專利名稱：：含抗hla-g的單克隆抗體的癌癥診斷試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種單克隆抗體，具體地說，涉及一種抗人類白細胞抗原G(HLA-G)的單克隆抗體及其分泌該抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明還涉及利用該抗體制備的診斷惡性腫瘤的酶聯(lián)免疫測定試劑盒，以及該試劑盒在癌癥診斷，預(yù)后評價，治療方案的選擇以及治療監(jiān)測的臨床應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：人類白細胞抗原G(HLA-G)是一種非經(jīng)典I類白細胞抗原(見Geraghtyetal.ProcNatlAcadSciUSA.1987;84:9145-9)。該白細胞抗原的基因位于第6對染色體的短臂上；基因和表達的產(chǎn)物與經(jīng)典I類白細胞抗原(HLA-A,B和C)有86%雷同。HLA-G與經(jīng)典I類白細胞抗原相比有兩個重要特點一是、在正常生理情況下，HLA-G僅在胎盤的絨毛膜細胞表達(見Kovatsetal.Science.248:220。1990;McMasteretal,JImmunol.154:3771，1995)而HLA陽A，-B和-C在幾乎所有的有核體細胞均有表達。二是、HLA-G不具有多態(tài)性HLA-G只有一種，僅有6個等位基因；而經(jīng)典I類白細胞抗原有96種，536個等位基因。不過，HLA-G基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可被剪切成為異構(gòu)體?，F(xiàn)已觀察到四種表達膜蛋白的HLA-GmRNA的異構(gòu)體HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4和三種表達可溶性蛋白的HLA-GmRNA的異構(gòu)體HLA-G5，HLA-G6和HLA-G7。(見Ishitanietal.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:3947。1992;Kirszenbaumetal，Proc,Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:4029。1994;FujiietalJ.Immunol.153:5516。1995)。經(jīng)十多年來研究已經(jīng)證明HLA-G具有抑制自然殺傷細胞(NK)和細胞毒性T淋巴細胞(CTL)的功能，在胎兒的免疫耐受基理中起著重要的作用(有關(guān)綜述見LeMaoultetal.TissueAntigens.62:273.2003;)。腫瘤在發(fā)生和發(fā)展變化過程中，要表達一些不同于正常組織的腫瘤抗原。免疫系統(tǒng)對這些發(fā)生癌變的細胞有排斥消除的功能，稱之宿主的免疫監(jiān)視。但在已經(jīng)患上癌癥病人，癌細胞明顯地逃過了宿主的免疫監(jiān)視，這種現(xiàn)象稱之為腫瘤的免疫逃逸。在腫瘤生物學中，經(jīng)典I類白細胞抗原族基因表達的下調(diào)是一個常見的現(xiàn)象(有關(guān)綜述見Garridoetal，ImmunologyToday18:89.1997)。由于HLA-I族分子在細胞毒性的T淋巴細胞的活化中發(fā)揮中心作用，HLA-I族基因表達的下調(diào)就成為腫瘤逃逸機制之一。因為HLA-G具有抑制自然殺傷細胞和細胞毒性T淋巴細胞的功能，在胎兒的免疫耐受基理中起著重要的作用。如果腫瘤細胞出現(xiàn)HLA-G的異常表達，就有可能像其在胎兒的免疫耐受基理起的作用一樣，抑制宿主對腫瘤細胞的免疫排斥，而參與腫瘤免疫逃逸機制。從上世紀九十年代中(1996)起，已有大量的研究結(jié)果發(fā)表證明1)癌細胞出現(xiàn)HLA-G的異常表達也是腫瘤生物學中的一個普遍現(xiàn)象；2)HLA-G在腫瘤免疫逃逸機制中起作重要作用；3)測定HLA-G有較高的臨床應(yīng)用價值，使HLA-G能成為一個新的、較為理想的腫瘤標志物。如在本申請人較早的中國授權(quán)專利(專利號ZL200410040919.X)中公開了利用高特異性的抗HLA-G的單克隆抗體HGY檢測常見惡性腫瘤病變中的HLA-G異常表達來診斷癌癥的方法，利用免疫印漬技術(shù)和免疫組化技術(shù)測定細胞樣品或組織樣品中HLA-G的異常表達，在癌癥診斷中取得了良好的效果。酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)是一種非常靈敏的測定血清或其它體液樣品中抗原或抗體的方法。在這種測定方法中有3種必要的試劑①固相的抗原或抗體，②酶標記的抗原或抗體，③酶作用的底物。一般說來，ELISA方法測定結(jié)果的準確性，取決于固相抗原或抗體(一抗)以及酶標抗原或抗體(二抗)的特異性和敏感性，即，一抗和二抗特異性和敏感性越好，ELISA測定結(jié)果的準確率越高。在臨床診斷中，以血清或體液作為測定樣品具有極大的好處，如采集血液樣品相對簡便，無明顯的創(chuàng)傷，可以反復(fù)檢測，可方便地用于病程及治療監(jiān)雖然研究證明癌細胞出現(xiàn)HLA-G的異常表達是腫瘤生物學中的一個普遍現(xiàn)象，但測定血清可溶性HLA-G是否可應(yīng)用于癌癥的臨床診斷則尚未得到證實。僅有兩篇文獻報道采用HLA-G酶聯(lián)免疫測定法檢測了黑色素瘤病人和某些血細胞惡性腫瘤的血清樣品及一篇報道檢測卵巢癌和乳腺癌患者的腹水樣品。分述如下Ugurel等人用HLA-G酶聯(lián)免疫測定法檢測了190例不同臨床分期的黑色素瘤病人的血清樣品。并以126例正常健康人血清樣品作為對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中HLA-G濃度在黑色素瘤病人顯著地高于正常人。統(tǒng)計學上有極顯著的意義(P<0.0005)。結(jié)果還發(fā)現(xiàn)病人血清HLA-G濃度與病人臨床分期和腫瘤的大小密切相關(guān)。P值分別<0.001和0.05(見Ugureleta1.AmJPathoU59:817.2001)。這個研究結(jié)果證明測定血清中HLA-G濃度的變化不僅可以用以診斷病人是否患有惡性腫瘤，并且還可能顯示腫瘤的大小。Sebti等人也采用了HLA-G酶聯(lián)免疫法檢測了17例的慢性B淋巴細胞白血病，75例非何杰金氏B淋巴瘤和11例非何杰金氏T細胞淋巴瘤的血清樣品，并以30例正常人作為對照。還同時采用了RT-PCR，REAL-TIME-RT-PCR，免疫印跡和細胞免疫組化等技術(shù)。在這項研究中，發(fā)現(xiàn)有70%的慢性B淋巴細胞白血病病例，53%的非何杰金氏B淋巴瘤病例和45。/。非何杰金氏T細胞淋巴瘤病例，血清HLA-G濃度比正常人顯著地增高(見Sebtietal.HumImmunol.64:1093.2003)。因此，這個研究結(jié)果證明測定血清HLA-G濃度的變化可以用于這些血液腫瘤疾病的診斷。Singer等人用HLA-G酶聯(lián)免疫測定法測定了42例卵巢癌和108例乳腺癌患者的腹水樣品。同時還測定了18例相應(yīng)良性腫瘤病人的腹水樣品。他們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤患者的可溶性HLA-G濃度顯著地高于良性腫瘤病人(P<0.001)。更有意義的是用ROC曲線分析方法分析測定的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)ROC曲線下的面積為0.95。在將特異性定為100%時，檢測的靈敏度可高達78%(68-88%)。表明測定腹水樣品中HLA-G濃度變化，78%的卵巢癌和乳腺癌病人都有可能得到準確的診斷(見Singeretal.，CancerRes.9:4460.2003)。根據(jù)我們和其他研究小組采用免疫組化技術(shù)研究的結(jié)果，HLA-G在62-84%的肺癌，食道癌，胃癌，直結(jié)腸癌和乳腺癌均有不同程度的表達，并且HLA-G的表達與各種臨床和病理指標密切相關(guān)；表達HLA-G陽性的患者的生存率和時間明顯低于和短于HLA-G表達陰性的病人,是一種具有臨床應(yīng)用價值的，獨立的，涉及腫瘤免疫學的腫瘤預(yù)后指標(見專利，葉尚勉《抗HLA一G的單克隆抗體及分泌它的雜交瘤細胞株、癌癥診斷方法、診斷試劑盒及其應(yīng)用》專利號-.ZL200410040919.X,2007年4月25日；Yeetal.ModemPathology,20:357.2007;Yieetal，AnnalSurgicalOncology,2007;Yieetal,AmericanJournalofClinicPatlogy，2007;Yieetal,LungCancer,2007)。因為HLA-G僅在惡性腫瘤表達的特性及在上述常見惡性腫瘤有較高的陽性表達率，采用HLA-G酶聯(lián)免疫法檢測血清或血漿中HLA-G濃度的變化有可能成為癌癥診斷的特異性的臨床指標。但現(xiàn)今采用抗HLA-G單克隆抗體(87Q01Q223G,MEMG/9和4H84)靈敏度較差，用于腫瘤HLA-G組化研究僅得到21%-51%的陽性率(見Amiot等，HumanImmunol.59:524,1998;Real等，Int.J.Cancer81:512,1999;Frumento等，TissueAntigens56:30,2000;Hurks等，Invest.Ophthalmol,Vis.Sci.42:3081，2001。Mizuno等，Br.J.Haematol.Ill:280,2000;Urosevic等，Am.J.Pathol.159:817,2001;Urosevic等，Blood99:609,2002;Lefebvre等，J.Pathol.196:266，2002;Yang等，ChineseJ.Histochem.Cytochem.10:70,2001)。由這些抗HLA-G抗體建立的HLA-G酶聯(lián)免疫測定法的敏感性可能相對較低。根據(jù)文獻和調(diào)查，迄今為止，僅有極少數(shù)HLA-G酶聯(lián)免疫測定法應(yīng)用的報道，而且其中多數(shù)HLA-G酶聯(lián)免疫測定法都采用一種抗經(jīng)典I類白細胞抗原族的單克隆抗體(W6/32)作為酶聯(lián)免疫測定夾心法的"二抗"。W6/32單克隆抗體即能和HLA-G蛋白結(jié)合也能與HLA-A，B和C抗原結(jié)合。因為血清中存在大量的可溶性HLA-A，B，C蛋白(見Turowski&Kedzierska.MedSciMonit.6:123.2000)，這種HLA-G酶聯(lián)免疫測定法有可能特異也相對較低，從而影響其在臨床診斷上的應(yīng)用。如上所述，對于檢測癌癥病人血清中HLA-G蛋白來說，檢測試劑如抗體，必須能夠有足夠高的特異性和敏感性才能得到好的結(jié)果。我們在中國專利ZL200410040919.X中業(yè)已證明我們所發(fā)明的抗HLA-G的單克隆抗體[HGY]比現(xiàn)有的抗HLA-G的單克隆抗體有較高的特異性和敏感性，使得由該抗體為基礎(chǔ)建立具有更高的檢測特異性和靈敏度的HLA-G酶聯(lián)免疫測定法成為可能。適宜用測定血清或血槳中HLA-G濃度的變化作癌癥臨床診斷，預(yù)后和治療方案的選擇，其應(yīng)用前景十分樂觀。正是由于缺乏特異性和敏感性均較好的"二抗"，目前尚未見報道利用酶聯(lián)免疫測定試劑盒，測定血液或體液樣品中可溶性HLA-G的濃度，在肺癌，胃癌，直-結(jié)腸癌,食道癌等常見惡性腫瘤的癌癥診斷中取得良好結(jié)果的應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容針對現(xiàn)有HLA-G單克隆抗體作為癌癥檢測標志物和HLA-G酶聯(lián)免疫測定法的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種新的單克隆抗體，即抗HLA-G單克隆抗體，命名為HGY—2，它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200722的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的，屬IgGl亞型。本發(fā)明的單克隆抗體可以通過本發(fā)明的雜交瘤細胞株產(chǎn)生，因此可以從培養(yǎng)本發(fā)明的雜交瘤細胞株的培養(yǎng)液中獲得，或用雜交瘤細胞株細胞種植到實驗動物腹腔產(chǎn)生腹水而獲得。本發(fā)明的另一目的是提供一種雜交瘤細胞株，它能夠產(chǎn)生屬IgGl亞型的抗HLA-G單克隆抗體。本發(fā)明的雜交瘤細胞株可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的細胞融合技術(shù)產(chǎn)生。因此，用天然的HLA-G蛋白作為抗原免疫小鼠等動物，將該動物的脾細胞或淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，產(chǎn)生雜交瘤細胞株，并從中篩選出產(chǎn)生IgGl亞型的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，從而獲得本發(fā)明的雜交瘤細胞株。所述的雜交瘤細胞株，是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200722的雜交瘤細胞株，保藏日期2007年7月16日。本發(fā)明的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體構(gòu)成了本發(fā)明的一個方面。本發(fā)明的另一方面是，含有至少一種上述的單克隆抗體的試劑盒，優(yōu)選的試劑盒是含有上述的任意一種單克隆抗體，更優(yōu)選的試劑盒還含有由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200416的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體[HGY](制備方法見專利號ZL200410040919.X的中國專利)。由于本發(fā)明的單克隆抗體HGY—2與其他類型的HLA—I族抗原不存在交叉反應(yīng)，因此本發(fā)明的單克隆抗體對于HLA-G具有高度的特異性。并且本發(fā)明的單克隆抗體與多數(shù)HLA-G異構(gòu)體相結(jié)合，雖然不同類型的癌癥可能表達出不同的HLA-G異構(gòu)體，但是對不同類型癌癥的各種表達產(chǎn)物，本發(fā)明單克隆抗體都能夠加以檢測，因此具有很高的靈敏性。本發(fā)明提供一種檢測惡性腫瘤病人血清或其它體液HLA-G濃度的一種夾心式酶聯(lián)免疫測定法，采用高特異性和靈敏性的HLA-G單克隆抗體HGY包被酶標板或酶標條作為本發(fā)明中HLA-G酶聯(lián)免疫測定法中的"一抗"，該單克隆抗體能夠特異性地結(jié)合血清或血漿中可溶性HLA-G，而不與血清或血漿中可溶性HLA-A，B，C抗原結(jié)合。本發(fā)明的單克隆抗體HGY—2是一種不同于HGY,能夠結(jié)合HLA-G不同抗原表位的單克隆抗體，因此，本發(fā)明采用HGY一2作為本HLA-G酶聯(lián)免疫測定法中的"二抗"，HGY-2采用蛋白G免疫親和層析純化后用生物素標記。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫測定試劑盒是一種夾心式酶聯(lián)免疫測定試劑盒，是根據(jù)MicallefandAhsan所描述的原理而研發(fā)成功的(MicallefJ,AhsanR.Immunoassaydevelopment.In:GoslingJP,BassoLV，editors.Immunoassay:laboratoryanalysisandclinicalapplications.London:Butterworth-Heinemann;1994.p.51-68)。由于本發(fā)明的這兩種單克隆抗體與其他類型的HLAI族抗原不存在交叉反應(yīng)，因此本發(fā)明的單克隆抗體和多克隆抗體對于HLA-G具有高度的特異性。并且本發(fā)明的這兩種單克隆抗體均具有很高的靈敏性。使該檢測試劑盒具有很高的特異性，敏感性，準確性和可重復(fù)性。同時，本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法，能夠方便臨床的大規(guī)模使用，為癌癥的診斷，發(fā)展轉(zhuǎn)移的評價以及治療指導提供了一種可靠的有價值的途徑。本發(fā)明的試劑盒優(yōu)選采用ELISA技術(shù)進行檢測。本發(fā)明還研發(fā)出一種分離純化和制備HLA-G蛋白標準的方法。本發(fā)明與抗人白細胞抗原G(HLA-G)單克隆抗體在臨床腫瘤學的應(yīng)用有關(guān)。具體地講，本發(fā)明涉及對于發(fā)生在常見類型的腫瘤惡變的過程中血液及體液中HLA-G的含量變化；HLA-G酶聯(lián)免疫測定法是測定血清或其他體液中可溶性的HLA-G蛋白。測定的原理是采用兩種具有抗HLA-G蛋白特異性的單克隆抗體(該兩種單抗結(jié)合HLA-G蛋白不同的抗原表位)，用夾心式酶聯(lián)免疫方法，根據(jù)純化的HLA-G蛋白標準，定量地確定血清或其他體液中HLA-G的含量。附圖的簡要說明圖1.標記生物素的抗HLA-G單克隆抗體HGY與未標記HGY抗體或抗HLA-G單克隆抗體HGY-2用競爭性抗體捕獲酶聯(lián)免疫檢測法測定。因為HGY-2抗體結(jié)合不同于HGY單克隆抗體的HLA-G蛋白分子上的抗原表位，加入不同劑量的HGY-2抗體對標記HGY對HLA-G蛋白分子的結(jié)合無顯著的影響；而未標價的HGY則競爭標記HGY對HLA-G蛋白分子的結(jié)合。圖2.抗HLA-G單克隆抗體HGY-2的抗體稀釋曲線。圖3.顯示10批HLA-GELISA的標準曲線。采用抗HLA-G單克隆抗體[HGY]4。C過夜包被96孔酶標板或12x8/8x12酶標條，10|ug/ml，每孔50^1。洗板，封閉后加入用不同劑量的HLA-G蛋白標準品(0-lpg/ml，每孔50pl)。HLA-G蛋白標準品是用單克隆抗體HGY抗體制備的特異性免疫親和層析技術(shù)從早期妊娠胎盤組織裂解物中分離純化獲得。在室溫保溫1小時，洗板4次，然后加入l:500的生物素標記的抗HLA-G多克隆抗體，每孔50pl。室溫保溫1小時，再加入l:1000的Streptoavidin-HRP復(fù)合物，每孔50|il,室溫保溫1小時。以TMB為底物顯色，1MHC1終止顯色反應(yīng)。在酶標儀上讀450/630nm波長的光密度。最后用直線回歸方法進行分析，得出標準曲線的切距，斜率和直線回歸方程，用于樣品的血漿/血清中HLA-G濃度的確定。圖4.顯示HLA-G蛋白標準曲線和待測血漿樣品稀釋曲線的平行性。HLA-G蛋白標準曲線和待測血漿/血清樣品稀釋曲線的直線回歸方程分別為Y二0.067+0.553X和Y二0.013+0.501X。這兩條的直線回歸方程的斜率(0.553VS0.501)統(tǒng)計學上無顯著差異。圖5A和B分別為65例正常對照組和215例癌癥病人組的血槳HLA-G蛋白濃度的分布曲線.兩者均呈現(xiàn)正態(tài)分布。圖6A.正常對照血漿HLA-G蛋白濃度與癌癥病人血清HLA-G蛋白濃度的比較。癌癥病人血清中的HLA-G蛋白濃度顯著性地高于正常人血漿HLA-G蛋白濃度(T檢驗，t=9.35,P=0.0001)。圖6B.檢測血漿HLA-G蛋白對癌癥診斷的ROC曲線分析。曲線下面積(AUC)=0.890，P=0.0001。圖7A.43例肺癌病人的血漿HLA-G蛋白濃度的分布曲線。圖7B.65例正常對照血漿HLA-G蛋白濃度與43例肺癌病人血漿HLA-G蛋白濃度的比較。肺癌病人血漿中的HLA-G蛋白濃度顯著性地高于正常人血漿HLA-G蛋白濃度(T檢驗，t=4.35,P=0.0001)。圖7C.檢測血漿HLA-G蛋白對肺癌診斷的ROC曲線分析。AUC=0.714，P=0.0001。圖8A.58例食道癌病人的血漿HLA-G蛋白濃度的分布曲線。圖8B.65例正常對照血漿HLA-G蛋白濃度與58例食道癌病人血漿HLA-G蛋白濃度的比較。食道癌病人血漿中的HLA-G蛋白濃度顯著性地高于正常人血漿HLA-G蛋白濃度(T檢驗，t=10.83,P=0,0001)。圖8C.檢測血漿HLA-G蛋白對肺癌診斷的ROC曲線分析。AUC=0.943，P=0.0001。圖9A.28例胃癌病人的血漿HLA-G蛋白濃度的分布曲線。圖9B.65例正常對照血漿HLA-G蛋白濃度與28例胃癌病人血漿HLA-G蛋白濃度的比較。胃癌病人血漿中的HLA-G蛋白濃度顯著性地高于正常人血漿HLA-G蛋白濃度(T檢驗，t=6.80,P=0.0001)。圖9C.檢測血漿HLA-G蛋白對胃癌診斷的ROC曲線分析。AUC=0.867，P=0.0001。圖10A.37例直-結(jié)腸癌病人的血漿HLA-G蛋白濃度的分布曲線。圖10B.65例正常對照血漿HLA-G蛋白濃度與37例直-結(jié)腸癌病人血漿HLA-G蛋白濃度的比較。直-結(jié)腸癌病人血漿中的HLA-G蛋白濃度顯著性地高于正常人血漿HLA-G蛋白濃度(T檢驗，t=10.78,P=0.0001)。圖10C.檢測血漿HLA-G蛋白對直-結(jié)腸癌診斷的ROC曲線分析。AUC=0.952，P=0.0001。圖11A.42例乳腺癌病人的血漿HLA-G蛋白濃度的分布曲線。圖11B.16例女性正常對照血漿HLA-G蛋白濃度與42例乳腺癌病人血漿HLA-G蛋白濃度的比較。乳腺癌病人血漿中的HLA-G蛋白濃度顯著性地高于正常人血漿HLA-G蛋白濃度(T檢驗，t=5.85,P=0.0001)。圖IIC.檢測血漿HLA-G蛋白對乳腺癌診斷的ROC曲線分析。AUC=0.952，P=0.0001。發(fā)明的具體實施例方式以下通過具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，所列舉的本發(fā)明抗體在癌癥檢測和診斷中的特殊應(yīng)用范例有助于更好地了解本發(fā)明的特點，并非對本發(fā)明的限制。實施例1本發(fā)明HGY單克隆抗體的制備按照葉尚勉專利ZL200410040919.X公開的方法，用中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200416的雜交瘤細胞株制備抗HLA-G的單克隆抗體HGY。天然HLA-G蛋白質(zhì)的純化,單克隆抗體的制備及單克隆抗體的特性，均與上述專利公開的內(nèi)容一致。本發(fā)明HGY-2單克隆抗體的制備按照葉尚勉專利ZL200410040919.X公開的方法，本發(fā)明的基礎(chǔ)亦采用HGY單克隆抗體的制備方法，用從妊娠三個月內(nèi)流產(chǎn)的胎盤組織中純化的天然HLA-G蛋白質(zhì)，其中含有全部HLA-G轉(zhuǎn)錄異構(gòu)體和糖蛋白異構(gòu)體，通過免疫小鼠，將小鼠脾細胞與SP2骨髓瘤細胞株融合雜交，得到一株由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200722的雜交瘤細胞株，來制備抗HLA-G的單克隆抗體HGY—2。天然HLA-G蛋白質(zhì)的純化,單克隆抗體的制備與上述專利公開的內(nèi)容一致。單克隆抗體HGY—2的特性用HGY-2單克隆抗體進行以下實驗，證明小鼠抗體分型試劑藥盒(Amersh)測定，該細胞株產(chǎn)生的單抗亞型為IgGl。參用抗體捕獲酶聯(lián)免疫檢測法測定表明，本發(fā)明的HGY-2抗體與其他類型的HLA-I族抗原不存在交叉反應(yīng)。與HGY單克隆抗體一樣，HGY-2對HLA-G具有高度的特異性(表l)。表1.HGY-2單克隆抗體的特異性(交叉反應(yīng)實驗)化合物交叉反應(yīng)％HLA-G100HLA-A20,01HLA-B40.02HLA-C0皿混合白細胞裂解液0.005將抗HLA-G多克隆抗體(10)iig/ml，5(^l/孔)包被在酶標板上,然后加入等量的HLA-G,HLA-A2,HLA-B4,HLA-C或混合白細胞裂解液。用生物素標記的抗HLA-G的單克隆抗體檢測抗HLA-G多克隆抗體結(jié)合這些樣品的程度。以結(jié)合HLA-G的為100%，然后比較結(jié)HLA-A2，HLA-B4,HLA-C或混合白細胞裂解液的相對于結(jié)合HLA-G的百分率。參用競爭性抗體捕獲酶聯(lián)免疫檢測法測定表明，本發(fā)明的HGY-2抗體結(jié)合不同于HGY單克隆抗體的HLA-G蛋白分子上的抗原表位(圖1)。參用抗體捕獲酶聯(lián)免疫檢測法測定的HGY-2單抗的抗體滴度實驗證明本發(fā)明該抗體的對HLA-G蛋白分子，與HGY—樣具有較高的敏感性(圖2)。實施例2本發(fā)明HLA-G酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的研制1.單抗該試劑盒采用了兩種抗HLA-G蛋白分子特異性單克隆抗體(HGY和HGY-2)。這兩種單抗能夠結(jié)合HLA-G蛋白分子不同的抗原表位?？贵w均儲藏在-80。C。2.HLA-G蛋白標準品的制備該試劑盒采用的HLA-G蛋白標準品是用抗HLA-G單克隆抗體(已經(jīng)商業(yè)化的4H84或葉尚勉專利ZL200410040919中的HGY)免疫親和層析方法從收集的人工流產(chǎn)的一期胎盤組織的提取液中分離純化獲得，其純度大于95%。也可用基因重組的方法克隆和建立表達HLA-G蛋白的細胞株，然后用抗HLA-G抗體免疫親和層析方法分離純化基因重組的HLA-G蛋白標準品。蛋白標準品儲藏在-80。C。3.制備試劑盒參本發(fā)明釆用特異很高的抗HLA-G單克隆抗體HGY作為"一抗"，包被在結(jié)合率高而背景低的酶標板(或酶標條)上。采用標準的抗體包被濃度和制備方法(10^ig/ml;見Harlow禾口Lane,Antibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NY,ppl39,1988)。參本發(fā)明采用HGY-2單克隆抗體作為"二抗"。為進一步提高檢測的靈敏度，將抗HLA-G多克隆抗體用蛋白G親和層析純化后標記上生物素。再采用商業(yè)化的多鏈Streptoavidin-HRP復(fù)合物放大檢測信號。參本發(fā)明采用從早期胎盤組織純化的HLA-G蛋白作為標準。4.測定步驟參測定時，將血清或其它體液加到HGY單抗包被的酶標板(條)，每孔0.05mL。同時加入用樣品稀液釋配制成0到lpg/ml的HLA-G的蛋白標準，共六個標準點以及質(zhì)控樣品。室溫下震蕩孵化1小時。用洗液將酶標板(條)洗滌4次。參加入用樣品稀液釋配制的1:1000的HGY-2-生物素復(fù)合物，每孔0.05mL。參室溫下震蕩孵化1小時。參用洗液將酶標板(條)洗滌4次。參加入用樣品稀液釋配制的1:2000的Streptoavidin-HRP復(fù)合物，每孔0.05mL。在室溫下震蕩孵化1小時。參用洗液將酶標板(條)洗滌4次。參加入TMB工作液，每孔0.1mL。在室溫下孵化10至U15分鐘。參用1M的HCL停止顏色反應(yīng)，每孔O.lmL。參用酶標儀在450/630的波長讀取樣品和標準的光密度，然后從標準曲線計算樣品中HLA-G的含量。實施例3本發(fā)明HLA-G酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的特性本發(fā)明首先是建立檢測血漿/血清可溶性HLA-G的夾心式酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，并對試劑盒的特異性，靈敏度，準確性和可重復(fù)性進行驗證。參圖3顯示10次HLA-GELISA測定的標準曲線。結(jié)果表明用本發(fā)明建立的夾心式酶聯(lián)免疫檢測試劑盒，靈敏度為10ng/ml，重復(fù)性較高(平均各標準點的批內(nèi)和批間誤差均小于10%;表2)。在每批檢測時，該HLA-GELISA設(shè)立三個劑量的陽性對照樣品。從表2還可以看到陽性對照樣品的批內(nèi)和批間誤差均小于10%;進一步證實該試劑盒的可重復(fù)性。表2.HLA-G酶聯(lián)免疫組化檢測法的可重復(fù)性(檢測的批內(nèi)和批間誤差CV%)批內(nèi)誤差(cvy。)均數(shù)+SD批間誤差(CV%)均數(shù)+SD標準曲線(N=10)6,27+4.168.6+4.35質(zhì)控樣品(N=10)5.67+2.159.4+2.53按酶聯(lián)免疫檢測法公知的標準，批內(nèi)誤差低于10%，批間誤差低于15%，即可認定該試劑盒具有可靠的可重復(fù)性(MicallefJ，AhsanR.Immunoassaydevelopment.In:GoslingJP,BassoLV,editors.Immunoassay:laboratoryanalysisandclinicalapplications.London:Butterworth-Heinemann;1994.p.51-68)。參從標準曲線和血漿稀釋曲線平行實驗的結(jié)果證明檢測血漿中可溶性HLA-G蛋白與試劑盒的標準一致(圖4)。參從表3的回收實驗的結(jié)果證明該HLA-GELISA試劑盒具有高度的準確性。表3.HLA-G酶聯(lián)免疫組化檢測法的準確性(回收實驗)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>既在同一血漿混合樣品中加入不同劑量的HLA-G蛋白標準品，然后用HLA-G酶聯(lián)免疫進行檢測，得到實際測定值。因為已知未加HLA-G蛋白標準的混合樣品中HLA-G蛋白含量，對加入不同劑量的HLA-G蛋白標準品的同一血漿混合樣品就有理論測定值。實際測定值與理論測定值的比率既為該酶聯(lián)免疫檢測的回收率。也就是該檢測方法的準確性。綜上所述，該發(fā)明建立的HLA-GELISA技術(shù)具有高度可靠性和可重復(fù)性。實施4癌癥常見類型的HLA-GELISA測定雖然已有文獻報道發(fā)現(xiàn)血清中HLA-G蛋白濃度在黑色素瘤病人和某些血液細胞腫瘤的病人正常人顯著地增高，但用酶聯(lián)免疫測定法檢測血清中HLA-G蛋白濃度是否能用于各種常見的惡性腫瘤，如肺癌，食道癌，胃癌，直結(jié)腸癌和乳腺癌尚未見報道。本實施的目的是驗證用本發(fā)明中建立的特異，敏感，準確，重復(fù)性高的HLA-G酶聯(lián)免疫測定法檢測試劑盒是否能用于上述常見惡性腫瘤的臨床診斷。1.材料和方法收集215例上述五種常見惡性腫瘤血漿樣品和65例健康人作為對照。在215例上述五種常見惡性腫瘤病人中肺癌43例，食道癌58例，胃癌28例，直結(jié)腸癌37例和乳腺癌42例。在65例健康人中男性49例，女性16例。女性對照及病人均無懷孕。癌癥病人的樣品均在手術(shù)前收集。手術(shù)前病人均未經(jīng)化療或放射治療。所有的樣品儲藏于-80。C待測。該280樣品中HLA-G濃度分8批復(fù)管用上述本發(fā)明中建立的HLA-G酶聯(lián)免疫測定法檢測試劑盒測定。每批均含一標準曲線，3個不同劑量的質(zhì)控樣品。每批均包括正常標準，測待樣品和質(zhì)控樣品在室溫保溫1小時，洗板4次，然后加入l:500的生物素標記的HGY-2單克隆抗體復(fù)合物，每孔50(iL室溫保溫1小時，再加入1:1000的Streptoavidin-HRP復(fù)合物，每孔50^1,室溫保溫1小時。以TMB為底物顯色，1MHC1終止顯色反應(yīng)。在酶標儀上讀450/630nm波長的光密度。最后用直線回歸方法進行分析，得出標準曲線的切距，斜率和直線回歸方程，血漿樣品中HLA-G濃度則從標準曲線確定。用SSPC統(tǒng)計軟件對測定的結(jié)果進行統(tǒng)計學分析。對樣品中HLA-G濃度的分布情況用Histogram分析。用T檢驗比較正常對照和癌癥病人。用ROC曲線分析方法確定測定血漿中HLA-G濃度對這五種常見癌癥臨床診斷特異性，敏感性和臨界值。2.結(jié)果正常對照和各種癌癥病人血漿中HLA-G的濃度均呈正態(tài)分布(圖5)。血清中HLA-G濃度在癌癥病人顯著地高于正常人。統(tǒng)計學上有極顯著的意義(P=0.0001)(圖6A)。ROC曲線分析結(jié)果表明檢測血漿HLA-G蛋白對癌癥診斷具有相當高的臨床意義的(AUC=0.890，P=0.0001)(圖6B)。圖7—圖11分別顯示對肺癌，食道癌，胃癌，直結(jié)腸癌和乳腺癌血漿中HLA-G濃度的分布，與正常對照的比較和ROC曲線分析結(jié)果。檢測血漿HLA-G蛋白對食道癌，直結(jié)腸癌和乳腺癌癌癥診斷具有很高臨床應(yīng)用價值(AUC在0.94-0.95之間)；胃癌其次(AUC二0.867)，肺癌較差(AUC二0.714)。表4總結(jié)采用該HLA-G酶聯(lián)免疫檢測試劑盒對肺癌，食道癌,胃癌,直-結(jié)腸癌和乳腺癌臨床診斷的效率。表4.HLA-G酶連免疫檢測試劑盒對肺癌，食道癌,胃癌,直-結(jié)腸癌和乳腺癌臨床診斷的效率<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>*根據(jù)ROC曲線確定3.討論一種腫瘤標志物能否用于癌癥的診斷主要取決于該腫瘤標志物的特異性和敏感性。也就是說，無論用什么方法檢測出該腫瘤標志物高于正常人的水平，便可以判斷該病人是否可能患有癌癥(特異性)。另一方面，則要求在癌癥患者中檢測出該腫瘤標志物水平增高的病例相對較高(敏感性)。ROC曲線指受試者工作特征曲線(receiveoperatingcharacteristiccurve),是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標，是用構(gòu)圖法揭示敏感性和特異性的相互關(guān)系，它通過將連續(xù)變量設(shè)定出多個不同的臨界值，從而計算出一系列敏感性和特異性，再以敏感性為縱坐標、(l-特異性)為橫坐標繪制成曲線，曲線下面積越大，診斷準確性越高。結(jié)果中患者和正常人分布的重疊程度決定了曲線下面積。重疊越小曲線下面積越大，反之亦然。兩個分布完全分開時，曲線下面積為l，兩個分布完全重疊時，曲線下面積為0.5。ROC曲線下面積在ROC曲線上，最靠近坐標圖左上方的點為敏感性和特異性均較高的臨界值。本研究已經(jīng)證實HLA-G在腫瘤的表達具有較高的惡性腫瘤的特異性；同時還證實HLA-G在上述五種惡性腫瘤濃度增高的病例也相對較高。因而，檢測血清其或其它體液以及組織中HLA-G濃度的變化，是能夠用于癌癥的臨床診斷的。再從上述國外已發(fā)表的臨床應(yīng)用的研究結(jié)果，在實際上應(yīng)用上，也完全支持這個論斷。發(fā)明總結(jié)本發(fā)明與使用用純化的天然HLA-G蛋白免疫小鼠制取抗-HLA-G兩種結(jié)合HLA-G蛋白不同抗原表位的單克隆抗體有關(guān)。并采用這些抗體建立的HLA-G酶聯(lián)免疫檢測法有關(guān)。按本發(fā)明方法，采用本發(fā)明的HLA-G酶聯(lián)免疫檢測法能夠?qū)Ψ伟车腊?，胃癌，直結(jié)腸癌和乳腺癌血漿中HLA-G濃度的增高進行檢測，在采用ROC曲線分析后得到臨床應(yīng)用的臨界值。采用臨界值，對肺癌，食道癌，胃癌，直結(jié)腸癌和乳腺癌診斷的特異性分別為71.8%,90.0%,80.0%，90.0%和100%;敏感性分別為58.1%，87.9%，85.7%，89.2%和88.1%。對這些常見類型的癌癥，采用本發(fā)明的酶聯(lián)免疫檢測法，其測定結(jié)果具有臨床癌癥診斷的應(yīng)用價值。實施例5癌癥診斷試劑盒的制備由以上的研究結(jié)果，我們研制了HLA-G免疫組化試劑盒，由于本發(fā)明的抗HLA-G單克隆抗體具有高度特異性和靈敏性，并且理化性質(zhì)穩(wěn)定，可以按照標準方法方便地制備成為癌癥診斷試劑盒。以下是用本發(fā)明抗HLA-G單克隆抗體制備的一種診斷試劑盒的具體組成參抗HLA-G抗體(HGY)包被的96孔酶標板(或12X8或8X12酶標條)參生物素標記的HGY-2單克隆抗體參STREPTOAVIDIN-HRP復(fù)合物參HLA-G蛋白標準品參樣品緩沖液參洗滌緩沖液參色原底物溶液(TMB)參色原終止液(1MHCL)參質(zhì)量控制樣品檢定原理該試劑盒是應(yīng)用一種特異性很高的抗HLA-G單克隆抗體(HGY)包被在96孔酶標板或12X8或8X12酶標條上。血漿或血清中的可溶性HLA-G蛋白和HGY抗體結(jié)合；再采用生物素標記的HGY-2單克隆抗體對被HGY抗體結(jié)合的HLA-G蛋白進行夾心式結(jié)合。然后用Streptoavidin-HRP復(fù)合物結(jié)合抗HLA-G多克隆抗體。辣根過氧化酶催化色原底物(TMB)顯色,根據(jù)標準曲線確定檢測樣品中HLA-G的濃度。本發(fā)明的癌癥診斷試劑盒以血清或其他體液為被測樣品，使用方便，準確率高，患者依從性好，為癌癥診斷提供了一種新的方法和途徑。權(quán)利要求1、一種單克隆抗體HGY-2，其特征是它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200722的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其特征是其屬于IgGl亞型。3、一種試劑盒，其特征是含有至少一種如權(quán)利要求l、2所述的單克隆抗體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征是含有如權(quán)利要求1或2所述的任意一種單克隆抗體。5、根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的試劑盒，其特征是還含有由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200416的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的單克隆抗體HGY。6、根據(jù)權(quán)利要求3—5任意一項所述的試劑盒，其特征是用于診斷惡性腫瘤。7、根據(jù)權(quán)利要求3—5任意一項所述的試劑盒，其特征是用于評價惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后。8、根據(jù)權(quán)利要求3—5任意一項所述的試劑盒，其特征是用于指導癌癥的治療。9、根據(jù)權(quán)利要求3—8任意一項所述的試劑盒，其特征是所述試劑盒采用ELISA技術(shù)。10、一種雜交瘤細胞株，其特征是該雜交瘤是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200722的雜交瘤細胞株。全文摘要本發(fā)明公開了一種含抗HLA-G的單克隆抗體的癌癥診斷試劑盒及其應(yīng)用。該試劑盒是由一種新的抗HLA-G的單克隆抗體HGY-2和抗HLA-G的單克隆抗體HGY制備的酶聯(lián)免疫癌癥診斷試劑盒，其中，HGY-2是由含有由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏編號為CCTCCNO.C200722的雜交瘤細胞株產(chǎn)生的。本發(fā)明的試劑盒以血清或其他體液為被測樣品，使用方便，準確率高，患者依從性好，為癌癥診斷提供了一種新的方法和途徑。文檔編號G01N33/52GK101358964SQ20071007544公開日2009年2月4日申請日期2007年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者葉尚勉申請人:葉尚勉