專利名稱：一種預(yù)防與改善帕金森氏癥的組合物及其制法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)退行性疾病領(lǐng)域，尤其涉及帕金森氏癥的預(yù)防和改善。
背景技術(shù)：
帕金森氏癥(PD)的病理機(jī)制是多方面的。從多巴胺(DA)代謝而言，DA神經(jīng)元內(nèi)DA的減少是PD發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，其合成代謝的限速酶——酪氨酸羥化酶(TH)需要有四氫喋啶和O2、Fe2+等輔因子的共同參與，并且TH活性和含量都較低；多巴脫羧酶(DDC)則以磷酸吡哆醛為其輔基，另外，自由基的作用是PD產(chǎn)生的另一種機(jī)制，多巴胺本身極易發(fā)生氧化，在體內(nèi)單胺氧化酶作用下(Fe3+參與)產(chǎn)生H2O2和O2·+，當(dāng)機(jī)體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，DA就發(fā)生代謝失常，成為內(nèi)源性毒素，同時(shí)，F(xiàn)e2+/Fe3+參與形成神經(jīng)黑色素，具有自由基清除功能的觸酶和谷光甘肽過(guò)氧化物酶出現(xiàn)功能缺陷，進(jìn)一步抑制線粒體NADH電子傳遞呼吸鏈，阻斷復(fù)合物I的活性，導(dǎo)致自由基的積累，另一方面，F(xiàn)e2+的變化將影響到線粒體內(nèi)亞鐵血紅素的合成，導(dǎo)致復(fù)合物IV的功能障礙，使線粒體的損傷進(jìn)一步加劇，不但正常三羧酸循環(huán)過(guò)程無(wú)法進(jìn)行，而且最終使DA神經(jīng)元死亡。
不斷增加的證據(jù)已經(jīng)顯示出不論是由毒物MPTP還是由基因損傷導(dǎo)致的帕金森氏癥(PD)，都與氧化損傷有關(guān)(Betarbet et al.，2002；Ebadi etal.，1996；Kondo，1996；Schapira et al.，1990)。目前，大多采用抵抗氧化損傷及保護(hù)紋狀體多巴胺(DA)能神經(jīng)元的方法治療PD，例如用Mazindol阻斷DA受體；用Dizocilpin馬來(lái)酸鹽封閉NMDA受體；通過(guò)給予腦源神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子增強(qiáng)神經(jīng)元的生存率；提供例如VE、VC等抗氧化物；或用Selegiline抑制單胺氧化酶。然而，所有這些方法因?yàn)槎加懈弊饔?，而不十分有效?br> 線粒體是氧化劑的來(lái)源同時(shí)也是其攻擊的對(duì)象，線粒體抗氧化劑及其代謝物水平的下降有可能會(huì)損傷神經(jīng)細(xì)胞抗氧化防御機(jī)制的效果，導(dǎo)致老年性癡呆癥(AD)、PD等神經(jīng)退行性疾病。
VB5、VB6、VB11、VB12單獨(dú)作用時(shí)對(duì)于PD果蠅運(yùn)動(dòng)能力的改善和壽命的延長(zhǎng)都有一定的作用，但無(wú)法達(dá)到對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和壽命都非常有效的效果，甚至?xí)龅綄?duì)二者的作用完全相反的現(xiàn)象。
資料顯示，對(duì)年老大鼠的飲食添加乙酰-L-肉堿(ALCAR)和/或R-硫辛酸(LA)，能夠改善隨著衰老而增加的線粒體凋亡，降低線粒體所遭受的氧化損傷程度，并增強(qiáng)老年大鼠的意識(shí)，及運(yùn)動(dòng)活力。而且有報(bào)道稱，將ALCAR和LA聯(lián)用，在改善老年大鼠的線粒體凋亡方面比單一使用更有效，聯(lián)合應(yīng)用的ALCAR和LA用量大，而且認(rèn)為用量越大效果越好。
因此，本領(lǐng)域迫切需要提供一種組合物，它所用的劑量小，安全性高，同時(shí)能更有效地抑制線粒體的氧化損傷，從而預(yù)防、治療和改善帕金森氏癥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在提供一種組合物，及其制備方法和用途。
在本發(fā)明的第一個(gè)方面，提供了一種組合物，它含有二種或多種(如2-12種)線粒體營(yíng)養(yǎng)素，或者所述的組合物由二種或多種(如2-12種)線粒體營(yíng)養(yǎng)素構(gòu)成。
在另一優(yōu)選例中，所述的線粒體營(yíng)養(yǎng)素選自下組R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(a)維生素B12；(b)一種或多種選自下組的B族維生素維生素B5、維生素B6、維生素B11。
在另一優(yōu)選例中，上述的組分(b)是維生素B5；或者上述的組分(b)是維生素B5和維生素B6。
在另一優(yōu)選例中，上述的組分(b)同時(shí)包括維生素B5、維生素B6和維生素B11三種B族維生素。
在另一優(yōu)選例中，上述的組合物還含有(c)一種或多種選自下組的線粒體營(yíng)養(yǎng)素R-硫辛酸、或乙酰肉堿。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(i)5-150重量份維生素B5；(ii)2-1000重量份維生素B6；(iii)0.4-40重量份維生素B11；(iv)0.003-1重量份維生素B12；且組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的10-100％。較佳地組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的20-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(i)15-50重量份維生素B5；(ii)50-300重量份維生素B6；(iii)1-10重量份維生素B11；(iv)0.01-0.2重量份維生素B12。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有(v)100-350重量份R-硫辛酸(vi)100-2000重量份乙酰肉堿；且組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)+(v)+(vi)占組合物總重量的15-100％。較佳地組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)+(v)+(vi)占組合物總重量的30-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有(v)150-250重量份R-硫辛酸(vi)180-500重量份乙酰肉堿。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉堿。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有
(1)100-350重量份R-硫辛酸；(2)100-2000重量份乙酰肉堿；且組份(1)+(2)占組合物總重量的10-100％。較佳地組份(1)+(2)占組合物總重量的20-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(1)150-250重量份R-硫辛酸；(2)180-500重量份乙酰肉堿。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有(3)5-150重量份維生素B5；(4)2-1000重量份維生素B6；(5)0.4-40重量份維生素B11；(6)0.003-1重量份維生素B12；且組份(1)+(2)+(3)+(4)+(5)+(6)占組合物總重量的15-100％。較佳地組份(1)+(2)+(3)+(4)+(5)+(6)占組合物總重量的30-90％。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有(3)15-50重量份維生素B5；(4)50-300重量份維生素B6；(5)1-10重量份維生素B11；(6)0.01-0.2重量份維生素B12。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物還含有藥學(xué)上可接受的載體。
在本發(fā)明的第二個(gè)方面，提供了一種組合物的制備方法，它包括步驟①將二種或多種線粒體營(yíng)養(yǎng)素混合在一起，形成組合物。
在另一優(yōu)選例中，所述的制備方法中的線粒體營(yíng)養(yǎng)素選自下組R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，將(a)維生素B12和(b)選自維生素B5、B6或B11中一種或多種B族維生素混合，制得組合物。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，再混入(c)一種或多種選自下組的線粒體營(yíng)養(yǎng)素R-硫辛酸、或乙酰肉堿，制得組合物。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，還包括混入一種或多種選自下組的額外的線粒體營(yíng)養(yǎng)素輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
在另一優(yōu)選例中，在步驟①中，將(i)5-150重量份維生素B5；(ii)2-1000重量份維生素B6；(iii)0.4-40重量份維生素B11；和(iv)0.003-1重量份維生素B12混合，制得組合物。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中還包括混入(v)100-350重量份的R-硫辛酸和(vi)100-2000重量份的乙酰肉堿混合，制得組合物。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，將(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉堿混合，制得組合物。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，還包括混入一種或多種選自下組的額外的線粒體營(yíng)養(yǎng)素輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，將(1)100-350重量份R-硫辛酸和(2)100-2000重量份乙酰肉堿混合，制得組合物。
在另一優(yōu)選例中，它包括步驟在步驟①中，還包括混入(3)5-150重量份維生素B5；(4)2-1000重量份維生素B6；(5)0.4-40重量份維生素B11；(6)0.003-1重量份維生素B12混合，從而制得組合物。
在本發(fā)明的第三個(gè)方面，提供了上述的組合物的用途，將所述的組合物用于制備預(yù)防、治療或改善帕金森氏癥的藥物，或用于制備預(yù)防或改善帕金森氏癥的飲食補(bǔ)充劑。
在本發(fā)明的第四個(gè)方面，提供了一種預(yù)防、治療或改善帕金森氏癥的方法，所述的方法是給予需要治療的對(duì)象施用一種或多種(更佳地2種或多種)線粒體營(yíng)養(yǎng)素。
在另一優(yōu)選例中，所述的線粒體營(yíng)養(yǎng)素選自下組R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的方法是給予需要治療的對(duì)象施用有效量的(a)維生素B12；(b)一種或多種選自下組的B族維生素維生素B5、維生素B6、維生素B11。
在另一優(yōu)選例中，所述的治療方法為還給需要的受試者施加有效量的(c)一種或多種選自下組的線粒體營(yíng)養(yǎng)素R-硫辛酸、或乙酰肉堿。
在另一優(yōu)選例中，所述的治療方法為還給需要的受試者施加有效量的(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉堿。
由此，本發(fā)明提供了一種組合物，它劑量小，安全性高，能更有效地抑制線粒體的氧化損傷，達(dá)到預(yù)防、治療和改善帕金森氏癥的目的。


圖1顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的線粒體膜電位下降的抑制效應(yīng)。
圖2顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的線粒體復(fù)合物I活性下降的抑制效應(yīng)。
圖3顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的ATP水平下降的抑制效應(yīng)。
圖4顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的細(xì)胞色素C釋放增加的抑制效應(yīng)。
圖5顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的GSH水平下降的抑制效應(yīng)。
圖6顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的蛋白質(zhì)氧化損傷增加的抑制效應(yīng)。
圖7顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的氧化的DNA損傷的抑制效應(yīng)。
圖8顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的ROS升高的抑制效應(yīng)。
圖9顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的突觸素I(α-synuclein)及其mRNA表達(dá)變化的影響。
圖10顯示了LA、ALCAR及其組合預(yù)處理對(duì)魚(yú)藤酮所引起的突觸素I和泛素(ubiquitin)水平升高的影響。
圖11顯示了VB5對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖12顯示了VB5對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖13顯示了VB5對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖14顯示了VB5對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖15顯示了VB12對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖16顯示了VB12對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖17顯示了VB12對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖18顯示了VB12對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖19顯示了VB6對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖20顯示了VB6對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖21顯示了VB6對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖22顯示了VB6對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖23顯示了VB11對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖24顯示了VB11對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖25顯示了VB11對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖26顯示了VB11對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖27顯示了VB5+VB12對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖28顯示了VB5+VB12對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖29顯示了VB5+VB12對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖30顯示了VB5+VB12對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖31顯示了VB6+VB11+VB12對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖32顯示了VB6+VB11+VB12對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖33顯示了VB6+VB11+VB12對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖34顯示了VB6+VB11+VB12對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖35顯示了VB5+VB6+VB11+VB12對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖36顯示了VB5+VB6+VB11+VB12對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖37顯示了VB5+VB6+VB11+VB12對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖38顯示了VB5+VB6+VB11+VB12對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖39顯示了LA+ALCAR、VB5+VB6+VB11+VB12以及LA+ALCAR十VB5+VB6+VB11+VB12預(yù)處理對(duì)MPP所引起的線粒體損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞死亡現(xiàn)象的抑制效應(yīng)。
圖40顯示了LA對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖41顯示了LA對(duì)PD雄性果蠅壽命的影響。
圖42顯示了LA對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖43顯示了LA對(duì)PD雌性果蠅壽命的影響。
圖44顯示了ALCAR對(duì)PD雄性果蠅攀爬能力的影響。
圖45顯示了ALCAR對(duì)PD雌性果蠅攀爬能力的影響。
圖46顯示了ALCAR對(duì)PD果蠅壽命的影響。
圖47顯示了LA+ALCAR對(duì)PD果蠅攀爬能力的影響。
圖48顯示了LA+ALCAR對(duì)PD果蠅壽命的影響。
圖49顯示了PD果蠅模型體內(nèi)酪氨酸羥化酶和突觸素I的表達(dá)情況。
1.雌性PD果蠅，2.雄性PD果蠅，3.雌性非PD果蠅，4.雄性非PD果蠅圖50顯示了LA對(duì)雄性PD果蠅突觸素I表達(dá)的作用。
1.非PD果蠅對(duì)照，2.PD果蠅對(duì)照，3.LA10圖51顯示了LA對(duì)雌性PD果蠅突觸素I表達(dá)的作用。
1.非PD果蠅對(duì)照，2.PD果蠅對(duì)照，3.LA10圖52顯示了LA對(duì)雄性PD果蠅突觸素ImRNA表達(dá)的作用。
圖53顯示了LA、VB6對(duì)PD果蠅神經(jīng)系統(tǒng)多巴胺神經(jīng)元的影響。
1.Uas-DDC-gal4果蠅(PD果蠅的父本果蠅)1天，2.PD果蠅對(duì)照1天，3.uas-DDC-gal4果蠅20天，4.PD果蠅對(duì)照20天，5.PD果蠅施用VB620天，6.PD果蠅施用LA20天圖54顯示了VB5、VB6、VB11、VB12、LA對(duì)雄性PD果蠅突觸素I表達(dá)的作用。
1.非PD果蠅對(duì)照，2.PD果蠅對(duì)照，3.VB5，4.VB6，5.VB11，6.VB12，7.LA圖55顯示了VB5+VB6+VB11+VB12(即VBS)對(duì)雄性PD果蠅突觸素ImRNA表達(dá)的作用。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過(guò)廣泛和深入地研究，意外地發(fā)現(xiàn)小劑量的乙酰肉堿(ALCAR)和R-硫辛酸(LA)聯(lián)用，可以有效地抑制神經(jīng)細(xì)胞的老年性退行性病變。
本發(fā)明人還意外地發(fā)現(xiàn)，將維生素(Vit)B5與維生素B6、B11、B12中的一種或多種B族維生素聯(lián)用(尤其是是將維生素(Vit)B5、B6、B11和B12四種維生素聯(lián)用)，可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而更有效地改善帕金森氏癥。
在另一優(yōu)選例中，發(fā)明人更進(jìn)一步地發(fā)現(xiàn)，將小劑量的ALCAR和LA，以及維生素(Vit)B5、B6、B11和B12聯(lián)用，改善帕金森氏癥的效果更佳。
定義如本文所用，術(shù)語(yǔ)“含有”或“包括”包括了“包含”、“基本上由……構(gòu)成”、和“由……構(gòu)成”。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“基本上由……構(gòu)成”指在組合物中，除了含有必要成分或必要組份之外，還可含有少量的且不影響有效成分的次要成分和/或雜質(zhì)。例如，可以含有甜味劑以改善口味、抗氧化劑以防止氧化，以及其他本領(lǐng)域常用的添加劑。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“有效量”是指可對(duì)人和/或動(dòng)物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動(dòng)物所接受的量。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“ALCAR”、“乙酰肉堿”和“乙酰-L-肉堿”可互換使用，都是指L-肉毒堿的乙?；苌?。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥或保健品食用的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術(shù)語(yǔ)指這樣一些載體它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒(méi)有過(guò)分的毒性。合適的載體是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關(guān)于藥學(xué)上可接受的賦形劑的充分討論。在組合物中藥學(xué)上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如潤(rùn)濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。來(lái)自于LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12等線粒體營(yíng)養(yǎng)素之外的非必要成分，以及其他非必要成分(例如其他輔助性藥材或食材)，也包括在藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體的定義中。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“必要成分”指作為活性成分的必要的化學(xué)物質(zhì)，即LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12等線粒體營(yíng)養(yǎng)素。各成分也可以以“生理學(xué)可接受的鹽”或“生理學(xué)可接受的酸或堿衍生的鹽”形式使用。所述的鹽包括(但不限于)與如下無(wú)機(jī)酸形成的鹽如鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、以及與有機(jī)酸形成的鹽，而有機(jī)酸則指乙酸、草酸、丁二酸、酒石酸、甲磺酸和馬來(lái)酸。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以酯、氨基甲酸酯或其他常規(guī)的“前體藥物”的形式(當(dāng)以這種形式給藥時(shí)，在體內(nèi)可轉(zhuǎn)化成活性部分)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“本發(fā)明的組合物”包括藥物組合物、食物組合物和/或膳食添加劑，只要它們含有或基本上由選自下組的兩種或多種線粒體營(yíng)養(yǎng)素組成R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺(VB1)、核黃素(VB2)、煙酸(VB3)、生物素(VB7)或肌酸。
如本文所用，“線粒體營(yíng)養(yǎng)素”是指能夠保護(hù)線粒體免受氧化損傷和能夠提高線粒體功能的營(yíng)養(yǎng)素，包括那些能夠①保護(hù)線粒體免遭氧化應(yīng)激，如抗氧化劑和金屬螯合物；②修復(fù)線粒體膜；③功能性修復(fù)和防止線粒體氧化損害，如線粒體酶的底物或輔酶；和④誘導(dǎo)2期抗氧化酶的表達(dá)。
如本文所用，術(shù)語(yǔ)“單元?jiǎng)┬汀笔侵笧榱朔梅奖?，將本發(fā)明的組合物制備成單次服用所需的劑型，包括但不限于各種固體劑(如片劑)、液體劑、膠囊劑、緩釋劑。所述的單元?jiǎng)┬椭泻袑?duì)于預(yù)防、治療、或改善帕金森氏癥有效的本發(fā)明的組合物。
如本文所用，“重量份”或“重量份數(shù)”可互換使用，所述的重量份可以是任何一個(gè)固定的以毫克、克數(shù)或千克數(shù)表示重量(如1mg、1g、2g、5g、或1kg等)。例如，一個(gè)由1重量份組分a和9重量份組分b構(gòu)成的組合物，可以是1克組分a+9克組分b，也可以是10克組分a+90克組分b等構(gòu)成的組合物。在所述組合物，某一組分的百分比含量＝(該組分的重量份數(shù)/所有組分的重量份數(shù)之和)×100％。因此，由1重量份組分a和9重量份組分b構(gòu)成的組合物中，組分a的含量為10％，組分b為90％。
本發(fā)明的組合物可直接用于預(yù)防、緩解或治療帕金森氏癥，或可與其它藥物或膳食添加劑共同給藥。
線粒體營(yíng)養(yǎng)素本發(fā)明的組合物中可含有選自下組的一種或多種線粒體營(yíng)養(yǎng)素R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11或維生素B12。本發(fā)明的線粒體營(yíng)養(yǎng)素組合物含有或基本上由①VitB12+VitB5、VitB6、VitB11中的一種或多種構(gòu)成、或含有或基本上由②R-硫辛酸+乙酰肉堿構(gòu)成、或含有或基本上由③R-硫辛酸+乙酰肉堿+VitB5+VitB6+VitB11+VitB12構(gòu)成。通常，①VitB12+VitB5、VitB6、VitB11中的一種或多種、或②R-硫辛酸+乙酰肉堿、或③R-硫辛酸+乙酰肉堿+VitB5+VitB6+VitB11+VitB12的重量占組合物總重量的15-99％，較佳地30-90％，更佳地50-90％。余量的物質(zhì)是藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體。在優(yōu)選例中，本發(fā)明組合物通常不含有目前在治療帕金森氏癥中所含的其他藥物，例如L-DOPA，selegiline等。
適用于本發(fā)明的代表性的其他線粒體營(yíng)養(yǎng)素包括(但并不限于)輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素和肌酸。
1.輔酶Q10(CoQ)位于線粒體內(nèi)膜里的一個(gè)電子載體，它可以穩(wěn)定呼吸鏈組分并能夠作為一種線粒體抗氧化劑起作用(Ebadi等人，2001；Ernster，1994；Frei等人，1990)。在多種線粒體病癥中，包括PD，亨廷頓氏癥和氏共濟(jì)失調(diào)，CoQ對(duì)于臨床治療和生化指標(biāo)的改變都有積極的影響(Beal等人，1998；Ebadi等人，2001；Shults等人，2002)。在用MPTP處理的小鼠中，CoQ能減輕MPTP導(dǎo)致的神經(jīng)中毒性，提高紋狀體的多巴胺水平，增加紋狀體的線粒體數(shù)量和ATP合成量，并增強(qiáng)紋狀體中線粒體復(fù)合體的活性(Beal，2003；Ebadi et al.，2001；Ebadi et al.，1996)，減弱由MPTP引起的氧化劑增加以及紋狀體中由MPTP導(dǎo)致的多巴胺損耗(Beal et al.，1998；Ebadi etal.，2001)。臨床研究顯示PD病人應(yīng)用高劑量CoQ能減緩致殘疾癥狀進(jìn)程，劑量最高可達(dá)1200mg/d。因此CoQ能夠安全地減緩PD癥狀的惡化(Shults et al.，2002)。
體內(nèi)CoQ(Ernster，1994)，LA，和肉毒堿(Liu et al.，2002)的水平將隨年齡退化，補(bǔ)充LA、ALCAR或CoQ可改進(jìn)在認(rèn)知功能和神經(jīng)退化中與年齡有關(guān)的衰退現(xiàn)象(Beal，2003年；Liu et al.，2002.a)。
2.硫胺(VB1)硫胺(VB1)是焦磷酸硫胺素輔酶的前體，VB1磷?；纬山沽姿崃虬匪兀前ň€粒體酶在內(nèi)的多種酶的輔因子；VB1對(duì)于乙酰膽堿的代謝及其從突觸前神經(jīng)元的釋放有著重要作用。已有報(bào)道指出在神經(jīng)退化性疾病和其它形式的癡呆癥中，例如AD患者的腦和外周組織中VB1依賴的酶活性都降低(Higdon，2003)，其中包括線粒體中的丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶(Butterworth和Besnard，1990；Gibson等人，1988；Rao等人，1993)，這引起線粒體的凋亡，導(dǎo)致線粒體中蛋白質(zhì)的氧化，再進(jìn)一步影響焦磷酸硫胺素的Km值，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致腦部功能的失調(diào)，并且這種功能缺陷能夠被高劑量的VB1逆轉(zhuǎn)(Harman，1988；Heroux et al.，1996)。因此，正常的和病理性的衰老所特有的腦機(jī)能失調(diào)，可能會(huì)被高劑量的VB1所緩解。由此看出，服用VB1有可能是防治PD的有效候選藥物。
3.核黃素(VB2)核黃素(VB2)是線粒體復(fù)合物I和II的輔酶FMN和FAD的前體。因?yàn)閂B2衍生物FAD是谷胱甘肽還原酶(催化產(chǎn)生還原型谷胱甘肽)，黃嘌呤氧化酶(催化產(chǎn)生尿酸)以及次甲基四氫葉酸還原酶(可催化高胱氨酸生成甲硫氨酸)的輔酶，所以VB2缺乏有可能通過(guò)影響電子傳遞鏈，抗氧化酶以及高胱氨酸的代謝從而對(duì)腦機(jī)能產(chǎn)生間接影響。同時(shí)高胱氨酸水平升高(Duan et al.，2002；Kruman et al.，2002；Seshadriet al.，2002)以及還原型谷胱甘肽(Shukitt-Hale et al.，1998)和尿酸(Ames et al.，1981)的水平降低均與衰老和認(rèn)知機(jī)能障礙相關(guān)。以FMN和FAD為輔助因子的線粒體復(fù)合物I在PD病人中存在缺陷。最近生理學(xué)實(shí)驗(yàn)和病理學(xué)實(shí)驗(yàn)將主要起作用的產(chǎn)氧位點(diǎn)限制在線粒體復(fù)合物I的FMN基團(tuán)上，而不像以前的觀點(diǎn)普遍認(rèn)為產(chǎn)氧位點(diǎn)在線粒體復(fù)合物III的泛醌上，這個(gè)發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明了改善PD線粒體復(fù)合物I缺陷的重要性(Liu，Y.，F(xiàn)iskum，G.，and Schubert，D.2002d)。已有臨床研究表明服用高劑量VB2(口服，每8小時(shí)30mg)同時(shí)除去食物中的紅肉，可提高一些PD病人的運(yùn)動(dòng)能力(Coimbra andJunqueira，2003)，這提示可以通過(guò)此療法改善PD患者的VB2敏感機(jī)制，如谷胱甘肽消耗，累積性線粒體DNA突變，無(wú)序線粒體蛋白復(fù)合物及鐵代謝異常等等。VB2可能刺激線粒體酶使之活性上升，并能改變FMN/FAD的Km值。但是VB2又是線粒體外膜上的單胺氧化酶(MAO)的重要輔酶，它的增加有可能會(huì)使多巴胺系統(tǒng)內(nèi)的多巴胺分解增多，不利于PD的癥狀的改善。因此VB2的應(yīng)用必須與其他線粒體營(yíng)養(yǎng)素精心搭配，防止副作用的產(chǎn)生。
4.煙酸(VB3)尼克酸和尼克酰胺統(tǒng)稱煙酸，是NAD和NADP的前體。在線粒體和細(xì)胞質(zhì)中，高劑量的尼克酸能提高NAD/NADP的水平(Ames等人，2002)，增加線粒體復(fù)合物I對(duì)底物的親和機(jī)會(huì)，進(jìn)一步提高酶活性。NADH和NADPH不但是線粒體復(fù)合物I的底物和輔酶，同時(shí)也是一種內(nèi)源性抗氧化劑。VB3在MPTP處理的小鼠和聚ADP-核糖多聚酶敲除小鼠中應(yīng)用可以抵御神經(jīng)毒性，并能減少神經(jīng)性損傷及局灶性腦缺血、丙二酸和MPTP引起的ATP消耗(Beal，2003)。NADH還可以刺激內(nèi)源性多巴胺合成，減輕PD患者的肌肉運(yùn)動(dòng)損傷和識(shí)別功能失調(diào)(Birkmayer and Birkmayer，1989；Kuhn andMuller，1997)。也有報(bào)道證明VB3與VB2共用時(shí)對(duì)線粒體復(fù)合物I缺陷疾病有一定療效，如線粒體腦病、乳酸中毒癥及腦休克。而PD患者的VB3攝取量明顯降低(Hellenbrand et al.，1996)，需要適當(dāng)補(bǔ)充。
5.生物素(VB7)以VB7作為輔助因子的線粒體酶包括丙酮酸羧化酶，乙酰輔酶A羧化酶，丙酰輔酶A羧化酶，以及羧化全酶合成酶等，參與體內(nèi)的糖代謝、脂肪酸合成和多種氨基酸的代謝過(guò)程。VB7缺乏在人群中(特別是在孕婦中)是相當(dāng)普遍的，(Mocket al.，2002.a；Mock et al.，2002b)，并直接導(dǎo)致線粒體的老化和氧化劑的產(chǎn)生(Atamna，Erlitski，& Ames，2005)。VB7對(duì)于上述四種酶分子上依賴生物素的羧基是彌補(bǔ)性基團(tuán)(Mock，1989)，其中前三種是線粒體專一酶，都催化三羧酸循環(huán)中的代謝物反饋反應(yīng)，同時(shí)提供亞鐵血紅素的前體——琥珀酰輔酶A。缺乏VB7將降低這些酶的活性，并且VB7缺乏時(shí)線粒體中積累的β-甲基巴豆酰-CoA與氨基乙酸起反應(yīng)(Mock，1989)，導(dǎo)致線粒體基質(zhì)中的氨基酸耗盡。因此，缺乏VB7將導(dǎo)致線粒體琥珀酰輔酶A和氨基乙酸的缺乏，進(jìn)一步引起亞鐵血紅素的缺乏。
6.肌酸(creatine)肌酸(creatine)是由精氨酸(arginine)、甘氨酸(glycine)及甲硫氨酸(methionine)三種氨基酸所合成的物質(zhì)。肌酸可以在肝、腎、胰等器官內(nèi)自行合成；也可攝取自飲食。在細(xì)胞質(zhì)和線粒體之間肌酸/磷酸肌酸轉(zhuǎn)化系統(tǒng)能夠利用一種獨(dú)特的線粒體肌酸激酶(CK)的重組異構(gòu)體并作為一種空間能量緩沖器起作用細(xì)胞內(nèi)的肌酸、磷酸可與磷酸肌酸(phosphocreatine)根據(jù)細(xì)胞的代謝水平和ATP濃度互相轉(zhuǎn)換。肌酸能提高肌酸/磷酸肌酸的轉(zhuǎn)化并抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔的開(kāi)啟(Beal，2003)。ATP是機(jī)體無(wú)氧代謝的供能物質(zhì)，但其分子量大且在體內(nèi)外穩(wěn)定性差，而肌酸分子量小化學(xué)穩(wěn)定性好，在體內(nèi)有廣泛的儲(chǔ)備意義。一個(gè)以45名年輕的素食主義者為對(duì)象所進(jìn)行的雙盲實(shí)驗(yàn)中，安慰劑對(duì)照的交叉試驗(yàn)顯示口服肌酸添加劑六周(5g/天)對(duì)于腦力工作和需要高效率的工作同樣都具有顯著作用(Rae等人，2003)。同樣，肌酸也已經(jīng)用于包括PD和亨廷頓病在內(nèi)的多種神經(jīng)性疾病的治療。
在本發(fā)明中，可有效用于預(yù)防、改善和治療帕金森氏癥的線粒體營(yíng)養(yǎng)素組合物包括但不限于①VitB12+VitB5、VitB6、VitB11中的一種或多種；②R-硫辛酸+乙酰肉堿；③R-硫辛酸+乙酰肉堿+VitB5+VitB6+VitB11+VitB12。對(duì)于患有帕金森氏癥的哺乳動(dòng)物，施用上述線粒體營(yíng)養(yǎng)素制備成的組合物，能夠獲得顯著增進(jìn)的效果。所述的組合物為藥物組合物；或?yàn)槭澄锝M合物。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，采用選自以下的組分來(lái)配制所述的組合物VitB12、VitB5、VitB6、VitB11，所述的組分可以兩種、三種或四種任意組合，一種更優(yōu)選的組合方式是VitB12+VitB5+VitB6+VitB11。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選例中，采用R-硫辛酸+乙酰肉堿聯(lián)合應(yīng)用的形式，比單獨(dú)應(yīng)用在效果上大大提高，且在劑量上大大降低。
此外，在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選例中，當(dāng)采用①VitB12+VitB5+VitB6+VitB11的組合時(shí)，將R-硫辛酸+乙酰肉堿加入到①中，可達(dá)到更優(yōu)的效果。
因此，本發(fā)明的用于預(yù)防、改善或治療帕金森氏癥的組合物中，含有維生素B12和維生素B5、B6或B11中任選的一種或多種。當(dāng)組合物中含有組分維生素B12時(shí)，還含有組分維生素B5、維生素B6或維生素B11中的一種或多種，比如，所述組合物包括但不限于維生素B12+維生素B5的組合物、維生素B12+維生素維生素B6的組合物、維生素B12+維生素B11的組合物、維生素B12+維生素B5+維生素B6的組合物、維生素B12+維生素B5+維生素B11的組合物、維生素B12+維生素B6+維生素B11的組合物、或維生素B12+維生素B5+維生素B6+維生素B11的組合物。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的組合物含有(i)5-150重量份維生素B5，較佳地15-50重量份，更佳地25-35重量；(ii)2-1000重量份維生素B6，較佳地50-300重量份，更佳地80-150重量份；(iii)0.4-40重量份維生素B11，較佳地1-10重量份，更佳地2.5-5.5重量份；(iv)0.003-1重量份維生素B12，較佳地0.01-0.2重量份，更佳地0.07-0.15重量份；且組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的10-100％；較佳地，組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的20-90％；更優(yōu)選地，組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的40-90％。
本發(fā)明的用于預(yù)防、改善或治療帕金森氏癥的組合物中，含有R-硫辛酸和乙酰肉堿。
在一個(gè)優(yōu)選例中，所述的組合物含有(1)100-350重量份R-硫辛酸，較佳地150-250重量份，更佳地180-220重量份；
(2)100-2000重量份乙酰肉堿，較佳地180-500重量份，更佳地180-300重量份；且組份(1)+(2)占組合物總重量的10-100％；較佳地，組份(1)+(2)占組合物總重量的20-90％；更佳地，組份(1)+(2)占組合物總重量的40-90％。
在本發(fā)明的一種優(yōu)選方式中，組分(1)與(2)以適當(dāng)?shù)谋壤嬖冢?1)與(2)的重量比為1∶10-10∶1；更優(yōu)選的，組分(1)與(2)的重量比為1∶5-5∶1；最優(yōu)選的，組分(1)與(2)的重量比為1∶1-3∶1。
作為本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的組合物，其含有組分如下(a)5-150重量份維生素B5，較佳地15-50重量份，更佳地25-35重量；(b)2-1000重量份維生素B6，較佳地50-300重量份，更佳地80-150重量份；(c)0.4-40重量份維生素B11，較佳地1-10重量份，更佳地2.5-5.5重量份；(d)0.003-1重量份維生素B12，較佳地0.01-0.2重量份，更佳地0.07-0.15重量份；(e)100-350重量份R-硫辛酸，較佳地150-250重量份，更佳地180-220重量份；和(f)100-2000重量份乙酰肉堿，較佳地180-500重量份，更佳地180-300重量份；且組份(a)+(b)+(c)+(d)+(e)+(f)占組合物總重量的15-100％；較佳地，組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的30-90％；更優(yōu)選地，組份(i)+(ii)+(iii)+(iv)占組合物總重量的50-90％。
本發(fā)明的組合物中還可以含有一種或多種代表性的其他線粒體營(yíng)養(yǎng)素8-1200mg重量份輔酶Q10、4-200mg重量份硫胺、2-240mg重量份核黃素、20-800mg重量份煙酸、1-20mg重量份生物素和0.5-12mg重量份肌酸。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(i)VB5 15mg(ii)VB6 50mg(iii)VB11 2mg(iv)VB12 0.05mg。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(1)R-硫辛酸 100mg，(2)乙酰肉堿 100mg。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物含有(a)R-硫辛酸 100mg，(b)乙酰肉堿 100mg(c)VB5 15mg(d)VB6 50mg(e)VB11 2mg(f)VB12 0.05mg。
作為本發(fā)明的一種特別優(yōu)選的組合物，所述的組合物中還含有藥學(xué)上或食品學(xué)上可接受的載體或賦形劑50-1000重量份。
本發(fā)明的藥物組合物或飲食補(bǔ)充劑，可以通過(guò)常規(guī)方法制成任何常規(guī)的制劑形式，優(yōu)選緩釋劑型，可以使必要成分緩慢而穩(wěn)定、持續(xù)地釋放。
所述的緩釋劑型可以通過(guò)常規(guī)的方法制得，一種優(yōu)選的方法是用賦形劑作為包覆材料，將必要成分包覆于其中，形成包衣緩/控釋制劑，或?qū)⒈匾煞州d入緩釋骨架中，形成骨架型緩/控釋制劑。另一優(yōu)選方法是將必要成分制成各自的鹽，利用不同鹽的溶解度差異使各必要成分逐步釋放，產(chǎn)生長(zhǎng)效。
本發(fā)明提供的組合物可以根據(jù)所需制備的劑型以及給藥途徑來(lái)決定，本領(lǐng)域技術(shù)人員在參考了本發(fā)明所提供的組合物以及配比后，采用常規(guī)的藥物組合物或食物組合物的制備方法即可制備出本發(fā)明的組合物。一種優(yōu)選的方法是先將脂溶性的必要成分先用助溶劑助溶后再加入水溶解制成溶液，而水溶性必要成分直接用水溶解制成溶液，然后將脂溶性必要成分的溶液和水溶性必要成分的溶液混合，從而制得本發(fā)明提供的組合物。
本發(fā)明提供的組合物用于預(yù)防和改善帕金森氏癥的用法用量為每日100-350mgLA和100-2000mgALCAR；或每日4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12；或每日100-350mgLA、100-2000mgALCAR、4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12。
本發(fā)明提供的用于預(yù)防和改善帕金森氏癥的組合物中還可包括但并不限于下述一種或多種代表性的其他線粒體營(yíng)養(yǎng)素輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素和肌酸，其用法用量為口服輔酶Q108-1200mg/天、口服硫胺4-200mg/天、口服核黃素2-240mg/天、口服煙酸20-800mg/天、口服生物素1-20mg/天、口服肌酸0.5-12mg/天。
一種優(yōu)選的方法是在服用時(shí)補(bǔ)充能量，如同時(shí)服用碳水化合物、果汁飲料，從而提供輔助的用于預(yù)防和改善帕金森氏癥的能量，促進(jìn)線粒體ATP的合成。所需補(bǔ)充的能量大概在50-150卡路里。
當(dāng)用于制備藥物組合物或食物組合物時(shí)，所用的線粒體營(yíng)養(yǎng)素組合物的有效劑量可隨施用的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度而變化。
對(duì)于本發(fā)明所述的組合物的劑型沒(méi)有特別的限制，可以是任何適用于哺乳動(dòng)物服用的劑型；優(yōu)選的，所述的劑型可選自顆粒劑、膠囊、片劑、粉末劑、口服液、混懸液、或乳劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方式中，所述的組合物作為一種膳食添加劑，添加到水、非-橙汁飲品等飲料、固體食品、烹飪菜肴中，比如可添加到葡萄汁或蘋(píng)果汁中。優(yōu)選添加到可以提供至少50-150卡路里熱量的膳食中。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方式中，所述的食品上學(xué)可接受的載體或賦形劑選自填充劑、崩解劑、潤(rùn)滑劑、助流劑、泡騰劑、矯味劑、包覆材料、膳食制品、或緩/控釋劑。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選方式中，所述的組合物為單元?jiǎng)┬?，每劑含?00-350mgLA和100-2000mgALCAR；或含有4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12；或含有100-350mgLA、100-2000mgALCAR、4-150mgVitB5、2-1000mgVitB6、0.4-40mgVitB11和0.003-1mgVitB12。每劑中還可以含有一種或多種代表性的其他線粒體營(yíng)養(yǎng)素8-1200mg輔酶Q10、4-200mg硫胺、2-240mg核黃素、20-800mg煙酸、1-20mg生物素和0.5-12mg肌酸。
當(dāng)將組合物制備成單元?jiǎng)┬蜁r(shí)，每天服用所述單元?jiǎng)┬偷慕M合物1-3劑；更優(yōu)選的，每天服用所述單元?jiǎng)┬偷慕M合物1-2劑。
本發(fā)明提供的組合物可通過(guò)口服等途徑給予。固態(tài)載體包括淀粉、乳糖、磷酸二鈣、微晶纖維素、蔗糖和白陶土，而液態(tài)載體包括培養(yǎng)基、聚乙二醇、非離子型表面活性劑和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)。在制備藥物組合物中通常使用的佐劑也可有利地被包括，例如調(diào)味劑、色素、防腐劑和抗氧化劑如維生素C、BHT和BHA。
從易于制備和給藥的立場(chǎng)看，優(yōu)選的藥物組合物是固態(tài)組合物，尤其是片劑和固體填充或液體填充的膠囊?？诜o藥是優(yōu)選的。
更優(yōu)選的劑型是那些可以保證營(yíng)養(yǎng)素緩慢而穩(wěn)定地24小時(shí)補(bǔ)充給線粒體，一種方式是用合適的載體承載將線粒體營(yíng)養(yǎng)素組合物，使得線粒體營(yíng)養(yǎng)素組合物緩慢釋放。比如以賦形劑(如羥丙甲基纖維素)作為包覆材料，將線粒體營(yíng)養(yǎng)素包在其中，形成球狀顆粒(包衣緩/控釋制劑)；或?qū)⒕€粒體營(yíng)養(yǎng)素載入骨架緩釋片(如羥乙基纖維素)中(骨架型緩/控釋制劑)。
應(yīng)理解，本發(fā)明的線粒體營(yíng)養(yǎng)素組合物中還可含有其它人體所必需的或?qū)θ梭w有益但不影響或不產(chǎn)生直接的藥效的成分。此外，根據(jù)醫(yī)師的指導(dǎo)，本發(fā)明的組合物也可與其它常規(guī)的治療或預(yù)防帕金森氏癥的藥物共同施用。
本發(fā)明的組合物可用于制備預(yù)防、改善或治療細(xì)胞線粒體代謝紊亂的藥物；或者，本發(fā)明所述的組合物可用于制備預(yù)防、改善或治療帕金森氏癥的藥物。
本發(fā)明人利用轉(zhuǎn)入突觸素I基因的果蠅帕金森氏癥模型(由突觸素I轉(zhuǎn)基因型果蠅與uas-DDC果蠅雜交所得)，帕金森果蠅模型表達(dá)突觸素I，并在成年后發(fā)生多巴胺神經(jīng)元的丟失，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)細(xì)絲狀含有突觸素I的內(nèi)含物，運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)障礙。由于這種果蠅模型具備人體帕金森癥的基本特征，因此可以利用這一遺傳學(xué)方法來(lái)進(jìn)行帕金森氏癥的研究。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，將VB5、VB6、VB11和VB12聯(lián)合作用于PD果蠅模型上，PD果蠅的運(yùn)動(dòng)能力和壽命有明顯的改善。
單獨(dú)作用時(shí)50X劑量組的LA對(duì)PD果蠅的運(yùn)動(dòng)能力和壽命均有效，而ALCAR只延長(zhǎng)了PD果蠅的壽命，對(duì)運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有影響。二者聯(lián)合作用時(shí)，10X劑量組對(duì)PD果蠅運(yùn)動(dòng)能力的作用強(qiáng)于10X劑量LA的單獨(dú)作用。
VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR彼此間的聯(lián)合作用強(qiáng)于單藥的作用，并且聯(lián)合作用條件下療效更穩(wěn)定和安全。在MPP處理細(xì)胞引起的線粒體損傷的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12預(yù)處理后的細(xì)胞存活率，比LA+ALCAR預(yù)處理或VB5+VB6+VB11+VB12預(yù)處理的細(xì)胞存活率高。
本發(fā)明人利用SK-NM-C的慢性魚(yú)藤酮模型(5nM，4周)作為一個(gè)體外PD模型再現(xiàn)了魚(yú)藤酮對(duì)線粒體功能的毒性影響，對(duì)PD病理特征、線粒體功能和氧化與抗氧化損傷生物標(biāo)記等幾個(gè)方面進(jìn)行考察，用LA(0.1，1，10，100uM)，ALCAR(0.1，1，10，100uM)和他們不同組分的組合進(jìn)行4周預(yù)處理。PD的分子病理表現(xiàn)是線粒體功能缺陷。在這個(gè)細(xì)胞模型里，魚(yú)藤酮處理后的線粒體內(nèi)膜上的復(fù)合體1活性降低、ATP損耗量增加以及細(xì)胞色素酶C的釋放增加。合適劑量的LA和ALCAR兩種線粒體營(yíng)養(yǎng)素對(duì)用魚(yú)藤酮處理后的線粒體有治療作用。最有效的劑量是10uM的LA和100uM的ALCAR，并且當(dāng)兩者混合使用后，有效劑量出現(xiàn)在0.1和1uM，這種最佳配比比任何一種單用有效得多。LA和ALCAR這樣的線粒體營(yíng)養(yǎng)素可以有效的抑制魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生及氧化損傷。
本發(fā)明證明線粒體營(yíng)養(yǎng)素VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR及其不同組合在PD果蠅模型上會(huì)有不同的療效，并且VB5、VB6、VB11和VB12聯(lián)合應(yīng)用，或LA和ALCAR聯(lián)合應(yīng)用的效果強(qiáng)于藥物的單獨(dú)作用。LA和ALCAR對(duì)抑制PD細(xì)胞模型線粒體的功能紊亂、氧化損傷和阻止突觸素I及泛素的積累有一定的作用。并且，LA和ALCAR兩種藥在低濃度時(shí)(0.1-1uM)的混合物表現(xiàn)出一種正協(xié)同效應(yīng)，這比單獨(dú)用10倍濃度的任何一種藥來(lái)對(duì)魚(yú)藤酮處理引發(fā)的線粒體功能紊亂和氧化損傷都有效。另外，LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于LA+ALCAR或VB5+VB6+VB11+VB12的組合。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1、通過(guò)將必要成分有機(jī)地組合在一起，多靶點(diǎn)、多方位地發(fā)揮協(xié)同作用；2、成分天然，無(wú)毒副作用，適于長(zhǎng)期服用；3、成本低廉，實(shí)用有效；4、功效明顯。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說(shuō)明，否則所有的百分比和份數(shù)按重量計(jì)。
實(shí)施例1-3制備組合物No.1-3

將LA和ALCAR按上述配方混合，制得組合物No.1-3。
實(shí)施例4-6制備組合物No.4-6

將VitB5、VitB6、VitB11和VitB12按上述配方混合，制得組合物No.4-6。
實(shí)施例7-9制備組合物No.7-9

將LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12按上述配方混合，制得組合物No.7-9。
實(shí)施例10LA和ALCAR的協(xié)同作用(細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn))材料ALCAR(購(gòu)自德國(guó)Sigma-Tau公司)和LA(R-a-lipoic acid tris鹽，購(gòu)自德國(guó)Viatris公司)；ADP和魚(yú)藤酮(購(gòu)自sigma公司)；DCF-DA，JC-1，Hoechst 33258和TRITC偶聯(lián)鼠源IgG抗體(購(gòu)自Molecular Probes公司)；蛋白氧化損傷檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自Chemicon International Inc.Temecula公司)；抗8羥基鳥(niǎo)苷抗體(購(gòu)自TrevigenGaithersburg MD公司)；BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自PIERCE公司)；抗a-synuclein單克隆抗體(購(gòu)自Calbiochem公司)；抗泛素修飾抗體(購(gòu)自DAKO公司)；IQTM SYBER綠(購(gòu)自Bio-Rad公司)；FITC和TRITC偶聯(lián)羊抗兔抗體(購(gòu)自Sino-American Biotech公司)；免疫印跡分析試劑(購(gòu)自Santa Cruz生物技術(shù)公司)；小牛血清(購(gòu)自Hyclone公司)；雙抗(購(gòu)自Invitrogen公司)；GSH分析試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)。
細(xì)胞培養(yǎng)和處理SK-N-MC神經(jīng)成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)在Earle’s緩沖液的MEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入15％小牛血清，5mM葡萄糖，2mM谷氨酸，1mM丙酮酸鈉，非必需氨基酸，50U/ml的青霉素和鏈霉素。培養(yǎng)基中加入LA和ALCAR以及這兩種藥物的組合培養(yǎng)四周。LA和ALCAR的濃度分別是0.1，1.0，10，100uM以及不同濃度的組合0.1uM LA+ALCAR0.1uM，1uM+1uM，10uM+10uM，0.1uM+1uM，0.1uM+10uM.用MEM洗滌3次以后換5nM或者沒(méi)有5nM魚(yú)藤酮的培養(yǎng)基培養(yǎng)4周(Sherer et al.，2002)。LA和ALCAR儲(chǔ)備液溶解在無(wú)菌的PBS緩沖液中。魚(yú)藤酮溶解在乙醇中。對(duì)照細(xì)胞加入乙醇和PBS。常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)在24孔板中，每周換培養(yǎng)基三次，每周等細(xì)胞長(zhǎng)滿之后傳代培養(yǎng)。
線粒體膜電位分析(MMP)用JC-1測(cè)定線粒體膜電位(Tirosh et al，2000)，JC-1是一種雙發(fā)射光，電勢(shì)敏感的分子探針，當(dāng)線粒體電位很低的時(shí)候或者低濃度單體存在的時(shí)候發(fā)射綠光(529nm)，高濃度則自己聚合發(fā)射紅光(590nm)。兩種成分對(duì)電勢(shì)都非常敏感，并且紅光和綠光的比例能夠提供線粒體電勢(shì)的分析。5×104細(xì)胞培養(yǎng)在特意的96孔板中(blk/clrbtm，Costar)檢測(cè)熒光。細(xì)胞用10uM/ml的JC-1，37攝氏度孵育15分鐘。孵育之后用PBS洗滌兩次，用雙波長(zhǎng)/雙光酶標(biāo)儀檢測(cè)(Flex Station_384，購(gòu)自Molecular Devices，USA)線粒體復(fù)合物I活性分析SK-N-MC細(xì)胞用差速離心的方法分離線粒體(Humphries and Szweda，1998).3×107細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌兩次，用提取緩沖液重懸細(xì)胞(0.25M蔗糖，5mM Tris-HCl緩沖液，pH7.5，和1mM EDTA pH8.0)和用玻璃研磨器研磨，沒(méi)有破的細(xì)胞用600g離心15分鐘，懸液10000g離心25分鐘，線粒體沉淀用提取介質(zhì)洗滌一次，線粒體復(fù)合物I的活性動(dòng)力學(xué)，通過(guò)測(cè)定DCPIP在600nm的吸收光值減少測(cè)定(Smith 1967)。
ATP水平檢測(cè)ATP水平的測(cè)量使用了可浸透洋地黃皂苷的細(xì)胞和可定量蛋白質(zhì)濃度的生物發(fā)光試劑盒。
細(xì)胞在96孔板中長(zhǎng)滿后。吸走緩沖液，在每個(gè)空中加入0.25M蔗糖100ul，20mMMOPS，0.05mg/ml洋地黃皂苷，調(diào)PH到7.4，置于室溫3分鐘。再換成含0.25M蔗糖的洋地黃皂苷緩沖液，20mM MOPS，20mM EDTA，調(diào)PH到7.4放置5分鐘，干燥并用含0.25M蔗糖的緩沖液100ul，20mM MOPS，20mM EDTA，5mM無(wú)機(jī)磷酸鹽，1mM ADP的緩沖液，調(diào)PH值到7.4按如下安排加入一些只加緩沖液；一些加入5mM丙酮酸和1mM L-蘋(píng)果酸；一些加入5mM谷氨酸和1mM L-蘋(píng)果；一些加入1.0uM魚(yú)藤酮和10mM琥珀酸；最后加入2mM抗霉素A，2mM抗壞血酸和0.1mM TMPD。37攝氏度孵育1小時(shí)，再加入1.6M高氯酸20ul和15ul6N碳酸鉀3000g離心10分鐘來(lái)沉淀細(xì)胞碎片。用生物熒光分析系統(tǒng)分析ATP水平，用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)蛋白質(zhì)濃度。
細(xì)胞色素C釋放檢測(cè)細(xì)胞是在MEM培養(yǎng)基中在蓋玻片上長(zhǎng)滿。移去緩沖液加入預(yù)熱37攝氏度的包MTGFM(1∶100，1uM)。37攝氏度孵育1小時(shí)后，用新鮮的預(yù)熱過(guò)的生長(zhǎng)緩沖液洗滌細(xì)胞。小心的移去清洗緩沖液，加入預(yù)先準(zhǔn)備好的含3.7％甲醛的生長(zhǎng)緩沖液，然后37攝氏度孵育15分鐘。固定后用PBS沖洗滌幾次細(xì)胞。固定了的細(xì)胞再用100％的甲醇在零下20攝氏度滲透5分鐘。滲透后用PBS洗3次每次10分鐘。用5％的BSA室溫處理1小時(shí)，然后用細(xì)胞色素C抗體(鼠1∶1000)稀釋至1％BSA室溫孵育1小時(shí)。用PBS沖洗細(xì)胞3次每次5分鐘，用FITC偶聯(lián)鼠抗體(1∶500)稀釋的BBS室溫孵育1小時(shí)。用PBS洗3次每次10分鐘，用2ug/ml DAPI孵育1小時(shí)。沖洗細(xì)胞并用共聚焦顯微鏡分析。
GSH水平檢測(cè)細(xì)胞在100mm板上生長(zhǎng)，用0.4ml 0.9％的NACL溶液使細(xì)胞(1×107)破碎，細(xì)胞小球顆粒均勻分布。4攝氏度3000g；離心10分鐘，收集上清。基于DTNB用GSH分析試劑盒分析GSH，并用分光光度計(jì)在412nm下測(cè)量。GSH是細(xì)胞蛋白質(zhì)的指標(biāo)和表達(dá)，作為參照細(xì)胞的GSH水平百分比。
蛋白質(zhì)羰基化檢測(cè)對(duì)于蛋白質(zhì)羰基化測(cè)定，細(xì)胞在100mm板上生長(zhǎng)。按以上所描述的用Western-Blotting方法收集可溶和不可溶的蛋白質(zhì)片斷。蛋白質(zhì)羰基化用蛋白氧化損傷檢測(cè)試劑盒測(cè)定。
簡(jiǎn)要步驟5ul(3ug/ul)的蛋白質(zhì)與等量的12％的SDS及兩倍量的1xDNPH混合溶解。參照反應(yīng)用1x引物替代DNPH參照溶液。室溫反應(yīng)進(jìn)行15分鐘后加入1.5倍的中和溶液停止。15ug蛋白質(zhì)12％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜，加1％BSA/PBS-T(PBS包含0.05％兩者混合20)室溫?fù)u動(dòng)1小時(shí)。膜在1∶150的兔抗二硝基苯基化腙抗體中4攝氏度過(guò)夜。PBS-T洗3遍后膜在辣根過(guò)氧化酶羊抗兔偶聯(lián)抗體中室溫孵育1小時(shí)。放射自顯影曝光膠片。
DNA氧化損傷用生產(chǎn)商提供的方案(1∶300)配出的8羥基鳥(niǎo)苷抗體測(cè)DNA氧化損傷，細(xì)胞生長(zhǎng)在12mm蓋玻片上，用70％乙醇在零下20攝氏度條件下混合10分鐘。TRITC-偶聯(lián)抗鼠抗體被用作二抗。用激光共聚焦顯微鏡成像。紅色熒光使每個(gè)細(xì)胞量化。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)描述平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。檢測(cè)最少200個(gè)細(xì)胞。
DNA氧化損傷也用彗星電泳分析。這一常規(guī)的方法已經(jīng)被前人驗(yàn)證過(guò)(Olive etal，1990，2005；Tice et al，2000)。用0.25％的胰島素和稀釋的培養(yǎng)液處理使細(xì)胞散開(kāi)。10ul的細(xì)胞(1×104)和90ul的0.6％的低熔點(diǎn)瓊脂糖在37攝氏度混合，迅速在顯微鏡載玻片上涂一層1％的正常溶點(diǎn)的瓊脂糖。把載玻片浸入100ml混合溶液(2.5MNaCl，100mM EDTA，10mM Tris，pH10)，加10mlTriton X-100和10ml的DMSO。然后置入電泳緩沖液中(300Mm NaOH，1Mm EDTA，PH大于13)4攝氏度20分鐘，使DNA在電泳前松散。電泳在4攝氏度0.73V/cm，28mA條件下跑20分鐘。載玻片浸入0.4M Tris，pH7.5，用2ug/ml DAPI褪色后蓋上蓋玻片。細(xì)胞用Olympus BX61a 60油鏡(光圈值＝1.25)連接Olympus DP70顯微鏡觀察。用DAPI使核褪色用UV激光(380nm)激發(fā)。用Image-ProPlus軟件分析圖像。從每個(gè)模型中隨機(jī)選出50個(gè)，并測(cè)量彗尾作為這個(gè)模型DNA氧化損傷的指標(biāo)。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)描述平均值+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差。
活性氧檢測(cè)細(xì)胞在24孔板中長(zhǎng)滿。吸走培養(yǎng)液，在每個(gè)孔中加入500ul 0.25M蔗糖，20mMMOPS，0.05mg/ml洋地黃皂苷，調(diào)pH至7.4，室溫放置3分鐘。再用含0.25M蔗糖，20mMMOPS，20mM EDTA的洋地黃皂苷緩沖液，調(diào)pH至7.4，室溫放置5分鐘，后干燥。再加入含0.25M蔗糖，20mM MOPS，20mM EDTA，5mM無(wú)機(jī)磷酸鹽，1mM ADP，5mM谷氨酸，1mM L-蘋(píng)果酸的呼吸緩沖液，調(diào)pH至7.4并加入10uM羧基H2DCFDA在37攝氏度的條件下測(cè)量線粒體的ROS 30分鐘。替換緩沖液，用PBS洗，將細(xì)胞移到Eppendorf管，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)分析。
突觸素I和泛素水平檢測(cè)熒光免疫標(biāo)記法和Western blotting檢測(cè)突觸素I和泛素的分布狀態(tài)與水平。用熒光免疫標(biāo)記法檢測(cè)，細(xì)胞生長(zhǎng)在12mm的蓋玻片上，突觸素I和泛素已經(jīng)有人做過(guò)(Arima et al 1999，Zhang et al，2004)經(jīng)過(guò)一些修改簡(jiǎn)要步驟如下細(xì)胞在零下20攝氏度與甲醇混合10分鐘，用PBS洗后用5％的BSA在室溫處理1小時(shí)。洗三次后混合后的細(xì)胞溶液中加入突觸素I鼠抗體(1∶200)和泛素(1∶500)兔抗體，室溫孵育半小時(shí)，接下來(lái)用PBS洗3次。之后加入FITC偶聯(lián)羊抗鼠抗體(1∶100)和TRITC偶聯(lián)羊抗兔抗體(1∶100)在37攝氏度條件下孵育半小時(shí)后再洗三次。之后加入5ug/mlHoechst33342室溫孵育10分鐘，用PBS洗3次后，將細(xì)胞置于甘油/PBS(9∶1)混合物中，然后使用LSM510META_德國(guó)_Zeiss激光共聚焦顯微用63x/1.4HCxPlanAPO的油鏡觀察。突觸素I用氬激光(488nm)激發(fā)，泛素用氦激光(543nm)激發(fā)，DNA用UV激光(364nm)激發(fā)。
用Western blotting檢測(cè)，細(xì)胞被收集，蛋白質(zhì)被萃取，在前人做Westernblotting檢測(cè)的經(jīng)驗(yàn)基礎(chǔ)上修改，簡(jiǎn)要步驟如下細(xì)胞被溶解緩沖液(50mMTris-HCl，250mM NaCl，5mM EDTA，50mM NaF，1％NP40，2ug/ml aprotinin，2ug/mlleupeptin，1mM phenylmethylsulfonyl fluoride，700U/ml DNase I，1％beta-mercaptoethanol以上試劑均購(gòu)自Sigma公司)。用BCA蛋白定量試劑盒定量可溶蛋白質(zhì)，考馬斯亮藍(lán)調(diào)平檢測(cè)不溶蛋白質(zhì)。等量蛋白質(zhì)加15％SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜到硝化纖維素膜，用5％BSA加入TBS-T(20mM Tris，500mM NaCl，0.1％兩者混合20)室溫?fù)u動(dòng)固定2小時(shí)。膜浸時(shí)在突觸素I鼠抗體(1∶2000)或泛素(1∶500)兔抗體中，在4攝氏度孵育過(guò)夜。之后用TBS-T洗滌六次，每次5分鐘。加入與二抗(突觸素I1∶4000羊抗鼠抗體，泛素1∶1000羊抗兔抗體)相偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化酶，室溫1-2小時(shí)。熒光放射自顯影使膠片感光。
反轉(zhuǎn)錄引物設(shè)定及反轉(zhuǎn)錄PCR的定量cDNA鏈?zhǔn)怯?ug總RNA和少量dNTP用反轉(zhuǎn)錄酶XL(購(gòu)自Takara，Shiga，Japan公司)合成的。引物參考Sherer et al.，2002β-actin的正引物，序列為tcaccatggatgatgatatcgcc；β-actin的反引物序列為ccacacgcagctcattgtagaagg；突觸素I正引物為aggactttcaaaggccaagg；突觸素I反引物為tcctccaacatttgtcacttgc。這兩對(duì)引物都可以使瘤狀突起的邊界交叉。用RT-PCR儀的多次循環(huán)來(lái)擴(kuò)增以達(dá)到定量的目的(Bio-Rad，Hercules，CA)。這兩種PCR產(chǎn)物的量通過(guò)IQTM SYBER的熒光接收器在每一個(gè)循環(huán)最后退火這一步進(jìn)行跟蹤定量。反應(yīng)在含有200nmol正反因物的25ul體系中完成。每個(gè)模板基因的表達(dá)水平用2-CT方法來(lái)計(jì)算。在的靶序列擴(kuò)增到一定的大小的時(shí)候再開(kāi)始采集數(shù)據(jù)。2-CT描述在處理后的細(xì)胞里基因表達(dá)的曲線變化。以actin的表達(dá)量以及沒(méi)有處理的細(xì)胞(control)來(lái)做一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)_CT＝_CT，Rotenone-_CT，Control＝(CT，synuclein-CT，actin)Rotenone-(CT，synuclein-CT，actin)Control.mRNA水平的結(jié)果用處理后的細(xì)胞與Control細(xì)胞的比來(lái)表示。
結(jié)果MMP的效果如圖1A(在激光共聚焦顯微鏡下JC-1的分布狀態(tài))和圖1B(熒光讀數(shù)分析JC-1的數(shù)量)，對(duì)比參照系，魚(yú)藤酮處理導(dǎo)致線粒體膜的激發(fā)熒光由紅變綠，紅光強(qiáng)度/綠光強(qiáng)度的比值降低，說(shuō)明魚(yú)藤酮誘導(dǎo)線粒體去極化。而LA，ALCAR及其組合的預(yù)處理能夠有效的抑制這一效應(yīng)，其中LA+ALCAR(0.1μM或1μM)最為有效。LA 10μM或ALCAR100μM一樣有效。經(jīng)過(guò)魚(yú)藤酮處理后的細(xì)胞用LA或ALCAR預(yù)處理與Shere等(2002)做過(guò)的那樣在200μM H2O2中處理2小時(shí)有同樣的效果(如圖1C)。由于魚(yú)藤酮處理后加與不加H2O2同樣的效果，所以我們以下所有的分析都不加H2O2.。
結(jié)果表明，低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能最有效地抑制線粒體去極化。
復(fù)合物I活性的分析結(jié)果用不同濃度DCPIP測(cè)定線粒體復(fù)合物I的活性動(dòng)力。如圖2所示，發(fā)現(xiàn)魚(yú)藤酮處理使復(fù)合物I的活力比參照系下降了30％，而LA(10，100μM)，ALCAR(100μM)，LA+ALCAR(0.1，1μM)的預(yù)處理能夠防止這一下降。而LA+ALCAR(0.1，1μM)比LA，ALCAR任何單一濃度都更有效。
結(jié)果表明，低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能最有效地防止復(fù)合物I的活力下降。
ATP分析結(jié)果魚(yú)藤酮能有效的降低細(xì)胞產(chǎn)生ATP的能力(圖3)。LA(10μM)和ALCAR(100μM)都能有效的抑制ATP水平降低。LA+ALCAR(0.1，1μM)也明顯抑制ATP水平降低，但較高濃度的混合(都是10μM)就失去抑制的效果，高濃度的LA(100μM)也同樣失去抑制效果。
結(jié)果表明，高濃度LA+ALCAR對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生ATP的能力的下降沒(méi)有抑制作用，而低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能有效抑制該能力的下降。
細(xì)胞色素C釋放分析的結(jié)果細(xì)胞色素C的釋放可由圖象判斷(圖4)1)參照細(xì)胞顯示線粒體被很好的保護(hù)，細(xì)胞色素C在線粒體上。圖象上復(fù)合的橙色顯示線粒體富含細(xì)胞色素C。魚(yú)藤酮處理過(guò)的細(xì)胞比起參照細(xì)胞橙色較少；2)魚(yú)藤酮處理的細(xì)胞顯示細(xì)胞色素C從線粒體上釋放到細(xì)胞溶膠中，使著色點(diǎn)變少而且分散。
結(jié)果表明，LA(10μM)和ALCAR(100μM)都有抑制細(xì)胞色素C的釋放的作用，低劑量LA+ALCAR(都是1μM)能有效抑制細(xì)胞色素C的釋放。
抗氧化GSH水平結(jié)果魚(yú)藤酮處理導(dǎo)致GSH明顯損失。用LA(0.1-100μM除了1μM)，ALCAR(1-100μM除了10μM)可保護(hù)魚(yú)藤酮引起的GSH損失(圖5)。LA(10μM)和ALCAR(100μM)是兩種單獨(dú)作用最有效濃度。
結(jié)果表明，低劑量LA+ALCAR(都是1μM)能最有效地保護(hù)魚(yú)藤酮引起的GSH損失。
蛋白質(zhì)羰基化的效果蛋白質(zhì)羰基化是蛋白質(zhì)氧化損傷的一個(gè)重要指標(biāo)，我們用Western blotting分析后用DNPH反應(yīng)測(cè)不溶蛋白質(zhì)片段。如圖6所示，與參照系(a)相比魚(yú)藤酮處理過(guò)的細(xì)胞蛋白質(zhì)羰基化升高(b)。用LA處理對(duì)蛋白質(zhì)羰基化無(wú)影響。ALCAR100μM處理蛋白質(zhì)羰基化明顯受到抑制。
結(jié)果表明，低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)處理有明顯的抑制蛋白質(zhì)羰基化的效果，而較高濃度的聯(lián)合使用(10μM+10μM)沒(méi)有抑制效果。
DNA氧化損傷的效果8羥基鳥(niǎo)苷抗體使細(xì)胞褪色，DNA氧化損傷的maker(紅色)。相同的細(xì)胞用Hoechst33342標(biāo)記細(xì)胞核形態(tài)。如圖7A和7B所示，魚(yú)藤酮處理的細(xì)胞8羥基鳥(niǎo)苷免疫反應(yīng)性升高。許多DNA氧化損傷的細(xì)胞顯示破碎的細(xì)胞核形態(tài)是apoptosis的特性。LA(10μM)和ALCAR(100μM)降低8羥基鳥(niǎo)苷免疫反應(yīng)性。
結(jié)果表明，低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能抑制魚(yú)藤酮引起的8羥基鳥(niǎo)苷免疫反應(yīng)性的升高。
ROS檢測(cè)的效果因?yàn)榫€粒體是ROS的來(lái)源和標(biāo)靶，用DCF檢測(cè)魚(yú)藤酮處理過(guò)的線粒體功能損傷和氧化損傷的同時(shí)是否伴隨著ROS增加。如圖8所示。
結(jié)果表明，魚(yú)藤酮處理過(guò)的樣品ROS顯著增加，而LA(10uM)和ALCAR(100uM)對(duì)此有顯著保護(hù)作用。另外，兩者低濃度聯(lián)合使用(0.1+0.1μM和1+1μM)也有對(duì)ROS增加的保護(hù)功能。
突觸素I和泛素的表達(dá)和分布狀態(tài)的分析結(jié)果PD癥狀表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中突觸素I和泛素的堆積，我們稱其為路易氏小體.突觸素I和泛素的表達(dá)水平可以用Western blotting分析檢驗(yàn).Western blotting的圖象和定量結(jié)果如圖9A和9B所示.與Control進(jìn)行比較(a).魚(yú)藤酮處理后的模型顯示出突觸素I的可溶性水平，用0.1-100uM的LA或者0.1-100uM的ALCAR進(jìn)行預(yù)處理可以對(duì)由于魚(yú)藤酮引起的突觸素I表達(dá)的增加有抑制作用。兩者在0.1+0.1uM和1+1uM的濃度混合時(shí)也有明顯的作用.
突觸素I的mRNA水平用RT-PCR方法檢測(cè)，如圖9C所示在魚(yú)藤酮處理過(guò)的細(xì)胞中突觸素I的mRNA的量與參照相比有明顯的減少，在10uM的LA和100uM的ALCAR，兩者在濃度0.1+0.1uM和1+1uM恢復(fù)突觸素I的mRNA水平達(dá)參照系水平。
用螢光免疫檢驗(yàn)法分析突觸素I和泛素的狀態(tài)分布魚(yú)藤酮引起細(xì)胞質(zhì)中突觸素I和泛素水平升高(圖10)。用10uM的LA和100uM的ALCAR和兩者在濃度0.1+0.1uM和1+1uM的混合物可抑制細(xì)胞質(zhì)中突觸素I和泛素水平升高。
結(jié)果表明低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能明顯抑制突觸素I表達(dá)的增加；低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能使突觸素I的mRNA水平恢復(fù)達(dá)參照系水平；低劑量LA+ALCAR(0.1μM或1μM)能抑制細(xì)胞質(zhì)中突觸素I和泛素水平升高。
實(shí)施例11LA和ALCAR的協(xié)同作用(PD果蠅行為學(xué)實(shí)驗(yàn))材料和方法轉(zhuǎn)入突觸素I基因的果蠅帕金森氏癥模型(由突觸素I轉(zhuǎn)基因型果蠅與Uas-DDC-gal4果蠅雜交所得)(購(gòu)自美國(guó))，帕金森果蠅模型表達(dá)突觸素I，并在成年后發(fā)生多巴胺神經(jīng)元的丟失，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)細(xì)絲狀含有突觸素I的內(nèi)含物，運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)障礙(見(jiàn)圖49)。這種果蠅模型具備人體帕金森癥的基本特征(Feny，2000)。
自果蠅羽化開(kāi)始，雌雄分開(kāi)實(shí)驗(yàn)，將果蠅隨機(jī)分為0X，0.2X，1X，5X，10X，20X，50X等多個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組包括雌雄各170-300只左右果蠅，PD果蠅的母本(即α-syn果蠅)本身不表達(dá)突觸素I，在羽化后3天時(shí)其運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試值與PD果蠅是相同的，可作為非PD對(duì)照(non-PD)。
所有果蠅均在25℃、50-60％濕度，12小時(shí)光照條件下以培養(yǎng)管培養(yǎng).
果蠅培養(yǎng)基采用玉米酵母培養(yǎng)基(其中溶解好的酵母粉在溫度降到60-70℃之間時(shí)加入并攪拌)，并加入丙酸抑制霉菌生長(zhǎng)；培養(yǎng)基加熱到沸騰后冷卻至45℃以下，加入相關(guān)藥物至所需濃度(0X，0.2X，1X，5X，10X，20X，50X等劑量)。做好的培養(yǎng)基用紗布覆蓋，水分蒸發(fā)后加瓶塞放入冰箱內(nèi)保存。保質(zhì)期6天培養(yǎng)基加藥方法(a)最終溶劑量按10ml/100g培養(yǎng)基為準(zhǔn)，對(duì)照組僅加10ml溶劑；水溶性的藥品直接以6ml水溶解(可事先配成濃縮液)；脂溶性的藥品先用蔗糖酸脂助溶后再加入6ml的水(因藥物不同方法略有差異)，助溶劑可用二甲亞砜、DMSO(＜10％)、蔗糖酸脂(＜0.5％)、吐溫20等；(b)根據(jù)各種藥品的耐熱溫度、光照反應(yīng)、溶解度等理化特征在配藥時(shí)作相應(yīng)調(diào)整，水溶性藥物和脂溶性藥物混用時(shí)不同時(shí)加。(c)其中5X、10X、20X、50X、100X劑量組分別表示在100g培養(yǎng)基中所含的藥物的mg數(shù)。
攀爬能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)自羽化后3天開(kāi)始，每6天進(jìn)行一次。以直徑27mm，長(zhǎng)110mm的玻璃管作為測(cè)試管，在距瓶底80mm處作一高度標(biāo)記，10只果蠅裝入管中后，輕輕震動(dòng)使果蠅落到管底，10秒鐘時(shí)記錄爬到80mm高度及以上的果蠅數(shù)量，連續(xù)測(cè)試10次，并根據(jù)這10次記錄的80mm高度及以上的果蠅數(shù)量計(jì)算每只果蠅每次爬到80mm高度處的概率值，以此作為該管果蠅的攀爬指數(shù)。
同時(shí)，果蠅3天換一次培養(yǎng)基，同時(shí)記錄每3天的果蠅死亡數(shù)，據(jù)此利用EXCEL軟件作出存活率-羽化年齡曲線，對(duì)其壽命進(jìn)行考察。
果蠅壽命學(xué)、攀爬能力的測(cè)試數(shù)據(jù)均利用EXCEL軟件處理。。
結(jié)果見(jiàn)圖40-48。
結(jié)果表明，LA的20X、50X劑量組可改善PD果蠅的攀爬能力，在一定程度上延長(zhǎng)其壽命；5X、10X、20X劑量組可在mRNA水平和蛋白質(zhì)水平較好地抑制突觸素I的表達(dá)，但50X劑量組卻在保護(hù)多巴胺神經(jīng)元方面較為突出。ALCAR的5X、10X、20X劑量組均可有效延長(zhǎng)PD果蠅的壽命，但對(duì)PD果蠅的攀爬能力均無(wú)影響。
LA+ALCAR的10X、20X劑量組均可有效延長(zhǎng)PD果蠅的壽命，并且作用強(qiáng)于10X劑量組的LA單獨(dú)作用，而且LA+ALCAR的5X、20X劑量組均可有效改善PD果蠅的攀爬能力。
實(shí)施例12VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的協(xié)同作用實(shí)驗(yàn)方法與實(shí)施例11中所述的相同。僅VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的劑量表示方法略有不同(見(jiàn)表1-7)。
VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的劑量表示如下表1-7所示表1

表2

表3

表4

表5

表6

表7

結(jié)果1.見(jiàn)圖11-14。
結(jié)果表明，VB5單獨(dú)使用可以延長(zhǎng)PD雄性果蠅的壽命，但對(duì)其攀爬能力無(wú)作用。對(duì)雌性PD果蠅，VB5除了對(duì)攀能力無(wú)改善作用外，低劑量(1X，5X)對(duì)壽命無(wú)明顯影響，高劑量有延長(zhǎng)壽命的作用(20X，100X)。
2.見(jiàn)圖15-18。
結(jié)果表明，VB12單獨(dú)使用可以改善PD雄性果蠅的攀爬能力，但對(duì)其壽命無(wú)延長(zhǎng)作用。對(duì)雌性PD果蠅，VB12對(duì)攀爬能力的改善作用不如雄性，對(duì)其壽命影響較小。
3.見(jiàn)圖19-22。
結(jié)果表明，VB6單獨(dú)使用可以延長(zhǎng)PD雄性果蠅的壽命，但對(duì)其攀爬能力無(wú)作用，同時(shí)VB6能保護(hù)多巴胺神經(jīng)元。對(duì)雌性PD果蠅，VB6可以延長(zhǎng)其壽命，但對(duì)其攀爬能力無(wú)作用。
4.見(jiàn)圖23-26。
結(jié)果表明，VB11單獨(dú)作用對(duì)雄性PD果蠅的攀爬能力和壽命均無(wú)明顯影響。對(duì)雌性PD果蠅，VB11對(duì)其攀爬能力和壽命有微小的改善作用。
5.見(jiàn)圖27-30。
結(jié)果表明，VB5+VB12聯(lián)合作用對(duì)雄性PD果蠅的攀爬能力和壽命均無(wú)明顯影響。VB5+VB12聯(lián)合作用下，對(duì)雌性PD果蠅的攀爬能力和壽命的影響均不明確。
6.見(jiàn)圖31-34。
結(jié)果表明，VB6、VB11、VB12三者聯(lián)合作用對(duì)雄性PD果蠅的攀爬能力和壽命均無(wú)明顯影響。同樣地，VB6、VB11、VB12三者聯(lián)合作用對(duì)雌性PD果蠅的攀爬能力和壽命也均無(wú)明顯影響。
7.見(jiàn)圖35-38。
結(jié)果表明，VB5、VB6、VB11、VB12四者聯(lián)合作用時(shí)，1X、20X、100X三個(gè)劑量組合對(duì)雄性PD果蠅的攀爬能力和壽命均有明顯影響。對(duì)雌性PD果蠅而言，VB5、VB6、VB11、VB12四者聯(lián)合作用時(shí)，1X、10X、20X、100X四個(gè)劑量組合對(duì)攀爬能力有明顯改善作用，而對(duì)壽命作用不大。
綜上所述，VB5、VB6、VB11和VB12雖然都對(duì)突觸素I的表達(dá)在不同程度上有抑制效應(yīng)(見(jiàn)圖54)，但是單獨(dú)作用時(shí)對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和壽命的影響較弱，兩兩、三種成分組合時(shí)，有一定的效果，當(dāng)四種成分聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)PD果蠅的攀爬能力改善和壽命的延長(zhǎng)具有明顯作用，其中的機(jī)制可能與對(duì)突觸素I表達(dá)的抑制效應(yīng)有關(guān)(見(jiàn)圖55)。
實(shí)施例13LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12的協(xié)同作用材料和方法SK-N-MC神經(jīng)成纖維細(xì)胞用LA、ALCAR、VB5、VB6、VB11、VB12處理72小時(shí)后，加入MTTP(250μm)處理72小時(shí)，去除培養(yǎng)基，加5mg/mLMTT在37℃條件下孵育3小時(shí)，測(cè)定550nm下的光吸收值，以550nm的光吸收值作為細(xì)胞活性的指標(biāo)。
表8各實(shí)驗(yàn)組加藥劑量表

結(jié)果見(jiàn)圖39。
結(jié)果表明，LA、ALCAR、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12聯(lián)用，其對(duì)帕金森氏癥細(xì)胞模型的保護(hù)作用比LA和ALCAR聯(lián)用增強(qiáng)3％，比VitB5、VitB6、VitB11和VitB12聯(lián)用時(shí)增強(qiáng)8％。
實(shí)施例14LA、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12及其聯(lián)合效應(yīng)對(duì)PD果蠅突觸素I基因表達(dá)的影響和對(duì)多巴胺神經(jīng)元的保護(hù)作用材料和方法利用與前述相同的突觸素I基因的果蠅帕金森氏癥模型作為考察對(duì)象，以PD果蠅的母本果蠅(α-syn果蠅)或父本果蠅(uas-DDC-gal4果蠅，即DDC果蠅)作為非PD對(duì)照，果蠅飼養(yǎng)與給藥、及給藥劑量等均采用與前述實(shí)施例10-13相同的方法。在果蠅達(dá)到相應(yīng)年齡時(shí)，在每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)抽取一定數(shù)量(約200只)的果蠅4℃條件下將其斷頭取材，將頭部勻漿離心，分離出蛋白質(zhì)和RNA成分，按照與細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)部分相似的方法進(jìn)行突觸素Iwestern-bloting或mRNA的RT-PCR實(shí)驗(yàn)；或者將果蠅頭部解剖，取出神經(jīng)組織進(jìn)行免疫組化實(shí)驗(yàn)，方法參考細(xì)胞學(xué)部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容。
結(jié)果見(jiàn)圖50-51。
結(jié)果表明，10X劑量的LA對(duì)突觸素I的表達(dá)有抑制效應(yīng)。
見(jiàn)圖52。
結(jié)果表明，20X劑量的LA對(duì)突觸素I基因的表達(dá)有抑制效應(yīng)。
見(jiàn)圖53。
結(jié)果表明，VitB6和20X劑量的LA能夠阻止PD果蠅多巴胺神經(jīng)元的丟失。
見(jiàn)圖54。
結(jié)果表明，LA、VitB5、VitB6、VitB11和VitB12分別對(duì)突觸素I的表達(dá)都有抑制效應(yīng)。
見(jiàn)圖55。
結(jié)果表明，VitB5+VitB6+VitB11+VitB12對(duì)突觸素I基因的表達(dá)有抑制效應(yīng)。
討論本發(fā)明針對(duì)PD多因素的發(fā)病機(jī)制，選擇針對(duì)線粒體損傷修復(fù)有一定作用的6種營(yíng)養(yǎng)素作為主要組成成分，通過(guò)不同組合，分別在不同位點(diǎn)聯(lián)合發(fā)揮作用，保障線粒體的正常代謝功能，以達(dá)到對(duì)PD的防治效果。
具體而言，泛酸(VB5)是輔酶A(CoA)前體，由輔酶A和脂肪酸合酶的磷酸泛酰巰基乙胺部分組成，因而對(duì)乙酰CoA的產(chǎn)生很重要。泛酸缺乏使猴子中亞鐵血紅素合成下降，并引起貧血癥(Plesofsky-Vig，1996)。缺乏泛酸的頭孢真菌中線粒體復(fù)合體IV減少(Brambl and P1esofsky-Vig，1986)，復(fù)合體IV的鐵含量也減少(Brambl andPlesofsky-Vig，1986)，這導(dǎo)致了線粒體復(fù)合體IV的缺失。脂肪酸和泛酸是保證亞鐵血紅素生物合成前體——琥珀酰輔酶A正常供應(yīng)的微量原料，任意一個(gè)的缺乏將通過(guò)與生物素缺乏相似的機(jī)制減少亞鐵血紅素合成。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過(guò)70種酶利用泛酸產(chǎn)生的輔酶A或衍生物作為反應(yīng)底物。
VB6是吡哚醛5-磷酸(PLP)的前體，PLP是DA合成的所必需的輔酶，也直接參與亞鐵血紅素的合成(Scholnick et a1.，1972)，在美國(guó)大約10％的人攝入維生素B6不到推薦每日攝入量(RDA)的一半(Wakimoto and Block，2001)，因此VB6是代謝的重要限制因素。亞鐵血紅素缺乏也許是在老化過(guò)程中的線粒體和神經(jīng)細(xì)胞衰敗的一個(gè)因素(Atamna et a1.，2002.a)。亞鐵血紅素是細(xì)胞中鐵的一個(gè)主要功能形式，它在線粒體由亞鐵螯合酶插入亞鐵原卟啉IX合成。亞鐵血紅素缺乏使腦細(xì)胞里的線粒體復(fù)合體IV減少，激活硝酸氧化物合成酶，改變淀粉樣前體蛋白質(zhì)，并破壞鐵和鋅內(nèi)環(huán)境恒定。鐵和B6的普遍缺乏導(dǎo)致其認(rèn)知困難，兒童缺鐵會(huì)遲延CNS的發(fā)展(Benton，2001；Tamura et a1.，2002)。因而，亞鐵血紅素缺乏或調(diào)節(jié)異常也許是神經(jīng)衰退過(guò)程的一個(gè)重要和可防止的部分(Atamna et a1.，2002.a)，但這還是可以通過(guò)補(bǔ)充VB6加以預(yù)防。
葉酸(VB11)是各種一碳四氫葉酸酯的衍生物的合成原料，在核酸合成與甲基化反應(yīng)中起著非常重要的作用，這些反應(yīng)對(duì)大腦正常功能至關(guān)重要。葉酸缺乏將影響核DNA或mtDNA的合成，減少嘌呤和dTMP的可利用性。與細(xì)胞質(zhì)的四氫葉酸酯合成酶比較，線粒體含有更高水平的葉酸輔酶。大腦中葉酸輔酶的線粒體含有較多谷氨酸鹽長(zhǎng)鏈，這與肝中分布有明顯差異，葉酸水平降低或高胱氨酸含量升高與認(rèn)知力損傷、帕金森氏病、阿爾茨海默氏病以及其他各類癡呆疾病密切相關(guān)。(Carl et al.，1996)VB12具有廣泛的生理作用，但需轉(zhuǎn)化為甲基鈷胺和輔酶B12后才具有活性，在人類的組織中，有兩種生化反應(yīng)需要維生素B12的參與一種是從高半胱氨酸合成甲硫氨酸的反應(yīng)，其中產(chǎn)生的四氫葉酸參與DNA的合成，間接參與胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成；另一種是甲基丙二酸輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)殓晁彷o酶A，參與三羧循環(huán)，從而對(duì)神經(jīng)髓鞘中脂蛋白的形成，保護(hù)中樞和外周的有髓神經(jīng)纖維的功能完整性起重要作用。同時(shí)參與廣泛的蛋白質(zhì)及脂肪代謝等。VB12對(duì)神經(jīng)親和力強(qiáng)，有修復(fù)神經(jīng)髓鞘、促進(jìn)再生作用。
在一帕金森氏綜合癥動(dòng)物模型上(Duan et al.，2002)及用L-多巴治療的患者中發(fā)現(xiàn)血漿高半胱氨酸水平增高，并且此高半胱氨酸水平與VB11，VB12和吡哆醛-5-磷酸鹽水平有負(fù)相關(guān)性(Miller et al.，2003)。
α-硫辛酸(LA)及其還原形式二氫硫辛酸，是α-酮戊二酸脫氫酶的輔酶和丙酮酸脫氫酶的輔酶；屬多功能的抗氧化物，能清除自由基，再循環(huán)產(chǎn)生其它的抗氧化劑(包括谷光甘肽，維生素C，CoQ和硫氧還原蛋白，所有的這些步驟都能再循環(huán)產(chǎn)生維生素E)，以及螯合催化金屬(例如鐵)來(lái)預(yù)防自由基的產(chǎn)生；誘導(dǎo)產(chǎn)生第二相酶。
乙酰-L肉堿(ALCAR)，是L-肉毒堿的乙?；苌铮梢源┻^(guò)線粒體膜，能夠?qū)㈤L(zhǎng)鏈脂肪酸轉(zhuǎn)入線粒體供能，增加雙磷脂酰甘油的水平，增加呼吸作用以及被看作二級(jí)抗氧化劑。動(dòng)物(包括人類)組織中的肉堿水平隨年齡增長(zhǎng)而下降(Costell等，1989；Liu等，2002a；Maccari等，1990)從而降低線粒體膜完整性。對(duì)于大小鼠，犬類等動(dòng)物的研究表明，補(bǔ)充ALCAR可以改善與衰老相關(guān)認(rèn)知力障礙，促進(jìn)神經(jīng)再生，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受線粒體解偶聯(lián)劑與抑制劑毒害，減輕腦局部貧血和再灌注后的神經(jīng)損傷，提高腦中谷胱苷肽和GABA水平。
本發(fā)明用轉(zhuǎn)入突觸素I基因的果蠅帕金森氏癥模型(由突觸素I轉(zhuǎn)基因型果蠅與uas-DDC果蠅雜交所得)，帕金森果蠅模型表達(dá)突觸素I，并在成年后發(fā)生多巴胺神經(jīng)元的丟失，神經(jīng)元內(nèi)出現(xiàn)細(xì)絲狀含有突觸素I的內(nèi)含物，運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)障礙。由于這種果蠅模型具備人體帕金森癥的基本特征，因此可以利用這一遺傳學(xué)方法來(lái)進(jìn)行帕金森氏癥的研究。
本發(fā)明顯示，VB5、VB6、VB11、VB12單獨(dú)作用時(shí)對(duì)于PD果蠅運(yùn)動(dòng)能力的改善和壽命的延長(zhǎng)都有一定的作用，但對(duì)每一個(gè)具體劑量來(lái)說(shuō)都無(wú)法達(dá)到對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和壽命都非常有效的效果，甚至?xí)龅綄?duì)二者的作用完全相反的現(xiàn)象；當(dāng)VB5與VB12組合時(shí)略有聯(lián)合效應(yīng)，對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和壽命的影響趨向一致，并在雌性PD果蠅上觀察到1X和20X劑量組的效果相對(duì)較好，但影響程度較??；當(dāng)VB6、VB11和VB12三者組合時(shí)，PD果蠅上觀察到藥物對(duì)運(yùn)動(dòng)能力和壽命均無(wú)明顯效果；只有在VB5、VB6、VB11和VB12聯(lián)合作用時(shí)，我們觀察到PD果蠅的運(yùn)動(dòng)能力和壽命有明顯的改善，水平接近非PD對(duì)照果蠅組。
單獨(dú)作用時(shí)50X劑量組的LA對(duì)PD果蠅的運(yùn)動(dòng)能力和壽命均有效，而ALCAR只延長(zhǎng)了PD果蠅的壽命，對(duì)運(yùn)動(dòng)能力沒(méi)有影響。二者聯(lián)合作用時(shí)，10X劑量組對(duì)PD果蠅運(yùn)動(dòng)能力的作用強(qiáng)于10X劑量LA的單獨(dú)作用。
由于VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR在體內(nèi)發(fā)揮作用的途徑有所不同，因此它們彼此間的聯(lián)合作用強(qiáng)于單藥的作用，并且聯(lián)合作用條件下療效更穩(wěn)定和安全。本發(fā)明中LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12預(yù)處理后在MTT環(huán)境中的細(xì)胞存活率，比LA+ALCAR預(yù)處理或VB5+VB6+VB11+VB12預(yù)處理的細(xì)胞存活率高。
本發(fā)明在進(jìn)一步對(duì)藥物作用機(jī)制的研究中，利用SK-NM-C的慢性魚(yú)藤酮模型(5nM，4周)作為一個(gè)體外PD模型再現(xiàn)了魚(yú)藤酮對(duì)線粒體功能的毒性影響。(復(fù)合酶1活性降低，MMP和ATP水平降低，細(xì)胞色素C釋放增加)氧化壓力(谷胱甘肽的丟失，ROS，蛋白質(zhì)酰基和8-OXO-dG增加)，和PD的病理特征(突觸素I和泛素水平的積累增加)。發(fā)明人在PD病理特征，線粒體功能和氧化與抗氧化損傷生物標(biāo)記幾個(gè)方面，研究用LA(0.1，1，10，100uM)，ALCAR(0.1，1，10，100uM)和他們不同組分的組合進(jìn)行4周預(yù)處理的效果。
PD的分子病理表現(xiàn)是線粒體功能缺陷。在這個(gè)細(xì)胞模型里，魚(yú)藤酮處理后的線粒體內(nèi)膜上的復(fù)合體1活性降低、ATP損耗量增加以及細(xì)胞色素酶C的釋放增加。合適劑量的LA和ALCAR兩種線粒體營(yíng)養(yǎng)素對(duì)用魚(yú)藤酮處理后的線粒體有治療作用。最有效的劑量是10uM的LA和100uM的ALCAR，并且當(dāng)兩者混合使用后，有效劑量出現(xiàn)在0.1和1uM，這種最佳配比比任何一種單用有效得多。LA和ALCAR這樣的線粒體營(yíng)養(yǎng)素可以有效的抑制魚(yú)藤酮引起的細(xì)胞氧自由基的產(chǎn)生及氧化損傷。
PD癥狀的最明顯表現(xiàn)是突觸素I和泛素的堆積。這說(shuō)明復(fù)合體I的調(diào)節(jié)是突觸素I堆積水平的關(guān)鍵，而且高表達(dá)量的突觸素I誘發(fā)氧化損傷。另外，氧化損傷以及細(xì)胞色素C的減少也可使突觸素I聚集。經(jīng)魚(yú)藤酮處理后的PD細(xì)胞模型的具體變化是細(xì)胞質(zhì)中突觸素I和泛素蛋白的顯著增加。因此，LA和ALCAR是否可以用于防止PD病癥的發(fā)生與治療，取決于他們能否阻止這些蛋白質(zhì)的表達(dá)及分配。
總之，本發(fā)明證明線粒體營(yíng)養(yǎng)素VB5、VB6、VB11、VB12、LA和ALCAR及其不同組合在PD果蠅模型上會(huì)有不同的療效，并且VB5、VB6、VB11和VB12聯(lián)合應(yīng)用，或LA和ALCAR聯(lián)合應(yīng)用的效果強(qiáng)于藥物的單獨(dú)作用。LA和ALCAR對(duì)抑制PD細(xì)胞模型線粒體的功能紊亂、氧化損傷和阻止突觸素I及泛素的積累有一定的作用。并且，LA和ALCAR兩種藥在低濃度時(shí)(0.1-1uM)的混合物表現(xiàn)出一種正協(xié)同效應(yīng)，這比單獨(dú)用10倍濃度的任何一種藥來(lái)對(duì)魚(yú)藤酮處理引發(fā)的線粒體功能紊亂和氧化損傷都有效。另外，LA+ALCAR+VB5+VB6+VB11+VB12對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用強(qiáng)于LA+ALCAR或VB5+VB6+VB11+VB12的組合。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種組合物，其特征在于，它含有二種或多種(如2-12種)線粒體營(yíng)養(yǎng)素，或者所述的組合物由二種或多種(如2-12種)線粒體營(yíng)養(yǎng)素構(gòu)成。
2.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的線粒體營(yíng)養(yǎng)素選自下組R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
3.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(a)維生素B12；(b)一種或多種選自下組的B族維生素維生素B5、維生素B6、維生素B11。
4.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組分(b)是維生素B5；或者所述的組分(b)是維生素B5和維生素B6。
5.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組分(b)同時(shí)包括維生素B5、維生素B6和維生素B11三種B族維生素。
6.如權(quán)利要求3-5中任一所述的組合物，其特征在于，所述的組合物還含有(c)一種或多種選自下組的線粒體營(yíng)養(yǎng)素R-硫辛酸、或乙酰肉堿。
7.如權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，所述的組合物含有(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉堿。
8.一種如權(quán)利要求1所述的組合物的制備方法，其特征在于，它包括步驟①將二種或多種線粒體營(yíng)養(yǎng)素混合在一起，形成組合物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的線粒體營(yíng)養(yǎng)素選自下組R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟①中，將(a)維生素B12和(b)選自維生素B5、B6或B11中一種或多種B族維生素混合，制得組合物。
11.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟①中，將(1)R-硫辛酸和(2)乙酰肉堿混合，制得組合物。
12.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，在步驟①中，再混入(c)一種或多種選自下組的線粒體營(yíng)養(yǎng)素R-硫辛酸、或乙酰肉堿，制得組合物。
13.如權(quán)利要求10或11所述的方法，其特征在于，在步驟①中，還包括混入一種或多種選自下組的額外的線粒體營(yíng)養(yǎng)素輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
14.一種如權(quán)利要求1-7中任一所述的組合物的用途，其特征在于，所述的組合物用于制備預(yù)防、治療或改善帕金森氏癥的藥物，用于制備預(yù)防或改善帕金森氏癥的飲食補(bǔ)充劑。
15.一種預(yù)防、治療或改善帕金森氏癥的方法，其特征在于，給予需要治療的對(duì)象施用一種或多種(更佳地2種或多種)線粒體營(yíng)養(yǎng)素。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述的線粒體營(yíng)養(yǎng)素選自下組R-硫辛酸、乙酰肉堿、維生素B5、維生素B6、維生素B11、維生素B12、輔酶Q10、硫胺、核黃素、煙酸、生物素或肌酸。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種B族維生素的組合，它可以有效改善帕金森氏癥；本發(fā)明公開(kāi)的低劑量的LA和ALCAR的組合，可以很有效地抑制魚(yú)藤酮導(dǎo)致的線粒體功能紊亂，突觸素I和泛素的表達(dá)水平的升高，氧化損傷升高和抗氧化GSH水平的降低。本發(fā)明還公開(kāi)了，低濃度LA和ALCAR與維生素B聯(lián)合使用可以提供一種更新更直接的線粒體營(yíng)養(yǎng)素復(fù)合物，對(duì)于帕金森癥的保護(hù)和治療更為有效。
文檔編號(hào)A61K31/525GK101057857SQ20061002590
公開(kāi)日2007年10月24日 申請(qǐng)日期2006年4月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月21日
發(fā)明者劉健康, 高鴻翔, 張紅宇 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院