專利名稱：具有減少身體脂肪活性的鼠李糖乳桿菌以及包含它們的食品的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及具有減少身體脂肪活性的鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)和包含它們的食品。本發(fā)明提供了具有減少身體脂肪活性的乳酸桿菌菌株。本發(fā)明還提供了含有具有減少身體脂肪作用的CLA的活的生物、死的生物、破碎的細胞壁部分、培養(yǎng)液、干燥的培養(yǎng)液、培養(yǎng)物提取物(其均由本發(fā)明的乳酸桿菌菌株產生)，以及包含它們的減少身體脂肪的功能食品和食品添加劑。另外，本發(fā)明提供了利用具有減少身體脂肪作用的乳酸桿菌菌株作為起始菌株(starter strain)或添加劑的減少身體脂肪的功能食品和飲料。此外，本發(fā)明提供了一種含有本發(fā)明的乳酸桿菌菌株的具有減少身體脂肪作用的藥物。
另外，本發(fā)明提供了在利用本發(fā)明的菌株生產發(fā)酵食品時能夠最大程度減少身體脂肪作用的條件。
背景技術：
在現代社會中，肥胖癥是具有比癌癥更低的完全治愈比例的疾病，并且增加了死亡率以及由此產生的各種成人疾病。在美國，它已經帶來了足以使公眾與肥胖癥進行斗爭的嚴重問題。許多材料被宣稱是對預防和治療肥胖癥有效的物質，但是直到目前，根據科學原理，僅有丙酮酸和共軛亞油酸(CLA)被證明是有效的(Lenz TL，Hamilton WR.Supplemental products used for weight loss.2004.J.AmPharm Assoc(Wash DC)4459-67)。有研究表明減少身體脂肪的機制是通過誘導脂肪細胞的凋亡來減少脂肪細胞的數量、減少脂肪細胞的大小、減少能量和食品的攝取、減少脂肪的產生、增加能量的消耗、分解脂肪活性、增加脂質氧化等(Chardigny JM，Hasselwander O，Genty M，Kraemer K，Ptock A，Sebedio JL.2003，Effect of conjugatedFA on feed intake，body composition，and liver FA in mice.Lipids.38(9)895-902)。
CLA(c9t11-十八碳二烯酸、t10c12-十八碳二烯酸)是通過亞油酸(LA，C182順式9順式12)的異構化形成的。根據雙鍵的位置，已知CLA具有抗氧化作用、降低膽固醇作用、生長促進作用、以及抗癌作用。最近，已知CLA具有減少身體血漿脂質、減少身體脂肪等作用。已報道CLA可以在動物肉類、發(fā)酵牛奶等中存在。動物實驗和臨床試驗已經證明CLA異構體中的c9，t11-CLA尤其具有減少身體脂肪的作用。最理想地，c9t11-CLA和t10c12-CLA最優(yōu)選以同樣的量生產。
溶纖維丁酸弧菌(Butyrivibrio fibriosolvents)是首先發(fā)現的生產CLA的厭氧性微生物，其從反芻動物(如奶牛)中分離出來。它通過兩個步驟對LA的生物氫化產生反-11-十八碳烯酸。在對產生的共軛酸進行氫化以產生反-11-十八碳烯酸之前，通過亞油酸異構酶的作用產生順-9，反-11-十八碳二烯酸。
根據2004年的最新挪威研究(Gaullier JM，Halse J，Hoye K，Kristiansen K，Fagertun H，Vik H，Gudmundsen O.2004.Conjugatedlinoleic acid supplementation for 1 y reduces body fat mass in healthyoverweight humans.Am J Clin Nutr.79(6)1118-1125)，當將CLA給予180個超重者達一年時，導致4-10％的重量減輕同時沒有副作用。
本發(fā)明選擇并鑒定了過度生產t10c12-CLA的具有減少身體脂肪作用的韓國型乳酸桿菌菌株，確認了菌株的前生命期的特性，如腸內適應性等，并且通過實施證實重量減少的動物試驗找到了該菌株能夠最大程度生產CLA的條件以及具有減少身體脂肪作用的乳酸桿菌菌株。

發(fā)明內容
因此，鑒于上述問題，形成了本發(fā)明，并且本發(fā)明的一個目的是提供生產CLA的菌株。
本發(fā)明的菌株是鼠李糖乳桿菌菌株PL60，保藏編號為KCCM-10654P，于2005年5月9日在韓國微生物培養(yǎng)中心保藏。
本發(fā)明的另一目的是提供能夠減少身體脂肪的乳酸桿菌菌株。
本發(fā)明的另一目的是通過減少身體脂肪來預防或治療各種成人疾病。
本發(fā)明的又一目的是提供生產最大量的具有減少身體脂肪作用的CLA的條件。
本發(fā)明的又一目的是提供一種菌株，其具有減少身體脂肪的作用、對腸道具有良好的粘附性、以及對酸和膽汁具有強的耐受性。
本發(fā)明的又一目的是提供作為前生命期的乳酸桿菌菌株，其不轉移抗生素耐受性并且是無害的。
乳酸桿菌菌株可以制成各種組合物，優(yōu)選這些組合物是合成形式，如膠囊、片劑、粉劑等以及能夠被加入到各種食品中的便利形式。
這些制劑可以通過已知的方法，利用藥學上可接受的載體、賦形劑、溶劑或添加物來制備。這些方法和成分是熟知的，并且詳細地披露在標準教科書和手冊中，例如出版物(Remington.1995.TheScience and Practice of Pharmacy.Mack Publishing Co.Easton，PA18042，USA)，其通過引用方式并入本文中。
含有乳酸桿菌菌株的助消化食品可以通過本領域熟知的方法來制備。
具有減少身體脂肪作用的食品和飲料可以通過本領域熟知的方法，利用所述菌株作為包含發(fā)酵奶制品的發(fā)酵食品的起始菌株或添加物來制備。
具有最大程度減少身體脂肪作用的發(fā)酵食品可以利用本文提供的條件生產。
在下文中，將更詳細的解釋本發(fā)明。
根據本發(fā)明的一個方面，上述和其他目的可以通過提供具有減少身體脂肪的功能食品來實現。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了能夠減少身體脂肪的鼠李糖乳桿菌菌株PL60KCCM-10654P。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了包含1×106-1×1011CFU/g的量的鼠李糖乳桿菌菌株PL60KCCM-10654P的減少身體脂肪的功能食品，以便利用減少身體脂肪的作用來預防和治療成人疾病。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了包含鼠李糖乳桿菌菌株PL60KCCM-10654P的食品和飲料添加劑。
根據本發(fā)明的另一方面，提供了利用鼠李糖乳桿菌菌株PL60KCCM-10654P能夠在發(fā)酵食品中獲得最大程度的減少身體脂肪作用的條件。
在下文中，將通過參照本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式
的實施例來更詳細地描述本發(fā)明，然而，其不應被解釋為以任何方式限制本發(fā)明。
本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌菌株PL60具有減少身體脂肪的作用，而能夠預防或治療由肥胖引起的疾病。另外，本發(fā)明的干燥鼠李糖乳桿菌菌株PL60和鼠李糖乳桿菌菌株PL60培養(yǎng)濾液、干燥培養(yǎng)濾液可以用作各種食品和飲料的添加劑，以用于預防和治療身體肥胖，因此可以用于預防和治療所有肥胖相關疾病。此外，利用本發(fā)明的所述鼠李糖乳桿菌菌株PL60的發(fā)酵食品可以通過減少身體脂肪作用來預防和治療肥胖癥。
另外，根據本發(fā)明，鼠李糖乳桿菌菌株PL60必須是在含有LA的培養(yǎng)基中初步培養(yǎng)的，以便生產最多的CLA。LA的含量為100-1000ppm，吐溫-80的含量為1～0.1％，并且糖類優(yōu)選果糖、蔗糖、和乳糖，最優(yōu)選果糖，以便利用鼠李糖乳桿菌菌株PL60的發(fā)酵食品具有最大程度的減少身體脂肪作用。


通過以下結合附圖的詳細說明將更清楚地理解本發(fā)明的上述和其他目的、特征和其他優(yōu)點，其中圖1是鑒定由鼠李糖乳桿菌菌株PL60生產的CLA的氣相色譜圖。
圖2是鼠李糖乳桿菌菌株PL60的顯微照片。
圖3示出了鼠李糖乳桿菌菌株PL60的16S rRNA序列。
圖4是利用多重PCR鑒定鼠李糖乳桿菌菌株PL60的帶狀圖。
圖5示出了鼠李糖乳桿菌菌株PL60對Caco-2細胞的適應性(adaptation)的實驗結果。
圖6a和6b示出了鼠李糖乳桿菌菌株PL60對人腸道的粘附性的實驗結果。
圖7為示出了將鼠李糖乳桿菌菌株PL60口服給予人后分離的菌落的PCR結果的帶狀圖。
圖8示出了服用鼠李糖乳桿菌菌株PL60的大鼠的體重變化。
圖9示出了服用鼠李糖乳桿菌菌株PL60后第10周的各組大鼠的體重的比較圖。
具體實施例方式
實施例1篩選能夠生產共軛亞油酸(下文中稱作CLA)的乳酸桿菌菌株為了選擇生產CLA的菌株，篩選在含有LA(CLA的底物)的培養(yǎng)基中生長的乳酸桿菌菌株。然后，確認它們是否表達異構酶(一種涉及生產CLA的酶)。
<材料和方法>
首先，選擇在含有亞油酸(LA)的培養(yǎng)基中生長的乳酸桿菌菌株，在其中篩選生產CLA的乳酸桿菌菌株。為此，通過利用異構酶測定可以從大量的乳酸桿菌菌株中容易地篩選生產CLA的菌株(Ogawa J，Matsumura K，Kishino S，Omura Y，and Shimizu S.2001.Conjugated linoleic acid accumulation via10-Hydroxy-12-octadecaenoic acid during microaerobic transformationof linoleic acid by Lactobacillus acidophilus.Appl.Envir.Microbiol.671246-1252)。首先，初步選擇在含有0.1％LA的MRS培養(yǎng)基中生長的乳酸桿菌菌株。然后，這些乳酸桿菌菌株在MRS肉湯培養(yǎng)基中進行二次傳代培養(yǎng)，并在含有0.1％LA 10mL的MRS肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。在用0.1M磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.0)洗滌細胞之前，將5mL的培養(yǎng)基在8000rpm下離心10分鐘以收集細胞。再次，向其中加入0.1M磷酸鉀緩沖溶液(pH 7.0)1.0mL，隨后利用超聲破碎機(ultrasonic breaker)在冰冷狀態(tài)下每3分鐘破碎并離心混合物，以獲得粗制的酶溶液。將該粗制的酶溶液加入到底物溶液中(LA0.1mL、0.1M磷酸鉀緩沖溶液2.7mL、以及1，3-丙二醇0.2mL)，以在233nm處測量吸光度。
<結果與討論>
利用異構酶試驗從超過200個乳酸桿菌菌株中篩選出產生CLA的乳酸桿菌菌株。
實驗實施例1利用氣相色譜法鑒定CLA的生產為了證實通過表達異構酶的乳酸桿菌菌株實質上產生了多少CLA，利用氣相色譜確定產生的CLA的量。
<材料和方法>
將乳酸桿菌備選菌株接種到含有LA的MRS液體培養(yǎng)基中，然后在37℃下培養(yǎng)該混合物24-48小時之前。用十七酸和氯仿甲醇的混合物提取培養(yǎng)的培養(yǎng)基(medium)。提取物用硫酸鈉處理，以除去濕氣(水分)，隨后蒸發(fā)。將1N氫氧化鈉(甲醇中)加入到制備的樣品中，隨后在100℃下皂化該樣品15分鐘之前。向其中加入4％HCl(甲醇中)以甲基化。將己烷∶水(1∶1，v/v)加入到該甲基化的樣品中，隨后混合并離心。利用氮氣帶走有機溶劑部分以除去有機溶劑，隨后將該樣品溶解在1mL己烷中。
根據本發(fā)明，通過具有火焰電離檢測器(FID)的氣相色譜(Hewlett Packard 5890 Series II GC)在除去氧化物之前和之后測量每個樣品內的CLA含量。所用的毛細管柱(DB FFAP毛細管柱)具有30m的長度、0.25μm的內徑、以及0.25μm的膜厚度。將該柱設置在GC中后，在以下條件下使用GC爐溫(柱溫)(210℃)；檢測器溫度(270℃)；進樣溫度(250℃)；載氣(氦(1mL/min))；分流比(50∶1)；以及進樣量(2μl)。每個峰面積利用與GC相連的積分儀(3395，Hewlett Packard)來計算。鑒定CLA，與標準物質的保留時間進行比較。十七酸用作內部標準物質以便測量CLA含量(Lin，T.Y.2000.Conjugated linoleic acid concentration as affected bylactic cultures and additives，Food Chemistry 69.27-31)。
<結果和討論>
如圖1的氣相色譜圖所示，分離的乳酸桿菌菌株生產CLA的c9t11和t10c12兩種異構體。如果以ppm表示具有減少身體脂肪作用的t10c12CLA的產量，則鼠李糖乳桿菌菌株PL60產生的t10c12CLA的量為43.25ppm，并且與所報道的路氏乳桿菌(Lactobacillusreuteri)和發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum)(其生產的CLA的量分別為30ppm和28ppm)相比，其具有更優(yōu)異的生產能力。
實驗實施例2乳酸桿菌菌株的鑒定革蘭氏染色、利用API試劑盒、16S rRNA序列分析、多重PCR檢測進行鑒定為了鑒定生產CLA的乳酸桿菌菌株，要確認它們對革蘭氏染色是否表現出革蘭氏陽性以及過氧化氫酶陰性。利用API試劑盒進行各種生物化學和生理學試驗，并且分析和鑒定16S rRNA序列。另外，為了把緊密相關的物種進行分類，通過多重PCR檢測利用種群特異性引物鑒定菌株。
1.革蘭氏染色將菌株在載玻片上涂片并熱固定，然后在其上加入結晶紫溶液，反應約1分鐘。所得的載玻片用碘溶液處理以便洗去多余的染料，隨后在其上加入碘，處理1分鐘。所得的載玻片用95％乙醇脫色30秒，然后用水洗滌2-3秒，用吸管(吸盤)除去水。所得的載玻片用番紅精0溶液處理10-30秒用于復染(counter stain)。所得的載玻片用水小心漂洗直到染料不再出來，隨后用吸管干燥所得的載玻片，滴上一滴浸漬用油以便通過顯微鏡觀察。
<結果與討論>
如圖2所示，生產CLA的乳酸桿菌菌株表現為革蘭氏陽性。
2.利用API試劑盒進行生物化學和生理學試驗在確認菌株是否為完全分離后，在30℃或37℃下，在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)該菌株24小時。將它們在MRS肉湯培養(yǎng)基中超過兩次傳代培養(yǎng)，隨后從MRS培養(yǎng)基分離菌落。懸浮培養(yǎng)基安瓿瓶被打開以利用棉球制備具有極高濁度的重懸浮液。制備的菌株溶液被逐滴滴入5mL該懸浮培養(yǎng)基直到濁度達到2McFarland。含有該菌株的API 50CHL培養(yǎng)基被分入條形管中并在30℃或37℃、需氧條件下培養(yǎng)48小時。如果產酸，則API試劑盒通過該培養(yǎng)基中的溴甲酚紫指示劑使培養(yǎng)基變?yōu)檫m度的淡黃色。如果在Esculin試驗(第25號管)中的顏色從紫色變?yōu)楹谏瑒t意味著是陽性反應。
<結果與討論>
如表1所示，利用API 50CH試劑盒的試驗結果表明本發(fā)明的乳酸桿菌菌株與鼠李糖乳桿菌和類干酪乳桿菌(Lactobacillus paraparacasei)具有類似性，但是沒有對其以％進行評價。
利用API CH50試劑盒鑒定乳酸桿菌菌株的結果

3.利用16S rRNA序列分析的鑒定分離基因組DNA以擴增其16S核糖體DNA片斷，隨后通過電泳確認擴增的DNA片斷。利用Qiagen PCR純化試劑盒(Qiagen，Hilden，Germany)來純化DNA片斷以便與含有d-若丹明染料標記的dd-NTP的反應溶液混合，隨后進行直接測序以利用乙醇/醋酸鈉沉淀來純化獲得的DNA。將純化的DNA溶解在TSR(模板抑制試劑)中以便用ABI棱鏡(prism)310基因分析儀(PE AppliedBiosystems，U.S.A)進行分析。利用基因庫(Genebank)(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)來鑒定所分析的序列。
<結果與討論>
作為分析生產CLA的乳酸桿菌菌株的結果(圖3)，其表現出與鼠李糖乳桿菌842/844(99％)和干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)(99％)的相似性。
4.利用多重PCR的鑒定為了確認PL60菌株是否為鼠李糖乳桿菌或干酪乳桿菌(類干酪乳桿菌)，在進行多重PCR檢測后，將從PL60菌株獲得的DNA片段與它們的DNA片斷進行比對(Song，Y.，N.Kato，C.Liu，Y.Matsumiya，H.Kato，and K.Watanabe.2000.Rapid identification of 11human intestinal Lactobacillus species by multiplex PCR assays usinggroup-and species-specific primers derived from the 16S 23S rRNAintergenic spacer region and its flanking 23S rRNA.FEMS Mictrobiol.Letters，187167-173)。為此，利用含有1x反應緩沖劑、200μM的dNTP、0.15單位的Taq聚合酶、10pmol的引物(LU-5，CTA GCG GGTGCG ACT TTG；Lpar-4，GGC CAG CTA TGT ATT CAC TGA；Rha II，GCG ATG CGA ATT TCT ATT ATT)、以及20ng的DNA的混合物，以30μl的最終量實施PCR反應。該PCR反應包括以下步驟使該混合物反應，重復循環(huán)35次，該循環(huán)包括在95℃20秒、62℃2分鐘，以及在74℃2分鐘；使該混合物在72℃下反應10分鐘；以及在4℃下保存產物。利用0.5x TBE(0.045M三硼酸鹽，0.001MEDTA)緩沖溶液將該PCR產物在1.5％瓊脂糖凝膠中電泳20分鐘，隨后觀察展開的DNA片段的圖案。
<結果與討論>
作為多重PCR檢測的結果，鼠李糖乳桿菌菌株和PL60菌株產生113bp的DNA片段，而類干酪乳桿菌ATCC 25302產生312bp大小的DNA片段(如圖4所示)。因此，PL60菌株被鑒定為鼠李糖乳桿菌。直到現在，生產CLA的鼠李糖乳桿菌菌株仍未有報道。本發(fā)明首次報道了生產CLA的鼠李糖乳桿菌菌株。
實驗實施例3鼠李糖乳桿菌的腸道適應性為了用作前生命期物(probiotic)，它必須對酸和膽汁具有強的耐受性，并且對腸道細胞具有良好的適應性。應該通過人實驗來確定腸道適應性。
1.耐酸性試驗為了知曉pH是否影響所選菌株的存活性，在利用10N HCl調整pH為7.0、4.8和4.5后，使用MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培養(yǎng)基?；罨木耆芤?OD＝2.0)以2％的量接種至MRS培養(yǎng)基并在37℃下培養(yǎng)24小時，隨后在600nm處測量吸光度。利用所測得的吸光度考察pH是否影響所選菌株的生長。pH7.0的OD被稀釋至1/10以測量并記錄吸光度(Conway PL，Gorback SL，Goldin BR，1987.Survival of lactic acid bacteria in the human stomach andadhesion to intestinal cells.J.Dairy Sci.701-12)。
<結果與討論>
作為低酸存在下的存活性實驗結果，即使所述菌株被處理24小時，它們仍存活，因此對酸具有強的耐受性，如表2所示。
鼠李糖乳桿菌菌株PL60的耐酸性實驗結果(在600nm處的OD)

2.膽汁耐受性試驗為了知曉膽汁是否影響所選菌株的生長，將牛膽(ox-gall)(OXOID)以0.125％和0.25％的量加入MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培養(yǎng)基以消毒滅菌?；罨木耆芤?OD＝2.0)以2％的量被接種至該無菌的培養(yǎng)基并在37℃下培養(yǎng)24小時，隨后在600nm處測量吸光度。0％膽汁中的OD被稀釋至1/10以測量并記錄吸光度(Ibrahim SA，Bezkorovainy A.1993.Survival of bifidobacteria inthe presence of bile salt.J.Sci.Food Agric.62351-354)。
<結果和討論>
健康人的小腸內具有0.06％的膽汁濃度。該菌株甚至在0.250％的膽汁中仍存活，因此具有強的膽汁耐受性。


3.腸道粘附性試驗為了知曉對人腸道的粘附性，將鼠李糖乳桿菌菌株PL60粘附至來源于腸上皮細胞的Caco-2細胞系。為此，將Caco-2細胞系在含有2.7g/L碳酸氫鈉、20％(v/v)的胎牛血清(FBS)和抗生素antimicotics的DMEM培養(yǎng)基(pH 7.0)中進行培養(yǎng)。將3×105個細胞接種至30mm皮氏培養(yǎng)皿中的2mL培養(yǎng)基中，以培養(yǎng)為單層。該培養(yǎng)基每2天更換一次。6天后，用2mL磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)漂洗該細胞單層兩次。將1×107個細胞的該乳酸桿菌菌株懸浮在2mL的培養(yǎng)基中并加入到皮氏培養(yǎng)皿，隨后在5％CO2-95％空氣下、在37℃下培養(yǎng)該混合物達60-90分鐘。用無菌的PBS漂洗該細胞兩次并用甲醇固定10分鐘。在革蘭氏染色后通過光學顯微鏡觀察它們。在100倍顯微鏡下觀察20個視野用于定量分析。計數粘附菌株的數量并以每100個Caco-2細胞粘附的菌株數量表示(Bibiloni R，Perez PF，DeAntoni GL.1999.Anaerobe 5，483-485；Edited by R.Fuller(1997)Probiotics 2，10-22)。
<結果與討論>
如圖5所示，鼠李糖乳桿菌菌株PL60對Caco-2細胞具有良好的粘附性。如果用20個視野來計算每個視野的粘附菌株的數量來計算每個視野的粘附菌株的平均數量，則每個視野粘附了59.29±5.33個乳酸桿菌菌株。這意味著每個培養(yǎng)皿中超過4000個乳酸桿菌菌株粘附至這些細胞，具有比常見的乳酸桿菌菌株更好的腸道粘附性。
4.對人腸道的適應性試驗為了確定乳酸桿菌菌株在人大量服用它們后是否對腸道適應，以1010CFU的量口服鼠李糖乳桿菌菌株PL60，每天一次，服用8天。次日，在MRS(具有1％溴代酚藍，30μg/mL萬古霉素)中培養(yǎng)糞便48小時。所有類似的菌落通過革蘭氏染色來考察、傳代培養(yǎng)、以及完全分離。利用完全分離的菌落進行種群特異性PCR試驗。
<結果與討論>
如圖6所示，在服用鼠李糖乳桿菌菌株PL60后一到六天進行檢測并在檢測到后立即停止服用。通過種群特異性PCR試驗證明所檢測的乳酸桿菌菌落為鼠李糖乳桿菌(圖7)。這證明鼠李糖乳桿菌菌株PL60適應腸道。尤其是，如圖6所示，認為在給予鼠李糖乳桿菌菌株PL60后，通過腸道內的細菌群落的事實進行的判斷變得更簡單，該乳酸桿菌菌株具有腸道調節(jié)性。
實驗實施例4乳酸桿菌菌株的安全性試驗對于人服用量，應該進行乳酸桿菌菌株的安全性試驗。為此，要確認乳酸桿菌菌株是否產生毒性物質，如氨、吲哚、溶血素等，以及有毒的酶是否存在。
1.溶血試驗當將鼠李糖乳桿菌菌株PL60被接種入羊血瓊脂中并在37℃下培養(yǎng)24小時時，僅發(fā)現α-溶血作用，未發(fā)現β-溶血作用。
2.明膠液化試驗將鼠李糖乳桿菌菌株PL60接種入由MRS明膠培養(yǎng)基(0.3g濃縮牛肉汁、0.5g蛋白胨、12g明膠、以及100mLMRS肉湯)制成的斜面培養(yǎng)基中并在35℃下培養(yǎng)6周。當它與對照一起在4℃冷卻大約4小時以檢查明膠液化時，由于沒有觀察到明膠液化，因此認為明膠酶不存在。
3.氨形成試驗將尿素瓊脂培養(yǎng)基(尿素20g、NaCl 5g、KH2PO42g、蛋白胨1g、葡萄糖1g、苯酚12mg、以及蒸餾水100mL)過濾并滅菌，隨后將15g瓊脂溶解在900mL蒸餾水中以被濕滅菌(wet-sterilized)，并與制備的尿素瓊脂培養(yǎng)基混合以調節(jié)總體積至1L(pH 6.9)。將鼠李糖乳桿菌菌株PL60接種至其上并在37℃下培養(yǎng)約12小時，隨后觀察該培養(yǎng)基的顏色變化。因為黃色培養(yǎng)基意味著陰性，因此證明鼠李糖乳桿菌菌株PL60不產氨。
4.吲哚形成試驗將鼠李糖乳桿菌菌株PL60接種到含0.1％胰胨的MRS瓊脂中并培養(yǎng)約18小時。當加入5滴Kovac試劑(p-二甲氨基苯甲醛10g、丁醇150mL、以及鹽酸50mL)后，沒有顏色變化。這表明沒有產生吲哚。
5.苯丙氨酸脫氨試驗將鼠李糖乳桿菌菌株PL60接種至含0.2％D，L-苯丙氨酸的MRS培養(yǎng)基中并培養(yǎng)約24小時。在將5-10滴10％氯化鐵滴落其上以流到斜面培養(yǎng)基上后，在1-5分鐘內觀察到顏色改變。在陽性反應的情況下，則產生的苯丙酮酸與氯化鐵反應而使培養(yǎng)基呈現綠色。鼠李糖乳桿菌菌株PL60表現出陰性反應。
6.β-葡糖醛酸糖苷酶試驗將p-硝基苯基-β-D-葡糖苷酸溶解在0.1M磷酸鈉緩沖液(pH6.0)中至0.2％的濃度。將鼠李糖乳桿菌菌株PL60懸浮在磷酸鹽緩沖液中至Ab600＝4以形成懸浮液。將具有基質(底物)的200μl緩沖溶液加入到200μl所述懸浮液中并在37℃下處理16小時。如果培養(yǎng)液變黃，則為陽性。然而，這個試驗表現為陰性反應。將該培養(yǎng)液離心以獲取上清液。在405nm處確定該上清液的吸光度為0.078。
7.硝基還原酶活性試驗在MRS液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌菌株PL60在3000xg下離心10分鐘以收集生物質(菌體，biomass)，隨后聲波處理該生物質5分鐘。將4-硝基苯甲酸(最終濃度為300μg/mL)和三氯乙酸(最終濃度為0.21％)加入到該上清液中并在37℃下處理1小時，隨后加入亞硝酸鈉(最終濃度為0.007％)以在室溫下處理20分鐘。其中加入氨基磺酸銨(最終濃度為0.04％)并在室溫下處理3分鐘。向其加入NEDD(N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽)(最終濃度為0.35％)并在4℃下生長。當在540nm的分光光度計下觀察生長的上清液時，它表現為陰性反應。將它與由加入1μg/mL 4-氨基苯甲酸獲得的陽性反應進行比較。
8.抗生素耐受性前生命期物具有的抗生素耐受性越強，則在腸內的存活能力越強。因此，抗生素耐受性越強，則越好。然而，如果抗生素耐受性轉移，則會導致耐受性問題。要確認抗生素耐受性是否轉移至其它細菌。
鼠李糖乳桿菌菌株PL60的抗生素耐受性

9.抗生素耐受性的轉移試驗為了考察抗生素耐受性的轉移，實施了濾器結合測定(Givers，D.，G.Huys，and J，Swings.2003.In vitro conjugal transfer oftetracycline resistance from Lactobacillus isolates to otherGram-positive bacteria.FEMS Microb.Letters 225125-130)。將鼠李糖乳桿菌菌株PL60培養(yǎng)至對數生長期中期(約4-5小時)。將1mL培養(yǎng)菌株與1mL糞腸球菌(Enterococcus faecalis)CCARM 5510混合，隨后通過無菌的醋酸纖維素濾器過濾該混合物以用PPS(蛋白胨生理鹽水溶液)洗滌。濾紙放在非選擇性瓊脂培養(yǎng)基上并在37℃下培養(yǎng)16小時。在該濾紙上生長的生物質用2mLPPS洗滌并與該濾紙分離，隨后稀釋該生物質以接種至含有各種抗生素的Enterococcosal選擇性培養(yǎng)基中并在37℃下培養(yǎng)24-48小時。觀察是否存在具有抗生素耐受性的糞腸球菌，但在培養(yǎng)物中不存在具有抗生素耐受性的糞腸球菌。這說明抗生素耐受性沒有轉移。
實施例2用于生產CLA的最佳條件我們找到了可以最大程度地生產CLA的LA的濃度和基質(底物)的種類。
1.能夠最大程度生產CLA的LA的濃度由于高濃度的LA抑制細菌自身的生長，因此LA不能以高濃度加入培養(yǎng)基中。另外，為了節(jié)約培養(yǎng)基上消耗的LA，找到了能夠最大程度生產CLA的LA的濃度。
<材料和方法>
將各種濃度的水溶性LA酯加入脫脂乳培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基并過夜培養(yǎng)，隨后測量在介質中產生的CLA的量。為此，提取培養(yǎng)基中的脂質并甲基化，然后利用GC來測量產生的CLA的量。為此，將1000ppm的十七酸和200mL的氯仿∶甲醇(2∶1)加入到20mL培養(yǎng)液中，隨后向其中加入玻璃珠，劇烈搖晃5分鐘并均化5分鐘。
將該混合物在6000rpm下離心15分鐘(4℃)并分為兩部分。用硫酸鈉處理有機溶劑部分以除去殘留水分，隨后蒸發(fā)有機溶劑以用氮氣干燥。將1N氫氧化鈉(甲醇)3mL加入該干燥的樣品中并在100℃下皂化15分鐘。此時，使用用特弗隆膠帶處理的螺帽蓋住的試管并且將該螺帽用石蠟膜(parafilm)包裹。向其加入4％HCl(甲醇)6mL以甲基化20分鐘。將該甲基化的樣品與2mL己烷∶水(1∶1，v/v)混合并劇烈搖晃10分鐘，隨后在8000rpm下(4℃)離心混合物15分鐘。提取有機溶劑部分并利用氮氣干燥，隨后將該干燥的物質溶解在1mL己烷中。
<結果與討論>
假定標準參考物質十七酸(heptodecanoic acid)的峰面積為100，則當LA以超過100ppm的量加入培養(yǎng)基中時，CLA以足夠的量產生(表5)。另外，如果LA分別以1000ppm和500ppm的量加入，則它們之間在生產CLA方面沒有顯著的差別。優(yōu)選地，LA以100-1000ppm的量加入以便生產CLA。考慮到成本和效率，500ppm是最優(yōu)選的。
根據加入到培養(yǎng)基中的LA濃度的CLA生產

2.用于最大程度生產CLA的乳化劑添加條件考察當加入乳化劑以提高LA在培養(yǎng)液中的溶解度時，CLA的產量是否提高。為此，將LA以0.1％的濃度加入至脫脂乳培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基。此時，LA以三種形式加入LA、LA鹽、以及LA鹽和吐溫-80(0.2％)，并過夜培養(yǎng)，隨后確定鼠李糖乳桿菌菌株PL60的CLA生產能力。利用上述方法，提取培養(yǎng)液中的脂質以被甲基化，隨后通過GC確定CLA的量。
<結果與討論>
與LA鹽相比，所使用的用于提高培養(yǎng)液中LA的溶解度的吐溫-80三倍地提高了t10c12 CLA的生產。非常重要的是，在將LA加入培養(yǎng)基時加入乳化劑，提高LA的溶解度。
吐溫-80的加入對CLA生產的影響

3.在原始培養(yǎng)物上用于誘導CLA生產的乳化劑添加條件為了在獲取鼠李糖乳桿菌菌株PL60本身、或起始菌株或其添加物(additive)后立即最大程度生產CLA，要考察當培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌菌株PL60以產生如凍干干粉的產物時，加入吐溫-80以提高LA的溶解度是否是有效的條件。為此，將LA鹽、0.1％的LA和吐溫-80、0.2％的LA和吐溫-80、以及0.5％的LA和吐溫-80加入到其中有原始培養(yǎng)的起始菌株的培養(yǎng)基中。將原始培養(yǎng)的鼠李糖乳桿菌菌株PL60在生產CLA的培養(yǎng)基(含0.1％LA的脫脂乳)中培養(yǎng)以測量產生的CLA的量。
<結果與討論>
為了在商業(yè)生產所用的脫脂乳培養(yǎng)基(乳清培養(yǎng)基)中最大程度地生產CLA，當在含有0.1％的LA和0.1-0.5％的吐溫-80的脫脂乳培養(yǎng)基中培養(yǎng)鼠李糖乳桿菌菌株PL60以誘導CLA生產時，CLA的生產能力為最佳(表7)。認為0.2％的吐溫-80比0.5％的吐溫-80的CLA生產能力更高的原因是0.5％的吐溫-80對乳酸桿菌菌株有生長抑制作用。
根據用于在培養(yǎng)基中溶解LA的吐溫-80的濃度的鼠李糖乳桿菌菌株PL60的CLA生產能力

4.用于最大程度生產CLA的糖類添加條件我們找到了能夠最大程度生產CLA的糖種類。為此，將6％濃度的果糖、蔗糖、以及乳糖各自加入到含0.1％LA的脫脂乳培養(yǎng)基中以測量CLA的生產。
<結果與討論>
在加入果糖后生產的CLA最多，其次為蔗糖和乳糖。當加入葡萄糖時，沒有觀察到有效的CLA生產。
根據各種糖的CLA生產的變化

實施例3給予生產CLA的鼠李糖乳桿菌菌株PL60的大鼠體重的變化將凍干的鼠李糖乳桿菌菌株PL60(其在利用脫脂乳作為賦形劑的含0.1％LA和0.2％吐溫-80的培養(yǎng)基中培養(yǎng))以109CFU/天和107CFU/天的劑量給予大鼠，并同時給予高脂肪飲食，隨后觀察大鼠體重的變化。
<材料和方法>
將C57BL/6N大鼠(Charles river laboratory animal facility，USA)分為五組，每組四只。第一組給予常規(guī)飲食(Purina rodent chow#5057(3.28cal/g))；第二組給予高脂肪飲食(Research飲食45％高脂肪飲食D12451(5.252卡/g))；第三組為對照組，給予高脂肪飲食和賦形劑的脫脂乳；第四組給予高脂肪飲食和高濃度(109CFU/天)的鼠李糖乳桿菌菌株PL60；第五組給予高脂肪飲食和低濃度(107CFU/天)的鼠李糖乳桿菌菌株PL60。當三周大的大鼠吃飽高脂肪飲食和水時，觀察它們體重和喂養(yǎng)飲食量的變化。大鼠在第8周被解剖，以便在染色后利用顯微鏡觀察腸道脂肪的重量、所有器官中脂肪細胞的大小和數量。
<結果與討論>
表9示出了給予鼠李糖乳桿菌菌株PL60的大鼠體重的變化。根據表9，雖然給予高濃度鼠李糖乳桿菌菌株PL60的組，在第4周幾乎沒有表現出顯著的統(tǒng)計量，但與對照組相比，它的重量增加較小，在第8周超過2g(圖8和圖9)。也就是說，常規(guī)飲食組的平均重量為24.7g，高脂肪飲食組的平均重量為33.4g，脫脂乳組的平均重量為31.9g，給予高濃度鼠李糖乳桿菌菌株PL60組的平均重量為26.9g，而給予低濃度鼠李糖乳桿菌菌株PL60組的平均重量為28.7g。高濃度組的重量增加比高脂肪飲食組的重量增加少6.5g，少了19.5％。低濃度組的重量增加比高脂肪飲食組少4.7g，少了14％。與脫脂乳組相比，高濃度組和低濃度組分別表現出較少的重量增加，為5g(15.7％)和3.2g(10％)。認為高脂肪飲食組和脫脂乳組的重量差為1.5g(4.5％)，其在容許誤差范圍內而不是由脫脂乳所致的重量減少。

本發(fā)明的鼠李糖乳桿菌菌株PL60具有減少身體脂肪的作用。所述乳酸桿菌菌株可以直接用作減少身體脂肪的功能食品，用于預防或治療由肥胖導致的所有疾病，或可用作減少身體脂肪的功能食品的添加劑。
雖然為了說明目的，已經披露了本發(fā)明的優(yōu)選具體實施方式
，但是本領域的技術人員應當理解，在不脫離所附權利要求書披露的本發(fā)明的范圍和精神的情況下，可以進行各種更改、添加和替換。
用于專利程序的微生物保藏的國際承認的布達佩斯條約國際表格至韓國首爾中區(qū) 由在本頁底認定的南大門路5街500 國際保藏單位CJ株式會社 依據條約第7.1條做出的原始情況下的接收

1其中采用6.4(d)條，該日期為國際保藏單位獲得的日期，其中在獲得國際保藏單位保藏后，布達佩斯條約外的保藏變?yōu)椴歼_佩斯條約下的保藏，該日期為國際保藏單位收到該微生物的日期。
權利要求
1.一種將亞油酸轉化為共軛亞油酸的鼠李糖乳桿菌菌株。
2.根據權利要求1所述的鼠李糖乳桿菌菌株，其中，所述菌株為鼠李糖乳桿菌菌株PL60KCCM-10654P。
3.根據權利要求1或2所述的鼠李糖乳桿菌菌株，其中，所述菌株為活菌株或干菌株。
4.一種用于生產CLA的組合物，包含根據權利要求1至3中任一項所述的菌株。
5.一種利用鼠李糖乳桿菌菌株大量生產CLA的方法，原始培養(yǎng)根據權利要求1至3中任一項所述的菌株。
6.根據權利要求5所述的利用鼠李糖乳桿菌菌株大量生產CLA的方法，其中，將0.01-1.0％的LA或紅花籽油加入到所述菌株的原始培養(yǎng)基中。
7.根據權利要求6所述的利用鼠李糖乳桿菌菌株大量生產CLA的方法，其中，將0.01-1.0％吐溫-80加入到所述菌株的原始培養(yǎng)基中。
8.根據權利要求7所述的利用鼠李糖乳桿菌菌株大量生產CLA的方法，其中，將果糖、蔗糖、或乳糖作為糖底物加入到所述菌株的原始培養(yǎng)基中。
9.減少身體脂肪的功能食品，包含作為添加劑的根據權利要求1至3中任一項所述的菌株。
10.根據權利要求9所述的減少身體脂肪的功能食品，其中，所述食品為保健食品或含有酸奶、干酪、泡菜、苦椒醬(kochujang，混合有紅辣椒的韓國稠大豆糊)、以及大醬(doenjang，韓國發(fā)酵大豆糊)的發(fā)酵食品。
11.利用鼠李糖乳桿菌菌株PL60 KCCM-10654P作為起始菌株制備的乳制品。
12.利用鼠李糖乳桿菌菌株PL60 KCCM-10654P作為發(fā)酵起始菌株制備的源自谷物的發(fā)酵食品。
13.一種用于預防和治療肥胖相關疾病的藥物，包含鼠李糖乳桿菌菌株PL60 KCCM-10654P的活菌株、干菌株、或培養(yǎng)濾液。
14.根據權利要求13所述的用于預防和治療肥胖相關疾病的藥物，其中，平均體重為60kg的健康人以1×107-1×1011CFU/劑量的量服用鼠李糖乳桿菌菌株PL60 KCCM-10654P，每天1-2次。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有減少身體脂肪的活性的乳酸桿菌菌株并提供了鼠李糖乳桿菌菌株PL60 KCCM－10654P。本發(fā)明的菌株可以直接用作減少身體脂肪的功能食品，或者可以用作減少身體脂肪的功能食品的添加劑、或者減少身體脂肪的功能發(fā)酵食品的發(fā)酵起始菌株。本發(fā)明的菌株產生的抑制身體脂肪的物質可加以分離以被利用。另外，在利用所述菌株來生產發(fā)酵食品的情況下，本發(fā)明提供了能夠具有最大程度減少身體脂肪的作用的條件。
文檔編號A61K35/66GK101068918SQ200580027086
公開日2007年11月7日 申請日期2005年6月30日 優(yōu)先權日2004年8月16日
發(fā)明者李蓮姬, 白璟洙, 孫京鉉, 金泰禛, 高志勛, 樸范石 申請人:Pl生物株式會社, Cj株式會社