專利名稱：一種仿生肝組織工程支架與接口及其成形工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種仿生肝組織工程支架及其制造工藝，特別涉及一種可生物降解的、模擬自然肝臟結(jié)構(gòu)的仿生肝組織工程支架與接口，以及采用單層壓印結(jié)合冷凍干燥致孔與層疊組裝的集成化成形工藝。
背景技術(shù)：
肝臟移植是治療各種慢性肝病的最有效的手段，然而供體的匱乏一直制約著肝臟移植。組織工程為體外培養(yǎng)活體肝臟提供了可能，它有望恢復(fù)人體肝臟更多的生化功能。然而肝組織工程對(duì)支架結(jié)構(gòu)有特定的要求支架內(nèi)應(yīng)存在三種形態(tài)的微觀結(jié)構(gòu)——光滑的微管道、孔洞及二者之間的半透孔隙。微管供內(nèi)皮細(xì)胞貼壁生長形成血管(血竇)，孔洞供肝細(xì)胞聚團(tuán)生長形成肝細(xì)胞索，半透孔隙是尺度更小的微觀結(jié)構(gòu)，其大小應(yīng)使?fàn)I養(yǎng)液通過，但對(duì)血漿細(xì)胞有阻隔作用。因此，如何制造這種獨(dú)特結(jié)構(gòu)的支架成為肝組織工程的關(guān)鍵問題之一。
傳統(tǒng)的支架制造方法包括相分離法、冷凍法、致孔劑析孔法和發(fā)泡法等。但這些工藝可控性差，難以構(gòu)建結(jié)構(gòu)復(fù)雜、供多細(xì)胞生長的支架微觀結(jié)構(gòu)，更重要的是無法實(shí)現(xiàn)多種細(xì)胞在支架內(nèi)的有序分布。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服傳統(tǒng)制造方法存在的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于提供一種仿生肝組織工程支架與接口及其成形工藝。
本發(fā)明的目的通過以下的具體措施(工藝)達(dá)到一種仿生肝組織工程支架與接口，其特征在于該仿生肝組織工程支架與接口的外形為圓柱狀，由支架主體和接口以及密封套組成；其中
支架主體模擬自然肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)，包括門靜脈和中央靜脈；沿中央靜脈周圍至門靜脈之間均勻排列有多層肝細(xì)胞微管和內(nèi)皮細(xì)胞微管，肝細(xì)胞微管和內(nèi)皮細(xì)胞微管之間由含有孔隙的生物可降解材料隔離，孔隙具有半透膜的作用；接口的輸入端和輸出端布置在圓柱的兩端，用于與生物反應(yīng)器連接；或者布置在圓柱的同一端，以利于體內(nèi)植入；內(nèi)皮細(xì)胞微管接口兩端為管狀突起狀結(jié)構(gòu)，用于與血管或生物反應(yīng)器相連，其中，進(jìn)口端接口為仿門靜脈結(jié)構(gòu)，并由入口分為6個(gè)主流道；出口端接口采用仿中央靜脈的主流道接口。在支架主體一端的圓柱端面上，還分布有六個(gè)肝細(xì)胞灌注口。
支架主體和接口連為一體，安裝在密封套內(nèi)。
所述的密封套的材料為纖維蛋白凝膠或生物橡膠。
所述的生物可降解支架材料采用殼聚糖凝膠、蠶絲/膠原、殼聚糖/膠原、聚乳酸或聚乳酸-聚羥基乙酸，與抗凝血?jiǎng)┗旌?，其混合比例?∶1～2∶1。
上述仿生肝組織工程支架與接口的制造工藝，其特征在于包括下列步驟1)首先設(shè)計(jì)支架微流道和接口立體結(jié)構(gòu)及單層結(jié)構(gòu)；并根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)果，利用快速成型或微雕刻或精密加工制造壓印模具，其中肝細(xì)胞微流道直徑在0.1～0.5 mm之間，內(nèi)皮細(xì)胞微流道直徑在0.3～1 mm之間；2)在模具上涂覆混合有抗凝血?jiǎng)┑纳锟山到庵Ъ懿牧掀渖锟山到庵Ъ懿牧峡鼓獎(jiǎng)┑幕旌媳壤秊?∶1～2∶1，然后快速凍干，冷凍干燥致孔得到的孔隙尺寸在10微米～200微米之間；3)冷凍干燥致孔后脫模，然后采用生物粘結(jié)劑將支架逐層粘結(jié)組裝起來；4)支架接口采用單層壓印、層疊粘結(jié)制造，或采用整體澆注成形，即可得到仿生肝組織工程支架與接口；5)支架與接口表面包裹一層防止支架滲血的密封材料。
本發(fā)明的仿生肝組織工程支架與接口，采用壓印工藝制造單層內(nèi)皮細(xì)胞微管道和肝細(xì)胞微管道，采用冷凍干燥致孔形成孔隙，采用層疊粘結(jié)工藝形成立體支架。支架接口既可以采用單層壓印、多層粘結(jié)制造，也可以采用整體澆注成形。
本創(chuàng)新技術(shù)與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)1.模擬自然肝臟的肝支架有利于支架降解向自然肝臟的轉(zhuǎn)變。
2.采用了先進(jìn)成型方法與傳統(tǒng)指控工藝相結(jié)合，既能保證支架內(nèi)部的導(dǎo)通，又能提高支架的孔隙率，采用的層疊粘結(jié)方法能較方便地形成立體支架。
3.充分考慮了支架的接口結(jié)構(gòu)，有利于體內(nèi)植入及生物反應(yīng)器培養(yǎng)。


圖1是本發(fā)明的仿生支架與接口的基本結(jié)構(gòu)圖；其中圖(a)是主視圖，(b)是圖(a)的A-A剖視圖，(c)是圖(a)的B-B剖視圖，(d)是圖(a)的C-C剖視放大圖；圖2仿生支架與接口的制造工藝流程圖，其中圖2(a)是設(shè)計(jì)與加工壓模圖，圖2(b)是涂覆支架材料圖，圖2(c)是下壓合模圖，圖2(d)是冷凍干燥致孔圖，圖2(e)是脫模圖，圖2(f)是逐層定位、粘結(jié)圖，圖2(g)是包裹密封套圖，圖2(h)是復(fù)合肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、靜態(tài)培養(yǎng)圖，圖2(i)是植入體內(nèi)、或生物反應(yīng)器培養(yǎng)圖。
下面將結(jié)合附圖對(duì)本支架的結(jié)構(gòu)及工藝流程加以詳述。
具體實(shí)施例方式
圖1是仿生支架與接口的基本結(jié)構(gòu)圖。該支架與接口模擬自然肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)，支架具有獨(dú)立的模擬肝小葉結(jié)構(gòu)的兩套微觀管路系統(tǒng)，并分別與兩端的接口連接，分別用于內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞生長的微流道結(jié)構(gòu)；兩套管路之間并不導(dǎo)通，但通過支架材料進(jìn)行滲透，可進(jìn)行物質(zhì)交流。兩端的接口分別可用于灌注肝細(xì)胞及與血管或營養(yǎng)液輸送管相連。具體結(jié)構(gòu)詳述如下。
如圖1(a)所示該仿生肝組織工程支架與接口的外形為圓柱狀，由支架主體和接口(包括密封套)組成。其中，如圖1(d)C-C剖視圖所示支架主體模擬自然肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)，包括門靜脈和中央靜脈，沿中央靜脈周圍至門靜脈之間均勻排列有多層肝細(xì)胞微管和內(nèi)皮細(xì)胞微管，這兩套微管之間由含有更小孔隙的可降解材料隔離，孔隙具有半透膜的作用。接口的輸入端和輸出端布置在圓柱的兩端，以利于與生物反應(yīng)器連接；也可以布置在圓柱的同一端，以利于體內(nèi)植入。如圖1(b)A-A剖示圖所示內(nèi)皮細(xì)胞微管接口兩端設(shè)計(jì)成管狀突起狀結(jié)構(gòu)，便于與血管或生物反應(yīng)器相連，其中進(jìn)口端接口采用仿門靜脈結(jié)構(gòu)，由進(jìn)口分流為若干個(gè)主流道(主流道的數(shù)量可以根據(jù)需要選擇，本實(shí)施例為6個(gè)，用于體外培養(yǎng)時(shí)可與生物反應(yīng)器循環(huán)系統(tǒng)接口相連，用于體內(nèi)植入時(shí)可與上腔靜脈相連；出口端接口采用仿中央靜脈的主流道接口，用于體外培養(yǎng)時(shí)可與生物反應(yīng)器循環(huán)系統(tǒng)接口相連，用于體內(nèi)植入時(shí)可與下腔靜脈相連。此外，如圖1(c)B-B剖示圖所示，還設(shè)有若干個(gè)(本實(shí)施例為6個(gè))肝細(xì)胞灌注口，灌注口的數(shù)量可以根據(jù)實(shí)際需要選擇，灌注完成時(shí)，灌注口須密封，如纖維蛋白凝膠。整個(gè)結(jié)構(gòu)安裝在密封套內(nèi)，密封套材料可以采用纖維蛋白凝膠或生物橡膠。
該仿生支架具有分別用于肝細(xì)胞灌注和內(nèi)皮細(xì)胞生長的兩套相互獨(dú)立的微觀通道結(jié)構(gòu)，可用于體內(nèi)植入或體外生物反應(yīng)器培養(yǎng)。
圖2是該支架及接口的制造過程圖。制造工藝的核心是采取單層壓印、冷凍干燥和層疊組裝相結(jié)合的集成工藝方法。其中，單層壓印的作用是制造微流道結(jié)構(gòu)；冷凍干燥致孔是為了形成孔隙，進(jìn)一步提高其孔隙率，以利于肝細(xì)胞的長入，為肝細(xì)胞的劇團(tuán)生長提供更加廣闊的孔洞，并使材料具有一定的半透膜作用；層疊粘結(jié)的目的則是為了形成立體化的肝支架。
具體工藝結(jié)合附圖2說明如下(1)圖2(a)是設(shè)計(jì)與加工壓模圖。即首先利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)(CAD)軟件(如PROE、UG等)設(shè)計(jì)支架微流道和接口立體結(jié)構(gòu)，支架結(jié)構(gòu)如圖2所示，其中肝細(xì)胞微流道直徑約在0.1～0.5mm之間，內(nèi)皮細(xì)胞微流道直徑在0.3～1mm之間；其次分解成單層結(jié)構(gòu)；然后設(shè)計(jì)出壓模的形狀；最后采用微雕刻機(jī)或快速成型機(jī)或精密切削機(jī)床加工出壓模。
(2)圖2(b)是涂覆支架材料圖。支架材料采用殼聚糖凝膠、或蠶絲/膠原、或殼聚糖/膠原、或聚乳酸、或聚乳酸-聚羥基乙酸等材料，可與其溶液混合后涂敷，并與抗凝血?jiǎng)┗旌?。生物可降解材料和抗凝血?jiǎng)┑幕旌媳壤秊?∶1～2∶1，可采用的抗凝血?jiǎng)┯袡幟仕徕c，濃度為3.8％；肝素，大約每ml血需要40單位的肝素；EDTA鉀，濃度在0.4％。
(3)圖2(c)是下壓合模圖。將預(yù)先制好的壓模壓在支架材料上，壓制時(shí)應(yīng)保證接觸均勻。實(shí)際上應(yīng)根據(jù)溶液的粘稠程度決定壓模的方位，如果溶液較稀，可將壓模水平放置微流道特征朝上，然后將溶液直接涂覆在模具上即可；反之若溶液較稠，則必須線將溶液涂覆在基板上，通過下壓力才能保證材料充滿模具。
圖2(d)是冷凍干燥致孔圖。將模具與涂覆的材料放入冷凍干燥機(jī)中，溫度可根據(jù)孔隙大小要求確定，10℃～-80℃的范圍均可以選擇，如孔隙要求較大，則冷凍溫度較高。冷凍干燥致孔得到的孔隙尺寸在10微米～200微米之間，其中，以150微米為宜。
圖2(e)是脫模圖。脫模時(shí)，應(yīng)仔細(xì)剝離，避免脫模時(shí)損壞單層流道結(jié)構(gòu)。為方便脫模，也可以硬模具通過翻制成硅橡膠軟模具，以利于脫模。
圖2(f)是逐層定位、粘結(jié)圖。將各層制備好的單層支架與接口層逐層粘結(jié)起來，粘結(jié)時(shí)應(yīng)保證各層流道對(duì)準(zhǔn)。實(shí)際上殼聚糖本身就可以作為良好的粘結(jié)劑。有些生物材料遇水后也有一定的粘結(jié)性能，因此也可以采用蒸餾水作為粘結(jié)劑。
圖2(g)是包裹密封套圖。為防止支架滲血或泄露營養(yǎng)液，植入前表面包裹一層密封套材料(如纖維蛋白凝膠或生物橡膠等)。密封材料可采用纖維蛋白凝膠、生物橡膠或人造血管密封，但人造血管不可降解。
圖2(h)是復(fù)合肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞、靜態(tài)培養(yǎng)圖。在制作好的支架內(nèi)分別灌注肝細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞(包括生長因子)，然后作體外短暫靜態(tài)培養(yǎng)。
圖2(i)是植入體內(nèi)、或生物反應(yīng)器培養(yǎng)圖。最后可植入體內(nèi)或用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)。體內(nèi)植入時(shí)支架輸入端和輸出端須分別與門靜脈和下腔靜脈縫合或粘結(jié)。
權(quán)利要求
1.一種仿生肝組織工程支架與接口，其特征在于該仿生肝組織工程支架與接口的外形為圓柱狀，由支架主體和接口以及密封套組成；其中支架主體模擬自然肝臟的肝小葉結(jié)構(gòu)，包括門靜脈和中央靜脈；沿中央靜脈周圍至門靜脈之間均勻排列有多層肝細(xì)胞微管和內(nèi)皮細(xì)胞微管，肝細(xì)胞微管和內(nèi)皮細(xì)胞微管之間由含有孔隙的生物可降解材料隔離，孔隙具有半透膜的作用；接口的輸入端和輸出端布置在圓柱的兩端，用于與生物反應(yīng)器連接；或者布置在圓柱的同一端，以利于體內(nèi)植入；內(nèi)皮細(xì)胞微管接口兩端為管狀突起狀結(jié)構(gòu)，用于與血管或生物反應(yīng)器相連，其中，進(jìn)口端接口為仿門靜脈結(jié)構(gòu)，并由入口分為6個(gè)主流道；出口端接口采用仿中央靜脈的主流道接口，在支架主體一端的圓柱端面上，還分布有六個(gè)肝細(xì)胞灌注口。支架主體和接口連為一體，安裝在密封套內(nèi)。
2.如權(quán)利要求1所述的仿生肝組織工程支架與接口，其特征在于，所述的密封套的材料為纖維蛋白凝膠或生物橡膠。
3.如權(quán)利要求1所述的仿生肝組織工程支架與接口，其特征在于，所述的生物可降解支架材料采用殼聚糖凝膠、蠶絲/膠原、殼聚糖/膠原、聚乳酸或聚乳酸-聚羥基乙酸，與抗凝血?jiǎng)┗旌?，其混合比例?∶1～2∶1。
4.實(shí)現(xiàn)權(quán)利要求1所述的仿生肝組織工程支架與接口的制造工藝，其特征在于包括下列步驟1)首先設(shè)計(jì)支架微流道和接口立體結(jié)構(gòu)及單層結(jié)構(gòu)；并根據(jù)設(shè)計(jì)結(jié)果，利用快速成型或微雕刻或精密加工制造壓印模具，其中肝細(xì)胞微流道直徑在0.1～0.5mm之間，內(nèi)皮細(xì)胞微流道直徑在0.3～1mm之間；2)在模具上涂覆混合有抗凝血?jiǎng)┑纳锟山到庵Ъ懿牧掀渖锟山到庵Ъ懿牧峡鼓獎(jiǎng)┑幕旌媳壤秊?∶1～2∶1，然后快速凍干，冷凍干燥致孔得到的孔隙尺寸在10微米～200微米之間；3)冷凍干燥致孔后脫模，然后采用生物粘結(jié)劑將支架逐層粘結(jié)組裝起來；4)支架接口采用單層壓印、層疊粘結(jié)制造，或采用整體澆注成形，即可得到仿生肝組織工程支架與接口；5)支架與接口表面包裹一層防止支架滲血的密封材料。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的密封材料為纖維蛋白凝膠或生物橡膠。
6.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述的生物可降解支架材料采用殼聚糖凝膠、蠶絲/膠原、殼聚糖/膠原、聚乳酸或聚乳酸-聚羥基乙酸，與抗凝血?jiǎng)┗旌?，其混合比例?∶1～2∶1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種新的仿生肝組織工程支架與接口及其成形工藝，其主要內(nèi)容是仿照自然肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)了一種肝組織工程支架，支架內(nèi)部為肝細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞設(shè)置了兩組獨(dú)立的微管道結(jié)構(gòu)及接口。其中內(nèi)皮細(xì)胞微管接口可以與自然肝臟內(nèi)部的血管相連，或與生物反應(yīng)器的循環(huán)系統(tǒng)相連，肝細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)用于灌注肝細(xì)胞時(shí)加快肝細(xì)胞的擴(kuò)散。通過壓印方法制作單層流道與接口，之后通過冷凍干燥可進(jìn)一步形成兩種微管結(jié)構(gòu)之間的孔隙，從而提高材料的孔隙率并使其具有一定的半透膜作用，然后通過層疊粘結(jié)方法制造含有肝細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)和內(nèi)皮細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)的立體化支架與接口。
文檔編號(hào)A61B17/00GK1883420SQ20061004285
公開日2006年12月27日 申請(qǐng)日期2006年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2006年5月22日
發(fā)明者劉亞雄, 李滌塵, 賀健康, 盧秉恒 申請(qǐng)人:西安交通大學(xué)