專利名稱：無(wú)指盤臭蛙抗菌肽及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種無(wú)指盤臭蛙(Rana grahami)抗菌肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
青霉素的發(fā)現(xiàn)使人們對(duì)由病原微生物感染而引發(fā)的各類疾病不再束手無(wú)策，并由此發(fā)展了大量的β-內(nèi)酰胺類抗生素，對(duì)保護(hù)人類健康作出了巨大貢獻(xiàn)。但隨著上述“傳統(tǒng)抗生素”的廣泛使用，不斷產(chǎn)生出諸多新問題。如β-內(nèi)酰胺類抗生素的過(guò)敏反應(yīng)以及長(zhǎng)期使用導(dǎo)致抗藥菌株的產(chǎn)生。于是人們開始尋找新一代抗菌劑。近期的研究發(fā)現(xiàn)，多肽抗生素具有廣譜的抗菌活性，同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無(wú)法比擬的優(yōu)越性如在最小作用濃度時(shí)，快速而廣譜地殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)；對(duì)真菌也有抑制作用；不會(huì)誘導(dǎo)抗藥菌株的產(chǎn)生；對(duì)于局部感染和全身感染都有效，有希望成為新一代抗菌劑，其研制目前受到廣泛重視。
很多兩棲類動(dòng)物在中國(guó)屬于傳統(tǒng)中藥和民族藥物而廣泛應(yīng)用，如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(pelophylaxnigromaculata)，沼蛙(Hylarana guentheri)和澤蛙(Euphlyctislimnocharis)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報(bào)道藥理活性有廣譜抗微生物作用、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、心血管系統(tǒng)作用等。在國(guó)外，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。據(jù)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，已從各種生物來(lái)源分離得到不同的活性多肽，而且有些已進(jìn)入臨床治療。如從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌液獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已進(jìn)入三期臨床；Intrabiotics公司生產(chǎn)的活性多肽IB-367已獲準(zhǔn)用于治療癌癥病人因多種細(xì)菌感染而引起的口腔潰瘍一期臨床試驗(yàn)；Applied Microbiology公司與Astra公司合作用活性多肽nisin治療胃潰瘍的臨床試驗(yàn)也取得良好的療效。
我國(guó)對(duì)兩棲類藥物的應(yīng)用有悠久的歷史，但對(duì)其活性成分和藥理性質(zhì)的研究主要集中于生物堿等有機(jī)小分子，對(duì)其皮膚活性肽類物質(zhì)研究不多。無(wú)指盤臭蛙(Rana grahami)在國(guó)內(nèi)主要分布于廣西、四川、貴州和云南等地。
發(fā)明人將本發(fā)明的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽(yáng)性細(xì)菌、真菌)的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽及其應(yīng)用。
本發(fā)明的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽采用常規(guī)方法制備，即乙醚刺激無(wú)指盤臭蛙，收集的皮膚分泌液離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)一系列的生物化學(xué)手段分離純化得到該多肽，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)，根據(jù)所得到的氨基酸序列合成該多肽。采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定分子量，等電聚焦測(cè)定等電點(diǎn)，自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀確認(rèn)氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽是從兩棲類無(wú)指盤臭蛙分泌液中分離得到的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點(diǎn)為9.39，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)eu Lys Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
本發(fā)明的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。
本發(fā)明的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽是從天然生物資源得到的產(chǎn)物，具有對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒有強(qiáng)烈活性抑制作用，及無(wú)溶血活性的優(yōu)點(diǎn)，可作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明無(wú)指盤臭蛙抗菌肽的Sephadex G-50凝膠過(guò)濾柱層析圖。
圖2為本發(fā)明無(wú)指盤臭蛙抗菌肽反相高壓液相色譜圖。
圖3為本發(fā)明無(wú)指盤臭蛙抗菌肽的飛行時(shí)間質(zhì)譜圖。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
無(wú)指盤臭蛙抗菌肽的制備將活體無(wú)指盤臭蛙用水清洗干凈，置于帶蓋的玻璃容器中，滴加無(wú)水乙醚(1升體積容積加1毫升無(wú)水乙醚)，密閉容器3-5分鐘，可見大量的泡沫狀物質(zhì)從無(wú)指盤臭蛙皮膚分泌出來(lái)，收集分泌物，離心(10000rpm，20分鐘)、冷凍干燥后保存。
第一步，Sephadex G-50凝膠過(guò)濾柱層析，按上述方法獲得的原材料無(wú)指盤臭蛙皮膚分泌液凍干粉300mg溶解于5ml純凈水，10000rpm 4℃離心10min去除沉淀。Sephadex G-50凝膠過(guò)濾柱(長(zhǎng)1000mm，直徑26mm)用0.1MNa2HPO4-NaH2PO4pH 6.0緩沖液平衡，充分后將樣品上于該柱。用同樣緩沖液洗脫，收集活性峰。
第二步，反相高壓液相色譜為Sephadex G-50凝膠過(guò)濾得到的活性成分的峰上樣于經(jīng)含1‰三氟乙酸的超純水充分平衡的C18反相柱(長(zhǎng)300mm，直徑5mm)用含1‰三氟乙酸的乙晴緩沖液從0％至80％的梯度洗脫。收集具有抑菌作用的活性峰。
第三步，純化的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度，分子量測(cè)定采用飛行時(shí)間質(zhì)譜法(Time of flight mass spectrometry，TOF-MS)，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
通過(guò)上述方法制備的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽是中國(guó)兩棲類無(wú)指盤臭蛙抗菌肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點(diǎn)為9.39，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)eu Lys Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
無(wú)指盤臭蛙抗菌肽的藥理實(shí)驗(yàn)1.無(wú)指盤臭蛙抗菌肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用抗菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h后測(cè)量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimalinhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此實(shí)驗(yàn)做四個(gè)平行，取幾何平均值，結(jié)果如表1。
表1.無(wú)指盤臭蛙抗菌肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用

由表1可見，無(wú)指盤臭蛙抗菌肽有顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)作用。
2.無(wú)指盤臭蛙抗菌肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用抗真菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24h-48h后測(cè)量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于云南大學(xué)微生物研究所，此實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行，取幾何平均值，結(jié)果如表2。
表2.無(wú)指盤臭蛙抗菌肽抑制真菌生長(zhǎng)的作用

由表2可見，無(wú)指盤臭蛙抗菌肽具有顯著的抑制真菌生長(zhǎng)作用。
權(quán)利要求
1.一種無(wú)指盤臭蛙抗菌肽，其特征在于該無(wú)指盤臭蛙抗菌肽是從兩棲類無(wú)指盤臭蛀分泌液中分離得到的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點(diǎn)為9.39，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)eu Lus Gly Cys Trp The Lys Ser Ile Pro Pro LysPro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。
2.權(quán)利要求1所述無(wú)指盤臭蛙抗菌肽的應(yīng)用，其特征在于該無(wú)指盤臭蛙抗菌肽作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種無(wú)指盤臭蛙抗菌肽及其應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。無(wú)指盤臭蛙抗菌肽是從兩棲類無(wú)指盤臭蛙分泌液中分離得到的一種環(huán)狀多肽，分子量為1705.3道爾頓，等電點(diǎn)為9.39，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為L(zhǎng)eu Lys Gly Cys Trp TheLys Ser Ile Pro Pro Lys Pro Cys Phe(LKGCWTKSIPPKPCF)，第四位和第十四位的的半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵。其制備方法是乙醚刺激無(wú)指盤臭蛙收集的分泌液離心去除沉淀，冷凍干燥后經(jīng)凝膠過(guò)濾柱層析和反相高壓液相色譜后分離純化后得到。本發(fā)明的無(wú)指盤臭蛙抗菌肽具有對(duì)細(xì)菌、真菌、病毒有強(qiáng)烈活性抑制作用，及無(wú)溶血活性的優(yōu)點(diǎn)，可作為制備治療病原微生物感染疾病藥物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)A61K38/10GK1927880SQ200610010928
公開日2007年3月14日 申請(qǐng)日期2006年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月30日
發(fā)明者賴仞, 李建許, 徐學(xué)清, 徐春花, 李東升, 呂毅 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所