專利名稱：一種化合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種可用作人源腺苷單核苷酸激活蛋白激酶(AMPK)激活劑的小分子有機化合物。該類化合物可用于作預防、延緩展或治療由AMPK介導的病癥，特別是II型糖尿病、肥胖癥和腫瘤。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法。另外本發(fā)明還涉及了該化合物在激活人源腺苷單核苷酸激活蛋白激酶中以及促進胞內(nèi)葡萄糖吸收的應(yīng)用和在制備治療代謝性疾病的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
糖尿病已成為危害人類健康的三大疾病之一，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，1997年全世界糖尿病患者已達1.24億，預計到2025年將上升至3億，其中97％為II型糖尿病患者。糖尿病是由不同病因與發(fā)病機理引起體內(nèi)胰島素缺乏或胰島素作用降低，臨床上以糖代謝異常為主要表現(xiàn)的一組異質(zhì)性內(nèi)分泌代謝疾病的總稱。(Ferrannini，E.Insulinresistance versus insulin deficiency in non-insulin-dependent diabetesmellitusproblems and prospects.Endocr.Rev，1998，19477-490.Stefan。The cost of diabetes and diabetes care.Diabetes Research and ClinicalPractice 54 Sullppl.1，2001S13-S18。)如果得不到及時有效的治療，可導致失明、心腦血管疾病、腎功能衰竭等多種并發(fā)癥，嚴重危害人類健康。糖尿病在我國及全世界發(fā)病率都很高。因此，研究對糖尿病的有效的預防和治療方法，具有重要意義。
盡管已有大量的實驗和研究資料去闡明其病因?qū)W，但絕大多數(shù)糖尿病患者體內(nèi)的基礎(chǔ)缺陷目前仍不清楚。由于其病因?qū)W極其復雜，產(chǎn)生的綜合癥也多種多樣，以至于目前市場上沒有一種能從根本上完全治愈糖尿病的藥物。所以近年來的研究多集中在從分子生物學的角度尋找新的藥物作用靶點，以推動新藥的研發(fā)。其中腺苷單核苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)就是近年來在該領(lǐng)域研究方面的一個熱點，是最新研究發(fā)現(xiàn)的治療II型糖尿病的新靶點。(Winder，W.W.AMP-activated protein kinasepossible target for treatmentof type 2 diabetes.Diabetes Technol Ther，2000，2(3)441-448。NicolasMusi，Nobuharu Fujii，Michael F.Hirshman，et al.AMP-activated proteinkinase(AMPK)is activated in muscle of subjects with Type 2 diabetesduring exercise.Diabetes，2001，50921-927。)AMPK是一個異源三聚體，包含一個α催化亞基，β、γ兩個調(diào)節(jié)亞基。對于哺乳動物細胞的AMPK，每種亞基分別被2-3個基因(α1、α2；β1、β2；γ1、γ2、γ3)編碼。在α亞基的N端含有一激酶催化活性區(qū)域，C端為活性調(diào)節(jié)區(qū)域，含有一個自我抑制區(qū)域和一個調(diào)節(jié)亞基的結(jié)合區(qū)域；β亞基起連接α和γ亞基的支架作用。(Hardie，D.G.，and D.Carling.The AMP-activated protein kinase.Fuel gauge of the mammalian cell？Eur.J.Biochem，1997，246259-273。Kahn，B.B.，Alquier，T.，Carling，D.，andHardie，D.G.AMP-activated protein kinaseAncient energy gaugeprovides clues to modem understanding of metabolism.Cell Metabolism.2005，115-25)在II型糖尿病中，糖代謝和脂代謝過程失調(diào)，而AMPK對這些代謝途徑有一個重要的調(diào)節(jié)作用。(Crute，B.E.，Seefeld，K.，Gamle，J.，Kemp，B.E.，and Witters，L.A.Functional domain of the alcatalytic subunit of the AMP-activated protein kinase.(1998)J.Biol.Chem.273，35347-35354)研究證實，AMPK激活后能激活并增強肌細胞中脂肪酸氧化和葡萄糖吸收，抑制肝細胞中膽固醇和甘油三酯合成、脂生成，調(diào)節(jié)β細胞的胰島素分泌，增強胰島素靶組織對胰島素的敏感性以及激活肌細胞內(nèi)葡萄糖的吸收等。(Winder，W.W.，and Hardie，D.G.AMP-activated protein kinase，a metabolic master switchpossible roles inType 2 diabetes.Am.J.Physiol，1999，277E1-E10)AMPK在體內(nèi)肌肉組織中及其它主要組織中增強葡萄糖吸收，增強胰島素敏感性和在糖代謝、脂代謝中的關(guān)鍵作用，使之成為治療II型糖尿病及肥胖癥的一條有效途徑。因此，利用人源AMPK-α1(aa 1-394)無活性片斷來篩選AMPK的高活性、高選擇性的激活劑，可為AMPK分子機理的研究和治療II型糖尿病新藥的開發(fā)提供重要的依據(jù)。
目前尚無AMPK激活劑的發(fā)明，目前所使用的AICAR也僅為非特異性AMPK激活劑，因此研究并開發(fā)出新型AMPK特異性激活劑用于預防II型糖尿病及肥胖等，具有廣闊的應(yīng)用前景和重大的商業(yè)意義。

發(fā)明內(nèi)容
考慮到上述問題，本發(fā)明設(shè)計并合成了一種新型化合物，可用作人源AMPK激活劑，并能有效激活人源AMPK-α1(aa 1-394)的活性從而促進胞內(nèi)葡萄糖吸收，因此可用于預防、延緩或治療由AMPK介導的病癥，特別是II型糖尿病、肥胖癥和腫瘤。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)相對簡單，易于制備。
本發(fā)明所述的新型化合物具有如下式1所示的結(jié)構(gòu)[式1]
其中X為NH、O或S；Y1為O或者S；Y2為NR5、O或者S，其中R5為H；苯基、 等；R1為H、苯基或 芐基、或者取代或未取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基等；其中R9、R10各自獨立的為H；F；Cl；三氟甲基；乙炔基、丙炔基；含有羧基、羧酸酯基的C1-C4烷基等。
R2、R3、R4各自獨立地為H、F、Cl、吡咯基、吡啶基、噻唑基、噻吩基、芐基、苯基、或者 等；其中R6、R7、R8各自獨立地為H、F、Cl、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、胺基、苯甲酰胺基、C2-C6烷酰胺基、和C3-C6的環(huán)烷基取代的酰胺基、C1-C4烷基等。
其中，所述的未取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基為環(huán)丙烷基、環(huán)丁烷基、甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊烷基、環(huán)戊烷基、正己烷基、環(huán)己基等；取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基的取代基包括一個或多個選自F、Cl、C1-C10的烷氧基、腈基、羧基、甲酸甲酯基、甲酸乙酯基或羥基的取代基團等。
本發(fā)明所述的新型人源AMPK激活劑通過下列三個步驟制備得到步驟a根據(jù)下面的化學反應(yīng)式1將化合物1中的羧基還原為醇基。
在0～5℃下，以四氫呋喃為溶劑，化合物1與四氫鋰鋁反應(yīng)將羧基還原為醇羥基，經(jīng)過加水淬滅、萃取、干燥、濃縮等后處理，得到化合物2；[化學反應(yīng)式2]
室溫下，以氯仿為溶劑用活性二氧化錳將化合物2的醇羥基氧化為醛基，經(jīng)過過慮、濃縮等后處理，得到化合物3；[化學反應(yīng)式3] 以冰醋酸為溶劑并醋酸鈉作用下或者以無水乙醇為溶劑并在哌啶作用下，回流，將化合物3、4偶聯(lián)，經(jīng)過萃取、干燥、濃縮、硅膠柱層析等后處理，得到最終的化合物5。
在以上三個步驟中，其中X為NH、O或S；Y1為O或者S；Y2為NR5、O或者S；其中R5為H、苯基、 等；R1為H、苯基或 芐基、或者取代或未取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基等；
其中R9、R10各自獨立的為H；F；Cl；三氟甲基；乙炔基、丙炔基；含有羧基、羧酸酯基的C1-C4烷基等。
R2、R3、R4各自獨立地為H、F、Cl、吡咯基、吡啶基、噻唑基、噻吩基、芐基、苯基、或者 等；其中R6、R7、R8各自獨立地為H、F、Cl、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、胺基、苯甲酰胺基、C2-C6烷酰胺基、和C3-C6的環(huán)烷基取代的酰胺基、C1-C4烷基等。
其中，所述的未取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基為環(huán)丙烷基、環(huán)丁烷基、甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊烷基、環(huán)戊烷基、正己烷基、環(huán)己基等；取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基的取代基包括一個或多個選自F、Cl、C1-C10的烷氧基、腈基、羧基、甲酸甲酯基、甲酸乙酯基或羥基的取代基團等。
通常用薄層層析法(TLC)來跟蹤測定反應(yīng)的完成程度。反應(yīng)完畢后一般采用的后處理方法包括冷卻、濃縮反應(yīng)液除盡溶劑、萃取、柱層析分離等。用NMR來檢測最終產(chǎn)物。
本發(fā)明的新型化合物，可用作人源AMPK激活劑，并能有效激活人源AMPK-α1(aa 1-394)的活性，從而可預防、延緩或治療由AMPK介導的病癥，特別是II型糖尿病、肥胖癥和腫瘤。
下面，通過實施例和對比實施例將更具體地描述本發(fā)明。然而，下面的實施例僅僅是為了說明而提供，因此本發(fā)明不局限于這些實施例。


圖1為不添加本發(fā)明的化合物和分別添加本發(fā)明的化合物5f、5r、5s、5t、5u的情況下，對AMPK活性的測定。
圖2為不同濃度下本發(fā)明實施例中制備的化合物5r的催化活性。
在圖2中，(-)表明未加此化合物處理細胞，(+)表明加此化合物處理細胞；(pAMPK)表示AMPK催化亞基α上蘇氨酸(Thr)172的磷酸化水平；(AMPK)表示胞內(nèi)AMPK催化亞基α的表達水平；(pACC)表示胞內(nèi)AMPK底物ACC的磷酸化水平；(ACC)表示胞內(nèi)ACC的表達水平；(-Actin)表示用胞內(nèi)肌動蛋白來顯示胞內(nèi)總蛋白量。
具體實施例方式
下述實施例中，NMR用Varian生產(chǎn)的Mercury-Vx 300M儀器測定，NMR定標δH/C 7.26/77.0ppm(CDCl3)；試劑主要由上海化學試劑公司提供，產(chǎn)品純化主要用柱色譜法，硅膠(200-300目)，柱色譜法所用的硅膠型號為粗空(ZLX-II)，由青島海洋化工廠分廠生產(chǎn)。
實施例1化合物5a的制備[化學反應(yīng)式4] 按照上面的化學反應(yīng)式
第一步在25ml圓底燒瓶中加入28mg的AlLiH4，使其分散在10ml新蒸的THF中，室溫下滴加101mg化合物3a(0.37mmol)的3ml新蒸THF溶液，滴畢室溫(24-26℃)攪拌反應(yīng)30分鐘，用TLC來跟蹤測定反應(yīng)的完成程度。反應(yīng)完畢后，小心加入0.5ml水，繼續(xù)攪拌10分鐘，加水稀釋，乙酸乙酯萃取，有機相經(jīng)無水Na2SO4干燥后濃縮除盡溶劑，得到2b。
第二步在50ml圓底燒瓶中加入68mg化合物2a，20ml氯仿，攪拌下加入活性MnO2122mg，室溫(24-26℃)攪拌反應(yīng)5小時，用TLC來跟蹤測定反應(yīng)的完成程度。反應(yīng)完畢后，過慮除去不溶物，濃縮除盡溶劑、得到3a 38mg。
第三步在5ml圓底燒瓶中加入38mg化合物3a(0.16mmol)，60mg化合物4a(0.16mmol)，27mg哌啶，3ml無水乙醇，氮氣保護回流(80℃至120℃)3小時，用TLC來跟蹤測定反應(yīng)的完成程度。反應(yīng)完畢后，冷卻，濃縮反應(yīng)液除盡溶劑、柱層析分離得產(chǎn)物5a 30mg。
化合物5a1H NMR(CDCl3，300MHz)δ 6.78(dd，2H)，7.11(m，4H)，7.43(m，3H)，7.69(t，1H)。
實施例2化合物5b的制備[化學反應(yīng)式5]
按照上面化學反應(yīng)式第一步除以原料1b代替實施例1中第一步驟中的原料1a外，以實施例1的第一步驟相同的方法制備化合物2b。
第二步除以原料2b代替實施例1中第二步驟中的原料2a外，以實施例1的第二步驟相同的方法制備化合物3b。
第三步在5ml圓底燒瓶中加入34mg化合物3b(0.28mmol)，60mg化合物4b(0.28mmol)，100mg AcONa，2ml冰醋酸，氮氣保護回流(100℃至120℃)2小時，TLC跟蹤反應(yīng)。反應(yīng)完畢后，冷卻，過濾，洗滌后真空干燥得得產(chǎn)物42mg的化合物5b。
化合物5b1H NMR(CDCl3，300MHz)δ1.27～1.43(m，4H)，1.69(d，4H)，1.87(d，2H)，2.10(s，3H)，2.27(s，3H)，5.10(br，1H)，5.99(s，1H)，6.76(s，1H)。
實施例3化合物5c的制備除以與化合物5c相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5c。
化合物5c的結(jié)構(gòu)式
化合物5c1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.32(s，6H)，3.66(s，3H)，3.75(s，3H)，3.93(s，2H)，6.78(d，1H)，6.93(d，1H)，7.01(s，1H)，7.09(s，1H)，7.63(s，1H)，7.73(s，1H)，7.83(d，1H)。
實施例4化合物5d的制備除以與化合物5d相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5d。
化合物5d的結(jié)構(gòu)式 化合物5d1H NMR(CDCl3，300MHz)δ3.11(s，1H)，6.83(d，1H)，7.02(d，1H)，7.16(s，1H)，7.37(m，6H)，7.5 1(s，1H)，7.80(s，1H)。
實施例5化合物5e的制備除以與化合物5e相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5e。
化合物5e的結(jié)構(gòu)式 化合物5e1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ6.78(d，1H)，7.05(d，1H)，7.21(m，2H)，7.40(m，1H)，7.60(m，2H)，7.79(d，1H)，7.99(d，1H)。
實施例6化合物5f的制備除以與化合物5f相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5f。
化合物5f的結(jié)構(gòu)式 化合物5f1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ1.78，1.94，2.02，2.49，6.85，7.19，7.28，7.45，7.72，8.03，8.39，9.45。
實施例7化合物5g的制備
除以與化合物5g相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5g。
化合物5g的結(jié)構(gòu)式 化合物5g1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.74(d)，7.05-7.11(m)，7.16(d)，7.31(d)，7.36(s)，7.58(d)。
實施例8化合物5h的制備除以與化合物5h相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5h。
化合物5h的結(jié)構(gòu)式 化合物5h1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.85(d)，7.02(d)，7.20(d)，7.33(d)，7.54(s)，7.75(d)。
實施例9化合物5i的制備
除以與化合物5i相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5i。
化合物5i的結(jié)構(gòu)式 化合物5i1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ7.06，7.18，7.43，7.56，7.74，8.01。
實施例10化合物5j的制備除以與化合物5j相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5j。
化合物5j的結(jié)構(gòu)式 化合物5j1H NMR(CDCl3，300MHz)δ6.77，6.94，7.06，7.27，7.37，7.68。
實施例11化合物5k的制備
除以與化合物5k相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5k。
化合物5k的結(jié)構(gòu)式 化合物5k1H NMR(CD3OD-d4，300MHz)δ6.70，6.82，7.06，7.23，7.43，7.52，7.60。
實施例12化合物5l的制備除以與化合物5l相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5l。
化合物5l的結(jié)構(gòu)式 化合物5l1H NMR(CD3OD-d4，300MHz)δ7.13，7.19，7.32，7.36，7.46，7.60，7.12，7.81，8.05。
實施例13化合物5m的制備
除以與化合物5m相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5m。
化合物5m的結(jié)構(gòu)式 化合物5m1H NMR(CD3OD-d4，300MHz)δ2.18，2.26，2.30，6.67，6.72，7.03，7.05，7.34，7.47。
實施例14化合物5n的制備除以與化合物5n相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例1相同的方法制備化合物5n。
化合物5n的結(jié)構(gòu)式 化合物5n1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.26，2.31，2.36，7.01，7.04，7.10，7.29，7.43，7.56，7.69，7.85。
實施例15化合物5o的制備
除以與化合物5o相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5o。
化合物5o的結(jié)構(gòu)式 化合物5o1H NMR(CD3OD-d4，300MHz)δ2.14，2.28，2.36，6.87，6.97，7.10，7.18，7.50，7.60，7.95。
實施例16化合物5p的制備除以與化合物5p相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5p。
化合物5p的結(jié)構(gòu)式 化合物5p1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ7.19，7.39，7.44，7.54，7.65，7.81，7.96，8.17。
實施例17化合物5q的制備
除以與化合物5q相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5q。
化合物5q的結(jié)構(gòu)式 化合物5q1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ6.67，6.71，6.97，7.08，7.24，7.46，7.49，7.77，8.00。
實施例18化合物5r的制備除以與化合物5r相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5r。
化合物5r的結(jié)構(gòu)式 化合物5r1H NMR(CD3OD-d4，300MHz)δ2.14，2.28，2.36，6.87，6.97，7.10，7.18，7.35，7.47，7.52。
實施例19化合物5s的制備
除以與化合物5s相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5s。
化合物5s的結(jié)構(gòu)式 化合物5s1H NMR(CDCl3，300MHz)δ2.18，3.91，6.68，7.16，7.19，7.37，7.68，7.84，7.92，8.01。
實施例20化合物5t的制備除以與化合物5t相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5t。
化合物5t的結(jié)構(gòu)式 化合物5t1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ1.06，2.19，2.36，6.99，7.12，7.28，7.44，7.58，8.04，8.39。
實施例21化合物5u的制備
除以與化合物5u相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5u。
化合物5u的結(jié)構(gòu)式 化合物5u1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ2.36，6.71，6.83，7.22，7.44，7.58，7.98。
實施例22化合物5v的制備除以與化合物5v相對應(yīng)的羧酸或羧酸酯以及羰基化合物為原料外，以實施例2相同的方法制備化合物5v。
化合物5v的結(jié)構(gòu)式 化合物5v1H NMR(DMSO-d6，300MHz)δ7.09，7.20，7.40，7.58，7.98，8.00，8.31。
測試實施例1AMPK活性激活測試試驗AMPK催化亞基α1無活性片斷α1(1-394氨基酸)的制備
將編碼人源AMPK催化亞基α1無活性片斷α1(1-394氨基酸)的基因序列構(gòu)建于pGEMEX-1載體中。將經(jīng)鑒定完全正確的pGEMEX-AMPK-α1(1-394)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達型大腸桿菌BL21-Codon-Plus(DE3)-RIL菌株，挑單克隆菌落于1L含50μg/mL氨芐青霉素和25μg/mL氯霉素的LB豐富培養(yǎng)基，每分鐘180轉(zhuǎn)于37℃培養(yǎng)過夜，直至菌液OD600值為0.4-0.6，加入0.1mM IPTG于22℃誘導表達過夜。4℃采用6000×g離心3分鐘收獲表達細菌(約2.0g/L表達菌)，用20mL Buffer A(50mM Tris·HCl，pH7.5，1mM DTT)重新懸浮細菌并洗菌三次，然后用裂解液Buffer A，1％Triton X-100重懸細菌。在4℃下用超聲波處理菌液三分鐘，充分裂解細胞。將上述含有目的蛋白的裂解液于4℃ 12000×g離心15分鐘，兩次離心后棄沉淀，取上清蛋白液過Q柱。使用HiTrap-5ml QHP陰離子交換柱和FPLCsystem進行。過Q柱的溶液有BufferA(50mM Tris·HCl，pH7.5，1mMDTT)和Buffer B(50mM Tris·HCl，pH7.5，1mM DTT，1M NaCl)。用Buffer A平衡HiTrap-5ml QHP層析柱后，注入上清蛋白樣品，先用Buffer A平衡，再用Buffer A和100％Buffer B組成的線性NaCl梯度洗脫。用SDS-PAGE驗證收集組分的蛋白組成和純度；并根據(jù)結(jié)果和蛋白濃度，分別合并較純的組分。洗脫得到的目的蛋白AMPK-α1(1-394)經(jīng)12％SDS-PAGE分離鑒定純化得到的目的蛋白純度約為95％左右。經(jīng)鑒定，其大小，酶學性質(zhì)均與文獻報道的氨基酸序列相對應(yīng)的重組鼠源AMPK-α1(aa 1-392)一致(Hamilton等，AMP-activated proteinkinase kinasedetection with recombinant AMPK al subunit，(2002)Biochem.Biophys.Res.Commun.293，892-898；Crute等，F(xiàn)unctionaldomains of the al catalytic subunit of the AMP-activated protein kinase，(1998)J.Biol.Chem.273，35347-35354)。
AMPK-α1(1-394)激活測試原理應(yīng)用上述大腸桿菌表達系統(tǒng)，純化得到了人源AMPK的催化亞基α1的無活性片斷α1(1-394)，其中該片斷含有自身的自我抑制序列，用于篩選實驗?；诜派湫酝凰丶夹g(shù)，激活的AMPK能夠磷酸化底物SAMS(MW1779)，將溶液中[γ-33P]-ATP上的γ-33P轉(zhuǎn)移共價結(jié)合到底物SAMS上，使其Ser殘基磷酸化，產(chǎn)生具有同位素標記的底物33P-SAMS，最后加入閃爍液通過液體閃爍計數(shù)儀計數(shù)來定量該酶活性。通過觀察不同化合物對其活性的激活情況，以初步評價化合物的活性。
比較測活體系中存在和不存在化合物樣品時，AMPK-α1(aa 1-394)的活性，判斷樣品是否具有激活活性；如果有，測定不同樣品濃度下AMPK-α1(aa 1-394)活性，計算樣品的EC50，即半最大激活效應(yīng)濃度(half maximum concentration 50％)。
AMPK-α1(1-394)激活測試方法HsAMPK-α1(aa 1-394)經(jīng)上游激酶CaMKKβ預磷酸化4小時后，按1∶4的體積比加入到含底物的測活反應(yīng)液(20mM Tris-HCl，pH7.5，1mM DTT，5mM MgCl2，50μM[γ-33P]-ATP(0.4 μCi/assay)，50μMSAMS)中，總測活體系為50μl，于30℃孵育10min。反應(yīng)經(jīng)1％H3PO4終止后，通過Harvester將蛋白反應(yīng)液吸附于P30濾紙上，經(jīng)0.1％H3PO4洗三次，烘干，加入閃爍液后封膜，置96孔微板閃爍計數(shù)儀計數(shù)。
將35.5μL反應(yīng)混合物(含20mM Tris-HCl，pH7.5，1mM DTT，5mM MgCl2，50μM[γ-33P]-ATP(0.4 μCi/assay)，50μM SAMS)分別加入到各含有2μL實施例6、18～21中的化合物5f、5r～5u的待檢測的樣品板中，最后由12.5μL已充分磷酸化的HsAMPK-α1(aa 1-394)(100nM)的加入而啟動反應(yīng)，測活溫度為30℃。在10min后終止反應(yīng)，吸樣，洗膜，烘干，封膜后計數(shù)。樣品的激活率通過下列公式求得樣品的激活率％＝[(化合物CPM值-空白對照)-(陰性對照-空白對照)]/(陰性對照-空白對照)×100。
上述測活體系所得反應(yīng)速度是該酶活性的反應(yīng)速度；把溶有上述化合物的DMSO(2μl)代替上述體系中的DMSO(2μl)，測得反應(yīng)速度為化合物作用下的反應(yīng)速度。
在30μM的初篩濃度下，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)上述實施例中的22種化合物顯示從3％-30％不等的激活率，選擇其中最具有代表性的5個化合物5f、5r、5s、5t、5u，測定不同樣品濃度下人源AMPK-α1(aa 1-394)活性，計算樣品的EC50，即半最大激活效應(yīng)濃度(half maximumconcentration 50％)。由此可以證明此類化合物能夠激活人源AMPK-α1(aa 1-394)的活性。
圖1為不添加本發(fā)明的化合物和分別添加本發(fā)明的化合物5f、5r、5s、5t、5u的情況下，對AMPK活性的測定。
圖2為不同濃度下本發(fā)明實施例中制備的化合物5r的催化活性。
在圖2中，(-)表明未加此化合物處理細胞，(+)表明加此化合物處理細胞；(pAMPK)表示AMPK催化亞基α上蘇氨酸(Thr)172的磷酸化水平；(AMPK)表示胞內(nèi)AMPK催化亞基α的表達水平；(pACC)表示胞內(nèi)AMPK底物ACC的磷酸化水平；(ACC)表示胞內(nèi)ACC的表達水平；(-Actin)表示用胞內(nèi)肌動蛋白來顯示胞內(nèi)總蛋白量。
實施例18中制備的化合物5r在L6細胞水平上具有明顯的增強胞內(nèi)AMPK磷酸化及其下游靶蛋白ACC的磷酸化水平的作用并呈現(xiàn)濃度依賴性，這表明該類化合物能在細胞水平上激活AMPK。
樣品測試結(jié)果


權(quán)利要求
1.具有如下式1結(jié)構(gòu)的化合物[式1] 其中X為NH、O或S；Y1為O或者S；Y2為NR5、O或者S，其中R5為H、苯基、 R1為H、苯基或 、芐基、或者取代或未取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基；其中R9、R10各自獨立地為H；F；Cl；三氟甲基；乙炔基、丙炔基；含有羧基、甲酸甲酯基、或甲酸乙酯基的C1-C4烷基；R2、R3、R4各自獨立地為H、F、Cl、吡咯基、吡啶基、噻唑基、噻吩基、芐基、苯基、或者 其中R6、R7、R8各自獨立地為H、F、Cl、三氟甲基、三氟甲氧基、硝基、胺基、苯甲酰胺基、C2-C6烷酰胺基、和C3-C6的環(huán)烷基取代的酰胺基、C1-C4烷基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物，其特征在于所述的未取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基為環(huán)丙烷基、環(huán)丁烷基、甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊烷基、環(huán)戊烷基、正己烷基、環(huán)己基；取代的C1-C10的烷基或環(huán)烷基的取代基包括一個或多個選自F、Cl、C1-C10的烷氧基、腈基、羧基、甲酸甲酯基、甲酸乙酯基或羥基的取代基團。
3.一種制備權(quán)利要求1所述的化合物的制備方法，該方法包括以下三個步驟 其中，各種基團的定義與權(quán)利要求1中的相同；步驟a.在0～5℃下，以四氫呋喃為溶劑，化合物1與四氫鋰鋁反應(yīng)將羧基還原為醇羥基，經(jīng)過常規(guī)后處理步驟，得到化合物2；步驟b.室溫下，以氯仿為溶劑用活性二氧化錳將化合物2的醇羥基氧化為醛基，經(jīng)過常規(guī)后處理步驟，得到化合物3；步驟c.以冰醋酸或無水乙醇為溶劑，并在醋酸鈉或哌啶作用下，80℃至120℃回流，將化合物3、4偶聯(lián)，經(jīng)過常規(guī)后處理步驟，得到最終的化合物5。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物在激活人源腺苷單核苷酸激活蛋白激酶中的應(yīng)用。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的化合物在制備治療代謝性疾病的藥物中的應(yīng)用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的應(yīng)用，其中所述的代謝性疾病為II型糖尿病、肥胖癥和腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用作人源腺苷單核苷酸激活蛋白激酶(AMPK)激活劑的小分子有機化合物。該類化合物可用于預防、延緩或治療由AMPK介導的病癥，特別是II型糖尿病、肥胖癥和腫瘤。本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法。另外本發(fā)明還涉及了該化合物在激活人源腺苷單核苷酸激活蛋白激酶中以及促進胞內(nèi)葡萄糖吸收的應(yīng)用和在制備治療代謝性疾病的藥物中的應(yīng)用。
文檔編號A61P3/00GK1978445SQ20051011111
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月2日
發(fā)明者南發(fā)俊, 李佳, 劉冰, 龐濤, 于麗芳, 李靜雅 申請人:中國科學院上海藥物研究所