特征在于大孔樹脂是HPD-100大孔樹脂。
5.依據(jù)權(quán)利要求1至4其中之一所述的開口箭提取物的制備方法含有以下步驟用水煎煮開口箭，或用不同濃度的1-4碳醇溶液加熱回流開口箭得到開口箭粗提取液；然后將開口箭粗提取液分離純化。
6.依據(jù)權(quán)利要求5所述的開口箭提取物的制備方法，其特征在于開口箭粗提取液分離純化是將開口箭粗提取液上HPD-100大孔樹脂層析柱后，先用水洗脫至苯酚-硫酸法測定無多糖顯色反應(yīng)，然后用乙醇進(jìn)行洗脫，收集皂甙顯色反應(yīng)陽性的部位濃縮干燥后得到開口箭提取物。
7.依據(jù)權(quán)利要求5所述的開口箭提取物的制備方法，其特征在于開口箭粗提取液分離純化是將開口箭粗提取液濃縮得到的浸膏溶解在水中，用正丁醇萃取，萃取液回收溶劑后得到開口箭提取物。
8.一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求1至4其中之一所述的開口箭提取物和藥學(xué)上可以接受的輔料。
9.依據(jù)權(quán)利要求1至4其中之一所述的開口箭提取物在制備治療抗腫瘤、抗炎以及抑制血小板聚集藥物中的應(yīng)用。
10.依據(jù)權(quán)利要求1至4其中之一所述的開口箭提取物在制備治療抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
11.依據(jù)權(quán)利要求8所述的藥物組合物在制備治療抗腫瘤、抗炎以及抑制血小板聚集藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，特別涉及一種中藥提取物及其制備方法和應(yīng)用，具體涉及開口箭提取物及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明開口箭提取物是從開口箭根莖、葉或全草提取得到，呈棕黃色粉末狀，其化學(xué)鑒定的特征為Liebermann－Burchard反應(yīng)、Molish反應(yīng)均呈陽性；泡沫試驗(yàn)呈陽性反應(yīng)，堿液管的泡沫高度較酸液管的泡沫高；Rosen－Heimer反應(yīng)在60℃時即呈現(xiàn)紫紅色顯色反應(yīng)，為甾體皂甙類化合物。其制備方法為首先對開口箭的根莖、葉或全草經(jīng)醇加熱回流或水煎后得到粗提取液，然后分離純化粗提取液得到。本發(fā)明開口箭提取物具有抗腫瘤作用、抗炎作用以及抑制血小板聚集、抗血栓作用。
文檔編號A61P7/02GK1775267SQ20051010083
公開日2006年5月24日 申請日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月3日
發(fā)明者朱正光, 余傳林, 雷林生, 吳曙光 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)