專利名稱：格爾德霉素(c－3559)在制備皰疹病毒生殖道感染藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請是申請?zhí)枮?3134665.0申請日為2003年9月25日，發(fā)明創(chuàng)造名稱為格爾德霉素(C-3559)在制備治療尖銳濕疣、皰疹病毒生殖道感染藥物及制備抗脊髓灰質(zhì)炎病毒藥物中的應(yīng)用的專利申請的分案申請。
本發(fā)明涉及格爾德霉素(Geldanamycin，GA)在制備治療尖銳濕疣、皰疹病毒生殖道感染藥物及制備抗脊髓灰質(zhì)炎病毒藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
格爾德霉素是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所于湖北省武漢市珞珈山地區(qū)土壤中分離的格爾德霉素產(chǎn)生菌(放線菌C-3559)的發(fā)酵液中分離純化的具有廣譜抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次級代謝產(chǎn)物。
尖銳濕疣及皰疹病毒(主要為皰疹病毒2型)生殖道感染是全國及全球性傳播疾病，流行廣泛，反復(fù)發(fā)作，治療困難。2002年全國31個省疫情報告系統(tǒng)上報，除艾滋病外7種性傳播疾病為744 848例，報告發(fā)病率為58.15/10萬。其中尖銳濕疣占22.25％(165 748例)，為第三位；皰疹病毒生殖道感染占4.79％(35 679例)，為第五位，病例數(shù)較2001年有所上升。由于漏報，實際感染數(shù)字遠大于報告數(shù)字，有報道我國女性的尖銳濕疣感染高峰在20～29歲之間，感染率為1606.1/10萬，35歲以上婦女感染率逐漸下降。人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)屬乳多空病毒科，為無包膜的DNA病毒。尖銳濕疣是由人乳頭瘤病毒引起的最常見的性傳播疾病之一，人乳頭瘤病毒感染與宮頸癌有關(guān)，多種脊椎動物均有乳頭瘤病毒引起的感染。HPV體外培養(yǎng)困難，亦無合適的動物模型，故缺乏特異抗病毒藥物。尖銳濕疣治療方法較多，有化學(xué)治療及物理治療，前者有鬼臼樹脂、鬼臼毒素、三氯乙酸、干擾素等；后者有液氮冷凍、激光、手術(shù)切除等。但這些方法的治愈率僅為18.5％～40.1％，且復(fù)發(fā)率特高(22％～67％)。這些療法均為非特異療法，且有些藥物腐蝕性強，易損傷健康皮膚，臨床急需特異抗乳頭狀瘤病毒藥物。皰疹病毒生殖道感染雖有阿昔洛韋(ACV)等藥物，由于現(xiàn)有藥物易產(chǎn)生耐藥，使治療遷延，反復(fù)發(fā)作，患者痛苦不堪。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種格爾德霉素在制備治療尖銳濕疣，皰疹病毒生殖道感染及脊髓灰質(zhì)炎病毒感染藥物中的應(yīng)用。
格爾德霉素是由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所于湖北省武漢市珞珈山地區(qū)土壤中分離的格爾德霉素產(chǎn)生菌(放線菌C-3559)的發(fā)酵液中分離純化的具有廣譜抗病毒作用(包括DNA及RNA病毒)的次級代謝產(chǎn)物。
放線菌C-3559屬于鏈霉菌的吸水類群，黑漆鏈霉菌，S.atrolaccusYen 1957。其形態(tài)特征包括基絲不斷裂，只有氣絲形成孢子鏈，孢子絲呈緊密螺旋形，不形成菌核和分子孢子器，孢子表面光滑，培養(yǎng)特征包括孢子成熟后，孢子絲自溶使菌落表面形成黑色粘性濕斑(吸水現(xiàn)象)。

生理特征包括1.碳源利用在葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖、鼠李糖、麥芽糖和肌醇等碳源的培養(yǎng)基生長良好。2.其它生理特征纖維素不利用，牛奶胨化，硝酸鹽還原陰性。細胞壁化學(xué)特征包括含LL-DAP屬細胞壁I型，糖型C，不含特征性糖。
格爾德霉素的提取、分離方法1.發(fā)酵液過濾后濾液上X5大孔吸附樹脂柱，吸附完畢水沖后，用80％丙酮洗下有效部分，除去丙酮有黃色沉淀為格爾德霉素粗品。
2.上述格爾德霉素粗品，再用大孔吸附柱進行第二次層析，用80％丙酮洗下有效部分，純度在90％以上，放在冰箱中析出黃色針狀結(jié)晶，即為純度達95％以上的格爾德霉素。再進行二次重結(jié)晶，純度可達98％以上的格爾德霉素。提取回收率可達30％～35％。
對采用上述方法在放線菌C-3559的發(fā)酵液中提取分離的單一有效組分，即C-3559活性組份理化性質(zhì)的測定及鑒別對活性組份進行穩(wěn)定性、熔點、溶解度，元素分析，UV、IR、MS及1HNMR及18CNMR及DEPT譜等波譜的測定，并進行了文獻資料的檢索，發(fā)現(xiàn)它與苯安沙霉素類中的格爾德霉素相同。
將兩者的性質(zhì)列表比較于下表

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，我們推斷活性組分C-3559應(yīng)有與格爾德霉素相同的結(jié)構(gòu)。
格爾德霉素在制備治療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用。
格爾德霉素在制備治療皰疹病毒生殖道感染藥物中的應(yīng)用。
格爾德霉素在制備抗脊髓灰質(zhì)炎病毒藥物中的應(yīng)用。
格爾德霉素抗病毒作用機制與現(xiàn)有抗病毒藥物不同，抑制病毒DNA合成，不易產(chǎn)生耐藥，與阿昔洛韋無交叉耐藥。格爾德霉素抗皰疹病毒活性強，且有特點。
本發(fā)明對格爾德霉素做了對乳牛乳頭皮膚纖維瘤的治療作用、藥物體外抗病毒活性、藥物體內(nèi)抗皰疹病毒2型(HSV-2)陰道炎藥效檢測三個方面的實驗，實驗結(jié)果表明1.對格爾德霉素進行的藥物對乳牛乳頭皮膚纖維瘤的治療作用方面在格爾德霉素對犢牛股內(nèi)側(cè)皮膚的刺激作用實驗中，格爾德霉素濃度為0.5mg/ml及0.25mg/ml時，對犢牛股內(nèi)側(cè)皮膚無刺激作用。
在藥物格爾德霉素對乳牛乳頭皮膚纖維瘤治療實驗中，由于格爾德霉素有抑制病毒DNA復(fù)制作用，所以對牛乳頭皮膚纖維瘤呈現(xiàn)良好的治療效果，可使瘤體在一周內(nèi)發(fā)生萎縮、老化、體積變小；停藥后6周內(nèi)這些老化的瘤體仍可繼續(xù)老化，第4、5周分別有老化的瘤體脫落；同時未發(fā)現(xiàn)格爾德霉素對乳頭皮膚發(fā)生損害。
2.藥物體外抗病毒活性方面格爾德霉素在細胞培養(yǎng)內(nèi)有廣譜抗病毒作用，對多種DNA、RNA病毒都有在微摩爾水平的抗病毒活性，其中對單純皰疹病毒1型(HSV-1)的治療指數(shù)為3763，對單純皰疹病毒2型(HSV-2)的治療指數(shù)為230，對水皰性口炎病毒(VSV)的治療指數(shù)為833，對脊髓灰質(zhì)炎病毒1型(Polio-1)的治療指數(shù)為2820，對柯薩奇病毒(Cox B3)的治療指數(shù)為248，對SARS冠狀病毒的治療指數(shù)為88，對人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)的治療指數(shù)為1111。
在體外HSV-1格爾德霉素耐藥毒株的訓(xùn)練中，用細胞實驗法，將HSV-1在非洲綠猴腎細胞(VERO)內(nèi)及一定濃度格爾德霉素條件下連續(xù)傳41代，未見產(chǎn)生格爾德霉素的耐藥毒株，HSV-1格爾德霉素耐藥訓(xùn)練第15代與野株具有相同的阿昔洛韋敏感性。對細胞無毒濃度格爾德霉素可特異抑制HSV-1DNA合成。
3.格爾德霉素在小鼠體內(nèi)抗皰疹病毒2型(HSV-2)陰道炎藥效檢測方面格爾德霉素在HSV-2陰道感染模型內(nèi)，可有效抑制HSV-2的復(fù)制。皰疹病毒原液感染時，格爾德霉素可延長HSV-2感染小白鼠的平均生活日；1/30稀釋的皰疹病毒液感染時，可顯著降低小白鼠的死亡率，延長感染小白鼠的平均生活日，并降低小白鼠陰道內(nèi)HSV-2排出量，與對照相比，差別顯著，效果優(yōu)于相同劑量的無環(huán)鳥苷(ACV)；并且通過對小白鼠體重的觀察，表明格爾德霉素所有劑量組對小白鼠體重增長無影響。
下面是針對本發(fā)明格爾德霉的有關(guān)實驗。
(1)針對本發(fā)明格爾德霉素進行的藥物對乳牛乳頭皮膚纖維瘤的治療作用上已述及人乳頭瘤病毒體外培養(yǎng)困難，亦無合適的動物模型，只能采用同類病毒牛乳頭瘤病毒引起的乳牛乳頭皮膚纖維瘤作為模型評價格爾德霉素治療乳頭瘤病毒感染療效。
觀察藥物格爾德霉素(C-3559)對犢牛股內(nèi)側(cè)皮膚的刺激作用一.動物北京黑白花乳牛6日齡公犢1頭，牛號97026。
二.藥品C-3559藥液，由醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所研制提供。檢測單位中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院。
三.實驗方法選臨床健康的北京黑白花公犢牛1頭。于右后肢股內(nèi)側(cè)皮膚上選取3×3cm2面積兩塊，在每塊皮膚上每日兩次分別涂以濃度分別為0.5mg/ml和0.25mg/ml的C-3559藥液；左后肢相應(yīng)部位選取同樣大小的皮膚面積，每日兩次涂以C-3559的溶劑(不含藥液的10％吐溫80)，作為對照。實驗連續(xù)進行7天。
四.觀察項目自實驗開始前3天，每天兩次(上午8:00，下午3:00)測量受試牛體溫，觀察用藥部位皮膚有無紅、腫、熱、痛及機能障礙;有無起皰、破潰、壞死、結(jié)痂等病變，逐項做好記錄。以確定C-3559藥液對犢牛皮膚的生物學(xué)作用。
五.實驗結(jié)果1.皮膚顏色及變化通過7天實驗，不論左后肢股內(nèi)側(cè)對照皮膚還是右后肢相應(yīng)部位的皮膚均未發(fā)生顏色變化，也未發(fā)生起皰、潰瘍等，與未涂藥部位皮膚無區(qū)別。
2.在實驗期內(nèi)，犢牛采食，飲水及精神狀態(tài)正常，體溫波動于38.8-39.5℃之間(正常體溫為38.0-39.5℃)。
六.小結(jié)1.連續(xù)7天在犢牛股內(nèi)側(cè)皮膚涂抹0.5mg/ml及0.25mg/ml的C-3559藥液，未見皮膚發(fā)生任何病變，說明該藥物濃度對犢牛股內(nèi)側(cè)皮膚無刺激作用。
2.在實驗期內(nèi)，受試犢牛采食、飲水、體溫、呼吸及精神狀態(tài)均正常。
藥物格爾德霉素(C-3559)對乳牛乳頭皮膚纖維瘤治療實驗一.動物將臨床患病牛隨機分為2組，每組6頭，其中一組作為實驗組，另一組作為對照組。
二.藥品C-3559藥液及其溶劑(10％吐溫80)，由醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所研制，提供濃度為0.5mg/ml，溶劑為配制C-3559藥液的溶劑，不含藥物成分。
三.實驗方法將牛群中自然發(fā)病的乳牛從原有班組調(diào)出，集中飼養(yǎng)，使實驗組與對照組條件一致，即飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方式、飼草、飼料的數(shù)量與質(zhì)量基本一致。兩組奶牛由同一飼養(yǎng)員、擠奶員負責(zé)管理，實行手工擠奶、乳牛每日上槽三次，在上槽采食的同時進行擠奶，每次擠奶之后立即將藥物和溶劑分別涂抹于實驗牛和對照牛乳頭皮膚的腫瘤上，為安全起見所擠牛奶全部廢棄，實驗連續(xù)進行7天。
四.觀察與記錄在實驗開始前3天，每日兩次測量兩組牛體溫，直至實驗結(jié)束。逐日統(tǒng)計受試牛及實驗牛病變情況——腫瘤發(fā)生的部位、瘤體大小(用卡尺測量)。性狀、顏色，有無脫落跡象等。作好記錄。
五.實驗結(jié)果表1 C-3559治療乳牛乳頭纖維瘤的效果 *指腫瘤基部直徑。
實驗表明，C-3559藥液有控制乳頭纖維瘤生長的作用，能夠促使瘤體老化，面積縮小。在歷時7天的實驗中，處于生長階段的纖維瘤不但沒有增大，平均直徑反而縮小了12.5％，顏色由原來的皮膚色變?yōu)樽厣?，說明發(fā)生了老化。對照組瘤體顏色無變化，平均直徑增加了4.1％，說明瘤體處于生長階段，未發(fā)生老化。
為了確定C-3559藥液對奶牛乳頭皮膚纖維瘤的遠期療效，在前期(實驗開始后7天內(nèi))觀察的基礎(chǔ)上，我們對實驗組和對照組牛只進行了連續(xù)6周的觀察，方法是每周對腫瘤的大小進行測量，對顏色及脫落與否等情況進行記錄，結(jié)果如下實驗組的93084號(實驗前瘤體已為棕黑色)、92002號兩頭奶牛的瘤體分別于第4周和第5周脫落，其它4頭奶牛的瘤體雖未脫落，但直徑總和由原來的14.6mm減少到12.7mm，減少12.3％，其中93070號奶牛的瘤體由原來的3.1mm縮小到2.4mm，顏色由原來的棕色變?yōu)樽睾谏?。對照組中除93046號奶牛的瘤體(實驗前已為棕黑色)于第5周脫落外，其它5頭奶牛的瘤體顏色均未發(fā)生改變，仍為皮膚色，而且瘤體直徑的總和由原來的20.8mm增加到26.4mm，其中93073號奶牛的瘤體直徑仍為6.3mm外，其它4頭的瘤體均有不同程度的增大，說明這些瘤體仍處于生長階段。
以上結(jié)果說明，C-3559藥液除在連續(xù)用藥期能使瘤體發(fā)生老化外；停藥后6周這些老化的瘤體仍可繼續(xù)老化(直徑縮小)，除了實驗組(93084號)和對照組(93046號)各一頭乳牛在實驗前已發(fā)生老化的瘤體(棕黑色)脫落外，實驗組另一頭乳牛(92002號)的瘤體也發(fā)生脫落，而對照組其它乳牛的瘤體不但未老化，仍在繼續(xù)生長(直徑變大)。
六.討論牛皮膚纖維乳頭狀瘤病(Fibropapillomatosis)又名疣(Warts)是由牛乳頭狀瘤病毒(Bovine papilloma Virus)引起的一種良性瘤。病毒的基因組為雙股環(huán)狀DNA。該病為乳牛的常見病、多發(fā)病，個別牛群的發(fā)病率可達30％以上。生長于乳頭皮膚的瘤體，尤其呈指狀生長者，其長度往往可達1.5-2cm，擠奶時奶牛不適，甚至疼痛。瘤體在遭受繼發(fā)感染的情況下，可發(fā)生潰瘍。該病有瘤體發(fā)生、生長、老化、脫落等自然階段，這一過程往往需要10個月或更長的時間。
七.小結(jié)由于C-3559藥液有抑制病毒DNA復(fù)制作用，所以對牛乳頭皮膚纖維瘤呈現(xiàn)良好的治療效果，可使瘤體在一周內(nèi)發(fā)生萎縮，老化，體積變小。停藥后6周這些老化的瘤體仍可繼續(xù)老化(直徑縮小)，除了實驗組(93084號)和對照組(93046號)各一頭乳牛在實驗前已發(fā)生老化的瘤體(棕黑色)脫落外，實驗組另一頭乳牛(92002號)的瘤體也發(fā)生脫落，而對照組其它乳牛的瘤體不但未老化，仍在繼續(xù)生長(直徑變大)。
實驗中未發(fā)現(xiàn)該種藥物對乳頭皮膚發(fā)生損害。
(2)針對本發(fā)明格爾德霉素進行的藥物體外抗病毒活性。
一.格爾德霉素的抗病毒譜 研究C-3559在細胞內(nèi)對單純皰疹病毒1型(HSV-1)、單純皰疹病毒2型(HSV-2)、人免疫缺陷病毒1型、水皰性口炎病毒(VSV)、柯薩奇病毒(Cox B3)、脊髓灰質(zhì)炎病毒1型Polio-1、SARS冠狀病毒SARS-coronavirus、流感病毒甲型Influenza A及流感病毒乙型Influenza B的抑制作用。
材料(1)病毒株單純皰疹病毒1型(HSV-1)SM44株、單純皰疹病毒2型(HSV-2)333株、人免疫缺陷病毒1型(HIV-1)IIIB株、水皰性口炎病毒(VSV)、柯薩奇病毒(Cox B3)、流感甲型病毒A/粵防/243/72株、流感病毒乙型濟防97-13株均為本室保存毒株；脊髓灰質(zhì)炎病毒1型Polio-1購自中國生物制品檢定所；冠狀病毒SARS-coronavirus為非典期間北京分離的流行株。
(2)細胞非洲綠猴腎細胞(Vero)，狗腎傳代細胞(MDCK)，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所保存；非洲綠猴腎細胞(Vero-E6)由軍科院五所惠贈。
方法(1)毒種制備①取出低溫凍存的試驗病毒毒種，用細胞維持液作10倍稀釋，然后接種于已經(jīng)長滿單層細胞瓶內(nèi)，置37℃溫箱中培養(yǎng)，逐日觀察病變，待3/4細胞出現(xiàn)病變時，收獲病毒，-20℃凍存。
②將細胞反復(fù)凍融三次，釋放病毒。然后離心(3000rpm，10min)去除細胞碎片，上清液即為所需的病毒懸液。分裝，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?br> (2)細胞傳代在長滿細胞的培養(yǎng)瓶內(nèi)加0.25％胰酶0.2ml，0.02％EDTA5ml，37℃消化20-25分鐘，吸出消化液，加培養(yǎng)液吹打，1∶3傳代，置37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
(3)C-3559對病毒的抑制實驗每毫升20-30萬個細胞接種96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.1ml，37℃5％CO2培養(yǎng)24小時，棄培養(yǎng)液，加入100TCID50的病毒37℃5％CO2吸附1小時，棄去病毒液后加入C-3559連續(xù)2倍稀釋液，同時設(shè)細胞對照，病毒對照，陽性藥對照。將培養(yǎng)板置于37℃5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待病毒對照組細胞病變達4時(約32小時)，觀察細胞病變，完全破壞為4；75％為3；50％為2；25％為1；無病變?yōu)?。按Reed and Muench法計算IC50。
結(jié)果表2 格爾德霉素在細胞內(nèi)抗病毒的IC50*值

IC50*抑制50％細胞病變的藥物劑量TD50#引起50％細胞毒性的藥物劑量二.體外HSV-1格爾德霉素耐藥毒株的訓(xùn)練方法及結(jié)果同上述細胞實驗法，將HSV-1在VERO細胞內(nèi)及一定濃度GA條件下連續(xù)傳41代，未見產(chǎn)生GA的耐藥毒株(表3)。
表3 訓(xùn)練HSV-1格爾德霉素耐藥毒株情況

HSV-1GA耐藥訓(xùn)練第15代與野株具有相同的阿昔洛韋敏感性。
三.格爾德霉素對HSV-1DNA的抑制作用(Southern blot檢測病毒DNA復(fù)制)方法Vero單層細胞用HSV-1(1噬斑單位/細胞)感染，吸附1h后用冰冷的PBS洗去未吸附的病毒，加入含4μM格爾德霉素(GA)或不含GA的培養(yǎng)基，置37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時設(shè)細胞對照組和溶劑1％二甲基亞砜的感染對照組。在感染后12h收集細胞，將藥物處理后的細胞約2×107個，用PBS洗兩次，加入500μl細胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，5mM EDTA，1％SDS，500μg/ml蛋白酶K)56℃消化2小時，加入500μl酚抽提一次，水相用酚∶氯仿∶異戊醇(50∶48∶2)抽提一次，水相置于新的離心管，加入50μl 3M NaAc(pH 5.2)和1ml預(yù)冷無水乙醇，-20℃沉淀2小時，4℃10000g離心20分鐘，預(yù)冷70％乙醇洗一次，離心去上清，風(fēng)干，溶于100μl TE中。每管加入終濃度為100μg/ml無DNA酶的RNA酶，37℃水浴20分鐘，取10μgDNA與1/6體積6×上樣緩沖液混勻，在1.0％瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后，將其轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上，80℃干烤1小時后，在68℃預(yù)雜交液(5×SSC，0.1％SDS，5×Denhardt’液，100μg/ml變性鮭魚精DNA，and 50％甲酰胺)中預(yù)雜交4hrs，然后在含有5×107cpm32P脫氧胞嘧啶核苷三磷酸標(biāo)記的HSV-1胸腺嘧啶核苷激酶(tk)DNA的預(yù)雜交液中42℃雜交24hrs。雜交完畢，硝酸纖維素膜用洗膜液(0.1×SSC，0.1％SDS)室溫洗三次，65℃洗兩次，夾上X光片后-20℃放射自顯影。按常規(guī)方法顯影、定影，最后分析條帶。結(jié)果見圖l為1細胞對照，2HSV-1感染對照，3DMSO對照，4GA 4μM；

圖1說明經(jīng)4μM GA處理的感染細胞與細胞對照一樣，無病毒DNA條帶。
(3)針對本發(fā)明格爾德霉素進行的藥物體內(nèi)抗皰疹病毒2型(HSV-2)陰道炎藥效檢測報告。
一.目的研究C-3559體內(nèi)對小白鼠HSV-2陰道炎的治療作用觀察小白鼠的平均生活日和死亡率，并進行病毒分離。
二.動物昆明鼠雌性，13-15g，購自中國生物制品檢定所為中國藥品生物制品檢定嚙齒類動物養(yǎng)殖中心提供的二級動物(有健康證書)，隨機分組。
三.病毒皰疹病毒2型(HSV-2)SAV株，本室傳代保存，用病毒原液或1/30病毒原液感染。
四.藥物C-3559由本所化學(xué)室提供，純度大于95％，用少許0.1％吐溫-80 200μl解后加到乳缽中，邊研磨邊加溶劑，配成4mg/ml，2mg/ml，1mg/ml，0.5mg/ml的懸液，4℃保存。
五.方法1.分組將體重為13-15g的雌性昆明鼠隨機分為C-35595.72mg/kg、2.86mg/kg、1.43mg/kg、0.5mg/ml組及陽性藥ACV2.86mg/kg對照組，溶劑(0.1％吐溫-80)對照組，病毒對照組，每組10只小白鼠，以上為感染組；以C-35595.72mf/kg、2.86mg/g、1.43mg/kg、0.72mg/ml組及陽性藥ACV2.86mg/kg對照組，溶劑對照組，正常對照組，每組6只，為非感染組，觀察藥物對小白鼠的毒性。
2.給藥方式用微量移液器向小白鼠陰道內(nèi)注入每濃度20μl藥物，病毒對照組和正常對照組均注入生理鹽水，每日三次。
3.感染方式用微量加樣器向感染組小白鼠陰道內(nèi)注入20μl 1/30稀釋的病毒液或病毒原液，非感染組注入20μl生理鹽水進行相同的處理，然后開始給藥。
4.觀察指標(biāo)觀察死亡率、平均生活日，每日觀察，記錄死亡，共2周，計算死亡率及平均生活日。
5.病毒分離實驗方法將體重為13-15g的雌性昆明鼠隨機分為C-35595.72mg/kg、2.86mg/kg、1.43mg/kg組及陽性藥ACV 2.86mg/kg對照組，溶劑對照組，病毒對照組，每組6只小白鼠，用微量加樣器向小白鼠陰道內(nèi)注入20μl 1/30稀釋的病毒液感染，于感染后即刻給藥，每日三次，在感染后48及96小時，將用培養(yǎng)液潤濕的棉簽插入小白鼠陰道內(nèi)拭擦，然后將棉拭放入盛有1ml培養(yǎng)液的小試管中，擠出棉拭中的液體即為標(biāo)本，在長滿單層Vero細胞的96孔培養(yǎng)板上進行TCID50滴定。
六.結(jié)果HSV-2的感染導(dǎo)致小白鼠在感染后大約第三天可見發(fā)病即陰道紅腫并有分泌液流出，后期也有后肢癱瘓，在第5、6天開始死亡。
第一批實驗用病毒原液感染，2.86mg/ml組和ACV組可顯著增加小白鼠的平均生活日(P＜0.05)，結(jié)果見表4。C-3559的三個劑量組對小白鼠體重的增加與正常對照組相比無明顯差異，結(jié)果見表3。
第二批實驗用1/30的病毒液感染，各劑量組和ACV組均能顯著延長感染小白鼠的平均生活日，并能顯著提高感染組小白鼠的存活率(P＜0.01)。結(jié)果見表5。給藥組小白鼠體重的增加與正常對照組小白鼠體重的增加無統(tǒng)計學(xué)上的差異(P＞0.05)，且1mg/ml劑量組小白鼠體重增加比正常對照組小白鼠多，二者之間有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。結(jié)果見表6及表7。
HSV-2感染后48及96小時，分離小白鼠陰道病毒，滴定TCID50的結(jié)果見表8及表9，結(jié)果表明C-3559三個劑量組均可有效降低小白鼠陰道內(nèi)HSV-2排出量，與對照組相比有顯著差別。
表4 C-3559對HSV-2陰道感染的療效(病毒原液感染)

*P＜0.05表5 C-3559對HSV-2陰道感染的療效(1∶30病毒液感染)

*P＜0.05，**P＜0.001表6.非感染組小鼠0day，7days，14days體重結(jié)果(第一批試驗)

注7天，14天所有給藥組與正常對照組體重相比均無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義。
表7.非感染組小鼠0day，7days，14days體重結(jié)果(第三批實驗)

注7天，14天所有C-3559高、中給藥組和ACV給藥組與正常對照組體重相比均無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義，而C-3559 1mg/ml組比正常對照組體重增加得多，二者差異顯著(7days P＜0.05，14days P＜0.01)。
表 8HSV-2SAV株感染小白鼠48hrs后陰道分離病毒結(jié)果


表9 HSV-2 SAV株感染小白鼠96hrs后陰道分離病毒結(jié)果

結(jié)論C-3559在HSV-2陰道感染模型內(nèi)，可有效抑制HSV-2的復(fù)制。病毒原液感染時，延長HSV-2感染小白鼠的平均生活日，有統(tǒng)計意義；1/30稀釋的病毒液感染時，可顯著降低小白鼠的死亡率，延長感染小白鼠的平均生活日，有統(tǒng)計意義，并降低小白鼠陰道內(nèi)HSV-2排出量，感染后48小時5.72mg/kg，2.86mg/kg及1.43mg/kg組與對照組相比病毒排出量分別降低794，158及100倍；感染后96小時5.72mg/kg，2.86mg/kg及1.43mg/kg與對照相比病毒排出量分別降低631，100及100倍，效果優(yōu)于相同劑量的ACV。通過對小白鼠體重的觀察，表明C-3559所有劑量組對小白鼠體重增長無影響。
權(quán)利要求
1.格爾德霉素在制備治療皰疹病毒生殖道感染藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
格爾德霉素在制備治療尖銳濕疣藥物中的應(yīng)用。格爾德霉素對健康犢牛股內(nèi)側(cè)皮膚無刺激作用。格爾德霉素有抑制牛乳頭狀瘤病毒DNA復(fù)制作用，可使瘤體發(fā)生萎縮，老化，體積變??；格爾德霉素在制備治療皰疹病毒生殖道感染藥物中的應(yīng)用。C－3559在細胞培養(yǎng)內(nèi)有廣譜抗病毒作用，對多種DNA及RNA病毒都有在微摩爾水平的抗病毒活性。經(jīng)體外傳41代，未分離出HSV－1對格爾德霉素的耐藥毒株。HSV－1 GA耐藥訓(xùn)練第15代與野株具有相同的阿昔洛韋敏感性。對細胞無毒濃度格爾德霉素可特異抑制HSV－1 DNA合成。在小白鼠皰疹病毒2型陰道感染模型內(nèi)，可有效抑制皰疹病毒2型的復(fù)制，顯著降低病毒排出量，降低小白鼠的死亡率，延長感染小白鼠的平均生活日，效果優(yōu)于相同劑量的阿昔洛韋；所有劑量組對小白鼠體重增長無影響。
文檔編號A61P31/00GK1788724SQ20051011278
公開日2006年6月21日 申請日期2003年9月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月25日
發(fā)明者陶佩珍, 李玉環(huán), 婁志賢, 姚天爵 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所