專利名稱：癌癥調(diào)節(jié)抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)的分離和生產(chǎn)，以及CDMAB在治療和診斷過(guò)程中的應(yīng)用，可選擇的與一種或多種化學(xué)療劑聯(lián)合使用。本發(fā)明還涉及利用本發(fā)明的CDMAB進(jìn)行的結(jié)合測(cè)定(binding assays)。
本發(fā)明特別涉及癌癥的診斷和治療，利用5LAC-23單克隆抗體(或從中衍生的抗原性結(jié)合片斷)與層粘連蛋白受體1前體蛋白37LRP的結(jié)合能力；尤其涉及肝細(xì)胞癌的診斷和治療，通過(guò)各種依賴于5LAC-23和特定抗原殘基直接結(jié)合的方法，所述抗原殘基由5LAC-23特異性識(shí)別并通常在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。
背景技術(shù)：
每一患有癌癥的個(gè)體都是獨(dú)特的，跟其身份一樣，每個(gè)人所患的癌癥都不同于其它癌癥。盡管如此，現(xiàn)有療法都是在同樣的時(shí)期、以同樣的方式來(lái)治療患有同種癌癥的患者。至少30％的患者的一線治療是失敗的，從而增加了額外的療程以及治療失敗、病毒轉(zhuǎn)移和最終死亡的可能性。治療的優(yōu)選方法將是針對(duì)特定個(gè)體的個(gè)性化治療。目前唯一的個(gè)性化治療方法是手術(shù)?；瘜W(xué)治療和放射治療無(wú)法針對(duì)患者具體情況，而在大多數(shù)情況下單靠手術(shù)不足以治愈癌癥。
隨著單克隆抗體的出現(xiàn)，開(kāi)發(fā)個(gè)性化治療方法的可能性變得更加現(xiàn)實(shí)，因?yàn)槊總€(gè)抗體能夠針對(duì)單一的抗原表位。而且，也可以生產(chǎn)針對(duì)多個(gè)相關(guān)抗原表位的組合抗體，所述多個(gè)相關(guān)抗原表位唯一確定了某一特定個(gè)體的腫瘤。
已經(jīng)認(rèn)識(shí)到癌細(xì)胞和正常細(xì)胞之間的顯著差別是癌細(xì)胞含有對(duì)變異細(xì)胞來(lái)說(shuō)具有特異性的抗原，科技界長(zhǎng)期認(rèn)為通過(guò)與癌抗原特異性結(jié)合，單克隆抗體能夠被設(shè)計(jì)來(lái)特異靶向變異細(xì)胞；因此產(chǎn)生了這樣的觀點(diǎn)單克隆抗體能夠作為“神奇子彈(Magic Bullets)”來(lái)消滅癌細(xì)胞。然而，現(xiàn)在普遍認(rèn)為沒(méi)有一個(gè)單克隆抗體能夠用于所有的癌癥，單克隆抗體可以作為一類被開(kāi)發(fā)為目標(biāo)癌癥的療法。
依照本發(fā)明方法分離的單克隆抗體已經(jīng)顯示出通過(guò)對(duì)患者有益的方式(如通過(guò)降低腫瘤負(fù)荷)來(lái)調(diào)節(jié)癌癥過(guò)程，在本文將被稱為癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)或“抗癌”抗體。
目前，癌癥的治療手段很少。已有的癌癥治療方法已經(jīng)對(duì)全球的癌癥存活率有所改善。然而，對(duì)于特定個(gè)體而言，這些改善的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)與他們的個(gè)人狀況不是必然相關(guān)的。
因此，如果有一種方法學(xué)能夠使醫(yī)師單獨(dú)處理同類腫瘤患者的每個(gè)腫瘤，將使每個(gè)患者可以用適合自己的獨(dú)特方法進(jìn)行治療。理論上，這種治療過(guò)程將提高治愈率，產(chǎn)生更好的結(jié)果，從而滿足人們長(zhǎng)期感受到的需要。
過(guò)去，多克隆抗體已經(jīng)被應(yīng)用于人類癌癥的治療，但只取得了有限的成功。已經(jīng)用人血漿來(lái)治療淋巴瘤和白血病，但是很少獲得持久的改善或應(yīng)答。而且，缺乏重現(xiàn)性，也沒(méi)有比化療多出額外的優(yōu)點(diǎn)。實(shí)體瘤(如乳癌、黑素瘤和腎細(xì)胞癌)也已經(jīng)采用人血液、猩猩血清、人血清和馬血清來(lái)治療，但是相應(yīng)的結(jié)果是不確定的和無(wú)效的。
有很多用單克隆抗體治療實(shí)體瘤的臨床實(shí)驗(yàn)。在20世紀(jì)80年代，對(duì)人乳腺癌進(jìn)行了至少4次利用抗體針對(duì)特異抗原或基于組織選擇性的臨床實(shí)驗(yàn)，在至少47例患者中只產(chǎn)生了1例應(yīng)答者。直至1998年，才有1次成功的臨床實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)聯(lián)合使用了人源化的抗Her2/neu抗體(HERCEPTIN)和順鉑(CISPLATIN)。在這次實(shí)驗(yàn)中，評(píng)價(jià)了37例患者的反應(yīng)，其中約1/4患者具有部分緩解率(partial responserate)，還有1/4患者疾病進(jìn)展輕微或穩(wěn)定。應(yīng)答者中的中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間(median time to progression)為8.4個(gè)月，中位緩解期(medianresponse duration)為5.3個(gè)月。
HERCEPTIN于1998年被批準(zhǔn)一線用藥，與Taxol結(jié)合使用。臨床研究結(jié)果顯示了中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間的增加，接受抗體治療+Taxol的患者(6.9個(gè)月)與只接受了Taxol治療的患者(3.0個(gè)月)相比較。中位存活時(shí)間也有所增加，HERCEPTIN+Taxol治療方式為22個(gè)月，Taxol單獨(dú)治療為18個(gè)月。另外，抗體+Taxol聯(lián)合治療組與Taxol單獨(dú)治療組相比，完全應(yīng)答者(8％2％)和部分應(yīng)答者(34％15％)的數(shù)目都有所增加。但是，采用抗體+Taxol治療相比于Taxol單獨(dú)治療，導(dǎo)致了較高的心臟毒發(fā)病率(13％1％)。在臨床實(shí)驗(yàn)中，Her2/neu的表達(dá)水平(通過(guò)免疫組織化學(xué)方法測(cè)定)預(yù)示了對(duì)HERCEPTIN治療的響應(yīng)。在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，只有那些過(guò)量表達(dá)Her2/neu的患者(在病理評(píng)分級(jí)指示為2-3+)從抗體治療中獲益。大約25％的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者過(guò)量表達(dá)Her2/neu而能夠用HERCEPTIN治療；那些沒(méi)有過(guò)量表達(dá)的患者將不會(huì)獲益，不能用抗體治療。對(duì)HERCEPTIN治療的選擇代表了一種選擇患者的方法，所選患者適合于以疾病分子標(biāo)志識(shí)別為基礎(chǔ)的治療，該方法作為診斷測(cè)驗(yàn)已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)。但是，還遠(yuǎn)未滿足乳腺癌患者的需求。甚至是那些能夠從HERCEPTIN治療獲益的患者，依然需要化療并因此依然不得不面對(duì)(至少在某種程度上)這種療法的副反應(yīng)。
研究結(jié)腸直腸癌的臨床實(shí)驗(yàn)涉及同時(shí)抗糖蛋白和糖脂類靶的抗體。對(duì)腺癌有一定特異性的抗體，如17-1A，已經(jīng)進(jìn)行了超過(guò)60例患者的2期臨床實(shí)驗(yàn)，其中僅有1例患者有部分反應(yīng)。在其他應(yīng)用17-1A的實(shí)驗(yàn)中，使用了附加的環(huán)磷酰胺，52例受試患者中僅有1例完全反應(yīng)和2例輕微反應(yīng)。其它涉及17-1A的實(shí)驗(yàn)得到了類似的結(jié)果。目前為止，17-1A的3期臨床實(shí)驗(yàn)沒(méi)有證明其作為輔助療法對(duì)III期結(jié)腸癌的改善效能。使用首次批準(zhǔn)用于影像的人源化鼠單克隆抗體也沒(méi)有產(chǎn)生腫瘤消退。
只有近期，在應(yīng)用單克隆抗體的結(jié)腸癌臨床研究中得到了一些正面的結(jié)果。2004年，ERBITUX被批準(zhǔn)用于表達(dá)EGFR的轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者的二線治療，這些患者對(duì)基于依立替康(irinotecan)的化療是耐受的。雙臂II期臨床研究和單臂研究的結(jié)果表明，ERBITUX與依立替康結(jié)合使用的緩解率分別為23％和15％，中位腫瘤進(jìn)展時(shí)間分別為4.1個(gè)月和6.5個(gè)月。同樣的雙臂II期臨床研究和另外一個(gè)單臂研究表明，ERBITUX單獨(dú)治療的緩解率分別為11％和9％，中位緩總瘤進(jìn)展時(shí)間分別為1.5個(gè)月和4.2個(gè)月。
因此，ERBITUX與依立替康結(jié)合治療在瑞士和美國(guó)，以及ERBITUX單獨(dú)治療在美國(guó)，都已經(jīng)被批準(zhǔn)作為那些在依立替康一線治療中失敗的結(jié)腸癌患者的二線治療。因此，與HERCEPTIN一樣，ERBITUX治療在瑞士只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的聯(lián)合使用。另外，在瑞士和美國(guó)，ERBITUX治療都是被批準(zhǔn)用于患者的二線療法。在2004年，AVASTIN(阿瓦斯汀)也被批準(zhǔn)與靜注為基礎(chǔ)的化療結(jié)合使用，作為轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌的一線治療。III期臨床研究結(jié)果表明了患者中位存活時(shí)間的延長(zhǎng)，AVASTIN+5-氟尿嘧啶治療與5-氟尿嘧啶單獨(dú)治療相比較(分別為20個(gè)月和16個(gè)月)。然而，還是與HERCEPTIN和ERBITUX一樣，AVASTIN治療只被批準(zhǔn)作為單克隆抗體和化療的結(jié)合使用。另外，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了基于HERCEPTIN和ERBITUX抗原性靶的診斷檢測(cè)，用于基于免疫組織化學(xué)平臺(tái)的癌癥診斷。
同樣，對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌和胃癌，存在同樣差的結(jié)果。使用抗GD3單克隆抗體治療黑素瘤獲得了某種有限的成功。因此，可以看到盡管作為人類臨床實(shí)驗(yàn)前的小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)取得了成功，但是迄今為止，試驗(yàn)過(guò)的抗體絕大部分是沒(méi)有作用的。
對(duì)于肺癌、腦癌、卵巢癌、胰腺癌前列腺癌、胃癌和肝細(xì)胞癌的較差結(jié)果依然繼續(xù)著。在II期臨床實(shí)驗(yàn)中，得到了近期對(duì)于非小細(xì)胞癌最有希望的結(jié)果，其中治療涉及了與細(xì)胞殺傷藥物阿霉素交聯(lián)的單克隆抗體(SGN-15；doxBR96，抗Sialyl-LeX)，與化學(xué)療劑TAXOTERE結(jié)合使用。TAXOTERE是唯一經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于肺癌二線治療的化學(xué)療劑。最初數(shù)據(jù)表明比單獨(dú)使用TAXOTERE具有提高的總存活。該研究的62例受試患者中，三分之二接受了SGN-15和TAXOTERE結(jié)合應(yīng)用，而留下三分之一接受單獨(dú)的TAXOTERE。接受SGN-15和TAXOTERE結(jié)合應(yīng)用的患者的中位總存活時(shí)間為7.3個(gè)月，而接受單獨(dú)TAXOTERE的患者為5.9個(gè)月。對(duì)于接受SGN-15+TAXOTERE的患者在1年和18個(gè)月時(shí)的總存活分別為29％和18％，相比較的接受單獨(dú)TAXOTERE的患者分別為24％和8％。為該藥計(jì)劃了進(jìn)一步的臨床實(shí)驗(yàn)。盡管SGN-15還沒(méi)有獲準(zhǔn)上市，但自2000年以來(lái)，已經(jīng)有幾個(gè)其他的用于癌癥的抗體復(fù)合物獲得FDA的批準(zhǔn)。這些抗體包括用于治療復(fù)發(fā)的急性髓細(xì)胞樣白血病的MYLOTARG(吉姆單抗奧佐米星(gemtuzumab ozogamicin)，一種人源化抗CD33單克隆抗體)，用于治療非何杰金淋巴瘤的ZEVALIN(替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)，Yttrium偶聯(lián)立妥昔單抗(RITUXEVIAB)，人源化抗CD20單克隆抗體)，這些抗體被開(kāi)發(fā)成抵抗癌癥的特異性分子，使它們適于結(jié)合毒素或放射同位素。顯然，目前只有血原性疾病得到了偶聯(lián)抗體的成功治療，而實(shí)體瘤(例如肝細(xì)胞癌)更需要這樣的治療。
腫瘤侵入和轉(zhuǎn)移的特征是一系列涉及癌細(xì)胞和宿主細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)程?；な菍ｉT(mén)的細(xì)胞外機(jī)構(gòu)，在組織位于它上面的細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移包括細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)之間的相互作用。層粘連蛋白是基膜的主要成分，促進(jìn)細(xì)胞附著、增殖、生長(zhǎng)、分化和遷移(Kleinman HK等人J Cell Biochem 1985，217317-25.Martin G等人，Annual Rev Cell Biol 1987，357-85.BeckK等人，F(xiàn)ASEB J 1990，4148-60)。體外和體內(nèi)模型顯示，結(jié)合于層粘連蛋白的腫瘤細(xì)胞與腫瘤侵入、遷移和轉(zhuǎn)移能力有關(guān)(Terranova VP等人，Cancer Res 1982，422265-2269.Varani J等人，Am J pathol 1983，11127-34.Barsky SH等人，J Clin Invest 1984，74843-848.MalinoffHL，Int J Cancer 1984，33651-655.Kanemoto K等人，ProcNatl AcadSci USA 1990，872279-2283)。67kD的層粘連蛋白受體(67LR)是一種非整聯(lián)(non-integrin)高親和的層粘連結(jié)合蛋白，它在癌細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高并與其他細(xì)胞表面蛋白中的層粘連蛋白相互作用(Malinoff HL等人Int J Cnacer 1984，33651-655.Rao CN等人Bicohem Biophys Res Commun 1983，111804-808.Terranova VP等人Proc Natl Acad Sci USA 1983，80444-448.MalinoffH等人J Cell Biol1983，961475-1480.Ruyman RB等人J Cell Biol 1988，1071863-1871.Albelda SM等人FASEB J 1990，42868-2880.Hail DE等人J CellBiol 1990，1102175-2184)。已經(jīng)表明，67LR的表達(dá)在腫瘤(如乳腺、結(jié)腸和胃癌)中的表達(dá)比正常組織有所增加(Cioce V等人J NatlCancer Inst 1991，8329-36.Castronovo V等人Am J Pathol 1990，1371373-1381.D′Errico A等人Mod Pathol 1991，4239-246)。67kD層粘連蛋白受體(67LR；表1)最初從鼠黑素瘤(Rao等人，1983.Biochem Biophys Res.Commun.111804-808)，fibrosarcoma cells(Malinoff & Wicha，1983.J Cell Biol 961475-1479)和正常牛肌肉細(xì)胞(Lesot等人，1983.EMBO J 2861)的細(xì)胞膜中分離。此后，在許多種屬中發(fā)現(xiàn)了該受體，并存在于廣泛的人體組織中(Barsoum Rohrer andCoggin 2000.Cell MoI Biol Lett.5207-230；Menard等人，1998 J.Cell.Biochem.67155-165；Mecham 1991 Annu Rev Cell Biol 771-91)。
表1層粘連蛋白受體1和前體的類似物

編碼67LR的人cDNA最初是從惡性結(jié)腸癌中分離出來(lái)的(因此該蛋白也已知為結(jié)腸癌層粘連蛋白結(jié)合蛋白；Yow等人，l988.856394-6398)，它且比最初所預(yù)期的要小。該cDNA預(yù)示了295個(gè)氨基酸蛋白質(zhì)的序列編碼，計(jì)算分子量為32kD。但是，它在SDS-PAGE凝膠上的位置是37-44kD，這可能是由于酸性蛋白質(zhì)電泳泳動(dòng)度的降低(計(jì)算pI為4.83)。少數(shù)(16)疏水性氨基酸朝向N末端(Castronovo，Taraboletti & Sobel，1991.J.Biol.Chem.26620440-20446)，可能跨越細(xì)胞膜。37kD蛋白質(zhì)和67kD蛋白質(zhì)表現(xiàn)出抗原性關(guān)聯(lián)(Rao等人，1989；Biochemistry 287476-7486)，而對(duì)黑色素瘤細(xì)胞所做的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)表明產(chǎn)生的37kD蛋白被加工成67kD產(chǎn)物(Castronovo等人，1991.Biochem.Biophys.Res.Commun.177177-183)。這些結(jié)果表明，這兩種蛋白之間存在直接的前體-產(chǎn)物關(guān)系。因此，37kD蛋白被稱為37kD層粘連蛋白受體前體(37LRP；表1)。脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)沒(méi)有揭示所述前體和最終67LR之間的任何中間形式(Castronovo等人，1991)，盡管檢測(cè)到了一種50kD降解產(chǎn)物。37kD多肽在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中可能具有多重功能性作用，并可能是67LR的配體結(jié)合組分(Elias Campo等人Am J pathol 1992，141No.5 1073-1083)。癌細(xì)胞中，已經(jīng)表明抗67kD蛋白的抗體結(jié)合到細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)(Wever UM等人CancerRes 1987，475691-5698)。
還沒(méi)有完全了解細(xì)胞是如何生成最終的受體來(lái)獲得67kD受體的，但是可能涉及脂肪酸軟脂酸、油酸和硬脂酸的?；饔?Landowski，Dratz，& Starkey，1995.3411276-87；Buto等人，1998 J.Cell Biochem.69244-251)。不涉及廣泛的糖基化。預(yù)測(cè)的cDNA序列不包含N聯(lián)糖基化的共有位點(diǎn)，而且盡管存在絲氨酸和蘇氨酸殘基，但沒(méi)有O聯(lián)糖基基團(tuán)的證據(jù)(Castronovo等人，1991.Biochem.Biophys.Res.Commun.177177-183；Landowski，Dratz，&Starkey，1995.3411276-87)。然而，Castronovo(Castronovo，1993 Invasion Metastasis131-30)表明67LR表達(dá)與β-半乳糖苷酶結(jié)合外源凝集素交叉反應(yīng)的抗原決定簇。67LR可以包括聯(lián)有脂類的前體多肽二聚物(Landowski，Dratz & Starkey，1998)。已經(jīng)表明異二聚體可以與一種凝集素樣蛋白或半乳凝素-3一起存在(Castronovo等人，1991；Buto等人，1998)(Castronovo等人，1991；Buto等人，1998)。抗半乳凝素3抗體不僅識(shí)別半乳凝素3，還識(shí)別67LR(Buto等人，1998)。該受體的最終結(jié)構(gòu)還有待闡明。當(dāng)67LR從培養(yǎng)液中的細(xì)胞表面脫落后，保持其與層粘連蛋白的結(jié)合能力(Karpatova等人，1996.J.Cell.Biochem.60226-503)。還不確定67LR是怎樣與細(xì)胞膜結(jié)合的。雖然該受體具有16個(gè)朝向其N末端的疏水氨基酸，但它也可能與締合分子相互作用，而不是以膜內(nèi)在蛋白的形式存在。但是，已經(jīng)確定多肽氨基酸的氨基末端在非通透細(xì)胞中是難以接觸的，這表明實(shí)際上該區(qū)域與其他分子相互作用(Castronovo等人，1991.J.Biol.Chem.3020440-20446；Wewer等人，1987 Cancer Res.475691-5698)。
已經(jīng)表明輔助因子可能與67LR結(jié)合，或者其本身作為輔助分子。這些性質(zhì)可能幫助向細(xì)胞表面轉(zhuǎn)運(yùn)和/或?qū)诱尺B蛋白結(jié)合。已經(jīng)注意到67LR和α6β1在小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中的共表達(dá)與細(xì)胞對(duì)層粘連蛋白的粘附直接相關(guān)(Pellergrine等人，1994.Int J Cancer Suppl 8116-120)。當(dāng)用層粘連蛋白出來(lái)人黑素瘤細(xì)胞時(shí)，67LR和α6β1共易位到質(zhì)膜(Romanov等人，1994.Cell Adhes Commun.2201-209)。與α6β1結(jié)合的67LR介導(dǎo)了大量人記憶T細(xì)胞對(duì)層粘連蛋白的高親和力的粘附(Clanfield andKhakoo，1999.J.Immunol.1633430-3440)。Ardini等人在1997年發(fā)現(xiàn)67LR和α6β4不僅共集中，而且被共調(diào)節(jié)，通過(guò)α6亞基和67LR之間的物理相互作用(Ardini等人，1997；J.Biol.Chem.2722342-2345)。但是，在卵巢癌中，37LRP的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)不依賴于α6亞基(Givant-Horwitz，2003 Clin.Exp.Metastasis20599-609；Skubitz等人，1996.Am J pathol 1481445-1461)。綜合這些結(jié)果表明，67LR可以與細(xì)胞質(zhì)中的層粘連蛋白特異性整聯(lián)蛋白(特別是α6亞基)相結(jié)合，從而作為復(fù)合體到達(dá)細(xì)胞膜，在那里兩個(gè)受體都參與了層粘連蛋白的識(shí)別，并決定相互作用是高親和還是低親和力(Landowski，Dratz，Starkey，1995)。
有效的人類37LRP基因圖譜是3p21.3，那些經(jīng)常涉及遺傳改變的染色體位點(diǎn)與癌癥相關(guān)聯(lián)(Jackers等人，1996.Oncogene 13495-503)。有效的基因包含7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子(Jackers等人1996.Oncogene 13495-503；avian gene Clausse等人，1996 DNA CellBiol 151009-1023)。它不包含經(jīng)典的TATA盒，但是可能具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。在啟動(dòng)子區(qū)域有4個(gè)Sp1位點(diǎn)，內(nèi)含子1中有6個(gè)Sp1位點(diǎn)，內(nèi)含子3中有2個(gè)Alu序列，可能影響選擇剪接。內(nèi)含子4含有編碼核內(nèi)小RNA E2的序列(Jackers等人1996.Oncogene 13495-503)。人類基因組中存在至少26個(gè)該基因的拷貝，所有都表現(xiàn)出與功能基因的高度同源性(Jackers etal，1996.Biochem Biophys Acta.130598-104)。19個(gè)拷貝被分析顯示為是經(jīng)過(guò)加工的擬基因，產(chǎn)生無(wú)功能的轉(zhuǎn)錄物。這些擬基因被認(rèn)為最可能是由復(fù)位生成的(Jackers等人，1996.Biochem Biophys Acta.130598-104)。cDNA在整個(gè)進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的，鼠、牛和人類序列之間至少有98.3％的同源性，而鼠和人序列共有99％的同源性(Menard等人，1997.J Cell Biochem67155-165)。
37LRP基因似乎產(chǎn)生了大量不同于37LRP的功能性蛋白。37LRP蛋白和參與翻譯結(jié)構(gòu)的p40核糖體結(jié)合蛋白(p40多肽；p40；核糖體蛋白SA；ItPSA)之間的同源性為99％(Makrides等人，1988.NucleicAcid Res.162349；Tohgo等人，1994.FEBS Lett.340133-138；Rosenthal & Wordeman 1995.J.Cell Sci.108245-256)。在胚眼發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)位置標(biāo)志物也是由與37LRPcDNA相同的基因編碼的(Rabacchi等人，1990.Development 109521-531；McCafferey，Neveand Drager，1990.PNAS 878570-8574)。
癌胚抗原(OFA；37-44kD)是一種在嚙齒類動(dòng)物和人類腫瘤和早期胎兒中表達(dá)的免疫原性糖蛋白。幼鼠37LRP與OFA的同源性達(dá)到99.5％(Coggin，Barsoum，Rohrer 1999.Anticancer Research 195535-5542)。OFA已經(jīng)被視為37LRP的自身免疫同系物。已經(jīng)表明OFA刺激鼠和人體內(nèi)的T和B淋巴細(xì)胞，并在癌癥中起免疫原作用，特別是在腎癌中(Zelle-Rieser等人，2001.J.Urol.1651705-9；Holt等人，2002.Clin.Cancer Res.83369-3376；Rohrer等人，1992；J.Natl.CancerInst.(Bethesda)84602-609；Rohrer etal，1994.J.Immunol.155755-764；Rohrer等人，1995.J.Immunol.1555719-5727；Rohrer等人，2001.Mod.Aspects Immunibiol.1191-195；Rohrer等人，1999.J.Immunol1626880-6892)。
有證據(jù)表明，可能存在37LRP和67LR的亞型或同系物。在人和牛上皮細(xì)胞中鑒定出了55kD蛋白，與37LRP同源(Ireland etal，1998.Clin.Exp.Immunol.112255-261)，并且已經(jīng)在幼鼠腦組織中發(fā)現(xiàn)了大量亞型(Simoneau等人，2003.Biol.Chem.384243-246)。這些蛋白質(zhì)可能產(chǎn)生于37LRP，該37LRP以多種方式被翻譯后修飾和/或與其他分子相互作用，或者可能產(chǎn)生于其他高度同源的基因。
在許多腫瘤中已經(jīng)證明了67LR的過(guò)量表達(dá)和異常表面分布，通過(guò)mRNA和蛋白質(zhì)水平上的各種技術(shù)手段得到檢測(cè)(For review seeMenard等人1998；Barsoum等人，2000)。已經(jīng)表明37LRP和/或67LR水平上的變化以疾病進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、惡化和預(yù)后等方式來(lái)影響腫瘤生物學(xué)。
雖然67LR的過(guò)量表達(dá)與在腫瘤進(jìn)展中起作用的受體相關(guān)聯(lián)，但進(jìn)展的時(shí)期可能依賴于腫瘤類型(Campo等人，1992.Am J Pathol 411073-83；Demeter等人，1992 Cancer Res.521561-1567；Martignone等人，1992.Clin.Exp.Metastasis 10379-386breast cancer；Vasso等人，1993；Cancer 15455-461melanoma；Boukerche等人，2004.Gene343191-201melanoma；Waltregny等人1997.J.Natl.Caner Inst891224-1227)。與腺瘤相比，腺癌中可以看到冷凍的直腸結(jié)腸組織中37LRP mRNA的增加，但是水平在正常和腺瘤組織之間是恒定的。這些結(jié)果表明，37LRP或67LR的表達(dá)是從腺瘤到腺癌/Dukes C癌的疾病進(jìn)展過(guò)程中的后期結(jié)果(Campo等人，1992.Am J Pathol 411073-83.)。相反，37LRP mRNA在腺瘤頸部損傷中有所增加，表明了一種疾病進(jìn)展過(guò)程的早期結(jié)果(Demeter等人，1992 Cancer Res.521561-1567)。67LR作為一種譜系相關(guān)抗原也被牽涉入單核細(xì)胞系的急性髓性白血病中(AML；Montouri等人，1999.Clin.Cancer Res.51465-1472)。
其他研究已經(jīng)表明67LR可能在侵襲和轉(zhuǎn)移中起作用，意味著它在多種腫瘤中的轉(zhuǎn)移表型的獲取中起著重要作用(Wewer等人，1987.Cancer Res 475691-8；Castronovo & Sobel 1990.Biochem Biophys ResCommun 681110-1117；Cioce等人，1991.J Natl Cancer Inst 8329-36；Sobel，1993 Semin.Cancer Biol.4311-317；Castronovo InvasionMetastasis 1993 131-30；You等人，1988.PNAS 856394-6398；Pelosi等人，1997.J.Pathol.18362-69；Boukerche等人，2004.Gene343191-201).例如，已經(jīng)顯示，在具有更大的惡性潛力的人結(jié)腸細(xì)胞系和組織中mRNA水平增加(Kondah等人，1992.Cancer Res 52791-796)。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過(guò)血漿的一種IgG餾分預(yù)處理后出現(xiàn)了人纖維肉瘤細(xì)胞系的轉(zhuǎn)移抑制，所述血漿來(lái)源于經(jīng)37LRP-GST融合蛋白免疫的兔(345bp cDNA；13kD；Narumi等人，1999.Jpn J.Cancer Res.90425-431)。上述血漿還減少了細(xì)胞與層粘連蛋白的附著，以一種劑量依賴方式。37LRP的反義RNA還體外抑制了分化不良的人結(jié)腸癌細(xì)胞系(Mafune and Ravikumar，1992.J.Surg.Res.52340-346)。
轉(zhuǎn)移過(guò)程中67LR表達(dá)的增加經(jīng)常相應(yīng)有另一個(gè)非整聯(lián)的層粘連蛋白結(jié)合蛋白(半乳凝素3)表達(dá)的減少(van den Brule etal，1994.Eur.J.Cancer 32A1598-1602；Xu etal，1995.Am.J.Pathol.147815-822；Castronovo等人，1995.J.Pathol.17943-48；Lotz等人，1993.PNAS903466-3470)。這些結(jié)果表明這兩個(gè)層粘連蛋白受體是被反向調(diào)節(jié)的，這可以解釋層粘連蛋白結(jié)合親和力的變化，取決于哪個(gè)受體被使用。相反，已經(jīng)觀察到了半乳凝素3表達(dá)增加與結(jié)腸癌惡性之間的直接關(guān)聯(lián)(Schoeppner.等人，1995 Cancer 752818-2826)。
67LR表達(dá)可能也是腫瘤侵襲性的一個(gè)標(biāo)志，因?yàn)樵黾拥谋磉_(dá)經(jīng)常與增殖和顯著的腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)聯(lián)。在快速增殖中的人肺癌組織和胰腺內(nèi)分泌腫瘤(Pelosi等人，1997.J.Pathol.18362-69)中檢測(cè)到了增加的37LRP mRNA水平(Satoh等人，1992.Biochem.Biophys.Res.Commun 182746-752)。人乳頭狀瘤病毒相關(guān)的頸部新生物中，37LRPmRNA的水平與細(xì)胞的增殖特性相關(guān)聯(lián)而不是與細(xì)胞的侵襲特性相關(guān)聯(lián)(Demeter等人，1992)。將反義37LRP RNA導(dǎo)入幼鼠肺癌細(xì)胞系T11中，延長(zhǎng)了它們的倍增時(shí)間(Satoh等人，1999.Br.J.Cancer 801115-1122)。這些細(xì)胞還與層粘連蛋白產(chǎn)生較弱的相互作用，在皮下注射經(jīng)反義RNA處理過(guò)的細(xì)胞后，小鼠的存活時(shí)間被延長(zhǎng)了。67LR在腫瘤侵襲中也起作用，因?yàn)樗梢栽鰪?qiáng)層粘連蛋白-1的溶蛋白性裂解，從而提高基膜的降解速度(Ardini等人，2002.Cancer Res.621321-1325)。
37LRP和/或67LR的過(guò)量表達(dá)也可能與幾種腫瘤中的預(yù)后不良有關(guān)(Barsoum Rohrer and Coggin 2000.Cell MoI Biol Lett.5207-230；Menard等人，1998 J.Cell.Biochem.67155-165；Menard，Tagliabue andColnaghi，1998.Breast Cancer Res.Treatment 52137-145)。在生成層粘連蛋白的乳腺癌中，預(yù)后是不利的(Martigone等人1993.J Natl.Cancer Inst.85379-386；Pellegrini等人，1985 Breast Cancer Res Treat35195-199)。人淋巴瘤中，67LR在CD30+間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞表面以及在高級(jí)B細(xì)胞非霍其金(non-Hodgkin′s)或霍其金(Hodgkin′s)淋巴瘤的小亞基中被檢測(cè)到(Carbone等人，1995.Hum.Pathol.2541-546)。
最近，67LR已經(jīng)被牽涉入與腫瘤生物學(xué)不同的生物過(guò)程。發(fā)現(xiàn)該受體得到了細(xì)胞因子、炎性試劑、與包括層粘連蛋白和類固醇在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)之間相互作用的正向調(diào)節(jié)(Menard等人，1998)，這表明37LRP和67LR可以在正常情況下得到調(diào)節(jié)。67LR在淋巴細(xì)胞趨化、粘附和尋靶中和/或在宿主防御機(jī)制中起著作用。已經(jīng)在一部分(10-15％)人類活化的外周血液記憶T細(xì)胞(CD4+和CD8+單陽(yáng)性)表面發(fā)現(xiàn)了67LR。它還顯示在響應(yīng)神經(jīng)肽過(guò)程中被正向調(diào)節(jié)(Chen等人，2002Nat.Med.81421-1426)。Ferrarini等人在1996年的一項(xiàng)研究支持了該受體的免疫作用，因?yàn)?，集中在肺腫瘤位置的γδ+淋巴細(xì)胞通過(guò)與67LR相互作用而能夠殺傷肺癌細(xì)胞(Ferrarini等人，1996.J.Natl.Cancer Inst.88436-441)。這種殺傷顯示出不依賴于自然殺傷細(xì)胞(NK)、淋巴因子活化細(xì)胞(LAK)和T細(xì)胞受體(TCR)，而層粘連蛋白能夠提供一種協(xié)同刺激信號(hào)。67LR也可以影響其他類型細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移和轉(zhuǎn)運(yùn)。67LR與GM-CSF受體的α(αGMR)和β(βGMR)亞基相互作用(Chen等人，2003.PNAS 10014000-14005)并抑制GM-CSF受體復(fù)合物的形成。GM-CSF調(diào)節(jié)骨髓前體細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和成熟，并增強(qiáng)成熟的中性白細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和單核吞噬細(xì)胞的功能。67LR可以通過(guò)防止GM-CSF復(fù)合物的生成來(lái)抑制這些活性。由于已經(jīng)在上皮細(xì)胞和Paneth細(xì)胞分泌粒中發(fā)現(xiàn)了67LR，從而暗示了67LR的分泌和胞吞作用(Shmakov等人，2000.J.Pathol.191318-322)。
67LR與層粘連蛋白相互作用的確切方式還未明確。67LR的兩個(gè)肽結(jié)構(gòu)域被認(rèn)為是可能的層粘連蛋白結(jié)合位點(diǎn)。其中之一是G肽，一種衍生于37LRP序列的合成肽，含有回文序列LMWWML。研究表明，它與層粘連蛋白結(jié)合，抑制腫瘤細(xì)胞與上皮細(xì)胞的結(jié)合，并在裸鼠中增加人黑素瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移(Castronovo等人，199l J Biol.Chem.26620440-20446；Castronovo，Taraboletti and Sobel 1991.Cancer Res.515672-5678；Taraboletti等人，1993.J.Natl.Cancer.Inst.85235-240)。研究發(fā)現(xiàn)，G肽增加并穩(wěn)定了層粘連蛋白與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合(Magnifico等人，1996.J.Biol.Chem.27131179-31184)。第二個(gè)可能的層粘連蛋白結(jié)合域是從37LRP的C末端序列(a.a.205-229；Landowski，Uthayakumar，Starkey，1995.Clin.Exp.Metastasis 13357-372)的疏水性而預(yù)測(cè)的。它也可能是67LR與層粘連蛋白相互作用的一個(gè)凝集素結(jié)構(gòu)域，因?yàn)槭荏w對(duì)層粘連蛋白的識(shí)別依賴于乳糖(Castronovo等人，1991.Biochem.Biophys.Res.Commun.177177-183)。
67LR可以與層粘連蛋白殘基YIGSR(a.a.929-933；β1鏈；Massi，Rao和Hubbell，1993.J.Biol.Chem.2688063-8059；Landowski，Uthayakumar，Starkey，1995.13357-72)、IKVAV(a.a.2091-2108；α鏈；Kibbey等人，1993.PNAS 9010150-10153)和LGTIPG(a.a.442-446；β1鏈；Mechametal 1989 J.Biol.Chem.26416652-16657)結(jié)合。67LR也可以與層粘連蛋白的疏水成分結(jié)合，特別是聚合(乳糖-氨基)結(jié)構(gòu)、半乳糖((α1，3)半乳糖鍵合和末端非還原的β-半乳糖殘基(Mecham，1991 Annu.Rev.Cell.Biol.771-91)。與YIGSR殘基的結(jié)合抑制轉(zhuǎn)移(Iwamoto等人，1996.Br.J.Cancer 73589-595)，而與IKVAV的相互作用刺激轉(zhuǎn)移(Bresalier等人，1995.Cancer Res.552476-2480)。由于自從1983年發(fā)現(xiàn)了67LR這第一個(gè)層粘連蛋白受體以來(lái)，至少14個(gè)其他的層粘連蛋白受體(Mecham 1991)被公開(kāi)，并可以利用同樣的層粘連蛋白結(jié)合位點(diǎn)。
67LR也與除了層粘連蛋白以外的其他分子相互作用，這些分子包括彈性蛋白(Grosso等人，1991.Biochemistry 303346-3350)、纖維結(jié)合素(FN)、IV型膠原(Narasimhan等人，1994.PNAS 917440-7444；Iwabuchi等人，1996 Blood 87365-372)和肝素(Guo等人，1992.PNAS 893040-3044)。其他研究還顯示67LR作為辛德比斯病毒(sindbis virus)受體(Wang等人，1992 J.Virol.664992-5001)，而37LRP能實(shí)現(xiàn)阮病毒蛋白的攝取(Rieger等人，1997.Nat.Med.31383-1387)。
肝癌最普通的肝臟原發(fā)惡性腫瘤是肝細(xì)胞癌(HCC)。HCC發(fā)病率在乙型和丙型肝炎病毒的高危人群中是增加的。已經(jīng)患有慢性肝炎、肝硬化、血色沉著病和兩種先天性肝功能障礙(α-1-抗胰蛋白酶缺陷和酪氨酸血癥)的患者也是發(fā)生HCC的高危人群。某種毒素或化學(xué)試劑也可能導(dǎo)致原發(fā)性肝癌，包括黃曲霉毒素，在非洲未適當(dāng)貯存的花生中發(fā)現(xiàn)的一種霉菌產(chǎn)物。即使通過(guò)切除而成功去除HCC，還是很可能復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的。大量研究顯示了多種關(guān)于原發(fā)性肝癌及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的預(yù)后標(biāo)志(Qin和Tang，2004.J Cancer Res Clin Oncol 130497-513)。
與HCC并發(fā)的肝臟疾病表明，結(jié)構(gòu)改變可以增加發(fā)生原發(fā)性肝癌的機(jī)率。在正常情況下，肝細(xì)胞的特征是沒(méi)有基膜(Schaffher和Popper 1963 Gastroenterology 44230-242)。細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(包括層粘連蛋白)作為肝硬化的發(fā)展產(chǎn)物而生成并聚集在竇狀隙周圍，形成了一種結(jié)構(gòu)基膜。研究發(fā)現(xiàn)，層粘連蛋白5存在于原發(fā)性HCC根瘤中，而不在正?；蛲庵苣[瘤性硬化組織中(Giannelli等人，2003.Clin.Can.Research.93684-3691)。研究顯示層粘連蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞角蛋白19的表達(dá)，這表明層粘連蛋白沉著物導(dǎo)致了其他蛋白的異常表達(dá)(Su等人，2003.World J Gastroenterol921-929)。有可能層粘連蛋白的表達(dá)提高了其任何受體的表達(dá)。
1990年，發(fā)現(xiàn)67LR在肝細(xì)胞中表達(dá)(Clement等人，1990.J.CellBiol.110185-192)，盡管它不是存在的唯一層粘連蛋白受體。在取自HCC和肝硬化患者的肝臟樣本中發(fā)現(xiàn)，新生腫瘤區(qū)域的67LR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目比相鄰軟細(xì)胞組織有所增加(Grigioni等人，1991，Am J Pathol138647-654)。另外一項(xiàng)研究(Ozaki等人，1998.Gut 43837-842)在正常肝組織中檢測(cè)到了37LRP mRNA的弱表達(dá)。mRNA水平在具有慢性肝病的非癌性肝組織中有所增加，而在腫瘤區(qū)域增加的更多。37LRP的翻譯及表達(dá)的蛋白質(zhì)在該項(xiàng)研究中沒(méi)有被確定(Ozaki等人，1998.Gut 43837-842)。在轉(zhuǎn)移的HCC組織中觀察到了增加的67LR生物合成，RNA增加和蛋白質(zhì)增加之間具有直接關(guān)系(Zheng等人，1997.J Tongji Medical University.17200-202)。L-02正常肝細(xì)胞和癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721顯示了37LRP mRNA和67LR不同的表達(dá)模式，這與細(xì)胞系的腫瘤狀態(tài)無(wú)關(guān)(Zheng等人，2002.Chinese JCancer 22248-252)。但是，癌細(xì)胞系SMMC-7721可以表達(dá)比其他細(xì)胞系更高的層粘連蛋白結(jié)合親和力，盡管這不能單獨(dú)歸功于67LR，因?yàn)槭褂昧苏麄€(gè)細(xì)胞用于結(jié)合研究。但是，一項(xiàng)蛋白組學(xué)研究顯示，67LR在高度轉(zhuǎn)移的細(xì)胞系MHCC97-H中被正向調(diào)節(jié)，與低轉(zhuǎn)移的對(duì)照MHCC97-L相比較(Li等人，2001.World J Gastroenterol 7630-636；Ding等人，2004.Proteomics 4；982-994)。67LR在HCC轉(zhuǎn)移中是否起直接作用還不確定。
現(xiàn)有專利US5750102公開(kāi)了一種方法，用MHC基因轉(zhuǎn)染患者腫瘤細(xì)胞，MHC基因可以從患者的組織或細(xì)胞中克隆。然后將這些經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用于接種患者。
US4861581公開(kāi)了一種方法，該方法包括如下步驟獲得單克隆抗體，該抗體對(duì)哺乳動(dòng)物的腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞的內(nèi)部細(xì)胞成分有特異性而對(duì)外部成分沒(méi)有特異性；標(biāo)記單克隆抗體；將標(biāo)記抗體與已經(jīng)接受過(guò)腫瘤細(xì)胞殺滅治療的哺乳動(dòng)物組織接觸；以及通過(guò)測(cè)定標(biāo)記抗體與退化腫瘤細(xì)胞內(nèi)部細(xì)胞成分的結(jié)合來(lái)確定治療的效果。在制備導(dǎo)向人類細(xì)胞內(nèi)抗原的抗體的過(guò)程中，專利權(quán)人認(rèn)識(shí)到癌細(xì)胞是這類抗原的一個(gè)方便來(lái)源。
US5171665提供了一種新型抗體和該抗體的生產(chǎn)方法。具體的，該專利說(shuō)明了單克隆抗體的制備，所述單克隆抗體具有與人類腫瘤相關(guān)蛋白抗原(如結(jié)腸和肺的)牢固結(jié)合的性質(zhì)，而與正常細(xì)胞的結(jié)合程度要小得多。
US5484596提供了一種癌癥的治療方法，該方法包括手術(shù)去除腫瘤患者的腫瘤組織；處理腫瘤組織以獲得腫瘤細(xì)胞；照射腫瘤細(xì)胞，使其存活但沒(méi)有致瘤性質(zhì)；以及用這些細(xì)胞為患者制備疫苗，該疫苗能夠抑制原發(fā)性腫瘤的復(fù)發(fā)并同時(shí)抑制病灶轉(zhuǎn)移。該專利公開(kāi)了與腫瘤細(xì)胞表面抗原具有反應(yīng)性的單克隆抗體的研制。如第4欄第45行等處說(shuō)明，專利權(quán)人在對(duì)人類腫瘤具有活性特異的免疫治療的單克隆抗體研發(fā)過(guò)程中，利用了自體腫瘤細(xì)胞。
US5693763說(shuō)明了人類癌細(xì)胞的糖蛋白抗原特性不依賴于原發(fā)的上皮組織。
US5783186說(shuō)明了誘導(dǎo)Her2表達(dá)細(xì)胞凋亡的抗Her2抗體，產(chǎn)生抗體的雜交瘤細(xì)胞系，使用抗體和含有所述抗體的藥物組合物治療癌癥的方法。
US5849876描述了用于生產(chǎn)單克隆抗體的新型雜交瘤細(xì)胞系，所述抗體針對(duì)從腫瘤和非腫瘤組織來(lái)源中提純的粘蛋白抗原。
US5869268公開(kāi)了生成人體淋巴細(xì)胞的方法，該淋巴細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)目標(biāo)抗原具有特異性的抗體，同時(shí)公開(kāi)了一種生產(chǎn)單克隆抗體的方法及由該方法生產(chǎn)的單克隆抗體。該專利特別公開(kāi)了用于診斷和治療癌癥的抗HD人類單克隆抗體的生產(chǎn)。
US5869045涉及和人體癌細(xì)胞反應(yīng)的抗體、抗體片段、抗體偶聯(lián)物和單鏈免疫毒素。這些抗體的功能機(jī)理是雙重的，因?yàn)檫@些抗體一方面與展示在人體癌細(xì)胞表面的膜抗原具有反應(yīng)性，另外這些抗體還能夠陷入癌細(xì)胞，隨后結(jié)合，使它們特別用于形成抗體-藥物和抗體-毒素結(jié)合物。以未修飾形式出現(xiàn)的抗體在特定濃度下也表現(xiàn)出細(xì)胞毒性質(zhì)。
US5780033公開(kāi)了自體抗體用于腫瘤治療和預(yù)防。不過(guò)，該抗體是從成年哺乳動(dòng)物中得到的抗細(xì)胞核自體抗體。這里，自體抗體是指在免疫系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的一種天然抗體。因?yàn)樽泽w抗體來(lái)源于“成年哺乳動(dòng)物”，因此就不要求自體抗體真正來(lái)源于受治患者。此外，該專利公開(kāi)了來(lái)自成年哺乳動(dòng)物的天然的單克隆抗細(xì)胞核自體抗體以及生成單克隆抗細(xì)胞核自體抗體的雜交瘤細(xì)胞系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明人在此之前已經(jīng)被授予了名稱為“個(gè)體化患者特異抗癌抗體”的美國(guó)專利6180357，是關(guān)于一種用于治療癌癥的個(gè)體化篩選個(gè)性化抗癌抗體的方法。基于本文目的，術(shù)語(yǔ)“抗體”和“單克隆抗體”(mAb)可以互換使用，是指雜交瘤(如鼠或人)生成的完整的免疫球蛋白、免疫交聯(lián)物，以及從所述免疫球蛋白衍生的適當(dāng)?shù)拿庖咔虻鞍灼瑪嗪椭亟M蛋白，如雜合的和人源化的免疫球蛋白、F(ab′)和F(ab′)2片斷、單鏈抗體、重組免疫球蛋白可變區(qū)(Fv)s、融合蛋白等。基于本文目的，術(shù)語(yǔ)“組織樣品”是表示從哺乳動(dòng)物中獲得的至少一種細(xì)胞或細(xì)胞凝聚物?，F(xiàn)有技術(shù)公認(rèn)一些氨基酸序列在多肽中是可變的，并對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)或功能沒(méi)有顯著影響。在抗體的分子重排中，骨架區(qū)的核苷酸或氨基酸序列變化通常是可以接受的，這些變化包括(但不限于)置換(優(yōu)選為保守置換)、缺失或增加。另外，本發(fā)明還包括將本發(fā)明的CDMAB和標(biāo)準(zhǔn)的化學(xué)治療藥征(如放射性核素)結(jié)合起來(lái)，從而集中了所述化療的作用。CDMAB還能與毒素、細(xì)胞毒殘基、酶(如生物素結(jié)合酶)或造血細(xì)胞結(jié)合，藉此形成抗體結(jié)合物。本文描述了這種結(jié)合部分與來(lái)源于雜交瘤細(xì)胞系(命名為6BD-25)的單克隆抗體相結(jié)合；利用來(lái)源于命名為5LAC-23的雜交瘤細(xì)胞系的單克隆抗體能夠形成類似的抗體結(jié)合物。
腫瘤相關(guān)單克隆抗體作為細(xì)胞毒素劑載體的使用在過(guò)去幾年已經(jīng)得到很多關(guān)注。這項(xiàng)工作的主要目的是提高結(jié)合藥物或毒素的抗癌藥物的效力，同時(shí)減少不希望的和經(jīng)常發(fā)生的毒性副反應(yīng)。
為使該方法有效，抗體必需有高度的腫瘤選擇性，藥物必需以有效的細(xì)胞毒形式給入。細(xì)胞毒藥物(如甲氨喋呤、柔紅霉素、絲裂霉素C(MMC)和長(zhǎng)春藥屬(VINCA))已經(jīng)被連接到抗體上并考察了由此得到的復(fù)合物的抗腫瘤活性。另外，生物制品(如假單胞菌外毒素)和新型毒素(如刺孢霉素和Auristatins)已經(jīng)被分別用來(lái)提高抗CD33和抗CD30抗體的效力。現(xiàn)有技術(shù)中有許多實(shí)施例，描述了抗體與藥物通過(guò)多種相對(duì)穩(wěn)定的化學(xué)鍵的連接，具有較慢的非特異性釋放。放射性核素，如碘131、釔90或銦111也能夠與抗體連接，用于殺滅腫瘤或診斷成像。不論什么方法，根本目的是要消滅腫瘤特異性方法能通過(guò)特定的抗37LR抗體來(lái)確定，利用所述抗體的目的是能夠顯著改變那些表達(dá)37LR抗原的細(xì)胞的靶向方法。
本發(fā)明利用了美國(guó)專利6180357中公開(kāi)的生產(chǎn)患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌癥調(diào)解單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？梢詾橐环N腫瘤而專門(mén)制備這些抗體，從而使癌癥的個(gè)性化治療成為可能。在本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容中，具有殺滅細(xì)胞(細(xì)胞毒素的)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的)性能的抗癌抗體將在下文中被稱為細(xì)胞毒。這些抗體能夠用于幫助癌癥分期和診斷，也可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移和原發(fā)性腫瘤。
個(gè)性化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來(lái)變化。一種可能的臨床情境是在一種腫瘤出現(xiàn)時(shí)就取樣并入庫(kù)。通過(guò)該樣品，能夠通過(guò)已有的癌癥調(diào)節(jié)抗體庫(kù)對(duì)該腫瘤進(jìn)行分類?；颊邔⒈怀Ｒ?guī)分期，但可用的抗體可以對(duì)患者進(jìn)一步分期?？梢杂靡延械目贵w立即對(duì)患者進(jìn)行治療，和/或腫瘤特異性抗體庫(kù)可以使用本發(fā)明公開(kāi)的方法或者使用噬菌體展示庫(kù)并結(jié)合本發(fā)明公開(kāi)的篩選方法來(lái)生成。生成的所有抗體將被添加入抗癌抗體庫(kù)，因?yàn)槠渌哪[瘤細(xì)胞可能具有與被治療的腫瘤相同的抗原表位。根據(jù)本方法生成的抗體可以用于治療任何數(shù)量的、患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者。
本發(fā)明實(shí)質(zhì)上利用了美國(guó)專利6180357中說(shuō)明的生產(chǎn)患者特異性抗癌抗體的方法，用以分離編碼癌癥調(diào)解單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系?？梢詾橐环N腫瘤而專門(mén)制備這些抗體，從而使癌癥的個(gè)性化治療成為可能。在本發(fā)明公開(kāi)的內(nèi)容中，具有殺滅細(xì)胞(細(xì)胞毒素的)或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)(細(xì)胞生長(zhǎng)抑制的)性能的抗癌抗體將在下文中被稱為細(xì)胞毒。這些抗體能夠用于幫助癌癥分期和診斷，也可用于治療腫瘤轉(zhuǎn)移和原發(fā)性腫瘤。
個(gè)性化抗癌治療的前景將給患者的治療方式帶來(lái)變化。一種可能的臨床情境是在一種腫瘤出現(xiàn)時(shí)就取樣并入庫(kù)。通過(guò)該樣品，能夠通過(guò)已有的癌癥調(diào)節(jié)抗體庫(kù)對(duì)該腫瘤進(jìn)行分類。患者將被常規(guī)分期，但可用的抗體可以對(duì)患者進(jìn)一步分期?？梢杂靡延械目贵w立即對(duì)患者進(jìn)行治療，和/或腫瘤特異性抗體庫(kù)可以使用本發(fā)明公開(kāi)的方法或者使用噬菌體展示庫(kù)并結(jié)合本發(fā)明公開(kāi)的篩選方法來(lái)生成。生成的所有抗體將被添加入抗癌抗體庫(kù)，因?yàn)槠渌哪[瘤細(xì)胞可能具有與被治療的腫瘤相同的抗原表位。根據(jù)本方法生成的抗體可以用于治療任何數(shù)量的、患有與這些抗體結(jié)合的癌癥的患者。
實(shí)際上利用US 6180370和US 6657048中描述的方法，用患者的乳腺和肺腫瘤活組織檢查細(xì)胞對(duì)鼠進(jìn)行免疫接種之后，分別得到小鼠單克隆抗體6BD-25和5LAC-23。利用細(xì)胞ELISA/FACS，最初并沒(méi)有在許多種人類正常和癌細(xì)胞系中檢測(cè)到6BD-25抗原。通過(guò)將6BD-25抗體與生物素結(jié)合而提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度之后，在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231和卵巢癌細(xì)胞系C-13、OVCA-429和OV2008中檢測(cè)到了該抗原。乳腺癌細(xì)胞系Hs574.T對(duì)未純化的6BD-25的細(xì)胞毒作用是敏感的。受試細(xì)胞系，只有乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3和結(jié)腸癌細(xì)胞系SW1116這3種癌細(xì)胞系對(duì)純化的6BD-25的細(xì)胞毒作用敏感。通過(guò)使用FACS分析，在SW620結(jié)腸癌細(xì)胞系上檢測(cè)到了針對(duì)5LAC-23的抗原，而在任何其他受試細(xì)胞系上都沒(méi)有檢測(cè)到該抗原。乳腺(Hs574.T)、肺(NCI-H661)和皮膚(A2058)癌細(xì)胞系對(duì)未純化的5LAC-23的細(xì)胞毒作用是敏感的。卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3是受試癌細(xì)胞系中唯一對(duì)純化的5LAC-23的細(xì)胞毒作用敏感的。
當(dāng)移植入鼠體內(nèi)后，6BD-25在培養(yǎng)液中的抗OVCAR-3和SW1116的細(xì)胞毒作用被進(jìn)一步擴(kuò)大，通過(guò)其對(duì)這些細(xì)胞的抗腫瘤活性。在體內(nèi)結(jié)腸癌模型中，人類SW1116細(xì)胞經(jīng)頸背皮下注入，而對(duì)于卵巢癌體內(nèi)模型，人類OVCAR-3細(xì)胞經(jīng)腹腔注入。對(duì)于兩種模型來(lái)說(shuō)，都使用了免疫缺陷小鼠，因?yàn)樗鼈冇捎谌狈μ囟庖呒?xì)胞而不能排斥人類腫瘤細(xì)胞。臨床前的異種移植腫瘤模型被認(rèn)為是治療效力懶得有效預(yù)測(cè)手段。小鼠中的異種移植物長(zhǎng)成實(shí)體瘤，發(fā)展了基質(zhì)、中心性壞死和新生血管。腫瘤細(xì)胞系OVCAR-3和SW1116作為體內(nèi)異種移植模型在免疫缺陷的小鼠體內(nèi)被評(píng)價(jià)。OVCAR-3和SW1116腫瘤良好的植入或“成活率”以及它們對(duì)標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)療劑的敏感性，使它們成為合適的模型。親本細(xì)胞系及細(xì)胞系的變種已經(jīng)被應(yīng)用于異種移植模型中，來(lái)評(píng)價(jià)各種治療劑。
在人類結(jié)腸癌的預(yù)防性體內(nèi)模型中，6BD-25在腫瘤細(xì)胞植入前一天給入小鼠，隨后每周注射一次，持續(xù)7周。治療期間，6BD-25治療在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面比緩沖液對(duì)照明顯有效(p＝0.001)。在治療期末，給入6BD-25的小鼠的腫瘤生長(zhǎng)只有對(duì)照組的54％。在治療后的隨訪期間，6BD-25的治療效果依然持續(xù)，受治組的平均腫瘤體積基序顯著小于對(duì)照組，直到檢測(cè)期結(jié)束(p＝0.002)。6BD-25治療顯示出是安全的，因?yàn)樗鼪](méi)有誘導(dǎo)任何毒性體征，包括體重降低或臨床不良應(yīng)激的其他體征。因此，6BD-25治療是有效的，因?yàn)榕c對(duì)照治療組相比，它在完備的人類結(jié)腸癌模型中延緩了腫瘤生長(zhǎng)。
除了預(yù)防性的結(jié)腸癌體內(nèi)腫瘤模型，6BD-25在預(yù)防性卵巢癌體內(nèi)腫瘤模型中表現(xiàn)出抗OVCAR-3細(xì)胞的抗腫瘤活性。在這一異種移植腫瘤模型中，OVCAR-3卵巢癌細(xì)胞經(jīng)腹膜植入免疫缺陷鼠，在植入后開(kāi)始治療，總共10個(gè)劑量。將6BD-25治療與緩沖液對(duì)照相比較。體重被用作腫瘤進(jìn)展的替代量度標(biāo)準(zhǔn)。增加的體重指示了腫瘤負(fù)擔(dān)，因?yàn)轶w重增加是由腹水形成導(dǎo)致的。在植入后80天(治療結(jié)束后16天)，治療組的小鼠體重明顯低于對(duì)照組(p＝0.002)。而且6BD-25治療比對(duì)照組具有顯著的存活受益(p＜0.02)。另外，6BD-25治療表現(xiàn)的安全，因?yàn)樗鼪](méi)有引發(fā)任何毒性或臨床不良應(yīng)激的體征。6BD-25的抗腫瘤活性及其明顯無(wú)毒性使其成為一種令人關(guān)注的抗腫瘤治療劑。
如果患者的初期治療沒(méi)有效果或發(fā)生了轉(zhuǎn)移，則可以重復(fù)腫瘤特異抗體生成過(guò)程來(lái)進(jìn)行治療。而且，抗癌抗體可以和患者的紅細(xì)胞結(jié)合并再次注入來(lái)治療病灶轉(zhuǎn)移。目前對(duì)轉(zhuǎn)移癌癥的有效治療很少，轉(zhuǎn)移通常預(yù)示著糟糕的出院率而導(dǎo)致死亡。不過(guò)，轉(zhuǎn)移的腫瘤通常有較好的血管生成，通過(guò)紅細(xì)胞進(jìn)行的抗癌抗體的輸送具有將抗體聚集在腫瘤位置的作用。甚至在轉(zhuǎn)移前，大多數(shù)癌細(xì)胞依靠宿主血液供應(yīng)來(lái)存活，而與紅細(xì)胞結(jié)合的抗癌抗體同樣能有效抵抗原位腫瘤。可選擇的，抗體可以和其它造血細(xì)胞結(jié)合，如淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，等等。
目前有五類抗體，每類抗體具有一種其重鏈所賦予的功能。通常認(rèn)為通過(guò)裸露抗體的癌細(xì)胞殺傷作用由抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)或補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)來(lái)介導(dǎo)。例如，鼠IgM和IgG2a抗體能夠通過(guò)與補(bǔ)體系統(tǒng)中的C-1組分結(jié)合來(lái)激活人類補(bǔ)體，從而激活補(bǔ)體激活的經(jīng)典途徑，這能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞溶解。對(duì)于人類抗體，最有效的補(bǔ)體激活抗體通常是IgM和IgG1。鼠同種型抗體IgG2a和IgG3在俘獲具有Fc受體的細(xì)胞毒性細(xì)胞過(guò)程中起作用，導(dǎo)致由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞和某些淋巴細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用。人類同種型抗體IgG1和IgG3都介導(dǎo)ADCC。
抗體介導(dǎo)的癌細(xì)胞殺傷作用的另一種可能的機(jī)制是可以通過(guò)利用抗體催化功能，來(lái)水解細(xì)胞膜與其結(jié)合的糖蛋白或糖脂之間的化學(xué)鍵，即所謂的催化抗體。
還有兩種被普遍接受的抗體調(diào)節(jié)癌細(xì)胞殺傷的機(jī)理。第一種是利用抗體作為疫苗來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞表面的特定癌抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)。第二種是利用抗體來(lái)靶向生長(zhǎng)受體并干擾其功能或下調(diào)該受體以使其功能喪失。
在與疾病發(fā)病明確有關(guān)的30000個(gè)已知基因的產(chǎn)物中，缺少相關(guān)變點(diǎn)的識(shí)別而阻礙了治療疾病新藥的發(fā)現(xiàn)。在腫瘤學(xué)研究中，潛在的藥物靶點(diǎn)經(jīng)常被容易的選出，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。然后，將上述被識(shí)別的靶點(diǎn)與大量化合物進(jìn)行相互作用篩選。對(duì)于可能的抗體治療，這些候選化合物一般通過(guò)單克隆抗體生成的傳統(tǒng)方法而獲得，根據(jù)Kohler和Milstein制定的基本原理(1975，Nature，256，495-497，Kohler and Milstein)。脾細(xì)胞從抗原免疫小鼠中被收集(如全細(xì)胞、細(xì)胞餾分、純化的抗原)并與永生化雜交瘤配偶體融合。所得到的雜交瘤經(jīng)過(guò)篩選，獲得能分泌與靶點(diǎn)最有效結(jié)合的抗體的雜交瘤。許多導(dǎo)向抗癌細(xì)胞的治療性和診斷性抗體(包括HERCEPTIN和RITUXIMAB)已經(jīng)通過(guò)這些方法而被生成并基于它們與靶點(diǎn)的親和力和特異性而被選擇。對(duì)腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒作用的抗原特異性試劑能與表達(dá)所述抗原的細(xì)胞相結(jié)合，通過(guò)自身或者與其他分子(如毒素、藥物或放射性同位素)結(jié)合而具有細(xì)胞水平上的體內(nèi)生理活性，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，且對(duì)正常細(xì)胞群沒(méi)有明顯的損害作用，作為潛在的治療和/或診斷工具，這些抗原特異性試劑的開(kāi)發(fā)將是非常有益的。
為了確認(rèn)5LAC-23抗原表位是癌癥相關(guān)靶點(diǎn)，檢測(cè)了5LAC-23抗原在冷凍的正常人組織中的表達(dá)。通過(guò)免疫組織化學(xué)顯示，5LAC-23在正常組織中表達(dá)有限。這一點(diǎn)通過(guò)檢測(cè)5LAC-23抗原在組織芯片中經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋的正常器官中的表達(dá)而得到證實(shí)?？傊?LAC-23對(duì)正常組織是弱染色，表明該抗原在正常肝臟、胃、腦和腎組織中的表達(dá)是受限制和減少的，相對(duì)于在腫瘤(如HCC)中(見(jiàn)下)。在體內(nèi)，這種表達(dá)有時(shí)還被限制在細(xì)胞質(zhì)中，完成的抗體一般難以進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在同樣的組織芯片中，5LAC-23抗原在HCC中的表達(dá)是顯著的，雖然在胃腺癌中也有表達(dá)。
對(duì)HCC中的靶點(diǎn)進(jìn)行更廣泛的研究，利用免疫組織化學(xué)來(lái)檢驗(yàn)5LAC-23抗原在這種癌中的普遍性。令人驚訝的是，55個(gè)肝癌樣品中有73％表達(dá)了這個(gè)靶點(diǎn)。為了證明作為靶點(diǎn)在診斷、治療診斷、預(yù)后或治療中的效用，比較了該靶點(diǎn)在相應(yīng)的正常肝臟和肝癌中的分布。顯然，5LAC-23只染色了腫瘤樣品并特別針對(duì)這些切片中代表惡性組織的中心區(qū)域。這些切面在用同種型對(duì)照染色時(shí)呈陰性，表明5LAC-23的結(jié)合是特異性的，支持了5LAC-23抗原的腫瘤專一性觀點(diǎn)。而且，已經(jīng)表明，可以使用多種測(cè)定法來(lái)檢測(cè)5LAC-23抗原，一些非限制性的具體實(shí)施方式
將以實(shí)施例的方式納入本文，例如通過(guò)Western雜交、FACS分析和免疫組織化學(xué)。其他測(cè)定法對(duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的并包含在本發(fā)明范圍內(nèi)，包括ELISA、免疫組織化學(xué)、基于免疫親和的實(shí)驗(yàn)(如SELDI質(zhì)譜分析)、表面細(xì)胞質(zhì)基因組共振測(cè)定(surface plasmon resonance determinations)、放射性免疫測(cè)定和分子診斷實(shí)驗(yàn)。如這里所述，額外的生化數(shù)據(jù)還表明5LAC-23識(shí)別的抗原是37LRP的一個(gè)表位。這一點(diǎn)通過(guò)使用雙向電泳、Western雜交和質(zhì)譜分析來(lái)鑒定5LAC-23抗原而得到支持。靶點(diǎn)抗原的鑒定通過(guò)證明靶點(diǎn)與抗體的共區(qū)域化而得到確認(rèn)，已知所述抗體與37LRP結(jié)合，如在Western雜交以及組織和細(xì)胞的免疫組織化學(xué)研究中的H-150，已知所述組織和細(xì)胞表達(dá)37LRP或者經(jīng)37LRP的cDNA轉(zhuǎn)染。重要的是，與其他抗37LRP抗體(H-150)相比，5LAC-23表現(xiàn)出獨(dú)特的結(jié)合模式。這表明兩種抗體所識(shí)別的表位是不同的，使用5LAC-23具有更嚴(yán)格的結(jié)合。另外，在實(shí)施例12中，H-150檢測(cè)所有細(xì)胞系中的37LRP，但是5LAC-23所識(shí)別的抗原表位的表達(dá)在不同的細(xì)胞裂解物中有變化，而且在一些細(xì)胞裂解物中不存在?？贵w間的這種差別不是由于5LAC-23與其抗原的親和力相對(duì)于H-150更低，因?yàn)閮蓚€(gè)抗體與CHO細(xì)胞裂解物的結(jié)合是相似的。支持5LAC-23和H-150所檢測(cè)的表位之間的差異，5LAC-23在非還原條件下檢測(cè)到了LS174T裂解物中獨(dú)特的、大約110kD的斑點(diǎn)(圖16B，泳道12)。該斑點(diǎn)在還原條件下消失，而對(duì)應(yīng)于37LRP前體的譜帶沒(méi)有增強(qiáng)。這些結(jié)果提供了進(jìn)一步的證據(jù)與已知的抗LRP抗體H-150相比，5LAC-23在37LRP上識(shí)別的表位是獨(dú)特的。這些IHC和生化結(jié)果證明5LAC-23導(dǎo)向一種獨(dú)特的37LRP抗原表位。
腫瘤藥物的臨床應(yīng)用基于該藥物在可接受的危險(xiǎn)評(píng)估之下的受益。在癌癥的治療中，存活率通常是最重要的受益目標(biāo)，但是除了延長(zhǎng)壽命外，還有一些其它公認(rèn)的受益。這些對(duì)存活沒(méi)有負(fù)面影響的其它受益包括癥狀的減輕、防止負(fù)面影響、延長(zhǎng)復(fù)發(fā)周期或無(wú)瘤存活時(shí)間和延長(zhǎng)疾病進(jìn)程。這些標(biāo)準(zhǔn)被普遍接受，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)等管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)產(chǎn)生這些受益的藥物(Hirschfeld等人.Critical Reviews in Oncology/Hematology 42137-143 2002)。除了這些標(biāo)準(zhǔn)外，人們充分認(rèn)識(shí)到還有其他特征可以預(yù)示這些受益類型。部分的，美國(guó)FDA的快速審批程序確認(rèn)了有替代特征可能預(yù)測(cè)患者的受益。到2003年末，有16個(gè)藥物被批準(zhǔn)進(jìn)入這個(gè)程序，其中四個(gè)已經(jīng)進(jìn)入全面審批，即，后續(xù)研究證明了替代特征所預(yù)示的直接的患者受益。確定實(shí)體瘤藥物療效的一個(gè)重要指標(biāo)是通過(guò)測(cè)試治療效果來(lái)評(píng)價(jià)腫瘤負(fù)荷(Therasse等人.Journal of the National Cancer Institute 92(3)205-216 2000)。這種評(píng)價(jià)的臨床標(biāo)準(zhǔn)(RECIST標(biāo)準(zhǔn))已經(jīng)由實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)工作組頒布，該工作組由國(guó)際癌癥專家組成。和參照RECIST標(biāo)準(zhǔn)的客觀療效所顯示的一樣，與適當(dāng)?shù)膶?duì)照組相比，對(duì)實(shí)體瘤有確切療效的藥物易于最終產(chǎn)生直接的患者受益。在臨床前條件下，腫瘤負(fù)荷通常更容易被評(píng)估和記錄。因?yàn)榕R床前研究可以被轉(zhuǎn)化為臨床條件，所以在臨床前模型中產(chǎn)生存活延長(zhǎng)的藥物具有最大的、所期望的臨床效用。與產(chǎn)生對(duì)臨床治療有益反應(yīng)相類似，在臨床前條件下降低腫瘤負(fù)荷的藥物也可能對(duì)疾病具有顯著的直接影響。盡管延長(zhǎng)生命是癌癥藥物治療最重要的目標(biāo)，但是還有其他受益具有臨床效用，顯然，腫瘤負(fù)荷的降低也能夠?qū)е轮苯拥氖芤娌⒕哂信R床效果(Eckhardt等人.Developmental TherapeuticsSuccesses and Failuresof Clinical Trial Designs of Targeted Compounds；ASCO EducationalBook，39thAnnual Meeting，2003，pages 209-219)。
總之，本發(fā)明說(shuō)明了6BD-25和5LAC-23抗原作為治療劑靶點(diǎn)的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證明，給藥后，6BD-25能夠減輕患有表達(dá)該抗原的癌癥的哺乳動(dòng)物的腫瘤負(fù)擔(dān)，還能導(dǎo)致受治哺乳動(dòng)物延長(zhǎng)的存活。6BD-25體內(nèi)治療的效力以及分別在SW1116和OVCAR-3細(xì)胞上檢測(cè)不到的或低水平的抗原表達(dá)，說(shuō)明抗原表達(dá)的水平不必然與體內(nèi)效力相關(guān)聯(lián)。另外，本發(fā)明還說(shuō)明了在癌細(xì)胞中檢測(cè)6BD-25和5LAC-23抗原能有助于患有表達(dá)該抗原的腫瘤的哺乳動(dòng)物的診斷、治療的預(yù)測(cè)和預(yù)后。本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明了5LAC-23抗原作為靶點(diǎn)用于診斷、治療診斷、預(yù)后或治療。
因此，本發(fā)明的目的是利用一種從特定個(gè)體的細(xì)胞中生產(chǎn)腫瘤調(diào)節(jié)抗體的方法，該抗體對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性而同時(shí)對(duì)非癌細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒，為了分離雜交瘤細(xì)胞系和該雜交瘤細(xì)胞系編碼的相應(yīng)的單克隆抗體及其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明另外一個(gè)目的是通過(guò)37LRP特定表位與一種分離的單克隆抗體(命名為5LAC-23)或其片斷(命名為抗原片斷)相結(jié)合的方式來(lái)識(shí)別層粘連蛋白受體1前體蛋白(命名為37LRP)，所述分離的單克隆抗體是通過(guò)一種從特定個(gè)體的細(xì)胞中生產(chǎn)腫瘤調(diào)節(jié)抗體的方法而生成的，該抗體對(duì)癌細(xì)胞有細(xì)胞毒性而同時(shí)對(duì)非癌細(xì)胞相對(duì)無(wú)毒。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種能夠與5LAC-23所識(shí)別的37LRP的特定表位相結(jié)合的偶合殘基，本文稱之為藥物-抗體結(jié)合物，其中所述抗體是與所述特定表位相結(jié)合的5LAC-23或其片斷，所述結(jié)合物可以是生物或化學(xué)毒素形式的放射性核素或一種抗腫瘤藥物，或者是一種具有等效抗腫瘤活性的化合物，包括但不限于化學(xué)治療藥物。
本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供一種傳輸活性抗腫瘤藥物、酶或放射性核素(作為抗腫瘤藥物或診斷顯影方法中的輔劑而起作用)至哺乳動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞位置的方法，包括為該哺乳動(dòng)物注入本發(fā)明的偶合殘基，從而發(fā)生所述偶合殘基與抗原表位之間的選擇性結(jié)合。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供一種確定癌細(xì)胞存在的方法，通過(guò)任何方式來(lái)證明5LAC-23抗體和37LRP前體蛋白之間的選擇性結(jié)合水平足以表明惡性腫瘤的存在。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供癌細(xì)胞或癌前細(xì)胞的診斷、預(yù)后、治療、顯影和監(jiān)測(cè)的方法，利用5LAC-23(一種抗原結(jié)合片斷，如前文所定義的)或偶合殘基(如前文所定義的)與37LRP特定抗原殘基相結(jié)合。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供癌癥調(diào)節(jié)抗體(CDMAB)及其抗原結(jié)合片段。
本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，其細(xì)胞毒通過(guò)抗體依賴性細(xì)胞毒(ADCC)來(lái)介導(dǎo)。
本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，其細(xì)胞毒通過(guò)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒來(lái)(CDC)介導(dǎo)。
本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，其細(xì)胞毒是其因?yàn)槠淠軌虼呋?xì)胞化學(xué)鍵的水解。
本發(fā)明另一個(gè)目的是生成CDMAB，該CDMAB在癌癥的診斷、預(yù)后和監(jiān)測(cè)的結(jié)合試驗(yàn)中是有用的。
本發(fā)明其它的目的和優(yōu)點(diǎn)通過(guò)本發(fā)明下述的說(shuō)明、舉例和實(shí)施例將變得顯而易見(jiàn)。


圖1.6BD-25、5LAC-23和抗Fas(陽(yáng)性對(duì)照)抗體靶向抗幾種癌和非癌細(xì)胞系的典型FACS圖。
圖2.6BD-25在預(yù)防性SW1116結(jié)腸癌模型中對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響。陰影線表示抗體給藥的時(shí)間。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。
圖3.6BD-25在預(yù)防性O(shè)VCAR-3卵巢癌模型中對(duì)體重的影響。陰影線表示抗體給藥的時(shí)間。數(shù)據(jù)點(diǎn)表示平均+/-SEM。
圖4.患有腫瘤的小鼠在用6BD-25或緩沖液對(duì)照治療后的存活率。在治療后的240天里監(jiān)測(cè)小鼠的存活。
圖5A和5B.OVCAR-3細(xì)胞的總細(xì)胞裂解物(T)和細(xì)胞質(zhì)餾分(C)的Western雜交，采用同種型對(duì)照(A)或5LAC23(B)染色。5LAC-23檢測(cè)到了不同的條帶，如黑色箭頭所示。
圖6A和6B.通過(guò)2-D電泳分離的OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)蛋白的Western雜交。A顯示了探針為IgM同種型對(duì)照的雜交帶，而B(niǎo)顯示了探針為5LAC-23的雜交帶。箭頭指示由5LAC-23識(shí)別的斑點(diǎn)。
圖7A、7B和7C.OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)蛋白的二維SDS-PAGE和Western雜交。A顯示細(xì)胞質(zhì)餾分的銀染膠。C說(shuō)明了由5LAC-23識(shí)別的蛋白質(zhì)位置，而B(niǎo)說(shuō)明了一種同種型抗體探針雜交相似斑點(diǎn)。箭頭指示由5LAC-23識(shí)別的斑點(diǎn)。
圖8A、8B、8C和8D.OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)餾分的Western雜交，探針為抗37LRP抗體H-150(A)、抗37LRP抗體F-18(B)、IgM同種型對(duì)照(C)和5LAC-23(B)。
圖9A和9B.來(lái)自O(shè)VCAR-3細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)蛋白的二維Western雜交。雜交A上的箭頭表示5LAC-23結(jié)合的主要斑點(diǎn)。雜交B中的線條表示針對(duì)抗37LRP(H-150)抗體的斑點(diǎn)。雜交帶上揭示的其他斑點(diǎn)是由于與抗體的同種型或使用的二級(jí)抗體相互作用的結(jié)果。
圖10A、10B、10C和10D.CHO細(xì)胞的免疫染色(10倍放大)，所述CHO細(xì)胞被編碼37LRP(pCMV-XL537LRP)的人cDNA克隆表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染，5LAC-23(底排)和IgM同種型對(duì)照(頂排)。細(xì)胞被Fugene試劑單獨(dú)(A)或增加數(shù)量的pCMV-XL537LRP(1微克B；2微克C；4微克D)所轉(zhuǎn)染。當(dāng)用5LAC-23對(duì)細(xì)胞染色時(shí)，可以看到質(zhì)粒數(shù)目的增加伴隨著增加數(shù)目的陽(yáng)性細(xì)胞(棕色)。
圖11A、11B和11C.CHO細(xì)胞的免疫染色(40×)，所述CHO細(xì)胞被編碼37LRP(pCMV-XL537LRP；2微克)的人cDNA克隆的表達(dá)質(zhì)粒所轉(zhuǎn)染。細(xì)胞被5LAC-23(A)、抗37LRP抗體H-150(B)和抗67LR抗體MLuC5(C)染色，可以在所有免疫染色中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性細(xì)胞。
圖12A、12B和12C.通過(guò)Western分析，用多種抗體檢測(cè)人37LRP在大腸桿菌(E.coli)中的表達(dá)。被包含在細(xì)菌反應(yīng)混合物中的質(zhì)粒包括具有C末端His6標(biāo)記的對(duì)照載體GFP、pIVEX2.3dLRP(37LRP；泳道2)和pIVEX2.4dLRPNHis6(具有N末端His6標(biāo)記的37LRP；泳道3)。雜交探針為IgM同種型對(duì)照(A)、5LAC-23(B)和抗37LRP抗體H-150(C)。
圖13A、13B和13C.用5LAC-23(底排)和IgM同種型對(duì)照(頂排)對(duì)石蠟包埋組織進(jìn)行染色。切片來(lái)自正常胃(A)、正常肝(B)和肝細(xì)胞癌(C)。
圖14A、14B和14C.多種抗體與凍存的配對(duì)正常肝組織(頂排)和配對(duì)腫瘤組織(底排)的結(jié)合。使用的抗體是IgM同種型對(duì)照(A)5LAC-23(B)和抗細(xì)胞角蛋白8(C)。
圖15A和15B.使用5LAC-23()和IgM同種型對(duì)照對(duì)正常肺上皮細(xì)胞系Beas-2B進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。細(xì)胞用Vitrogen培養(yǎng)(B)或不用Vitrogen培養(yǎng)(A)。
圖16A和16B.非還原條件下用Western雜交檢測(cè)抗37LRP抗體H-150(A)和5LAC-23(B)表位在大量腫瘤及變異細(xì)胞系中的表達(dá)。細(xì)胞系包括野生型CHO細(xì)胞(泳道1)和人細(xì)胞系HB4aR4.a(泳道2)、HMT 3522(泳道3)、MCF-7(泳道4)、MDA-MB-231(泳道5)、MDA-MB-361(泳道6)、OVCAR-3(泳道7)、Chang′s Liver(泳道8)、HepG2(泳道9)、A375(泳道10)、DLD-I(泳道11)、LS174T(泳道12)和SW620(泳道13)。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1雜交瘤生產(chǎn)-雜交瘤細(xì)胞系6BD-25和5LAC-23
根據(jù)布達(dá)佩斯條約，雜交瘤細(xì)胞系6BD-25和5LAC-23于2003年12月9日保藏在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，地址10801University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209，保藏號(hào)分別是PTA-5691和PTA-5690。根據(jù)37 CFR 1.808的規(guī)定，保藏者保證在專利授權(quán)時(shí)永久取消對(duì)公眾獲取該保藏材料的所有限制。6BD-25和5LAC-23的克隆衍生、上清液和細(xì)胞ELISA篩選之前已經(jīng)在US6657048中描述過(guò)。
通過(guò)在CL-1000瓶(BD Biosciences，Oakville，ON)中培養(yǎng)雜交瘤來(lái)生成單克隆抗體，每星期兩次收集和再接種。然后用瓊脂糖凝膠Protein G Sepharose 4 Fast Flow(Amersham Biosciences，Baie d′Urfé，QC)，依照標(biāo)準(zhǔn)的抗體純化過(guò)程來(lái)純化抗體。
細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)中，將6BD-25和5LAC-23與許多陽(yáng)性(抗Fas(EOS9.1，IgM，kappa，20μg/mL，eBioscience，San Diego，CA)、抗EGFR(C225，IgG1，kappa，5μg/mL，Cedarlane，Hornby，ON)、環(huán)己酰亞胺(100μmol，Sigma，Oakville，ON)、NaN3(0.1％，Sigma，Oakville，ON))和陰性(107.3(抗TNP)，IgG1，kappa，20μg/ml，BD Bioscience，Oakville，ON)、G155-178(抗TNP,IgG2a，kappa，20μg/mL，BDBiosciences，Oakville，ON)、MPC-11(抗原特異性未知，IgG2b，kappa，20μg/mL)、J606(抗果聚糖，IgG3，kappa，20μg/mL)、IgG緩沖液(2％)、IgM緩沖液(2％))對(duì)照進(jìn)行了比較(表2)。乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231)，MAD-MB-468(MB-468)，MCF-7)、結(jié)腸癌(HT-29，SW1116，SW620)、肺癌(NCI-H460)、卵巢癌(OVCAR-3)、前列腺癌(PC-3)和非癌(CCD-27sk，Hs888.Lu)細(xì)胞系都進(jìn)行了測(cè)試(全部來(lái)自ATCC，Manassas，VA)。Live/Dead細(xì)胞毒性測(cè)定法獲自Molecular Probes公司(Eugene，OR)。根據(jù)生產(chǎn)者的要求進(jìn)行測(cè)定，做了下述改變。測(cè)定前將細(xì)胞以預(yù)先確定的適當(dāng)濃度進(jìn)行鋪板。2天后，將100μl純化的抗體或?qū)φ障♂尯筠D(zhuǎn)移至細(xì)胞孔板，于5％CO2的培育箱中培養(yǎng)5天?？装褰?jīng)倒空并吸干。通過(guò)多通道塑料擠壓瓶將室溫下的、含有MgCl2and CaCl2的DPBS分入每個(gè)孔中，輕敲三次，倒空，然后吸干。將用含有MgCl2和CaCl2的DPBS稀釋的50微升的熒光鈣黃綠素染料加入到每個(gè)孔中，在5％CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)30分鐘。Perkin-Elmer HTS7000熒光讀板機(jī)讀板，數(shù)據(jù)用Microsoft Excel進(jìn)行分析。結(jié)果在表1中列出。數(shù)據(jù)代表了四組試驗(yàn)(每組實(shí)驗(yàn)有三次平行測(cè)定值)的平均值，用下述方式定性表示4/4的實(shí)驗(yàn)高出閾值細(xì)胞毒性(++++)；3/4的實(shí)驗(yàn)高出閾值細(xì)胞毒性(++)；2/4的實(shí)驗(yàn)高出閾值細(xì)胞毒性(+)。表1中未標(biāo)記的細(xì)胞表示不連續(xù)或作用未達(dá)到閾值細(xì)胞毒性。化學(xué)細(xì)胞毒性試劑產(chǎn)生了預(yù)期的細(xì)胞毒性，而許多其他用來(lái)比較的抗體也預(yù)期表現(xiàn)出對(duì)生物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的限制。6BD-25抗體在乳腺、卵巢和結(jié)腸癌細(xì)胞系中表現(xiàn)出選擇性的細(xì)胞毒性，而對(duì)非變異的正常細(xì)胞沒(méi)有毒性。5LAC-23抗體在卵巢癌細(xì)胞系中具有選擇性細(xì)胞毒性，而對(duì)非變異的正常細(xì)胞也沒(méi)有毒性。6BD-25和5LAC-23抗體的活性是選擇性的，因?yàn)椴皇撬械陌┘?xì)胞系都受影響。另外，6BD-25和5LAC-23抗體表現(xiàn)出功能特異性，因?yàn)樗鼈儧](méi)有產(chǎn)生對(duì)非癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性，這是一個(gè)重要的治療因素。
表26BD-25和5LAC-23抗體的體內(nèi)細(xì)胞毒性

通過(guò)流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS)評(píng)價(jià)了6BD-25與上述所列癌細(xì)胞及正常細(xì)胞系的結(jié)合。開(kāi)始用DPBS(不含Ca++和Mg++)洗滌單層細(xì)胞，準(zhǔn)備進(jìn)行FACS。然后用細(xì)胞離解緩沖液(INVITROGEN，Burlington，ON)在37℃條件下將細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)板上分離出來(lái)。離心收集細(xì)胞，用4℃的、含有MgCl2、CaCl2和2％胎牛血清的Dulbecco′s磷酸鹽緩沖液(洗滌介質(zhì))懸浮細(xì)胞，計(jì)數(shù)，稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)胞濃度，離心沉淀細(xì)胞后懸浮于含有6BD-25(未偶合或與生物素偶合)、5LAC-23或?qū)φ湛贵w(同種型對(duì)照或抗Fas)的濃度為20μg/mL的染色介質(zhì)(含有MgCl2和CaCl2的DPBS)中，冰上放置30分鐘。使用生物素?；噭?Pierce E2-Link Sulfo-NHS-LC-biotin，Rockford，IL)偶合6BD-25和生物素。加入比6BD-25摩爾數(shù)多20倍的生物素?；噭覝叵抡駝?dòng)培養(yǎng)2小時(shí)。然后將生物素?；?BD-25在PBS中40℃下透析過(guò)夜。在加入結(jié)合了熒光染料Alexa Fluor 488的二抗(針對(duì)未結(jié)合的原始抗體)或結(jié)合了抗生物素蛋白鏈霉素R-藻紅蛋白的二抗(針對(duì)生物素?；?BD-25)之前，細(xì)胞用洗滌液洗滌一次。然后加入適當(dāng)?shù)娜旧橘|(zhì)中的二抗，經(jīng)過(guò)30分鐘。最后洗滌一次細(xì)胞，并懸浮于含有1μg/mL碘化丙啶的染色介質(zhì)中。通過(guò)在FACSan上跑樣并使用CellQquest軟件(BD Biosciences，Oakville，ON)來(lái)評(píng)價(jià)流式細(xì)胞計(jì)數(shù)的細(xì)胞獲取。通過(guò)調(diào)節(jié)FSC和SSC檢測(cè)器的電壓和幅度(amplitude)來(lái)設(shè)置細(xì)胞的前向散射(FSC)和測(cè)向散散(SSC)。通過(guò)經(jīng)純化的同種型對(duì)照抗體及隨后適當(dāng)二抗染色的細(xì)胞來(lái)調(diào)整三個(gè)熒光通道(FL1、FL2和FL3)的檢測(cè)器，以便細(xì)胞具有均勻的峰，中位熒光強(qiáng)度大約為1-5單位。篩選獲得活細(xì)胞用于FSC和碘化丙啶排除。對(duì)于每個(gè)樣品，大約需要10000個(gè)活細(xì)胞用于分析，結(jié)果如表3所示。表3列出了高出同種型對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度倍增，定性表示如下1.5(-)；1.5-2(+)；2-3(++)；3-10(+++)和＞10(++++)。
圖1匯集了有代表性的6BD-25和5LAC-23抗體直方圖。未偶合的6BD-25最初沒(méi)有結(jié)合任何被測(cè)細(xì)胞系。但是，在6BD-25與生物素結(jié)合而提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度后，證明低水平抗原存在于MDA-MB-231、C-13、OVCA-429和OV2008癌細(xì)胞表面。通過(guò)FACS，5LAC-23表現(xiàn)出與結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620高水平和特異性的結(jié)合。對(duì)于6BD-25和5LAC-23來(lái)說(shuō)，這進(jìn)一步證明了結(jié)合程度未必預(yù)示了抗體與其相關(guān)抗原連接的結(jié)果，這是一個(gè)非顯而易見(jiàn)的發(fā)現(xiàn)。這表明在不同細(xì)胞中的抗體連接情況決定了細(xì)胞毒性，而不僅僅是抗體結(jié)合。
表36BD-25和5LAC-23的FACS分析

實(shí)施例2體內(nèi)結(jié)腸預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖2數(shù)據(jù)，給4-8周的雌性SCID小鼠頸背皮下注射100微升含有5百萬(wàn)SW1116人結(jié)腸癌細(xì)胞的生理鹽水。小鼠被隨機(jī)分為兩個(gè)治療組，每組10只。植入前一天，腹腔注射300微升的6BD-25測(cè)試抗體溶液(20mg/kg)或?qū)φ站彌_液，所述抗體溶液由保存濃縮液稀釋而來(lái)，所用稀釋劑含有500mMNaCl、20mMNa2HPO4·H2O和20mMNaH2PO4·H2O。然后，以同樣方式每周注射一次抗體，持續(xù)7周。
大約每7天用測(cè)量?jī)x測(cè)定腫瘤的生長(zhǎng)，持續(xù)至16周，或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)規(guī)定的極限或112天。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都根據(jù)CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。
在整個(gè)研究中，沒(méi)有臨床毒性癥狀。使用獨(dú)立的樣品測(cè)試來(lái)分析數(shù)據(jù)，使用均值差異性t檢驗(yàn)來(lái)確定顯著性。在第50天(最終治療后1天)，6BD-25治療組的腫瘤體積是緩沖液對(duì)照組的54％(p＝0.001)。延緩的腫瘤生長(zhǎng)在治療期后持續(xù)。在第112天(治療后63天)，抗體治療組的腫瘤體積是緩沖液對(duì)照組的59％(p＝0.002)?？傊?，在公認(rèn)的人結(jié)腸癌腫瘤模型中，6BD-25抗體治療與對(duì)照組相比減輕了腫瘤負(fù)擔(dān)。這些結(jié)果表明該抗體(6BD-25)在其他哺乳動(dòng)物(包括人)中作為治療方法的潛在的藥理學(xué)和藥劑學(xué)益處。
實(shí)施例3體內(nèi)卵巢預(yù)防性腫瘤實(shí)驗(yàn)參考圖3和4數(shù)據(jù)，給4-8周的雌性SCID小鼠頸背皮下注射1000微升含有5百萬(wàn)OVCAR-3人卵巢癌細(xì)胞的生理鹽水。小鼠被隨機(jī)分為兩個(gè)治療組，每組10只。植入后一天，腹腔注射300微升的6BD-25測(cè)試抗體溶液(20mg/kg)或?qū)φ站彌_液，所述抗體溶液由保存濃縮液稀釋而來(lái)，所用稀釋劑含有500mMNaCl、20mMNa2HPO4·H2O和20mMNaH2PO4·H2O。然后，以同樣方式每周注射一次抗體，持續(xù)9周。
大約每7天用測(cè)量?jī)x測(cè)定腫瘤的生長(zhǎng)，持續(xù)至11周，或直至個(gè)體動(dòng)物達(dá)到加拿大動(dòng)物護(hù)理委員會(huì)(CCAC)規(guī)定的極限或76天。在研究的持續(xù)過(guò)程中記錄動(dòng)物的體重。在研究結(jié)束時(shí)，所有的動(dòng)物都依照CCAC指南進(jìn)行安樂(lè)死。
在整個(gè)研究中，沒(méi)有臨床毒性癥狀。體重作為腫瘤進(jìn)展的替代量度(圖3)。增加的體重代表腫瘤負(fù)擔(dān)，因?yàn)轶w重增加是因?yàn)楦顾纬?。Dunnett′st檢驗(yàn)來(lái)測(cè)定顯著性。植入后80天(治療結(jié)束后16天)，6BD-25治療組中的小鼠體重顯著低于緩沖液對(duì)照組(p＝0.002)。6BD-25治療與緩沖液對(duì)照相比還具有提高的存活率(圖4)，如時(shí)序?qū)嶒?yàn)檢測(cè)的。對(duì)照組小鼠中位存活時(shí)長(zhǎng)為87.0天，而6BD-25治療組為107.5天(p＜0.02)。同時(shí)，緩沖液對(duì)照組的所有小鼠都在植入后120內(nèi)死亡(治療后56天)?？贵w治療組中，治療后250天(治療后186天)依然有1只小鼠存活?？偨Y(jié)，在另一個(gè)公認(rèn)的人類癌疾病模型中，6BD-25抗體治療與緩沖液對(duì)照相比，抑制了腫瘤負(fù)擔(dān)。6BD-25還提高了卵巢癌異種移植模型中的存活。
總體上，在小鼠的結(jié)腸和卵巢癌預(yù)防性腫瘤異種移植模型中，6BD-25在抑制腫瘤生長(zhǎng)方面比緩沖液對(duì)照明顯更加有效。6BD-25治療在公認(rèn)的人卵巢癌疾病模型中還顯示出存活受益，表明了該抗體治療其他哺乳動(dòng)物(包括人)的藥理學(xué)和藥劑學(xué)益處。另外，在SW1116和OVCAR-3上檢測(cè)不到的或低水平的抗原表達(dá)，說(shuō)明抗原表達(dá)水平并不必然與體內(nèi)效力有關(guān)。
實(shí)施例4Western雜交確認(rèn)結(jié)合蛋白為確認(rèn)由抗體5LAC-23所識(shí)別的抗原，將表達(dá)該抗原的細(xì)胞裂解物和細(xì)胞質(zhì)成分進(jìn)行凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜。使用Western雜交來(lái)確定由這一抗體檢測(cè)的蛋白質(zhì)。
1.一維SDS-PAGE之前通過(guò)FACS分析證明了5LAC-23與卵巢癌細(xì)胞系的弱結(jié)合，5LAC-23表現(xiàn)出對(duì)這一細(xì)胞系的細(xì)胞毒作用(美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?0/810163，以參考文獻(xiàn)的方式將其內(nèi)容并入本文)?？偧?xì)胞裂解物在RIPA緩沖液[50mM Tris-HCl，pH7.2；150mM NaCl；0.1％(w/v)SDS；1％(w/v)去氧膽酸鈉；1％(w/v)Triton X-100]中制備，而細(xì)胞成分使用Mem-PER真核膜蛋白提取試劑盒(Cat.No.89826；Pierce；Tattenhall，Cheshire，UK)來(lái)制備。生成的親水性成分經(jīng)過(guò)去除膜組分而得到基本的濃縮，并被認(rèn)為是細(xì)胞質(zhì)成分。蛋白酶抑制因子(SIGMA P8340)被加入所有裂解步驟中。部分細(xì)胞制品上12％凝膠，在60V下電泳30分鐘，然后150V，直至染料前沿到達(dá)膠底部。通過(guò)NOVEX XCeI1 II點(diǎn)模式(Invitrogen，Paisley，UK)，在30伏的電壓下經(jīng)過(guò)2小時(shí)，蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜后，使用含有0.5％吐溫(TBST)、5％脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水4℃下對(duì)膜封閉過(guò)夜。膜用初級(jí)抗體室溫培養(yǎng)4小時(shí)。初級(jí)抗體包括5LAC-23(5μg/mL)和同種型對(duì)照(鼠抗-三硝基酚、IgM、κ；克隆G155-228；Cat.No.553472；BD PharMingen；Oxford，Oxon，UK；5μg/ml)。膜經(jīng)TBST洗滌3次之后，用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的山羊抗鼠IgM、μ鏈特異性抗體(1/10,0000；Cat.No.115-035-075；Jackson Immunologicals West Grove，PA，USA)培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌膜5次，使用ECL Western雜交檢測(cè)試劑(Amersham)來(lái)檢測(cè)HRP。
5LAC-23與OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)成分的結(jié)合產(chǎn)生了大約40kDa的電泳條帶(圖5)，如黑色箭頭所示。該條帶在OVCAR-3細(xì)胞制成的總細(xì)胞裂解物中非常弱，表明該抗原可以通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞質(zhì)成分而被富集。該條帶沒(méi)有被同種型對(duì)照檢測(cè)出來(lái)，表明與5LAC-23的相互作用是特異性的。盡管在大約70kD也觀察到了明顯條帶，但同種型對(duì)照檢測(cè)該條帶的量度較低。根據(jù)這一實(shí)驗(yàn)，5LAC-23顯示出與大約kD的蛋白質(zhì)特異性結(jié)合。
2.2二維SDS-PAGE使用Plus One 2-D Clean-Up試劑盒(Cat.No.80-6484-51；Amersham，Little Chalfont，Bucks，UK)對(duì)上述制備的總細(xì)胞質(zhì)蛋白進(jìn)行沉淀，然后懸浮于含有兩性電解質(zhì)的再水合緩沖液，pH3-10。第一向等電聚焦(IEF)在IPGphor(Amersham)上進(jìn)行，7cm固定pH3-10梯度干膠條(Amersham，Little Chalfont，Bucks，UK)，含有再水合溶液(8M urea，2％CHAPS；Amersham)。電壓限制為30V持續(xù)14小時(shí)來(lái)實(shí)現(xiàn)再水合，然后200V持續(xù)1小時(shí)、500V持續(xù)1小時(shí)、1000V持續(xù)30分鐘和8000V直至達(dá)到8000Vh。在IEF分離之后，在不含DTT、含有2.5％IAA的SDS-PAGE平衡緩沖液中平衡干膠條15分鐘。干膠條被置于10％凝膠的頂端，然后用0.5％瓊脂糖密封。SDS-PAGE電泳在60V下進(jìn)行30分鐘，然后150V直至染料前沿到達(dá)凝膠底端。使用Hoefer TE 77 Semi-Dry Transfer Unit(Amersham)，將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。
在轉(zhuǎn)膜之后，使用含有0.5％吐溫(TBST)、5％脫脂奶粉的Tris-緩沖鹽水4℃下對(duì)膜封閉過(guò)夜。膜與初級(jí)抗體一起室溫下培養(yǎng)4小時(shí)。初級(jí)抗體包括5LAC-23(5μg/mL)和同種型對(duì)照(鼠抗-三硝基酚、IgM、κ；克隆G155-228；Cat.No.553472；BD PharMingen；Oxford，Oxon，UK；5μg/ml)。膜經(jīng)TBST洗滌3次之后，與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)結(jié)合的山羊抗鼠IgM、μ鏈特異性抗體(1/5000-1/10,0000；Cat.No.115-035-075；Jackson Immunologicals West Grove，PA，USA)培養(yǎng)1小時(shí)。洗滌膜5次，使用ECL Western雜交檢測(cè)試劑(Amersham)來(lái)檢測(cè)HRP。
圖6說(shuō)明與5LAC-23一起培養(yǎng)的OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)成分的Western雜交。與同種型對(duì)照培養(yǎng)的雜交(Figure 6a)相比，在與5LAC-23探針的雜交中能夠發(fā)現(xiàn)一個(gè)不同的斑點(diǎn)(Figure 6b)。該獨(dú)特的斑點(diǎn)如箭頭所示，具有酸性pI，分子量與36kD的蛋白質(zhì)標(biāo)記相似。使用較大的干膠條(18cm；Amersham)重復(fù)雙向電泳，目的是確認(rèn)與酸性蛋白結(jié)合的5LAC-23，來(lái)提高蛋白斑的分離并能獲得足量蛋白用于隨后的質(zhì)譜分析。依照程序化的設(shè)置進(jìn)行再水合作用和IEF30V 14h；200V 30min；500V 30min；1000V 1h梯度；6500V 3h梯度；8000V?？俈h為54000-60000。隨著IEF的分離，在含有2.5％IAA的SDS-PAGE平衡緩沖液中平衡干膠條15分鐘。干膠條置于12％凝膠上并用0.5％的瓊脂糖密封，SDS-PAGE在60V下過(guò)夜。依照生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)，使用PlusOne銀染試劑盒(PlusOne Sliver Staining kit)(Cat.No.17-1150-01；Amersham)對(duì)一個(gè)凝膠進(jìn)行蛋白質(zhì)染色，與MS分析相一致。其他膠如上所述進(jìn)行蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)PVDF膜。同上，探針5LAC-23和同種型對(duì)照與膜雜交。轉(zhuǎn)膜后，凝膠也被進(jìn)行如上的蛋白質(zhì)染色，來(lái)幫助校正蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。
圖7中，能夠清晰可見(jiàn)5LAC-23與之結(jié)合的OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)成分的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。圖7a顯示了銀染色的OVCAR-3細(xì)胞質(zhì)成分的凝膠。圖7b說(shuō)明同種型對(duì)照沒(méi)有與任何蛋白質(zhì)斑點(diǎn)結(jié)合，而與5LAC-3探針雜交的斑點(diǎn)中明顯存在一個(gè)不同的斑點(diǎn)(圖7c)，分子量與36kD蛋白標(biāo)記相似。5LAC-3的結(jié)合是特異性的，因?yàn)橛猛N型對(duì)照沒(méi)有檢測(cè)到該斑點(diǎn)(圖7b)。這一實(shí)驗(yàn)證實(shí)了5LAC-23與之結(jié)合的抗原性殘疾大約為36kD并具有酸性等電點(diǎn)(pI)。
實(shí)施例5通過(guò)質(zhì)譜鑒定結(jié)合蛋白質(zhì)用無(wú)菌吸管頭將對(duì)應(yīng)于5LAC-23所識(shí)別的37-40kD蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的凝膠區(qū)域切下。然后使用凝膠塞，通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。將樣品在凝膠內(nèi)進(jìn)行胰蛋白酶水解，使用aMWGRoboseq 4204 robot(MWG Biotech)。多肽從凝膠塞中釋放，使用1％甲酸和2％乙腈。在MicroMass Q-TOF Global上分析一部分水解上清液，使用75mm、Cl8柱用于肽分離。使用MASCOT檢索數(shù)據(jù)。
MS分析鑒定的、5LAC-23所識(shí)別的凝膠區(qū)域中的蛋白質(zhì)列在表4中。質(zhì)譜鑒定的5LAC-23抗原是層粘連蛋白受體1。
表4.5LAC-23從人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR-3識(shí)別的經(jīng)鑒定的蛋白質(zhì)

實(shí)施例65LAC-23抗原的確認(rèn)1.通過(guò)共區(qū)域化研究確認(rèn)推定抗原的確認(rèn)是通過(guò)測(cè)定已知的抗37LRP抗體是否能與5LAC-23共區(qū)域化。來(lái)自O(shè)VCAR-3細(xì)胞質(zhì)成分中的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE被分離并雜交印跡到硝酸纖維素膜上。如上所述，對(duì)一維SDS-PAGE進(jìn)行了Western雜交。初級(jí)抗體包括5LAC-23(5μg/mL)、IgM同種型對(duì)照(如前所述；5μg/mL)、抗37LRP抗體H-150(0.2μg/mL；Cat.No.sc-20979；Santa Cruz Biotechnology；Santa Cruz，CA，USA；該抗體用來(lái)抵抗相應(yīng)于人37LRP的AA 110-250的重組蛋白質(zhì))、抗37LRP抗體F-18(0.4μg/mL；Cat.No.sc-21534；Santa Cruz)和正常兔IgG(0.2μg/mL；Cat.No.AB-105-C；R&D Systems；Abingdon，Oxon，UK)。二級(jí)抗體包括前述的HRP結(jié)合的山羊抗鼠IgM(1/5000-10000；Jackson Immunologicals)用于IgMs檢測(cè)、HRP結(jié)合的抗兔免疫球蛋白(1/2000；Cat.no.P0448；DAKO，Carpentaria，CA，USA)和HRP結(jié)合的抗山羊免疫球蛋白(1/2000；Cat.No.P0449)。
兩種抗37LRP抗體，H-150和F-18，與分子量約為40kD的條帶結(jié)合(圖8A和8B)。5LAC-23也與類似大小的條帶結(jié)合(圖4D)，而IgM同種型對(duì)照沒(méi)有，證明5LAC-23與該蛋白的相互作用是特異性的。
OVCAR-3細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白準(zhǔn)備進(jìn)一步的二維Western，如二維SDS-PAGE部分所述，除了IEF的進(jìn)行是使用pharmylates(pI3.5-5)來(lái)限制pH范圍。用于雜交的初級(jí)和次級(jí)抗體如前所述。
圖9顯示了5LAC-23和H-150與Western雜交的結(jié)合，并與適當(dāng)同種型對(duì)照探針雜交做了比較(數(shù)據(jù)未顯示)。5LAC-23識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)顯示在圖9中，黑色箭頭所示?？?7LRP抗體、H-150結(jié)合到黑線突出顯示的較廣的蛋白質(zhì)斑(圖9)，與凝膠上5LAC-23結(jié)合區(qū)域相一致?？赡蹾-150識(shí)別的斑點(diǎn)包含至少3個(gè)蛋白質(zhì)斑，可能表明OVCAR-3細(xì)胞的胞質(zhì)蛋白中含有不同的蛋白質(zhì)亞型。斑點(diǎn)上檢測(cè)到的其他蛋白質(zhì)是源于同種型抗體或次級(jí)抗體間的相互作用，而非特異性的針對(duì)5LAC-23或H-150?？?7LRP抗體和5LAC-23與約40kD蛋白質(zhì)相結(jié)合，進(jìn)一步證明了37LRP確實(shí)是針對(duì)5LAC-23的抗原。然而，盡管分子量相似，但5LAC-23表現(xiàn)出獨(dú)特的結(jié)合模式，與其他抗37LRP抗體相比。這表明兩個(gè)抗體識(shí)別的表位是不同的，5LAC-23表現(xiàn)了更嚴(yán)格的結(jié)合。
2.通過(guò)轉(zhuǎn)染研究確認(rèn)通過(guò)測(cè)定5LAC-23能否與經(jīng)37LRP的cDNA克隆轉(zhuǎn)染的細(xì)胞相結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)推定抗原的確認(rèn)。在質(zhì)粒pCMV6-XL5(被稱為pCMV-XL537LRP；產(chǎn)品號(hào)TC107938；訪問(wèn)號(hào)NM-002295；ORIGENE Technologies；Rockville，MA，USA)中獲得一個(gè)編碼37LRP的cDNA克隆。中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞在6孔板中生長(zhǎng)至60-70％融合(F12 Ham營(yíng)養(yǎng)混合物；10％FBS；2mM谷氨酰胺)。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)(Cat.No.1988387；Roche Diagnostics；Lewes，East Sussex，UK)，利用Fugene轉(zhuǎn)染試劑用pCMV-XL537LRP轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞在免疫染色前生長(zhǎng)至少48小時(shí)。用PBS洗滌細(xì)胞2次，然后與冰冷丙酮∶甲醇(1∶1)混合3分鐘。去除丙酮∶甲醇，風(fēng)干細(xì)胞。用PBS洗滌3次，然后使用2％FBS在PBS中封閉30分鐘。加入初級(jí)抗體，室溫下培養(yǎng)1小時(shí)。初級(jí)抗體包括5LAC-23(5μg/mL)、IgM同種型對(duì)照(如前所述；5μg/mL)、抗37LRP抗體(H-150；0.2μg/mL；SantaCruz Biotechnology)、抗67LR抗體(MLuC5；Cat.no.ab3099；4μg/mL；Abeam limited，Cambridge，Cambs，UK)和正常兔IgG(0.2μg/mL；Cat.No.AB-105-C；R&D Systems；Abingdon，Oxon，UK)。細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌3次后，加入二級(jí)抗體(HRP結(jié)合的山羊抗鼠IgM，1/1000；JacksonImmunologicals)培養(yǎng)1小時(shí)。二級(jí)抗體包括前述的HRP結(jié)合的山羊抗鼠IgM(1/5000-10000；Jackson Immunologicals)用于檢測(cè)IgMs和HRP結(jié)合的抗兔免疫球蛋白(1/200；DAKO)。洗滌細(xì)胞3次，使用DAB底物試劑盒(Cat.No.SK4-4100；Vector laboratories；Peterborough，Cambs.，UK)依照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)檢測(cè)HRP。
免疫染色說(shuō)明5LAC-23染色呈陽(yáng)性(棕色)的細(xì)胞增加了，因?yàn)镈NA(pCMV-XL537LRP)的數(shù)量增加了(圖10)。同種型對(duì)照染色的CHO細(xì)胞帶一些背景染色，但這是相似的，不論轉(zhuǎn)染過(guò)程中使用的DNA質(zhì)量如何(圖10，頂排)，表明5LAC-23與瞬間轉(zhuǎn)染的細(xì)胞之間的結(jié)合是特異性的。這些結(jié)果證實(shí)了針對(duì)5LAC-23的結(jié)合蛋白是37kd LRP。
除了轉(zhuǎn)染細(xì)胞的5LAC-23染色外，一些細(xì)胞也用靶向37LRP和67LP的兩種其他抗體來(lái)染色(圖11)。抗37LRP抗體H-150識(shí)別一些集中于細(xì)胞質(zhì)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞(圖11B)。識(shí)別67LR的二級(jí)抗體MLuC5也結(jié)合一些細(xì)胞(圖11C)，盡管結(jié)合方式不同于5LAC-23和H-150(圖11A和11C)。其他研究者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，MLuC5未能與轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞相結(jié)合。這可能是由于實(shí)驗(yàn)性差異，如使用不同的啟動(dòng)子、二級(jí)抗體或克隆、或染色技術(shù)的不同。注意，MLuC5染色可能被限制在溶酶體膜區(qū)室，實(shí)現(xiàn)受體的釋放，用于結(jié)合層粘連蛋白。這些結(jié)果證實(shí)了轉(zhuǎn)染蛋白，37LRP，成功表達(dá)于CHO細(xì)胞中。這些結(jié)果也證明67LR與37LRP多肽相關(guān)，它能夠在CHO細(xì)胞中被合成。SDS-PAGE結(jié)果表明，5LAC-23結(jié)合前體分子，而不是67kD的層粘連蛋白受體，因?yàn)?LAC-23結(jié)合的蛋白大約為37-45kD(實(shí)施例4)。這一揭示轉(zhuǎn)染細(xì)胞免疫染色模式的實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，5LAC-23主要位于細(xì)胞質(zhì)，更類似于H-150結(jié)合，相對(duì)于MluC5結(jié)合。總之，這一證據(jù)表明針對(duì)5LAC-23的抗原是37LRP前體分子，而非67LR。
3.通過(guò)37LRP細(xì)菌表達(dá)的確認(rèn)為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)假定的5LAC-23，37LRP cDNA被克隆入表達(dá)載體，用于在無(wú)細(xì)胞的體外翻譯系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白質(zhì)合成。質(zhì)粒pCMV-XL537LRP(前述；ORIGENE)被用作模板來(lái)擴(kuò)增37LRPcDNA，引物為5′-GGGAAATTTTCCATATGTCCGGAGC-3′(包括一個(gè)合成Nde I位點(diǎn))和5′-CCTATGC AAGCCCGGGTTAAGACCAG-3′(包括一個(gè)終止密碼子和合成Sma I位點(diǎn))。使用Turbo DNA聚合酶(Stratagem)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。DNA模板在94℃下變性5分鐘，隨后30個(gè)循環(huán)(94℃、45分鐘，60℃、45分鐘，72℃、1分鐘)并延長(zhǎng)10、72℃。利用Nde I和Sma I位點(diǎn)，將37LRP PCR產(chǎn)物克隆入pIVEX2.3d和pIVEX2.4d(Cat.no.03 269 019 001；Roche)。生成的質(zhì)粒包括pIVEX2.3dLRP(沒(méi)有His6-標(biāo)記的37LRP)和prVEX2.4dLRPNHis6(在N末端帶有His6-標(biāo)記的37LRP)。按照生產(chǎn)商的說(shuō)明(RTS 100 E.coli HYKit；Cat no.3186 148；Roche Diagnostics，Lewes，UK)，使用無(wú)細(xì)胞的體外翻譯系統(tǒng)在細(xì)菌中表達(dá)37LRP蛋白。一部分反應(yīng)混合物上10％凝膠，然后轉(zhuǎn)硝酸纖維素膜。使用5％脫脂乳在TBST中4℃下封閉過(guò)夜。加入初級(jí)抗體，室溫培養(yǎng)3小時(shí)。TBST洗滌5次后，加入二級(jí)抗體，室溫1小時(shí)。初級(jí)抗體包括5LAC-23(5μg/mL)、IgM同種型對(duì)照(如前所述；5μg/mL)、抗37LRP抗體(H-150；0.2μg/mL；SantaCruz Biotechnology)和正常兔IgG(0.2μg/mL；R&D Systems)。二級(jí)抗體包括前述的HRP結(jié)合的山羊抗鼠IgM(1/5000-10000；JacksonImmunologicals)用于檢測(cè)IgMs和HRP結(jié)合的抗兔免疫球蛋白(1/200；DAKO)。洗滌5次后，用ECL Western雜交檢測(cè)試劑檢測(cè)HRP結(jié)合抗體(Amersham)。
Western雜交分析表明，只有當(dāng)反應(yīng)混合物中含有37LRP(pIVEX2.3dLRP(37LRP和prVEX2.4dLRPNHis6)的模板時(shí)，抗37LRP抗體、H-150和5LAC-23才與細(xì)菌反應(yīng)混合物中合成的蛋白質(zhì)相結(jié)合(圖12)。當(dāng)反應(yīng)混合物中含有表達(dá)GFP的對(duì)照質(zhì)粒時(shí)，5LAC-23和H-150沒(méi)有與反應(yīng)混合物結(jié)合。針對(duì)C末端His6標(biāo)記的抗體證實(shí)了GFP蛋白是合成的(數(shù)據(jù)未顯示)。反應(yīng)混合物從pIVEXLRP構(gòu)建質(zhì)粒上至少產(chǎn)生2鐘蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可能由于這些構(gòu)建質(zhì)粒中含有兩個(gè)起始密碼子(一個(gè)緊隨核糖體結(jié)合位點(diǎn)之后，一個(gè)位于用于克隆的Nde I位點(diǎn))，或者由于翻譯后的修飾。雖然5LAC-23和H-150識(shí)別兩種相似的蛋白條帶，但結(jié)合模式完全不同。5LAC-23優(yōu)先結(jié)合頂部條帶，該條帶更多的以涂帶形式出現(xiàn)，表明可能的翻譯后修飾。H-150結(jié)合不同的條帶(注意每個(gè)條帶是成對(duì)的；在照片中不明顯)。出現(xiàn)IgM同種型對(duì)照與上部37LRP的一些結(jié)合(圖8，A)，可能是由于蛋白質(zhì)超載而產(chǎn)生的非特異性結(jié)合。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了5LAC-23與37kD LRP的結(jié)合，并進(jìn)一步證明了該抗體結(jié)合針對(duì)的獨(dú)特表位，不同于已知的抗37LRP抗體H-150。
使用羅氏的RTS系統(tǒng)，大量翻譯后修飾被排除在37LRP產(chǎn)物合成之外。這些修飾包括N-和O-糖基化、磷酸化和雙硫鍵生成。其他分子(如脂類和硫酸基團(tuán))可能被加入多肽并成為5LAC-23結(jié)合表位的一部分。ScanProsite(Expasy)預(yù)測(cè)，37LRP序列具有大量的磷酸化位點(diǎn)、2N-肉豆蔻酮?；稽c(diǎn)和酪氨酸硫酸化位點(diǎn)。潛在的肉豆蔻基能夠被排除在5LAC-23表位之外，因?yàn)榇竽c桿菌不能調(diào)節(jié)這一修飾。磷酸化的缺乏也許是有趣的，因?yàn)槿绻?LAC-23結(jié)合到多肽序列，該序列可能在正常人類細(xì)胞中被磷酸化并在腫瘤細(xì)胞中被去磷酸化，從而暴露5LAC-23抗原。
實(shí)施例7冷藏保存的正常人組織中抗原分布的IHC研究對(duì)冷藏保存的組織進(jìn)行IHC研究來(lái)表現(xiàn)5LAC-23抗原在正常人組織中的分布特征。冷藏保存的正常人組織切片可以從Covance(UK)獲得。它們?cè)诒泄潭?0分鐘，然后在洗滌緩沖液(含有0.02％吐溫20的PBS)中洗滌2次。通過(guò)在含有0.6％過(guò)氧化氫的甲醇中培養(yǎng)15分鐘來(lái)封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性。切片經(jīng)緩沖液洗滌，在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫封閉20分鐘。然后在2％BSA(SP-5050；Vector Laboratories Ltd)中進(jìn)一步封閉20分鐘。使用卵白素/生物素封閉試劑盒(SP-2001；Vector Laboratories Ltd)，依照生產(chǎn)商說(shuō)明，封閉內(nèi)源性生物素位點(diǎn)。5LAC-23、抗細(xì)胞角蛋白8(M0631；Dako Cytomation)和IgM抗KLH同種型對(duì)照(550340；BD PharMingen)和切片一起以5μg/mL于含2％BSA的洗滌緩沖液中室溫培養(yǎng)60分鐘。切片洗滌3次，與山羊抗鼠IgM生物素酰化的二級(jí)抗體(B9265；Sigma-AldrichCompany Ltd)一起以1∶100的比例于含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫培養(yǎng)30分鐘。切片被洗滌3次，然后與卵白素-HRP一起室溫培養(yǎng)30分鐘，所述卵白素-HRP是根據(jù)鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；Vector Laboratories Ltd)制備。洗滌3次后，切片被DAB染色，依照生產(chǎn)商的說(shuō)明(SK-4100；Vector Laboratories Ltd)。在水洗滌后，切片經(jīng)Harris′s蘇木紫復(fù)染，大量水洗滌，然后脫水并裝入DPX封固劑(M/Dl 10/08；Fischer Scientific Ltd)。
在冷藏的正常組織上，5LAC-23與正常的腦和腎小管結(jié)合，而與受試的其他組織都不結(jié)合(表5)。
表5.冷藏的正常組織切片染色

g＝顆粒狀的；epi＝上皮組織；mc＝膜的/細(xì)胞質(zhì)的；c＝細(xì)胞質(zhì)的；bv＝血管；heps＝肝細(xì)胞這些結(jié)果表明，5LAC-23的抗原不是廣泛表達(dá)于正常組織上，且該抗體只與人體中有限數(shù)目的組織結(jié)合。
實(shí)施例8人類正常和腫瘤IHC通過(guò)檢測(cè)更廣范圍的福爾馬林固定人類組織的結(jié)合而擴(kuò)展了人類組織結(jié)合的結(jié)果。福爾馬林固定的石蠟包埋的正常器官和腫瘤陣列芯片(B A3；AMS Biotechnology Ltd)通過(guò)乙醇脫臘。切片短暫浸泡于洗滌緩沖液(PBS with 0.02％Tween-20)中。抗原回收是通過(guò)在低pH的靶回收溶液(S1699；Dako Cytomation)中以最大功率進(jìn)行微波20分鐘。通過(guò)在含有0.6％過(guò)氧化氫的甲醇中保溫15分鐘，內(nèi)源性過(guò)氧化物活性被阻斷。阻斷前，切片在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫洗滌20分鐘。依照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)使用卵白素/生物素阻斷試劑盒(SP-2001；Vector Laboratories Ltd)阻斷內(nèi)源性生物素位點(diǎn)。5LAC-23和IgM抗KLH同種型對(duì)照(550340；BD PharMingen)與0.75μg/mL切片一起在含有1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫培養(yǎng)90分鐘。切片在培養(yǎng)前被洗滌兩次，洗滌緩沖液為山羊抗鼠IgM生物素?；?B 9265；Sigma-Aldrich Company Ltd)1∶100稀釋于含有1％馬血清的洗滌緩沖液，室溫30分鐘。洗滌兩次后，切片在依照小鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；Vector Laboratories Ltd)制備的卵白素-HRP中室溫培養(yǎng)30分鐘。切片洗滌兩次，然后依照試劑盒(SK-4100；VectorLaboratories Ltd)使用DAB進(jìn)行染色。切片洗滌一次后，用Harris′s蘇木紫復(fù)染，然后大量水洗滌，然后脫水并在DPX固定介質(zhì)(MfDl 10/08；Fischer Scientific Ltd)中固定。
表6說(shuō)明，當(dāng)組織被石蠟包埋時(shí)，5LAC-23與骨骼肌、正常肝和正常胃弱結(jié)合。在前述實(shí)施例中，5LAC-23的結(jié)合被限制在正常組織中。5LAC-23與肝細(xì)胞癌(HCC)有最強(qiáng)的結(jié)合，而與胃腺癌有弱結(jié)合。它沒(méi)有與受試的其他正?；蚰[瘤組織結(jié)合。這些IHC研究表明，與正常肝和絕大部分其他正常組織相比，5LAC-23與HCC有明顯區(qū)別的結(jié)合。
表6.5LAC-23對(duì)人正常器官和腫瘤陣列芯片的染色


sc＝分散細(xì)胞；ctis＝結(jié)締組織；g＝顆粒性的；epi＝上皮組織mc＝膜的/細(xì)胞質(zhì)的；c＝細(xì)胞質(zhì)的；bv＝血管；heps＝肝細(xì)胞圖13中可以看到使用5LAC-23染色的正常胃(A)、正常肝(B)和肝腫瘤(C)的實(shí)例。同種型對(duì)照沒(méi)有結(jié)合任何組織，說(shuō)明5LAC-23的結(jié)合是特異性的。5LAC-23主要與細(xì)胞質(zhì)結(jié)合，但也觀察到一些細(xì)胞膜上的聚集。5LAC-23與正常肝和正常胃的結(jié)合非常弱，但與惡性肝的結(jié)合強(qiáng)。
實(shí)施例95LAC-23與人肝腫瘤切片的結(jié)合進(jìn)行了IHC研究，來(lái)確定5LAC-23抗原與人類肝癌的關(guān)聯(lián)。福爾馬林固定的石蠟包埋的肝陣列芯片(CSl；AMS Biotechnology Ltd)通過(guò)乙醇被脫臘。芯片被短暫浸泡于洗滌緩沖液(含0.02％吐溫20的PBS)中?？乖厥帐峭ㄟ^(guò)在低pH的靶回收溶液(S1699；DakoCytomation)中以最大功率進(jìn)行微波20分鐘。通過(guò)在含有0.6％過(guò)氧化氫的甲醇中保溫15分鐘，內(nèi)源性過(guò)氧化物活性被阻斷。阻斷前，切片在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫洗滌20分鐘。依照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)使用卵白素/生物素阻斷試劑盒(SP-2001；Vector Laboratories Ltd)阻斷內(nèi)源性生物素位點(diǎn)。5LAC-23和IgM抗KLH同種型對(duì)照(550340；BD PharMingen)與0.75μg/mL切片一起在含有1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫培養(yǎng)90分鐘。切片在培養(yǎng)前被洗滌兩次，洗滌緩沖液為山羊抗鼠IgM生物素?；?B 9265；Sigma-Aldrich Company Ltd)1∶100稀釋于含有1％馬血清的洗滌緩沖液，室溫30分鐘。洗滌兩次后，切片在依照小鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；VectorLaboratories Ltd)制備的卵白素-HRP中室溫培養(yǎng)30分鐘。切片洗滌兩次，然后依照試劑盒(SK-4100；Vector Laboratories Ltd)使用DAB進(jìn)行染色。切片洗滌一次后，用Harris′s蘇木紫復(fù)染，然后大量水洗滌，然后脫水并在DPX固定介質(zhì)(MfDl 10/08；Fischer Scientific Ltd)中固定。
5LAC-23結(jié)合了一個(gè)HCC組織陣列芯片上73％的HCC切片(表7)，但在一個(gè)或兩個(gè)樣品中只有幾個(gè)細(xì)胞被染色。染色主要是細(xì)胞質(zhì)。這些結(jié)果表明，5LAC-23抗原不僅在肝癌中高度表達(dá)(相對(duì)于其他組織類型)，而且它在多數(shù)來(lái)自不同患者的人類肝癌中表達(dá)。
表7.人類肝陣列芯片與5LAC-23和IgM同種型對(duì)照的IHC



實(shí)施例10配對(duì)的正常和肝腫瘤染色配對(duì)的正常和原發(fā)人類肝癌細(xì)胞組織的冷藏芯片(T6235149；AMS Biotechnology Ltd)經(jīng)解凍后風(fēng)干。在丙酮中固定10分鐘，然后在洗滌緩沖液(含有吐溫20的PBS)中洗滌兩次。在含有0.6％過(guò)氧化氫的甲醇中保溫15分鐘，內(nèi)源性過(guò)氧化物活性被阻斷。阻斷前洗滌芯片，在含1％馬血清的洗滌緩沖液中室溫20分鐘。在2％BSA(SP-5050；Vector Laboratories Ltd)中進(jìn)一步阻斷20分鐘。依照生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)使用卵白素/生物素阻斷試劑盒(SP-2001；Vector LaboratoriesLtd)阻斷內(nèi)源性生物素位點(diǎn)。5LAC-23、抗細(xì)胞角蛋白-8(M0631；Dako Cytomation)和IgM抗KLH同種型對(duì)照(550340；BD PharMingen)與5μg/mL切片一起在含有2％BSA的洗滌緩沖液中室溫培養(yǎng)60分鐘。切片在培養(yǎng)前被洗滌3次，洗滌緩沖液為山羊抗鼠IgM生物素?；?B 9265；Sigma-Aldrich Company Ltd)1∶100稀釋于含有1％馬血清的洗滌緩沖液，室溫30分鐘。洗滌3次后，切片在依照小鼠IgG Vectastain ABC試劑盒(PK-6102；Vector Laboratories Ltd)制備的卵白素-HRP中室溫培養(yǎng)30分鐘。切片洗滌3次，然后依照試劑盒(SK-4100；Vector Laboratories Ltd)使用DAB進(jìn)行染色。切片洗滌后，用Harris′s蘇木紫復(fù)染，大量水洗滌，然后脫水并固定于DPX固定介質(zhì)(MfDl 10/08；Fischer Scientific Ltd)中。
圖14顯示了來(lái)自同一個(gè)體的配對(duì)的正常和腫瘤組織的冷藏肝切片。注意，細(xì)胞角蛋白8(C)集中于正常肝細(xì)胞，結(jié)合限制于正常組織，表明一些切片是正常組織和癌組織的混合物。5LAC-23只結(jié)合腫瘤樣品，并針對(duì)代表該切片惡性組織的中心區(qū)域。切片經(jīng)同種型對(duì)照染色為陰性，表明5LAC-23的結(jié)合是特異性的。5LAC-23的染色模式表明，在患者樣品中，該抗體高度特異性的針對(duì)惡性細(xì)胞，從而使它成為令人關(guān)注的藥靶。
實(shí)施例11改變生長(zhǎng)條件而誘導(dǎo)的正常細(xì)胞中的結(jié)合進(jìn)行了條件實(shí)驗(yàn)來(lái)考察能否在選定條件下誘導(dǎo)5LAC-23表達(dá)。β-2B“正?！狈紊掀ぜ?xì)胞生長(zhǎng)在未包被或經(jīng)vitrogen(0.03mg/mlvifrogel；Cohesion Technologies Inc.)包被的培養(yǎng)瓶上。細(xì)胞被培養(yǎng)于支氣管上皮生長(zhǎng)培養(yǎng)基(CC-3170；Clonetics)中，濕潤(rùn)的空氣環(huán)境(95％空氣/5％CO2)，37℃。當(dāng)大約80％融合的時(shí)候，將細(xì)胞與細(xì)胞裂解溶液(SIGMA Cat.No.C5914)一起移出，PBS中洗滌2次，10％福爾馬林中固定30分鐘。細(xì)胞沉淀于乙醇中脫水，之后懸浮于石蠟中45℃培養(yǎng)60分鐘，期間更新石蠟3次。冷卻并靜置后，Leica RM 2135切片機(jī)上切下3μm切片并固定于載玻片上。切片經(jīng)5μg/mL的5LAC-23或IgM同種型對(duì)照染色，作為如上所述的成對(duì)肝樣品。只有當(dāng)細(xì)胞與Vitrogen一起培養(yǎng)時(shí)才能看見(jiàn)5LAC-23與正常肺上皮細(xì)胞系β-2B的結(jié)合(Figure 15)。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)IgM同種型對(duì)照的結(jié)合，表明在一定的條件下，如存在生長(zhǎng)因子、粘附分子和細(xì)胞外基質(zhì)分子，5LAC-23的抗原能夠被誘導(dǎo)，甚至是在正常細(xì)胞中。這些生長(zhǎng)條件的異常經(jīng)常發(fā)生在惡化和惡化前的狀態(tài)，可以促成37LRP表達(dá)的改變，如在肝細(xì)胞癌中所觀察到的。
實(shí)施例12Western分析5LAC-23在各種人類細(xì)胞系中的分布通過(guò)Western分析對(duì)人類細(xì)胞系進(jìn)行了考察，來(lái)評(píng)價(jià)37LRP和5LAC-23表位的分布。細(xì)胞裂解物是在含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液中從大量人類腫瘤或變異細(xì)胞系制備而得，Western雜交的進(jìn)行如一維SDS-PAGE章節(jié)所述。裂解物從如下細(xì)胞系制備乳腺細(xì)胞系HB4aR4.a(經(jīng)Ras轉(zhuǎn)化的正常乳腺細(xì)胞)、HMT 3522(正常細(xì)胞)、MCF-7(腫瘤細(xì)胞)、MDA-MB-231(腫瘤細(xì)胞)；MDA-MB-361(源自乳腺腫瘤的腦轉(zhuǎn)移)；卵巢腫瘤細(xì)胞系OVCAR-3；肝細(xì)胞系Chang′sLiver和HepG2；黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375；和結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系DLD-I、LS174T和SW620。野生型的CHO細(xì)胞也被包括在內(nèi)，因?yàn)橹耙呀?jīng)報(bào)道了來(lái)自中國(guó)倉(cāng)鼠的37LRP蛋白(Cricetulus griseus；NCBIAccession number298088)。雜交探針為H-150或5LAC-23，如共區(qū)域化章節(jié)所述。
抗37LRP抗體H-150識(shí)別所有受試細(xì)胞中的蛋白帶，包括野生型CHO細(xì)胞(圖16A)。注意，H-150檢測(cè)到在結(jié)腸細(xì)胞系DLD-I中至少存在2條蛋白帶，表明存在不同的人類亞型。Western中，雖然H-150和5LAC-23結(jié)合相似大小的條帶，但5LAC-23以不同于H-150的方式與細(xì)胞裂解物結(jié)合(圖16B)。H-150檢測(cè)所有細(xì)胞系中的37LRP，5LAC-23表位的表達(dá)在不同細(xì)胞裂解物中有所變化并在一些細(xì)胞裂解物中不存在?？贵w間的這種差別不是歸因于5LAC-23對(duì)其抗原的親和力比H-150與其抗原的親和力低，因?yàn)閮煞N抗體與CHO細(xì)胞裂解物的結(jié)合是相似的。5LAC-23檢測(cè)了LS174T裂解物在非還原條件下約110kD的獨(dú)特條帶(圖16B，泳道12)。該條帶在還原條件下消失，但對(duì)應(yīng)于37LRP前體的條帶沒(méi)有增強(qiáng)(數(shù)據(jù)未顯示)。這些結(jié)果進(jìn)一步證明37LRP上由5LAC-23所識(shí)別的表位是獨(dú)特的，相對(duì)于已知的抗LRP抗體H-150。通過(guò)免疫組織化學(xué)分析(轉(zhuǎn)染章節(jié)，實(shí)施例6)，5LAC-23沒(méi)有結(jié)合野生型CHO細(xì)胞，但Western表明它在還原和非還原條件下都與wt CHO裂解物結(jié)合(圖16)。這表明5LAC-23的表位可以是構(gòu)型依賴性的和/或該表位在天然條件下是不暴露于抗體或抗體無(wú)法與之接近的。
總之，數(shù)據(jù)表明5LAC-23是癌相關(guān)抗原并表達(dá)于人體中，也是病理學(xué)相關(guān)的癌靶點(diǎn)。另外，數(shù)據(jù)還說(shuō)明5LAC-23抗體與人類癌組織的結(jié)合，并能被適當(dāng)使用于診斷、治療預(yù)測(cè)或預(yù)后的測(cè)定中。另外，該抗原的細(xì)胞區(qū)域化指示著細(xì)胞的癌狀態(tài)，因?yàn)樵摽乖诖蟛糠址菒盒约?xì)胞中缺少表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)允許該抗原、它的基因或衍生物、它的蛋白或變型用于診斷、治療預(yù)測(cè)或預(yù)后的測(cè)定中。
本說(shuō)明書(shū)中提到的所有專利和公開(kāi)出版物代表了本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員的水平。所有專利和出版物都以參考資料的方式并入本文，其引用程度如同每個(gè)出版物被特別單獨(dú)指明以參考資料的方式并入本文。
需要理解盡管本發(fā)明以某一方式被說(shuō)明，這不是要將本發(fā)明限制在本文所描述或顯示的特定形式或部分安排。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是在不偏離本發(fā)明范圍的情況下可以做出不同的變化，不能認(rèn)為本發(fā)明局限于本說(shuō)明書(shū)所顯示和描述的內(nèi)容。一個(gè)現(xiàn)有技術(shù)人員將容易理解適當(dāng)調(diào)整本發(fā)明來(lái)實(shí)現(xiàn)目的并獲得所提到的及其固有的結(jié)果和優(yōu)點(diǎn)。本文描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物學(xué)相關(guān)化合物、方法、程序和技術(shù)都是目前代表性的優(yōu)選實(shí)施方式，目的是可效仿實(shí)現(xiàn)而不是對(duì)范圍的限制。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)人員來(lái)說(shuō)一些變化和其他使用，這些變化和使用都包含在本發(fā)明的構(gòu)思之內(nèi)并被權(quán)利要求書(shū)的范圍所限定。盡管本發(fā)明以特定的優(yōu)選實(shí)施方式被描述，但是應(yīng)該理解所要求保護(hù)的發(fā)明不應(yīng)當(dāng)被不適當(dāng)?shù)南拗圃谶@些特定實(shí)施方式中。實(shí)際上，為實(shí)施本發(fā)明所描述的方式的各種對(duì)現(xiàn)有技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的修改都要在權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種通過(guò)治療哺乳動(dòng)物中的人類腫瘤來(lái)延長(zhǎng)存活和/或延緩疾病進(jìn)展的方法，其中所述腫瘤表達(dá)一種與單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷特異性結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷具有保藏在ATCC、保藏號(hào)為PTA-5691的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物注入有效降低所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)擔(dān)的量的所述單克隆抗體，從而延緩疾病進(jìn)展和/或延長(zhǎng)存活。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體與細(xì)胞毒殘基相結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述細(xì)胞毒殘基是放射性同位素。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體激活補(bǔ)體。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是鼠抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是人源化抗體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體是嵌合抗體。
9.一種由保藏在ATCC、保藏號(hào)為PTA-5691的克隆所編碼的分離的單克隆抗體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，該抗體是人源化抗體。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，該抗體是嵌合抗體。
12.權(quán)利要求9所述的分離的單克隆抗體的抗原結(jié)合片斷。
13.權(quán)利要求10所述的人源化抗體的抗原結(jié)合片斷。
14.權(quán)利要求11所述的嵌合抗體的抗原結(jié)合片斷。
15.根據(jù)權(quán)利要求9、10、11、12、13和14中任意一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片斷，與選自細(xì)胞毒殘基、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞中的一種物質(zhì)相交聯(lián)，從而形成抗體交聯(lián)物。
16.保藏在ATCC、保藏號(hào)為PTA-5691的分離的克隆。
17.一種檢測(cè)人類腫瘤組織樣品中癌細(xì)胞存在的結(jié)合測(cè)定法，包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號(hào)為PTA-5691的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品接觸；和，測(cè)定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品的結(jié)合；從而指示所述癌細(xì)胞存在于所述組織樣品中。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的結(jié)合測(cè)定法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自卵巢和乳腺組織。
19.從選自人類腫瘤的組織樣品中分離或篩選癌細(xì)胞的方法，包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號(hào)為PTA-5691的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品接觸；和，測(cè)定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品的結(jié)合；從而，所述癌細(xì)胞通過(guò)所述結(jié)合而被分離，并證實(shí)它們存在于所述組織樣品中。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自卵巢和乳腺組織。
21.由保藏在ATCC、保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的抗體，該抗體是人源化的抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的抗體，該抗體是嵌合抗體。
24.權(quán)利要求21所述的分離的單克隆抗體的抗原結(jié)合片斷。
25.權(quán)利要求22所述的人源化抗體的抗原結(jié)合片斷。
26.權(quán)利要求23所述的嵌合抗體的抗原結(jié)合片斷。
27.根據(jù)權(quán)利要求21、22、23、24、25和26中任意一項(xiàng)所述的分離的抗體或抗原結(jié)合片斷，與選自細(xì)胞毒殘基、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞中的一種物質(zhì)相結(jié)合，從而形成抗體交聯(lián)物。
28.保藏在ATCC、保藏號(hào)為PTA-5690的分離的克隆。
29.一種測(cè)定人類腫瘤組織樣品中癌細(xì)胞存在的結(jié)合測(cè)定法，包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品相接觸；和，測(cè)定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品的結(jié)合；從而表明所述癌細(xì)胞存在于所述組織樣品中。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的結(jié)合測(cè)定法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自結(jié)腸組織。
31.從人類腫瘤組織樣品中分離或篩選癌細(xì)胞的方法，包括提供來(lái)自所述人類腫瘤的組織樣品；提供ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品接觸；和，測(cè)定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷或其抗體交聯(lián)物與所述組織樣品的結(jié)合；從而，所述癌細(xì)胞通過(guò)所述結(jié)合而被分離，并證實(shí)它們存在于所述組織樣品中。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中所述人類腫瘤組織樣品獲自組織中生成的腫瘤，所述組織選自結(jié)腸組織。
33.一種識(shí)別組織樣品中層粘連蛋白受體1前體(37LRP)的方法，包括提供組織樣品；將所述組織樣品與由ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的雜交瘤細(xì)胞系所生成的、與37LRP所表達(dá)的抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷相接觸，所述抗原殘基的特征是與所述分離的單克隆抗體獨(dú)特結(jié)合；和，測(cè)定所述抗原殘基的結(jié)合；從而識(shí)別37LRP。
34.一種診斷肝細(xì)胞癌患者的方法，包括提供肝細(xì)胞癌疑似患者的組織樣品；將所述組織樣品與由ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的雜交瘤細(xì)胞系所生成的、與37LRP表達(dá)的抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷相接觸，所述抗原殘基的特征是與所述分離的單克隆抗體獨(dú)特結(jié)合；和，測(cè)定所述抗原殘基的結(jié)合；從而確認(rèn)肝細(xì)胞癌的診斷。
35.一種用于37LRP表達(dá)細(xì)胞的區(qū)分、處理或診斷顯像的方法，包括提供所述細(xì)胞的樣品；提供包含分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷的交聯(lián)殘基，所述抗體或其抗原結(jié)合片斷是一種與被表達(dá)的37LRP抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結(jié)合，該抗體具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片斷與藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質(zhì)相結(jié)合；從而，所述交聯(lián)殘基與所述細(xì)胞的結(jié)合促成了對(duì)所述細(xì)胞的區(qū)分、處理或診斷顯像。
36.一種治療癌癥患者的方法，包括提供包含分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷的交聯(lián)殘基，所述抗體或其抗原結(jié)合片斷是一種與被表達(dá)的37LRP抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結(jié)合，該抗體具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性，所述分離的抗體或其抗原結(jié)合片斷與選自藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質(zhì)相結(jié)合；和，將所述交聯(lián)的殘基給入所述患者。
37.一種測(cè)定37LRP抗原殘基的表達(dá)細(xì)胞存在的結(jié)合測(cè)定法，所述抗原殘基與ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷特異性結(jié)合，包括提供細(xì)胞樣品；所述抗體或其抗原結(jié)合片斷是與所述被表達(dá)的37LRP抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結(jié)合，該抗體具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性；將所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷與所述細(xì)胞樣品相接觸；和，測(cè)定所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷與所述細(xì)胞樣品的結(jié)合；從而測(cè)定表達(dá)與所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷相結(jié)合的37LRP抗原殘基的細(xì)胞的存在。
38.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是人源化的。
39.根據(jù)權(quán)利要求33所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是嵌合的。
40.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是人源化的。
41.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是嵌合的。
42.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是人源化的。
43.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是嵌合的。
44.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是人源化的。
45.根據(jù)權(quán)利要求36所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是嵌合的。
46.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是人源化的。
47.根據(jù)權(quán)利要求37所述的方法，其中所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷是嵌合的。
48.一種通過(guò)治療哺乳動(dòng)物的人類腫瘤來(lái)延長(zhǎng)存活和/或延緩疾病進(jìn)展的方法，其中所述腫瘤表達(dá)與單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷特異性結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷具有保藏在ATCC、保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性，該方法包括給所述哺乳動(dòng)物注入能有效降低所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)擔(dān)的量的所述單克隆，從而延緩疾病進(jìn)展和/或延長(zhǎng)存活。
49.具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷在生產(chǎn)治療哺乳動(dòng)物人類腫瘤的藥劑中的應(yīng)用，其中所述腫瘤表達(dá)與所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷特異性結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體以有效降低所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)擔(dān)的量被給入，從而延緩疾病進(jìn)展和/或延長(zhǎng)存活。
50.具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5691的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷在生產(chǎn)治療哺乳動(dòng)物人類腫瘤的藥劑中的應(yīng)用，其中所述腫瘤表達(dá)與所述單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷特異性結(jié)合的抗原，所述單克隆抗體以有效降低所述哺乳動(dòng)物腫瘤負(fù)擔(dān)的量被給入，從而延緩疾病進(jìn)展和/或延長(zhǎng)存活。
51.包含分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷的交聯(lián)殘基在生產(chǎn)治療癌癥患者的藥劑中的應(yīng)用，所述抗體或其抗原結(jié)合片斷是與被表達(dá)的37LRP抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結(jié)合，該抗體具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷與藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質(zhì)相交聯(lián)。
52.包含分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷的交聯(lián)殘基在生產(chǎn)治療癌癥患者的藥劑中的應(yīng)用，所述抗原殘基的特征是被一種抗體結(jié)合，該抗體具有ATCC保藏號(hào)為PTA-5691的克隆所編碼的單克隆抗體的識(shí)別特性，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷與藥物、毒素、酶和放射性化合物中的至少一種物質(zhì)相交聯(lián)。
53.從腫瘤患者中選出那些對(duì)分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷治療敏感的患者的方法，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷與37LRP所表達(dá)的抗原殘基相結(jié)合，該方法包括提供來(lái)自腫瘤患者的組織樣品；將所述組織樣品與由ATCC保藏號(hào)為PTA-5690的雜交瘤細(xì)胞系所生成的、與37LRP表達(dá)的抗原殘基相結(jié)合的分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷相接觸，所述抗原殘基的特征是與所述分離的單克隆抗體獨(dú)特結(jié)合；和，測(cè)定所述抗原殘基的結(jié)合；從而實(shí)現(xiàn)患者的選擇。
54.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，進(jìn)一步包括用一種分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷治療患者，所述分離的單克隆抗體或其抗原結(jié)合片斷與37LRP所表達(dá)的抗原殘基相結(jié)合。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用新型篩選方案來(lái)生成患者的癌癥調(diào)節(jié)抗體的方法。該抗體能夠用于幫助腫瘤分期和診斷，還能用來(lái)治療原發(fā)性腫瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移?？拱┛贵w能夠與毒素、酶、放射性化合物和造血細(xì)胞交聯(lián)。本發(fā)明進(jìn)一步涉及這樣的診斷和治療，利用5LAC23單克隆抗體(或來(lái)源自它們的抗原結(jié)合片斷)與層粘連蛋白受體1前體蛋白37LRP相結(jié)合的能力；特別涉及肝細(xì)胞癌的診斷和治療，利用依賴于5LAC－23與特定抗原殘基直接結(jié)合的各種方法，所述抗原殘基被特異性識(shí)別并通常在肝細(xì)胞癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)。
文檔編號(hào)A61K47/48GK101023164SQ200580016953
公開(kāi)日2007年8月22日 申請(qǐng)日期2005年3月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月26日
發(fā)明者大衛(wèi)·S·F·楊, 蘇姍·E·哈恩, 海倫·P·芬德利, 福圖納·麥康基, 米歇爾·凱萊赫, 安德魯·沃納 申請(qǐng)人:阿里烏斯研究公司, 英國(guó)牛津生物醫(yī)藥有限公司