專利名稱：鹽水中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鹽水中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體及其制備方法。
背景技術(shù)：
利什曼病由寄生在巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)的原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)杜氏利什曼原蟲(chóng)、嬰兒利什曼原蟲(chóng)和恰加斯利什曼原蟲(chóng)引起。寄生蟲(chóng)傳播通過(guò)被感染的雌性白蛉亞科昆蟲(chóng)的叮咬而產(chǎn)生。當(dāng)白蛉從攜帶有寄生蟲(chóng)的寄主那里吸了血后便獲得了感染的血液。人類可患具有不同臨床表現(xiàn)的四種形式的利什曼病。在這些不同的形式中，內(nèi)臟利什曼病(VL)，也就是所說(shuō)的黑熱病，是最嚴(yán)重的，如果不治療其死亡率幾乎為100％。發(fā)燒的頻繁發(fā)作、體重減輕、伴隨貧血的肝脾肥大是內(nèi)臟利什曼病的典型病征和癥狀。
兩性霉素B是一種由土壤菌、鏈霉菌產(chǎn)生的多烯類抗生素。兩性霉素B是自二十世紀(jì)五十年代發(fā)現(xiàn)以來(lái)被認(rèn)為是最有潛力的抗真菌藥。隨后還發(fā)現(xiàn)它能夠有效治療黑熱病(Trans Royal Soc.Trop.Med.Hyg，1963；57266-268)。
與通常所用的最優(yōu)良的藥物，即銻酰葡萄糖酸鈉和戊烷脒驚人的耐性事件不同，兩性霉素B沒(méi)有耐藥性的問(wèn)題(CP Thakur et.al，1993，The NationalMedical Journal of India657-60和CP Thakur et.al，1993，Indian Journal ofMedical Research；97170-175)。兩性霉素B除了是一種有效的抗利什曼原蟲(chóng)藥物外，由于其注射相關(guān)的不良影響和毒性，主要是腎毒性、心臟毒性和神經(jīng)毒性，因此僅被謹(jǐn)慎地用作二線藥物。因?yàn)闆](méi)有其它藥物可以替代兩性霉素B的廣普性和效力，因此可以理解，各種方案已進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并且甚至進(jìn)行了取得有限成功的實(shí)踐以克服兩性霉素B的藥劑相關(guān)的毒性。
因?yàn)槭亲畈豢茖W(xué)的、不清楚的和不可接受的不一致，因此極少實(shí)踐來(lái)克服兩性霉素B相關(guān)的毒性的方法是加熱、冷卻，然后服用傳統(tǒng)的兩性霉素B。已經(jīng)進(jìn)行臨床試驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)將英脫利匹特(Intralipid，靜脈注射脂類懸浮液)與傳統(tǒng)的兩性霉素B相結(jié)合作為兩性霉素B真正脂類配方的替代品的優(yōu)點(diǎn)(Dupont B.2002，J.Antimicrobial Chemotherapy；49，Suppl.S1，31-36)。
在對(duì)82名兒童單獨(dú)使用兩性霉素B脫氧膽酸懸浮液和使用其與英脫利匹特的混合物的這樣的對(duì)比研究中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)混合物在提高兩性霉素B的安全性或耐受性上有好處(Nath，CE et.al.1999，Antimicrobial Agents andChemotherapy431417-1423)。在另一個(gè)對(duì)成人患者的研究中，兩性霉素B的兩種形式被對(duì)比評(píng)價(jià)，觀察揭示在腎毒性方面在給予有或沒(méi)有英脫利匹特的兩性霉素B的各組中沒(méi)有顯著的不同(Nucci，Met.al.1999，AntimicrobialAgents and Chemotherapy；431445-1448)。
英脫利匹特混合物除了缺乏優(yōu)點(diǎn)外，與兩性霉素B-英脫利匹特混合物的給藥相關(guān)的方面還存在顯著問(wèn)題。這些問(wèn)題是較低的治療活性、肝功能異常、膽汁淤積和肺毒性(Deray，G.2002，J.Antimicrobial Chemotherapy；49，Suppl.S1，37-41)。
另外，另一種通?？紤]減少兩性霉素B的毒性作用的替代方法是以較慢的速率注射。雖然預(yù)期的研究推斷，較慢的注射速率不能降低兩性霉素B的毒性(Ellis，M.E.1992，Antimicrobial Agents and Chemotherapy；36172-179)，但在腎機(jī)能不全的患者中，建議避免快速注射以克服嚴(yán)重的高血鉀病和潛在的致命的心率失常(Bell，N.H.et.al.1962，American Journal ofMedicine；34064-69和Craven P.C.1985，Antimicrobial Agents and Chemotherapy；27868-871)。兩性霉素B的毒性如此關(guān)鍵以至于雖有十分有限的和增長(zhǎng)的優(yōu)點(diǎn)，緩慢注射兩性霉素B的所有配方也已成為標(biāo)準(zhǔn)的作法。
然而，兩性霉素B的不良影響已經(jīng)通過(guò)兩性霉素B的脂類配方被成功克服(Sunder S and Murray HW，1996；173762-765和Seaman et.al.1995；21188-193)。脂質(zhì)體兩性霉素B是目前確定的最有效和安全的藥物，該藥物也沒(méi)有耐藥性的問(wèn)題。
用來(lái)治療心臟利什曼病的兩性霉素B的脂質(zhì)體配方的關(guān)鍵的適用性源自若干因素，這些因素包括例如利什曼原蟲(chóng)存在于諸如巨噬細(xì)胞的清除細(xì)胞中，脂質(zhì)體快速地被巨噬細(xì)胞吸收，兩性霉素B是有效的抗利什曼病的藥物和兩性霉素B可配制成脂質(zhì)體制劑。所有這些因素都促進(jìn)脂質(zhì)體兩性霉素B靶向輸送到理想的抗寄生蟲(chóng)的作用位點(diǎn)，并降低兩性霉素B的毒性。另外，脂質(zhì)體通過(guò)將含大量藥物分子的包囊聚集到輸送到作用位點(diǎn)的每個(gè)脂質(zhì)體顆粒中而提供放大作用(Gregoriadis G，1995.Engineering liposomes for drugdeliveryProgress and Problems.TIBTECH；13527-537)。通過(guò)在脂質(zhì)體中包埋兩性霉素B對(duì)毒性的阻止使脂質(zhì)體的兩性霉素B成為治療心臟利什曼病的最佳選擇。
使治療全身性真菌病配方的兩性霉素B的毒性最小化的關(guān)鍵脂類成份是固醇。在可用于配方的固醇中，膽固醇、膽固醇琥珀酸鹽、膽固醇硫酸鹽已用于試驗(yàn)和/或商品化的兩性霉素B脂類制劑中。已報(bào)道，包括含有特定磷脂的麥角固醇的兩性霉素B的配方引起體外紅細(xì)胞的溶胞，因而認(rèn)為是不適合的(Mehta，R.et.al.1984，Biochimica et Biophysica Acta；770230-234)。
有限數(shù)量的磷脂結(jié)合物和麥角固醇的不成功的嘗試阻止了開(kāi)發(fā)含麥角固醇的兩性霉素B配方的進(jìn)一步努力(New，P.R.C.et.al.1981，J.Antimicrobial Agents and Chemotherapy；8371-381和Graybill，J.R.et.al.1982，J.Infectious Diseases；145748-752)。
兩性霉素B的細(xì)胞溶解作用通過(guò)兩性霉素B與細(xì)胞中固醇的相互作用完成。與膽固醇，一種存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜中的固醇相比，該藥物與引起寄生蟲(chóng)利什曼原蟲(chóng)的黑熱病中的麥角固醇和麥角固醇的前體(Meyerhoff，A.1999，Clinical Infectious Diseases；2842-48)有更強(qiáng)的親合力，其中麥角固醇是一種真菌細(xì)胞膜的主要成份(Szoka，F(xiàn).C.and Tang，M.1993，J.LiposomeResearch；3363-375)。在細(xì)胞膜中兩性霉素B與固醇的結(jié)合導(dǎo)致孔洞的形成，從而引起該藥物的細(xì)胞溶解作用。治療的抗微生物的作用和對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的毒性作用均由該相同的機(jī)制引起。
為了通過(guò)以病原體為目標(biāo)和對(duì)哺乳動(dòng)物宿主的回避而獲得對(duì)宿主細(xì)胞毒性的降低，含膽固醇的脂質(zhì)體作為以甚至高至15毫克/公斤體重/天的劑量的攻擊性治療來(lái)治療全身性真菌病的惟一策略出現(xiàn)。對(duì)于這樣的攻擊性治療，似乎更好的方法是給予更高濃度兩性霉素B的配方。對(duì)濃縮的兩性霉素B制劑預(yù)期毒性的明顯考慮已將全部?jī)尚悦顾谺制劑限制為1mg/ml，并建議緩慢注射。
對(duì)于以脂質(zhì)體的兩性霉素B治療由寄生在巨噬細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)寄生蟲(chóng)引起的利什曼病來(lái)說(shuō)，對(duì)兩性霉素B的這種考慮應(yīng)該更重要。已知脂質(zhì)體可被快速吞噬到巨噬細(xì)胞中，并將顯著導(dǎo)致被脂質(zhì)體包埋的兩性霉素B在巨噬細(xì)胞中聚集。配制具有較高濃度的兩性霉素B的脂質(zhì)體而不引起毒性需要對(duì)策，目前為止這樣的對(duì)策還沒(méi)有報(bào)道。
理解固醇的合成對(duì)于合理設(shè)計(jì)用脂質(zhì)體兩性霉素B快速、有效和特異的治療利什曼病是重要的。脂類占利什曼原蟲(chóng)細(xì)胞干重的15％(Meyer andIlolz，1966，J.Biol.Chem.245000-5007)。脂類的代謝對(duì)于若干極重要的生理過(guò)程是至關(guān)重要的，并影響到寄生蟲(chóng)的生存。麥角固醇或其前體(episterol)是由乙酰輔酶A到E(evalonate)到S(Sqalene)到羊毛固醇隨后通過(guò)另外四個(gè)步驟最終得到麥角固醇(Coppens and Courtoy.1995，Mol.Bichem.Parasitol.73，179-188和美國(guó)專利No.6,403,576B1)。
應(yīng)適當(dāng)注意，利什曼原蟲(chóng)需要膽固醇為其給養(yǎng)，并通過(guò)從其宿主巨噬細(xì)胞中廢物利用膽固醇來(lái)滿足其需要。有效的藥物設(shè)計(jì)應(yīng)謹(jǐn)慎地涉及通過(guò)不滿足利什曼原蟲(chóng)的膽固醇需求而使其不能生存。
網(wǎng)狀內(nèi)皮組織細(xì)胞的吞噬細(xì)胞作用對(duì)含膽固醇的脂質(zhì)體的輸送在一定程度上消除了在利什曼原蟲(chóng)寄居的巨噬細(xì)胞中兩性霉素B靶向輸送的益處。
在較短的期間服用20～21mg的兩性霉素B也導(dǎo)致在糖尿病患者中不期望的蔗糖攝入。已知含有0.9％氯化鈉的傳統(tǒng)兩性霉素B的混合物導(dǎo)致兩性霉素B的沉淀(Martindale，315頁(yè))。此外，也報(bào)道單糖和二糖，例如葡萄糖、甘露醇、海藻糖、蔗糖和乳糖，能使脂質(zhì)體的配方穩(wěn)定(美國(guó)專利No.5,180,713)。這些觀察反駁了用氯化鈉溶液作為脂質(zhì)體兩性霉素B的懸浮液的做法，并且用法說(shuō)明建議不使用鹽水(AmBisome產(chǎn)品信息)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是提供一種鹽水中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，通過(guò)脂質(zhì)體兩性霉素B的靶向輸送從而降低兩性霉素B的毒性而用于感染的治療。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是制備膽固醇被適當(dāng)替代的脂質(zhì)體兩性霉素B。膽固醇通常用于防止脂質(zhì)體的藥物/疫苗的泄漏，對(duì)于兩性霉素B配方的情況，膽固醇用于導(dǎo)向目標(biāo)和使藥物毒性最小化。然而，膽固醇在宿主體內(nèi)支持利什曼原蟲(chóng)的生存，因此不應(yīng)該作為配方的組份。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是將更高濃度的兩性霉素B輸送到靶區(qū)域而不引起毒性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是在給藥前對(duì)脂質(zhì)體的藥物進(jìn)行聲波處理，以增加脂質(zhì)體藥物血漿半衰期來(lái)促進(jìn)在體內(nèi)更好的生物分布。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種含有脂質(zhì)體兩性霉素B的無(wú)糖組合物，因此能自由地用于糖尿病人。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供在0.9％的鹽水中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中用于感染治療的兩性霉素B的濃度是1～15mg/ml。在脂質(zhì)體中兩性霉素B的濃度是高的。
所述固醇是含有或不含膽固醇的麥角固醇。所述固醇與磷脂結(jié)合。所述磷脂是卵磷脂。所述麥角固醇構(gòu)成脂質(zhì)體總脂類的50％。一個(gè)實(shí)施例的卵磷脂、麥角固醇和兩性霉素B的優(yōu)選比例是5∶2∶1。
給藥前的聲波處理增加血漿半衰期并提供更好的生物分布。
具體實(shí)施例方式
脂質(zhì)體，特別是固醇的脂類成份的選擇是挑剔的，以謹(jǐn)慎設(shè)計(jì)十分有效的和安全的抗利什曼病的藥物。包含合適的固醇必須能夠防止脂質(zhì)體兩性霉素B結(jié)合到哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞。通過(guò)吞噬細(xì)胞對(duì)含膽固醇的脂質(zhì)體兩性霉素B的攝取，膽固醇在利什曼原蟲(chóng)寄居的巨噬細(xì)胞中的輸送消除了兩性霉素B靶向輸送的最優(yōu)的益處。而在脂質(zhì)體中麥角固醇與特定脂類結(jié)合的其它固醇的選擇，如上所述已顯示引起體外紅細(xì)胞毒性。本發(fā)明旨在設(shè)計(jì)不含膽固醇，含有合適固醇的脂質(zhì)體兩性霉素B。
發(fā)現(xiàn)麥角固醇適于配制能安全并十分有效地抗諸如利什曼原蟲(chóng)之類感染的脂質(zhì)體兩性霉素B，其中所述麥角固醇可以含有膽固醇也可以不含，并在一定比率范圍內(nèi)與諸如卵磷脂之類的磷脂結(jié)合而不管磷脂的脂肪酸成份是合成的或是天然來(lái)源，如來(lái)源于大豆。所用兩性霉素B的濃度范圍在最終制劑中為1～15mg/ml。脂類，即磷脂，優(yōu)選為卵磷脂和麥角固醇，其所用的比率為麥角固醇構(gòu)成脂質(zhì)體配方的總脂類的50摩爾％。例如，一個(gè)優(yōu)選的配方為在水介質(zhì)中PC(卵磷脂)∶麥角固醇∶兩性霉素B的摩爾比為5∶2∶1。
文獻(xiàn)很好地證明兩性霉素B在鹽水中沉淀。兩性霉素B在以上所述的磷脂的脂質(zhì)體組合物中是穩(wěn)定的，并且即使經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期貯存也沒(méi)有沉淀發(fā)生。本發(fā)明允許以右旋糖替代鹽水，其中可以有緩沖液也可以沒(méi)有。一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例是用0.9％的氯化鈉作為脂質(zhì)體兩性霉素B的懸浮液。這樣的脂質(zhì)體配方在懸浮液中或在凍干后貯存時(shí)都是穩(wěn)定的。
或者，凍干的脂質(zhì)體兩性霉素B可以在諸如0.9％氯化鈉的水溶液中重新配制。
說(shuō)明制備脂質(zhì)體兩性霉素B的過(guò)程，但不限于以下的實(shí)施例。
脂質(zhì)體可以通過(guò)多種方法來(lái)生產(chǎn)，這些方法可以單獨(dú)使用也可結(jié)合使用(Szoka，F(xiàn).Jr.和Papahadjopoulos，D.，1980.Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9467-508)。
實(shí)施例1.蒸發(fā)脂質(zhì)體組份的甲醇溶液獲得該組份的膜。這個(gè)膜用水溶液水合，并通過(guò)把所述膜相互避開(kāi)(sheering)而獲得多層狀的脂質(zhì)體。
實(shí)施例2.脂質(zhì)體組份的甲醇溶液進(jìn)行噴霧干燥，然后水合，并在選擇的水介質(zhì)中重新配制以獲得混合的層狀的脂質(zhì)體制劑。
實(shí)施3.蒸發(fā)脂質(zhì)體組份的甲醇溶液獲得該組份的膜，加入選擇的水介質(zhì)，然后進(jìn)行聲波處理得到主要為單層狀的脂質(zhì)體制劑。
生物治療的性質(zhì)具有較高脂質(zhì)體濃度的麥角固醇-PC脂質(zhì)體可被很好地耐受，并發(fā)現(xiàn)在慢性和急性毒性方面都是安全的。這些具有高至15mg/ml兩性霉素B的脂質(zhì)體配方的制劑可以被服用而沒(méi)有任何與注射有關(guān)的不良影響。這些配方的LD50高于已報(bào)道的膽固醇-PC脂質(zhì)體兩性霉素B。
中毒性腎損害通過(guò)在服用該藥物后的不同時(shí)間段測(cè)量血清中肌酸酐的值而被檢測(cè)。血清肌酸酐的值在高至利什曼病完全治療所需的完全劑量，即每公斤體重21mg下給藥明顯保持不變。
在此報(bào)告，采用任何濃縮的包埋的兩性霉素B麥角固醇-PC脂質(zhì)體以脂質(zhì)體中含21mg的兩性霉素B給藥后，利什曼原蟲(chóng)完全被清除。僅在各別情況下，需要給予額外劑量的脂質(zhì)體兩性霉素B以完全清除寄生蟲(chóng)。
為支持該發(fā)現(xiàn)，采用本文描述的方法制備本發(fā)明的固醇組合物，對(duì)小鼠進(jìn)行了耐受性研究。高至10mg/ml的更高濃度的兩性霉素B被服用。耐受性研究顯示，在該用于脂質(zhì)體配方的麥角固醇中以100mg兩性霉素B/kg為單劑量可被很好的耐受。
參考文獻(xiàn)Nath，CE et.al.1999，Antimicrobial Agents and Chemotherapy；431417-1423Ellis，M.E.1992，Antimicrobial Agents and Chemotherapy；36172-179Bell，N.H.et.al.1962，American Journal of Medicine；34064-69Craven P.C.1985，Antimicrobial Agents and Chemotherapy；27868-87權(quán)利要求
1.水性懸浮液中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中用于感染治療的兩性霉素B的濃度為1～15mg/ml。
2.水性懸浮液中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中所述水性懸浮液含有或不含有0.9％的鹽水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中所述固醇是含有或不含膽固醇的麥角固醇。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中所述固醇與磷脂相結(jié)合。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中所述磷脂是卵磷脂。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中麥角固醇構(gòu)成脂質(zhì)體總脂類的50％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～5任意一項(xiàng)所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中卵磷脂、麥角固醇和兩性霉素B的比例為5∶2∶1。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中所述感染由包括利什曼原蟲(chóng)的細(xì)胞內(nèi)原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)引起。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所要求的富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體，其中在制造過(guò)程中和在給藥前對(duì)所述組合物進(jìn)行聲波處理以增加血漿半衰期和更好的生物分布。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于治療主要是寄生蟲(chóng)感染，特別是由細(xì)胞內(nèi)原生動(dòng)物寄生蟲(chóng)引起的那些感染的鹽水中富含固醇的添加兩性霉素的混合層狀脂質(zhì)體。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)在給藥前聲波處理該脂質(zhì)體藥物以增加包埋在脂質(zhì)體中的藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間。
文檔編號(hào)A61K31/7048GK101014322SQ200580023366
公開(kāi)日2007年8月8日 申請(qǐng)日期2005年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月11日
發(fā)明者吉藤德拉·納提·維瑪, 莉莉·維瑪, 庫(kù)里山·庫(kù)馬爾·特里帕提 申請(qǐng)人:吉藤德拉·納提·維瑪, 莉莉·維瑪, 庫(kù)里山·庫(kù)馬爾·特里帕提