專利名稱：：用于骨折愈合的半固體混合纖維蛋白成骨細(xì)胞成分及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法。本發(fā)明尤其涉及一種用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分，其提供了一種含有成骨細(xì)胞和纖維蛋白混合物的治療劑，可以注入到患病區(qū)域使骨結(jié)合來(lái)治療嚴(yán)重的骨折，及其制備方法。
背景技術(shù)：
：一般地，簡(jiǎn)單的骨折可以通過(guò)固定幾個(gè)星期骨折部位完全愈合，但是嚴(yán)重的骨折或骨缺陷需要骨移植。大多數(shù)醫(yī)生首選的骨移植方法是自體移植，包括從患者身體的某一部位收集骨，尤其是髂脊，接下來(lái)移植到患者的患病區(qū)域。由于移植的是患者自己的骨骼，這種方法能得到極好的結(jié)果。然而，這種自體移植的缺點(diǎn)是這種手術(shù)方法會(huì)伴隨有嚴(yán)重的疼痛，并且存在多種潛在問(wèn)題，在骨接受區(qū)可能出現(xiàn)敏感度和感覺(jué)降低，為了骨移植需要額外的手術(shù)，長(zhǎng)時(shí)間的住院治療，痊愈醫(yī)療費(fèi)用增加。另外，在身體里沒(méi)有足夠的額外骨骼用于移植，這種自體移植為了保護(hù)貢獻(xiàn)部位需克服許多困難。據(jù)報(bào)道如果脊髓手術(shù)迫使大量骨移植，由于骨自體移植引起的并發(fā)癥發(fā)病率高達(dá)23%。為了緩解自體移植上述缺點(diǎn)的異體移植，主要是從尸體獲得骨，不必為了骨移植做額外二次手術(shù)，但是具有致命的缺點(diǎn)，例如在滅菌過(guò)程中骨強(qiáng)度降低，出現(xiàn)移植排斥，具有被傳染性疾病感染的可能性，例如肝炎和艾滋病。另外，異體移植具有以下缺點(diǎn)低骨形成作用，免疫反應(yīng)，骨吸收及相關(guān)骨骼再骨折，應(yīng)用范圍窄。因此，這種手術(shù)方法由于食品藥品監(jiān)督部門(mén)為了抵制感染加強(qiáng)骨組織庫(kù)管理乂人1993年底開(kāi)始減少。同時(shí)，骨髓注射是基于Huggins(1931),Friedenstein(1973),和Ashton(1980)聲明的技術(shù)，其中來(lái)自骨髓的骨原細(xì)胞促進(jìn)并推動(dòng)骨形成。骨髓注射在治療骨折時(shí)通常單獨(dú)使用，但也在骨移植中使用。與其它骨移植技術(shù)不同，這用骨髓注射供體不需切開(kāi)皮膚，有利于降低供體發(fā)病率，沒(méi)有并發(fā)癥或副作用。其后，盡管大量臨床應(yīng)用病例獲得好結(jié)果被報(bào)道，骨髓注射的缺點(diǎn)是不具有健全的理論基礎(chǔ)，獲得的相當(dāng)一部分結(jié)果間不具有一致性，從一個(gè)位置收集的骨髓數(shù)量是有限的，骨髓中的骨原細(xì)胞的數(shù)量是相當(dāng)有限的。
發(fā)明內(nèi)容因此，基于上述問(wèn)題本發(fā)明的目的在于提供一種用于骨結(jié)合含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法，通過(guò)向骨結(jié)合的部位注射成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物，無(wú)臨床移植排異，通過(guò)注射適于一定程度的這用成分可以獲得有效、快速的骨結(jié)合，為了減輕由于注射的成骨細(xì)胞從骨結(jié)合區(qū)域逃逸而造成的非必要區(qū)域骨組織形成及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于單獨(dú)注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法，當(dāng)成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物注射到骨結(jié)合部位時(shí)，進(jìn)行外科手術(shù)只需一個(gè)最小的切口，通過(guò)筒單有效地注射成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物獲得骨結(jié)合，利用放射線無(wú)需在相關(guān)受損區(qū)域切口。與本發(fā)明的一個(gè)方面一致，上述及其它目的通過(guò)提供一種制備用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分來(lái)實(shí)現(xiàn)，包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或者a-MEM(MinimumEssentialMedium,AlphaModification)中培養(yǎng)/增生分離的成骨細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液；及將成骨細(xì)胞懸浮液與凝固因子混合制備成骨細(xì)胞治療劑。其中，凝固因子是凝血酶和纖維蛋白原的混合物。其中，治療劑的制備步驟包括凍干的凝血酶溶解在液體DMEM或者cx-MEM中，將l-100IU/mL的溶解凝血酶與成骨細(xì)胞混合溶液混合；凍干的纖維蛋白原溶解在液體DMEM或者oc-MEM中，將20-100mg/mL的溶解纖維蛋白原與含有凝血酶的成骨細(xì)胞混合溶液混合。與本發(fā)明的另一個(gè)方面一致，提供了一種上述方法制備的成骨細(xì)胞成分，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)與本發(fā)明一種用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法相一致，如上所述，能夠使骨移植，通過(guò)向骨結(jié)合的部位注射成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物，無(wú)臨床移植排異，通過(guò)注射適合的一定程度的成分可以獲得有效、快速的骨結(jié)合，為了減輕由于注射的成骨細(xì)胞從骨結(jié)合區(qū)域逃逸而造成的非必要區(qū)域骨組織形成及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于單獨(dú)注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。另外，本發(fā)明可以使骨移植，當(dāng)成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物注射到骨結(jié)合部位時(shí)，進(jìn)行外科手術(shù)只需一個(gè)最小的切口，通過(guò)簡(jiǎn)單有效地注射成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物獲得骨結(jié)合，利用放射線無(wú)需在相關(guān)受損區(qū)域切口。圖1是纖維蛋白聚合級(jí)聯(lián)作用圖；圖2是纖維蛋白基質(zhì)聚合作用示意圖；圖3是本發(fā)明制備用于骨結(jié)合的半固體成骨細(xì)胞成分方法流程圖；圖4是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物的照片；圖5是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物的治療劑6周后的X光照片；圖6是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物的治療劑6周后用蘇木精-曙紅染色的組織切片照片。圖7是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物6周后用曼森氏三色法(Masson，sTrichrome)染色的組織切片照片。圖9是在回圏中消耗所剩余的反應(yīng)電動(dòng)勢(shì)突波曲線示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明一種用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法將參考附圖做進(jìn)一步詳細(xì)描述。為了克服骨相關(guān)錯(cuò)亂和疾病傳統(tǒng)治療方法的不足，例如移植和骨移植，通過(guò)培育成骨細(xì)胞，自體成骨細(xì)胞移植技術(shù)作為最后的治療方法在受損部位無(wú)副作用，與傳統(tǒng)治療方法的改進(jìn)共同發(fā)展。然而，為了獲得早期骨結(jié)合，需要將成骨細(xì)胞與基質(zhì)混合來(lái)治療多種病變，因此，沒(méi)有分享治療的益處，注射僅僅由液體成骨細(xì)胞構(gòu)成的成骨細(xì)胞懸浮液可能治療多種骨疾病?？梢赃@樣說(shuō)，含有成骨細(xì)胞和纖維蛋白混合物的半固體成骨細(xì)胞治療劑是一種更先進(jìn)的基于細(xì)胞治療用于液體成骨細(xì)胞懸浮液注射方法的產(chǎn)品。傳統(tǒng)的液體成骨細(xì)胞懸浮液注射方法，包括單獨(dú)移植成骨細(xì)胞，僅僅可以治療有限類型的骨缺陷，并且要遭受一些由于注入的成骨細(xì)胞從骨形成位點(diǎn)逃逸，骨組織在非必要區(qū)域形成，及經(jīng)過(guò)血流在其它位點(diǎn)增生的相關(guān)問(wèn)題。相反地，本發(fā)明含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞治療劑由成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物組成，因此可以快速有效地治療較大范圍的骨折和嚴(yán)重的骨疾病。具報(bào)道，纖維蛋白膠在動(dòng)物模型中可以促進(jìn)新血管形成(SchlagG.ClinicalOrthopedics,1988)，可有效提高在骨替換中用于移植方法的移植材料的適應(yīng)性，例如去除礦物質(zhì)的骨粉末、生物活性玻璃、羥磷灰石及珊瑚顆粒，用于移植手術(shù)的材料。另外，纖維蛋白膠是一種用于骨基質(zhì)的有效生物活性劑運(yùn)載工具。上述舉例的生物活性劑可以由TGF-卩-1(Transforminggrowthfactor-beta-1)和TGF-(3-relatedBMP(Transforminggrowthfactor-betarelatedBonemorphogeneticprotein)制備。最近，纖維蛋白膠作為有效傳遞細(xì)胞的基質(zhì)組成材料在組織工程學(xué)的應(yīng)用引起了大量關(guān)注(HuangQ.TissueEngineering2002)。纖維蛋白膠的上述特征導(dǎo)致了快速的骨結(jié)合過(guò)程，現(xiàn)有成分中包含成骨細(xì)胞和纖維蛋白膠作為基質(zhì)材料，應(yīng)用于骨結(jié)合。參考附圖，圖1是纖維蛋白聚合級(jí)聯(lián)作用圖，圖2是纖維蛋白基質(zhì)聚合作用示意圖。為了骨折愈合，首先要固定骨折區(qū)域，及確保供給骨折區(qū)域區(qū)域足夠的血液和壓力。骨折一旦發(fā)生通常會(huì)伴隨其周邊的皮膚、肌肉、韌帶、血管神經(jīng)和關(guān)節(jié)損傷。依據(jù)組織學(xué)，骨折康復(fù)過(guò)程包括三個(gè)階段發(fā)炎、修復(fù)和再造，這些階段是連續(xù)交疊不能?chē)?yán)格區(qū)分的。發(fā)炎階段，骨折區(qū)域附近的骨基質(zhì)、血管和軟組織，例如骨膜、肌肉，由于骨折引起的外傷也會(huì)損傷，導(dǎo)致骨膜下的髓腔血腫。壞死細(xì)胞釋放的炎癥衍生物導(dǎo)致血管舒張，血漿滲出，因此引起急性水腫。在發(fā)炎階段后，伴隨著新基質(zhì)形成的開(kāi)始轉(zhuǎn)換到修復(fù)階段。修復(fù)階段以骨折區(qū)域組織血腫開(kāi)始。血肺形成纖維蛋白支架，接受修復(fù)細(xì)胞。然后，修復(fù)細(xì)胞中的生長(zhǎng)因子或者在修復(fù)細(xì)胞中形成的其它蛋白導(dǎo)致細(xì)胞遷移和增生，構(gòu)成修復(fù)基質(zhì)，這是骨折復(fù)原的第一步。在骨折恢復(fù)階段，大多數(shù)細(xì)胞生成的骨組織與肉芽組織在骨折區(qū)域一起出現(xiàn)，形成胼胝體，月并胝體在骨折區(qū)域周?chē)衫w維組織、軟骨和編織骨組成。胼胝體的礦化作用由成骨細(xì)胞的一系列作用開(kāi)始。由成骨細(xì)胞合成的基質(zhì)包括大量規(guī)則間隔的I型膠原纖維，其可在本階段提供磷酸4丐絡(luò)合物沉淀的條件。然而，本修復(fù)階段不是骨結(jié)合完成的階段，從而導(dǎo)致不成熟骨折胼胝體具有較正常骨組織弱的骨強(qiáng)度。因此，在再造階段，這樣的骨折胼胝體獲得正常骨組織展示的強(qiáng)度。關(guān)于再造階段，在胼胝體內(nèi)的編織骨由成熟的板層骨替換，非必要的過(guò)量的胼胝體被逐漸吸收?；诜派湫酝凰貦z測(cè)的結(jié)果，入X光照片所示，在骨結(jié)合完成后，骨折區(qū)域功能完全回復(fù)正常狀態(tài)的一段時(shí)間內(nèi)，骨折區(qū)域放射性同位素的活性增強(qiáng)。因此，再造階段在骨折臨床結(jié)合后要持續(xù)幾年。圖3是本發(fā)明制備用于骨結(jié)合的半固體成骨細(xì)胞成分方法的流程圖。參考圖3，制備用于骨結(jié)合含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的方法，包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或者a-MEM(MinimumEssentialMedium,AlphaModification)中培育/增生分離的成骨細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液(S100);將上述成骨細(xì)胞懸浮液與凝固因子混合，制備成骨細(xì)胞治療劑(S200)。其中，凝固因子是凝血酶和纖維蛋白原的混合物。其中，制備治療劑的步驟包括將凍干的凝血酶溶解在液體DMEM或者cc隱MEM中，將濃度為1IU/mL-100IU/mL的溶解的凝血酶與成骨細(xì)胞混合溶液混合(S210);將凍干的纖維蛋白原溶解在液體DMEM或者oc-MEM中，然后將濃度為20-100mg/mL的溶解的纖維蛋白原與上述含有凝血酶的成骨細(xì)胞混合溶液混合(S220)。其中，凝血酶的濃度決定纖維蛋白聚合時(shí)間。因此，依賴凝血酶的濃度，纖維蛋白的聚合時(shí)間可由4小時(shí)降低到3秒鐘。凝血酶適用于濃縮本發(fā)明的成分，當(dāng)該成分為了骨折結(jié)合而注射時(shí)，該成分適于阻止成骨細(xì)胞和凝固因子從受損部位泄漏，在受損區(qū)域注射該成分可以加速基質(zhì)形成，形成用于骨形成的成骨細(xì)胞最佳蛋白纖維氣孔基質(zhì)本發(fā)明實(shí)施例用于骨結(jié)合含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的效果將結(jié)合附圖做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。首先，從相關(guān)組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM或者a-MEM中培養(yǎng)4個(gè)星期，增生足夠數(shù)量的成骨細(xì)胞。然后，將上述成骨細(xì)胞懸浮于DMEM或者(x-MEM中，制備成骨細(xì)胞懸浮液。在室溫制備醫(yī)學(xué)級(jí)纖維蛋白膠，纖維蛋白原溶解在適量含有凍干纖維蛋白原的液體DMEM或者a-MEM中。另外，凝血酶溶解在適量含有凍干凝血酶的液體DMEM或者a-MEM中。向溶解的凝血酶中加入1/5體積的液體成骨細(xì)胞懸浮液，混勻。混有凝血酶的成骨細(xì)胞懸浮液與等量的纖維蛋白原混合，制備500^成骨細(xì)胞成分。30只新西蘭白兔，重約3kg，忽略性別，分成骨移植對(duì)照組和移植實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組使用用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分，每組15只兔子。根據(jù)Henry的方法，在兔的前臂制造縱向切口，從而暴露橈骨骨干，用鋸制造尺寸為15mm的骨損傷，完全去除骨損傷區(qū)域的骨膜。對(duì)照組，先從長(zhǎng)骨收集松質(zhì)骨，移植到骨損傷區(qū)域，然后縫合皮膚和皮200580049294.6說(shuō)明書(shū)第7/8頁(yè)下組織。實(shí)驗(yàn)組，小心縫合皮膚和皮下組織，骨損傷區(qū)域成為未用空間，3周后注射成骨細(xì)胞成分，如圖4所示。在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后的3，6和9周拍攝X光照片，骨結(jié)合用相關(guān)要點(diǎn)近端和遠(yuǎn)端的骨切開(kāi)術(shù)區(qū)域任務(wù)來(lái)評(píng)估，分別依賴于骨結(jié)合程度和獲得要點(diǎn)的數(shù)量。表l決定骨折缺口結(jié)合的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組骨移植9周后結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖5是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物的半固體成骨細(xì)胞治療劑6周后的X光照片，可以看出骨折完全結(jié)合。圖6是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物的半固體成骨細(xì)胞治療劑6周后用蘇木精-曙紅染色的組織切片照片，可以看出單獨(dú)形成了骨島。圖7是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射纖維蛋白和成骨細(xì)胞混合物6周后用曼森氏三色法(Masson，sTrichrome)染色的組織切片照片，證實(shí)了膠原質(zhì)沿著預(yù)訂方式伸長(zhǎng)，展示了骨形成和血管形成進(jìn)展(紅色橢圓形點(diǎn)線)。從而，本發(fā)明提供了無(wú)免疫排斥骨移植，當(dāng)由于嚴(yán)重的骨折而使骨結(jié)合無(wú)法進(jìn)行時(shí)，用成骨細(xì)胞與纖維蛋白混合，并將混合物注入受損部位用于骨結(jié)合，通過(guò)注射適合程度的成分，顯示了有效快速的骨結(jié)合效果。如前所述，本發(fā)明一種用于骨結(jié)合含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法，可以促進(jìn)骨折再結(jié)合，向骨結(jié)合部位注射成骨細(xì)胞和纖維蛋白的混合物無(wú)臨床移植排斥，通過(guò)注射適合程度的成分可以有效、快速促進(jìn)域骨組織形成及成骨細(xì)胞通過(guò)血流增生的問(wèn)題，這個(gè)問(wèn)題是由于單獨(dú)注射成骨細(xì)胞懸浮液而造成的。另外，本發(fā)明可以使骨折再結(jié)合，當(dāng)成骨細(xì)胞和纖維蛋白注入到骨結(jié)合區(qū)域時(shí)，實(shí)施的外科手術(shù)只需最小的切口，通過(guò)成骨細(xì)胞和纖維蛋白混合物在相關(guān)受損區(qū)域利用》文射線，例如X射線，無(wú)切口簡(jiǎn)單而有效的注射，獲得骨結(jié)合。盡管本發(fā)明的首選實(shí)施例揭示了發(fā)明目的，但是技術(shù)的改進(jìn)、增加及替換仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。權(quán)利要求1、一種制備用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的方法，其特征在于，包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)或者α-MEM(MinimumEssentialMedium，AlphaModification)中培育/增生分離的成骨細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液；及將成骨細(xì)胞懸浮液與凝固因子混合，制備成骨細(xì)胞治療劑。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述制備用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的方法，其特征在于，凝固因子是凝血酶和纖維蛋白原的混合物。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述制備用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的方法，其特征在于，治療劑的制備步驟包括將凍干的凝血酶溶解于液體DMEM或a-MEM，然后將濃度為1-100IU/mL的凝血酶與成骨細(xì)胞混合溶液混合；及將凍干的纖維蛋白原溶解于液體DMEM或a-MEM,然后將濃度為20mg/mL_100mg/mL的纖維蛋白原與含有凝血酶的成骨細(xì)胞混合溶液混合4、由權(quán)利要求1所述制備用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的方法，其特征在于，制備用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分的方法制備的成骨細(xì)胞成分。全文摘要本發(fā)明是有關(guān)于一種用于骨結(jié)合的含有纖維蛋白的半固體成骨細(xì)胞成分及其制備方法。該方法包括從骨組織中分離成骨細(xì)胞，在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)或者α-MEM(MinimumEssentialMedium，AlphaModification)中培育/增生分離的成骨細(xì)胞，制備成骨細(xì)胞懸浮液；及將成骨細(xì)胞懸浮液與凝固因子混合，制備成骨細(xì)胞治療劑。文檔編號(hào)A61K35/32GK101247814SQ200580049294公開(kāi)日2008年8月20日申請(qǐng)日期2005年8月3日優(yōu)先權(quán)日2005年6月13日發(fā)明者張?jiān)诘?張晶皓,樸炫信,李璽邦,鄭修真,高暢權(quán)申請(qǐng)人:世源世龍股份有限公司