專利名稱：塔斯品堿的制備方法以及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種藥物化合物的制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一種具有抑制血管生成、抗腫瘤作用的塔斯品堿的制備方法以及以該活性成分在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
紅毛七(Radix et Rhizoma Leonticis)為小檗科植物類葉牡丹Leonticerobustum(Maxim.)Diels.的根及根莖，產(chǎn)于秦嶺和大巴山區(qū)，原蘇聯(lián)、日本也有分布，屬于非藥典收錄天然藥物，含木蘭花堿、塔斯品堿、N-甲基金雀花堿、右旋羽扇豆堿等生物堿。
塔斯品堿(1-[2-(Dimethylamino)ethyl]-3，8-dimethoxy[1]benzopyrano[5，4，3-cde][1]benzopyran-5，10-dione，Taspine)是一種阿樸菲類生物堿，含有兩個內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)，分子式為C20H19NO6，分子量369.36，結(jié)構(gòu)式如圖1-1。熔點為370℃。
塔斯品堿是從紅毛七總堿中分離出來的一種化合物，其制備方法是使用硅膠為固定相，氯仿∶甲醇∶氨水的體積比(15∶1∶0.1)為流動相，按每體積100mL收集，減壓濃縮，薄層硅膠板檢測，合并55-76份，甲醇重結(jié)晶，得塔斯品堿純品。該方法較復(fù)雜、繁瑣，費時，不適合工業(yè)制備生產(chǎn)。
目前發(fā)現(xiàn)塔斯品堿的主要藥理作用如下抑菌作用塔斯品堿具有顯著的抑菌作用，1∶1,000,000對結(jié)核桿菌(H27及Academia株)具有顯著活性，對小鼠實驗性結(jié)核病有治療作用。
抗炎作用Perdue GP等用角叉菜膠導(dǎo)致的大鼠足踝腫、棉球?qū)е碌娜庋磕[、關(guān)節(jié)炎三個模型考察了塔斯品堿鹽酸鹽的抗炎活性，發(fā)現(xiàn)20mg/kg塔斯品堿鹽酸鹽抑制大鼠角叉菜膠足踝腫、棉球?qū)е碌娜庋磕[和關(guān)節(jié)炎的作用與1mg/kg的消炎痛效力相當，且具有劑量依賴關(guān)系，口服半數(shù)有效濃度(ED50)為58mg/kg，效力是保泰松的3～4倍。且各治療組的大鼠體重沒有發(fā)現(xiàn)有明顯差別。
促進傷口愈合作用Vaisberg AJ等研究了塔斯品堿促進傷口愈合的藥理作用，并對其作用機理進行了研究。動物實驗表明塔斯品堿具有促進傷口愈合的活性，并與劑量相關(guān)，半數(shù)有效濃度(ED50)為0.375mg/kg，體外細胞實驗表明塔斯品堿鹽酸鹽在濃度低于150ng/mL時對人的纖維母細胞無毒性，也不能促進細胞增殖，但它能夠促進人纖維母細胞的遷移，這可能就是塔斯品堿促進傷口愈合的機理。治療17個月后，未發(fā)現(xiàn)塔斯品堿鹽酸鹽有致癌作用。
細胞毒性作用塔斯品堿具有較強的細胞毒性，對口腔癌細胞(KB)細胞的半數(shù)抑制濃度為(IC50)0.39μg/mL，對V-79細胞的半數(shù)抑制濃度為0.17μg/mL。
抗病毒作用塔斯品堿還具有抑制RNA腫瘤病毒的作用。
腫瘤是人體細胞異常分化增殖的惡性疾病。腫瘤在表現(xiàn)其生長、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為時與其中的微血管增生有密切的關(guān)系。無論原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤，其持續(xù)性生長都必須依賴于新生血管的形成。腫瘤的生長大致可分為兩個時期即血管前期，為無血管生長期，腫瘤增殖到大約直徑2mm后，進人血管期，此期以腫瘤組織中毛細血管的進行性生長為標志。新生的毛細血管為迅速增長的腫瘤組織運送氧氣和養(yǎng)料，并將代謝產(chǎn)物運走。此期腫瘤組織增殖迅速，這一理論在乳腺癌、宮頸癌等的發(fā)病過程中已得到明確的證實。腫瘤的轉(zhuǎn)移及在轉(zhuǎn)移部位的生長也依賴于新生血管的形成。原發(fā)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移依賴于源自既存血管的新生血管的生長。腫瘤既可通過腫瘤血管從宿主獲取營養(yǎng)和氧氣，又可通過腫瘤血管源源不斷地向宿主輸送轉(zhuǎn)移細胞，并在機體的其他部位繼續(xù)生長和誘導(dǎo)血管形成，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤的血管系統(tǒng)已成為一個嶄新的、有希望的抗腫瘤治療靶點。
至今未發(fā)現(xiàn)塔斯品堿的有關(guān)抑制血管生成的作用以及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述塔斯品堿制備方法的缺點，提供一種塔斯品堿的制備方法。
本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題在于提供一種塔斯品堿在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是它包括下述步驟1、配置溶解液按常規(guī)方法配置濃度為0.5～2％的鹽酸溶液，作為溶解液。
2、溶解紅毛七總堿塔斯品堿的制備原料為紅毛七總堿，紅毛七總堿的制備原料以及制備方法已在專利號為200410073122.X、發(fā)明名稱為《一種紅毛七總堿的制備工藝》的中國申請專利中公開。取紅毛七總堿裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入紅毛七總堿重量10～12倍濃度為0.5～2％的鹽酸溶液，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。
3、吸附分離將步驟2制備的紅毛七總堿溶液上紅毛七總堿1倍重量的樹脂柱，柱徑與柱高比為1∶3，吸附流速為每小時1.0～1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。
4、配置洗脫液將氨水與甲醇按體積比為2∶98配制成洗脫液。
5、洗脫將步驟4配置的洗脫液20倍柱體積以流速為每小時0.5～0.6倍柱體積洗脫，按每倍柱體積分別收集洗脫液。
6、減壓濃縮合并3～10倍柱體積洗脫液，45℃、0.08MPa減壓濃縮至不含洗脫液，得分離物。
7、重結(jié)晶先進行結(jié)晶，將步驟6制備的分離物放入容器內(nèi)，加入分離物20倍量的甲醇，80℃加熱溶解，趁熱抽濾，室溫靜置24小時，再進行抽濾，得塔斯品堿粗品。按上述方法重結(jié)晶，置于干燥器中，110℃、烘1小時，得塔斯品堿純品。
8、按塔斯品堿的質(zhì)量標準進行檢驗，檢驗合格后包裝入庫。
本發(fā)明塔斯品堿制備方法中所用優(yōu)選的溶解液是濃度為1.0～1.5％鹽酸溶液。
本發(fā)明塔斯品堿制備方法中所用最佳的溶解液是濃度為1.0％的鹽酸溶液。在溶解紅毛七總堿的工藝步驟中，加入與紅毛七總堿最佳重量比為10倍的濃度為1.0％的鹽酸溶液，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附工藝步驟中，最佳吸附流速為每小時1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。
本發(fā)明塔斯品堿制備方法的吸附分離步驟中，所用的優(yōu)選樹脂柱為陽離子交換樹脂柱。
本發(fā)明塔斯品堿制備方法的吸附分離步驟中，所用的最佳樹脂柱為LSD001型陽離子交換樹脂柱。
本發(fā)明的藥物組合物含有治療有效量的塔斯品堿為活性成份，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
塔斯品堿在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
有效成分塔斯品堿制備治療腫瘤的藥物用常規(guī)藥用制劑的形式來使用。所述的常規(guī)藥用制劑含作為活性成分的塔斯品堿，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于胃腸內(nèi)給藥的有機或無機的固體或液體賦形劑混合。該藥用制劑可以是固體形式如片劑、顆粒劑、膠囊劑；也可以是液體形式如懸浮劑、糖漿劑、乳劑等。
上述制劑中可含有輔助物質(zhì)、穩(wěn)定劑、潤濕劑、增溶劑和其它常用的添加劑，如乳糖、滑石粉、纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、果膠、吐溫-80、聚乙烯醇等。
上述制劑可按照各種制劑常規(guī)的制備工藝制成。
含有塔斯品堿治療腫瘤的藥物中塔斯品堿含有重量比為0.1～99.5％的活性成分，優(yōu)選含有重量比為0.5～95％的活性成分。
本發(fā)明的活性成分塔斯品堿制成各種劑型的口服藥物，成人口服，常用劑量一次25mg，1日3次，最大劑量的塔斯品堿含量應(yīng)為每天75mg，飯后服用，兒童用藥酌情減量。
本發(fā)明的適應(yīng)癥腫瘤。
本發(fā)明塔斯品堿的制備方法與現(xiàn)有的制備方法相比，具有工藝步驟簡單、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，可進行中間放大試驗。
發(fā)明人采用本發(fā)明塔斯品堿制備方法制備的塔斯品堿進行了抑制血管生成的體外和體內(nèi)試驗。體外試驗包括血管內(nèi)皮細胞增殖試驗、血管內(nèi)皮細胞遷移試驗和主動脈環(huán)血管生成試驗，體內(nèi)試驗采用雞胚尿囊膜血管生成試驗。利用小鼠肉瘤S180移植試驗證實塔斯品堿治療腫瘤的用途。試驗結(jié)果表明塔斯品堿有抑制血管生成的作用，明顯抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細胞遷移，抑制主動脈環(huán)血管生成，并抑制雞胚尿囊膜血管生成。通過體外及體內(nèi)試驗表明塔斯品堿抑制血管生成的多個過程，而顯示明顯的抑制血管生成的藥理作用及治療腫瘤的作用。


圖1是塔斯品堿抑制大鼠胸主動脈環(huán)血管生成曲線。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進一步詳細說明，但本發(fā)明不限于這些實施例。
實施例1以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下1、配置溶解液按常規(guī)方法配置濃度為1％的鹽酸溶液1000g，作為溶解液。
2、溶解紅毛七總堿取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為1％的鹽酸溶液1000g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。
3、吸附分離將步驟2制備的紅毛七總堿溶液上100g的LSD001型陽離子交換樹脂裝柱，柱徑與柱高比為1∶3，吸附流速為每小時1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。
4、配置洗脫液將氨水與甲醇按體積比為2∶98配制成洗脫液。
5、洗脫將步驟4配置的洗脫液20倍柱體積以流速為每小時0.5～0.6倍柱體積洗脫，按每倍柱體積分別收集洗脫液。
6、減壓濃縮合并3～10倍柱體積洗脫液，45℃、0.08MPa減壓濃縮至不含洗脫液，得分離物。
7、重結(jié)晶先進行結(jié)晶，將步驟6制備的分離物放入容器內(nèi)，加入分離物20倍量的甲醇，80℃加熱溶解，趁熱抽濾，室溫靜置24小時，再進行抽濾，得塔斯品堿粗品。按上述方法重結(jié)晶，置于干燥器中，110℃、烘1小時，得塔斯品堿純品。
8、按塔斯品堿的質(zhì)量標準進行檢驗，檢驗合格后包裝入庫。
實施例2以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下
本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為2％的鹽酸溶液1000g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為2％的鹽酸溶液1000g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.1倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例3以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為0.5％的鹽酸溶液1200g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為0.5％的鹽酸溶液1200g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.0倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例4以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為0.5％的鹽酸溶液1000g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為0.5％的鹽酸溶液1000g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.0倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例5以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為2％的鹽酸溶液1200g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為2％的鹽酸溶液1200g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例6以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為0.5％的鹽酸溶液1200g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為0.5％的鹽酸溶液1200g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例7以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為2％的鹽酸溶液1000g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為2％的鹽酸溶液1000g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.0倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例8以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為0.5％的鹽酸溶液1000g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為0.5％的鹽酸溶液1000g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例9以制備塔斯品堿的所用原料紅毛七總堿100g為例其制備方法步驟如下本實施例在配置溶解液工藝步驟中，按常規(guī)方法配置濃度為2％的鹽酸溶液1200g，作為溶解液。在溶解紅毛七總堿工藝步驟中，取紅毛七總堿100g裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入濃度為2％的鹽酸溶液1200g，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液。在吸附分離工藝步驟中，吸附流速為每小時1.0倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。其他工藝步驟與實施例1相同。
實施例10以制備含有活性成分塔斯品堿片劑1000片為例所用的原料和輔料及其配比如下塔斯品堿 25g淀粉 300g采用常規(guī)片劑的制備工藝制成，每片重0.3g，含塔斯品堿25mg。用法成人一日3次，一次1片，一日最大劑量為75mg，飯后服用，兒童酌情減量。
實施例11以制備含有活性成分塔斯品堿膠囊劑1000粒為例所用的原料和輔料及其配比如下塔斯品堿25g淀粉加至300g采用常規(guī)膠囊劑的制備工藝制成，每粒重3g，含塔斯品堿25mg。用法成人1日3次，一次一粒，一日最大劑量為75mg，飯后服用，兒童酌情減量。
實施例12以制備含有活性成分塔斯品堿口服液1000ml為例所用的原料和輔料及其配比如下塔斯品堿 25g甜菊糖 50g蒸餾水 加至1000ml采用常規(guī)口服液的制備工藝制成，每支10ml，含塔斯品堿25mg。用法成人一日3次，一次10ml，一日最大劑量為75mg，飯后服用，兒童酌情減量。
最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制，盡管參照以上較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明進行修改、變形或等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。
為了確定本發(fā)明塔斯品堿最佳的工藝步驟，發(fā)明人進行了大量的實驗室研究試驗，各種試驗情況如下實驗儀器與設(shè)備LC-10ATvp型色譜泵，SPD-10Avp紫外檢測器，由日本島津公司生產(chǎn)；ANASTAR色譜工作站，由中國奧泰科技有限公司生產(chǎn)；酶聯(lián)免疫檢測儀，由美國伯樂公司生產(chǎn)。
1、鹽酸溶液的濃度以及用量對紅毛七總堿溶解的影響(1)鹽酸的濃度對紅毛七總堿溶解的影響取紅毛七總堿5g共5份，分別加入10倍量的0.1％、0.5％、1％、2％、4％鹽酸溶液，20℃攪拌2小時，抽濾，沉淀經(jīng)干燥后，稱重。
實驗結(jié)果見表1。
表1 鹽酸濃度對紅毛七總堿溶解的影響結(jié)果表

實驗結(jié)果表明，隨著鹽酸溶液濃度由0.1％增加到1％時，沉淀重量逐漸減少，鹽酸溶液濃度由1％增加到4％時，沉淀重量逐漸增加，1％鹽酸沉淀量最小為0.08g，能很好地溶解紅毛七總堿，在本法明的工藝步驟中選擇10倍量的1％鹽酸溶液溶解紅毛七總堿。
(2)1％鹽酸溶液的用量對紅毛七總堿溶解的影響取紅毛七總堿5g共5份，分別加入8、9、10、11、12倍量的1％鹽酸溶液，20℃攪拌2小時，抽濾，沉淀經(jīng)干燥后，稱重。實驗結(jié)果見表2。
表2 1％鹽酸溶液用量對紅毛七總堿溶解的影響結(jié)果表

結(jié)果表明，隨著1％鹽酸溶液用量增加，沉淀重量減少，10倍量1％鹽酸溶液已能很好地溶解紅毛七總堿，在本發(fā)明的工藝步驟中選擇10倍量的1％鹽酸溶液。
2、樹脂對塔斯品堿吸附性能的影響取LSD001型陽離子交換樹脂、LSD113型陽離子交換樹脂、XDA-1型樹脂、D101型大孔吸附樹脂各20g，各加入同一批的1％鹽酸溶液600mL，25℃靜態(tài)吸附24小時后，采用島津Shimadzu高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp型色譜泵、SPD-10Avp紫外檢測器，ANASTAR色譜工作站測定1％鹽酸溶液中塔斯品堿含量。HPLC條件色譜柱為Planetsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-20mmol/L NaH2PO4溶液-三乙胺，體積比為45∶55∶0.2，冰醋酸調(diào)pH值5.0；流速為1.0mL/min，檢測波長為260nm，靈敏度為0.1AUFs。
試驗結(jié)果見表3。
表3 四種樹脂靜態(tài)吸附后酸水中塔斯品堿含量表

結(jié)果表明，四種樹脂中LSD001陽離子交換樹脂對塔斯品堿的吸附性能最好，而其它樹脂對塔斯品堿的吸附性能較差。在本發(fā)明的工藝步驟中選擇LSD001陽離子交換樹脂對塔斯品堿進行分離制備。
3、上樣流速對陽離子交換樹脂柱吸附量的影響用1％鹽酸溶解紅毛七總堿的紅毛七總堿溶液上樣于LSD001型陽離子交換樹脂柱，樹脂重80g，陽離子交換樹脂柱體積100mL，陽離子交換樹脂柱徑與柱高比為1∶3，分別采用紅毛七總堿溶液的不同流速上樣，以改良碘化鉍鉀試劑檢測流出液中生物堿，實驗了上樣流速對陽離子交換樹脂柱吸附量的影響，實驗結(jié)果見表4。
表4 上樣流速對LSD001型陽離子交換樹脂柱吸附量的影響結(jié)果表

結(jié)果表明上樣液流速與上樣量呈負相關(guān)，流速越大，吸附量越小?？紤]到1mL/min流速太小，耗時較長，而流速大于3mL/min時，吸附量又偏低，耗用陽離子交換樹脂量大，在本發(fā)明的工藝步驟中采用2mL/min的流速上樣，即上樣流速為每小時1.2倍陽離子交換樹脂柱體積。
4、洗脫液的選擇將已吸附樣品的LSD001型陽離子交換樹脂柱，樹脂重80g，樹脂柱體積100ml，柱徑柱高為1∶3，分別用氨水與甲醇的體積比為0.5∶99.5、2∶98、10∶90洗脫液以流速為每小時0.5～0.6倍柱體積洗脫，按每倍柱體積等體積收集，采用島津Shimadzu高效液相色譜儀，包括LC-10ATvp型色譜泵，SPD-10Avp紫外檢測器，測定洗脫液中塔斯品堿含量；采用ANASTAR色譜工作站測定洗脫液中塔斯品堿含量。HPLC條件色譜柱為Planetsil C18(150mm×4.6mm，5μm)；流動相為甲醇-20mmol/LNaH2PO4溶液-三乙胺，體積比為45∶55∶0.2，冰醋酸調(diào)pH值5.0；流速為1.0mL/min，檢測波長為260nm，靈敏度為0.1AUFs。
測試結(jié)果見表5。
表5 洗脫液中塔斯品堿的含量

結(jié)果表明，氨水與甲醇的體積比為0.5∶99.5洗脫液不能完全洗脫塔斯品堿，氨水與甲醇的體積比為2∶98、10∶90洗脫液洗脫曲線對稱，均能較好地洗脫出塔斯品堿，考慮氨水與甲醇的體積比為10∶90洗脫液中氨水用量較大，造成浪費，所以確定洗脫液為氨水與甲醇的體積比2∶98。
5、塔斯品堿的純度測試發(fā)明人采用本發(fā)明方法實施例1制備的塔斯品堿高效液相色譜儀進行了純度測試，純度為99.85％。
6、塔斯品堿的結(jié)構(gòu)鑒定發(fā)明人采用本發(fā)明方法實施例1制備的塔斯品堿進行了結(jié)構(gòu)鑒定，測定了分離化合物的熔點、紫外光譜、紅外光譜、1HNMR、13CNMR和MS。
結(jié)果表明，分離化合物的熔點為372-374℃，紫外光譜為UV(λmaxmethanol)245(ε25800)，285(4200)，333(3100)，348(3800)。紅外光譜為IR(KBr)ν3066，2941，2764，1730，1597，1472，1436，1288，1136，1092cm-1。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.21(d，J＝8.8Hz，1H)，7.31(d，J＝8.8Hz，1H)，7.20(s，1H)，4.10(s，6H)，3.53(t，J＝7.6Hz，2H)，2.68(t，J＝7.6Hz，2H)，2.41(s，6H)；13CNMR(100MHz，CDCl3)δ158.7，157.7，151.2，151.0，144.3，137.9，136.8，126.9，119.1，118.5，116.5，113.6，111.6，109.2，60.3，56.6，56.5，45.3，33.0。MS C20H20NO6(M+H)370.1291。
以上結(jié)果與文獻報道的塔斯品堿的熔點、紫外光譜、紅外光譜、1HNMR、13CNMR和MS完全相同。確定分離化合物為塔斯品堿。
為了驗證本發(fā)明的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明方法實施例1制備的塔斯品堿進行了藥效試驗，各種試驗情況如下一、塔斯品堿抑制血管生成的體外試驗1、塔斯品堿對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞增殖抑制實驗取對數(shù)生長期的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，用0.25％的胰酶消化3～5分鐘，吹打成均勻的單個細胞懸液后，血球計數(shù)板計數(shù)，并稀釋成濃度為2.5×104個/mL的單細胞懸液，每孔200μL平行接種于96孔培養(yǎng)板，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中濕化培養(yǎng)24小時，吸棄培養(yǎng)液，每孔200μL加入含系列濃度藥物的培養(yǎng)基，分別是1.50μg/mL、1.00μg/mL、0.75μg/mL、0.50μg/mL、0.38μg/mL、0.25μg/mL、0.13μg/mL，每個藥物濃度設(shè)5復(fù)孔，培養(yǎng)72小時后加入5mg/mL的噻唑藍工作液8μL，混勻，37℃、5％CO2培養(yǎng)箱孵育4小時，取出，小心吸棄培養(yǎng)液，每孔加入200μL二甲基亞砜，振蕩10分鐘，在波長為490nm處用酶聯(lián)免疫檢測儀測量各孔的光吸收值(OD值)，計算抑制率，繪制藥物濃度-抑制率曲線，求出半數(shù)抑制濃度IC50。試驗結(jié)果見表6。
抑制率％＝(1-實驗組OD值/對照組OD值)×100％表6 塔斯品堿抑制血管內(nèi)皮細胞增殖MTT試驗結(jié)果

結(jié)果顯示，塔斯品堿各濃度組的OD值顯著低于空白對照組(p＜0.05)，抑制率有明顯的劑量依賴關(guān)系，顯示塔斯品堿明顯抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的增殖，半數(shù)抑制濃度(IC50)在0.55～0.60μg/mL的范圍內(nèi)。
2、塔斯品堿對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞遷移作用實驗取對數(shù)生長期的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞，用0.25％的胰酶消化3～5分鐘，吹打成均勻的單個細胞懸液后，血球計數(shù)板計數(shù)，并稀釋成濃度為2.5×104個/mL的單細胞懸液，每孔200μL平行接種于Transwell中，上層加入含塔斯品堿的培養(yǎng)基，終濃度為0.1μg/mL、0.5μg/mL、0.9μg/mL，每個藥物濃度設(shè)5復(fù)孔，培養(yǎng)48小時后，倒置顯微鏡下每孔計10個視野的位于Transwell背面的細胞數(shù)，比較各濃度組與空白對照組血管內(nèi)皮細胞遷移的數(shù)量。試驗結(jié)果見表7。
表7 塔斯品堿抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞遷移作用結(jié)果表

*與陰性對照組比較，經(jīng)t檢驗，p＜0.05結(jié)果顯示，各濃度組遷移細胞數(shù)與對照組比較有顯著差異(p＜0.05)，塔斯品堿對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞遷移抑制率與塔斯品堿的濃度有明顯的劑量關(guān)系，表明塔斯品堿顯著抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞的遷移。
3、大鼠胸主動脈環(huán)血管生成試驗腹腔注射過劑量戊巴比妥鈉處死大鼠，切取主動脈，立即放入MCDB131無血清培養(yǎng)液中清洗，在解剖顯微鏡觀察下，用眼科手術(shù)剪輯鑷子小心的去除脈管外纖維性和脂肪性組織。切取1mm的動脈環(huán)，用MCDB131無血清培養(yǎng)液沖洗10次。將瓊脂培養(yǎng)圈放入100mm大小的培養(yǎng)皿中，每皿3個，使之與平皿的底部貼緊。瓊脂圈內(nèi)加入正在凝結(jié)的纖維蛋白溶液4滴，使凝成纖維蛋白膠。在瓊脂圈內(nèi)加滿正在凝結(jié)的纖維蛋白溶液，立即放入動脈環(huán)，使沉于底部正中部位。加入不同濃度塔斯品堿的MCDB131無血清培養(yǎng)液于培養(yǎng)皿中，各組濃度為0.10μg/mL、0.50μg/mL、0.90μg/mL、1.30μg/mL，每天觀察新生血管數(shù)量，見圖1。記錄第7天的各濃度組的新生血管數(shù)量，與生理鹽水陰性對照組比較。試驗結(jié)果見表8。
表8 塔斯品堿抑制大鼠胸主動脈環(huán)血管生成實驗(第7天)表

*與陰性對照組比較，經(jīng)t檢驗，p＜0.05結(jié)果顯示，塔斯品堿各濃度組的新生血管數(shù)量顯著低于空白對照組，(p＜0.05)，有明顯的劑量依賴關(guān)系，顯示塔斯品堿明顯抑制體外培養(yǎng)的大鼠胸主動脈環(huán)的血管新生。
二、塔斯品堿抑制血管生成的體內(nèi)試驗雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗取受精雞蛋，經(jīng)新潔爾滅液消毒后，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)。孵蛋第6～7天，制備假氣室，并暴露尿囊膜，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1天后，以生理鹽水為陰性對照，加入不同濃度的塔斯品堿，繼續(xù)培養(yǎng)3天，然后由觀察窗加入甲醇∶丙酮為1∶1的固定液預(yù)固定15分鐘，去掉雞胚，取下尿囊膜并與蛋皮分離，完成后固定，將尿囊膜平鋪在載波片上，顯微鏡下觀察計血管數(shù)。試驗結(jié)果見表9。
表9 雞胚絨毛尿囊膜血管生成實驗結(jié)果表

*與陰性對照組比較，經(jīng)t檢驗，p＜0.05結(jié)果顯示，塔斯品堿各組微血管數(shù)與陰性對照組比較，有顯著性差異(p＜0.05)，隨著給藥濃度的增加，微血管數(shù)減小，抑制率增大，表明塔斯品堿對雞胚絨毛尿囊膜血管生成有明顯的抑制作用。
三、塔斯品堿抑制腫瘤作用試驗取接種6～8天的小鼠肉瘤S180瘤源小鼠，頸椎脫臼致死，消毒后剪開并剝?nèi)テつw，用無菌注射器穿過腹壁肌層抽取腹水，放入無菌小瓶。按1∶2～1∶4加入無菌生理鹽水，將腹水加以稀釋。接種時吸取腫瘤細胞稀釋液于注射器，刺入小鼠腋下皮下組織，注入懸液0.2mL，接種24小時后將小鼠編號，并隨機分為6組，每組12只。環(huán)磷酰胺組各鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺25mg·kg-1，塔斯品堿各組各鼠腹腔注射10mg/kg、1mg/kg、0.1mg/kg，每天1次，連續(xù)10天。陰性對照組各鼠以相同途徑給予相應(yīng)量的生理鹽水。給藥期間注意觀察小鼠有無排稀便、拒食等現(xiàn)象。
療程結(jié)束后之次日，將各組小鼠逐個稱體重，拉斷脊椎處死，分別排列于磁盤中。逐只剝?nèi)∧[瘤，稱記瘤重，并檢查腫瘤有無壞死、感染等情況。如陰性對照組小鼠的平均瘤重大于1g，或80％以上小鼠的瘤重大于0.4g，表示該次實驗?zāi)[瘤生長正常，可計算藥物的腫瘤抑制率。
腫瘤抑制率(％)＝(C-T)/C×100％式中C為陰性對照組平均瘤重，T為實驗組平均瘤重。
試驗結(jié)果見表10。
表10 塔斯品堿抑制小鼠肉瘤S180作用試驗結(jié)果表

*與陰性對照組比較，經(jīng)t檢驗，p＜0.05結(jié)果顯示，塔斯品堿各組的平均瘤重均小于陰性對照組，塔斯品堿大劑量組平均瘤重與陰性對照組比較，有顯著性差異(p＜0.05)，隨著給藥濃度的增加，抑瘤率增大，表明塔斯品堿對小鼠肉瘤S180有明顯的治療作用。
權(quán)利要求
1.一種塔斯品堿的制備方法，其特征在于它包括下列步驟(1)配置溶解液按常規(guī)方法配置濃度為0.5～2％的鹽酸溶液，作為溶解液；(2)溶解紅毛七總堿取紅毛七總堿裝入反應(yīng)釜內(nèi)，加入紅毛七總堿重量10～12倍濃度為0.5～2％的鹽酸溶液，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液；(3)吸附分離將步驟(2)制備的紅毛七總堿溶液上紅毛七總堿1倍重量的樹脂柱，柱徑與柱高比為1∶3，吸附流速為每小時1.0～1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離；(4)配置洗脫液將氨水與甲醇按體積比為2∶98配制成洗脫液；(5)洗脫將步驟4配置的洗脫液20倍柱體積以流速為每小時0.5～0.6倍柱體積洗脫，按每倍柱體積分別收集洗脫液；(6)減壓濃縮合并3～10倍柱體積洗脫液，45℃、0.08MPa減壓濃縮至不含洗脫液，得分離物；(7)重結(jié)晶先進行結(jié)晶，將步驟6制備的分離物放入容器內(nèi)，加入分離物20倍量的甲醇，80℃加熱溶解，趁熱抽濾，室溫靜置24小時，再進行抽濾，得塔斯品堿粗品；按上述方法重結(jié)晶，置于干燥器中，110℃、烘1小時，得塔斯品堿純品；(8)按塔斯品堿的質(zhì)量標準進行檢驗，檢驗合格后包裝入庫。
2.按照權(quán)利要求1所述的塔斯品堿的制備方法，其特征在于所用溶解液其中是濃度為1.0～1.5的鹽酸溶液。
3.按照權(quán)利要求1所述的塔斯品堿的制備方法，其特征在于所用溶解液其中是濃度為1.0的鹽酸溶液，在溶解紅毛七總堿的工藝步驟中，其中加入與紅毛七總堿重量比為10倍濃度為1.0％的鹽酸溶液，用攪拌機攪拌使其充分溶解，制成紅毛七總堿溶液，在吸附工藝步驟中，其中吸附流速為每小時1.2倍柱體積，在常溫常壓下進行吸附分離。
4.按照權(quán)利要求1所述的塔斯品堿的制備方法，其特征在于所說的樹脂柱為陽離子交換樹脂柱。
5.按照權(quán)利要求4所述的塔斯品堿的制備方法，其特征在于所說的陽離子交換樹脂柱為LSD001型陽離子交換樹脂柱。
6.塔斯品堿制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。
7.按照權(quán)利要求6所述的治療腫瘤的藥物，含有治療有效量的塔斯品堿重量比為0.1～99.5％的活性成分和一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
8.按照權(quán)利要求7所述的治療腫瘤的藥物，其特征在于其中含有塔斯品堿重量比為0.5～95％的活性成分。
全文摘要
一種塔斯品堿的制備方法以及在制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用，塔斯品堿的制備方法包括步驟配置溶解液、溶解紅毛七總堿、吸附分離、配置洗脫液、洗脫、減壓濃縮、重結(jié)晶、檢驗步驟。塔斯品堿制備治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。塔斯品堿制備方法具有工藝步驟簡單、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，可進行中間放大試驗。塔斯品堿經(jīng)體外試驗和體內(nèi)試驗，試驗結(jié)果表明塔斯品堿有抑制血管生成的作用，明顯抑制血管內(nèi)皮細胞增殖，抑制血管內(nèi)皮細胞遷移，抑制主動脈環(huán)血管生成，并抑制雞胚尿囊膜血管生成。通過體外及體內(nèi)試驗表明塔斯品堿抑制血管生成的多個過程，而顯示明顯的抑制血管生成的藥理作用及治療腫瘤的作用。
文檔編號A61P35/00GK1800187SQ20061004166
公開日2006年7月12日 申請日期2006年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月13日
發(fā)明者賀浪沖, 李義平, 盧聞, 張彥民, 張健, 何強, 杜娟, 吳嬌芬 申請人:賀浪沖