本發(fā)明屬于仿生礦化材料及組織工程支架材料領域，涉及高分子聚電解質(zhì)誘導膠原纖維內(nèi)仿生鈣化的方法及其應用。

背景技術：

當今社會隨著人口老齡化、外傷、腫瘤等原因造成的骨組織缺損不斷增加，人們對植骨材料的需求也日益增多。在現(xiàn)有的骨替代材料中，自體骨、異體骨是常用的移植材料，但是它們普遍存在來源有限、手術操作復雜，免疫排斥、骨愈合時間長、愈合率低，耐受性差及并發(fā)癥多等問題，因此合成結構功能高度仿生的人工骨再生修復材料是解決這一問題的關鍵。

天然的骨組織主要由無機礦物質(zhì)(即磷酸鈣)、i型膠原和非膠原蛋白構成。其中i型膠原蛋白是脊椎動物骨、牙等硬組織中的主要有機基質(zhì)，具有來源廣泛、合成簡單、生物相容性良好、韌性較強等特點。而磷酸鈣因其可以作為生物活性劑、基因或各種生物分子的載體以及作為骨移植材料的無機礦物質(zhì)成分來源，在生物材料領域的應用前景極為廣泛。如何用仿生合成的方法，實現(xiàn)磷酸鈣在i型膠原纖維內(nèi)的有序沉積，恢復自然礦化單位中膠原分子與礦物質(zhì)從微觀水平到介觀水平再到宏觀水平分級有序的結合形式，從而達到優(yōu)良的機械性能，是該領域的研究熱點和難點，針對該問題的探索也必將為新一代的骨、牙等硬組織修復材料的研發(fā)提供全新的思路。

技術實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有骨缺損修復材料的缺陷或不足，本發(fā)明的目的在于提供兩種類型的高分子聚電解質(zhì)——聚陽離子和聚陰離子誘導膠原纖維內(nèi)仿生鈣化的方法；制備的高分子聚電解質(zhì)誘導膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料作為硬組織缺損修復材料的應用。

為此，本發(fā)明采取的技術方案包括：

高分子聚電解質(zhì)誘導膠原纖維內(nèi)仿生鈣化的方法，該方法包括：

將膠原支架在含有聚陽離子的磷酸鈣礦化液或者含有聚陰離子的磷酸鈣礦化液中進行處理，得到仿生鈣化膠原支架材料。

具體的，所述的含有聚陽離子的磷酸鈣礦化液為聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣溶液、聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣溶液或聚二烯丙基二甲基氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣溶液。

更具體的，所述的聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣溶液為將聚丙烯氯化銨按照200～800μg/ml的比例加入到磷酸鈣溶液中得到的溶液；

所述的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣溶液為按1.0％～5.0％體積分數(shù)的比例將聚乙烯亞胺與磷酸鈣溶液混合得到的溶液；

所述的聚二烯丙基二甲基氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣溶液為按2.5％～5.0％體積分數(shù)的比例將聚二烯丙基二甲基氯化銨與磷酸鈣溶液混合得到的溶液。

最好的，所述的聚陽離子的供體為聚丙烯氯化銨、聚乙烯亞胺或聚二烯丙基二甲基氯化銨；

聚丙烯氯化銨的分子量為150kda，聚乙烯亞胺的分子量為70kda，聚二烯丙基二甲基氯化銨的分子量為100kda。

具體的，所述的含有聚陰離子的磷酸鈣礦化液為聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣溶液、聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣溶液或聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣溶液。

更具體的，所述的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣溶液為按50～300μg/ml的比例將聚天冬氨酸鈉溶于磷酸鈣溶液中得到的溶液；

所述的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣溶液為按20～1000μg/ml的比例將聚丙烯酸溶于磷酸鈣溶液中得到的溶液；

所述的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣溶液為按20～1000μg/ml的比例將聚谷氨酸溶于磷酸鈣溶液中得到的溶液。

最好的，所述的聚陰離子的供體為聚天冬氨酸、聚丙烯酸或聚谷氨酸；

聚天冬氨酸的分子量為50kda，聚丙烯酸的分子量為450kda，聚谷氨酸的分子量為200kda。

任一所述的高分子聚電解質(zhì)誘導膠原纖維內(nèi)仿生鈣化的方法，其特征在于，所述的磷酸鈣礦化液為磷酸鈣溶液，磷酸鈣溶液為含有9mm的cacl2和4.2mm的k2hpo4的水溶液。

任一方法得到的高分子聚電解質(zhì)誘導膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料作為硬組織缺損修復材料的應用。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明所形成的纖維內(nèi)鈣化仿生膠原支架相比于其他骨修復材料具有明顯的優(yōu)越性，體現(xiàn)在：

(1)纖維內(nèi)的礦化模式更高程度的模擬了自然骨組織的礦化形式，顯著增強了膠原纖維的機械強度，并能夠為細胞生長提供更好的內(nèi)環(huán)境，是理想的骨缺損再生修復材料；

(2)材料中將磷酸鈣礦物質(zhì)成分整合入i型膠原纖維內(nèi)并在其中有序沉積，無定形磷酸鈣前體在纖維內(nèi)進一步轉換為羥基磷灰石晶體的特點綜合了膠原纖維的生物相容性、羥基磷灰石的骨傳導性及運載基因或各種生物分子的能力，并且在生物體內(nèi)具有適當?shù)慕到饽芰Γ?/p>

(3)納米羥基磷灰石的強吸附性，使得材料的可修飾性強，且不同的修飾位點及修飾機理有利于對材料實現(xiàn)多重功能化改性；

(4)與傳統(tǒng)礦化中膠原與礦物質(zhì)的無序混合不同，本發(fā)明中采用仿生礦化的方法，利用高分子聚電解質(zhì)對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定及引導作用，實現(xiàn)了膠原纖維內(nèi)部的有序礦化，模擬了自然骨組織膠原纖維與礦物質(zhì)有序排列的纖維內(nèi)礦化形式，而這種纖維內(nèi)礦化形式是構成自然骨組織7級分級結構的基礎，不僅決定了骨組織在納米尺度上的力學性能，更對其整體機械和生物學特性起著決定性作用。

附圖說明

圖1為實施例1構建的材料的鈣化膠原的透射電鏡圖；

其中，圖1(a)表示低倍(放大倍數(shù)為500nm)觀察下，整個膠原纖維束呈現(xiàn)高電子密度的狀態(tài)，無機礦物質(zhì)全部存在于膠原纖維內(nèi)部，膠原纖維周圍空間內(nèi)的很少；圖1(b)顯示高倍(放大倍數(shù)為200nm)觀察下，纖維內(nèi)礦物質(zhì)即羥基磷灰石晶體充實了膠原纖維內(nèi)部空隙，可見膠原纖維內(nèi)部羥基磷灰石晶體有序沉積所反映出的膠原纖維的規(guī)律性橫紋結構；

圖2為實施例1的膠原支架仿生鈣化處理前后的對比圖，其中，c表示鈣化前膠原支架；d表示濕潤后膠原支架體積有所增大，e表示經(jīng)實施例1的鈣化方法鈣化后的膠原支架的體積明顯增大；

圖3為分子動力學模擬觀察實施例1的膠原支架仿生鈣化過程中膠原纖維內(nèi)外的分子及離子變化情況；

圖4為實施例1的膠原支架仿生硅化處理前后的官能團變化示意圖；

圖5為實施例1聚陽離子誘導纖維內(nèi)鈣化前后膠原纖維內(nèi)、外環(huán)境中的離子變化示意圖；

圖6為將實施例1得到的成骨材料經(jīng)熱重分析表征鈣化膠原纖維的熱穩(wěn)定性和組份；

圖7為將實施例1得到的成骨材料經(jīng)分子動力學模擬觀察仿生鈣化過程中膠原纖維內(nèi)外的分子及離子變化情況；

圖8為將實施例1得到的成骨材料經(jīng)聚陽離子誘導纖維內(nèi)鈣化前后膠原纖維內(nèi)、外環(huán)境中的離子變化示意圖；

以下結合說明書附圖和具體實施方式對本發(fā)明做具體說明。

具體實施方式

本研究利用聚電解質(zhì)對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，穩(wěn)定并引導納米級的磷酸鈣無定形液相前體滲透進入i型膠原纖維內(nèi)，在纖維內(nèi)有序沉積并逐步轉化為磷灰石晶體，形成了仿生膠原纖維內(nèi)鈣化支架材料。該材料具有良好的機械性能、生物相容性以及適當?shù)纳矬w內(nèi)降解能力，是理想的骨缺損再生修復材料。此外，由于此前該領域內(nèi)的研究均采用陰離子聚電解質(zhì)進行仿生礦化的探索，本研究創(chuàng)造性地實現(xiàn)了利用陽離子聚電解質(zhì)(聚丙烯氯化銨、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨)誘導纖維內(nèi)鈣化，并據(jù)此提出了在膠原纖維內(nèi)、外環(huán)境中維持滲透壓和電荷雙平衡以促進纖維內(nèi)礦化的新機制，顛覆了傳統(tǒng)上認為庫倫引力是誘導纖維內(nèi)礦化的唯一機制的認識，極大地豐富了生物礦化的理論系統(tǒng)，在生物礦化機制研究領域中具有重要里程碑式的作用。

天然骨的礦化過程存在三個關鍵的要素：膠原纖維，無定形礦物質(zhì)前體，非膠原蛋白。其中，非膠原蛋白調(diào)控的纖維內(nèi)礦化決定了骨組織優(yōu)異的力學特性和生物學特征，理解其中的機理并模擬這一過程成為仿生礦化的關鍵一步。

常見的非膠原蛋白有dspp(牙本質(zhì)涎磷蛋白)，dmp-1(成牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白),bsp(骨涎蛋白),骨鈣素，骨形態(tài)發(fā)生蛋白2，骨橋蛋白等，這些蛋白的共同特點是富含谷氨酸、天冬氨酸，因此存在大量羧基，此外這些蛋白上的絲氨酸經(jīng)磷酸化作用后生成磷酸絲氨酸，進一步增強了非膠原蛋白的陰離子特性。而此前已經(jīng)有研究證實膠原纖維的周期性結構(稱為d周期)中存在abcde5類條帶，其中位于孔區(qū)的a帶和c帶具有明顯的正電荷。因此形成了目前在國際上關于纖維內(nèi)礦化機制的研究中占主導地位的正負電荷相吸的庫倫引力理論，即帶負電荷的礦化前體會與帶正電荷的膠原位點間相互吸引，構成了纖維內(nèi)礦化形成的動力?；谶@一理論，幾乎所有的體外研究都使用富含羧基的酸性聚電解質(zhì)來模擬非膠原蛋白的功能，并集中于聚陰離子誘導的纖維內(nèi)礦化上。

本發(fā)明在國際上首次發(fā)現(xiàn)聚陽離子也可以穩(wěn)定鈣磷溶液形成帶正電荷的礦化前體，并成功誘導了聚陽離子穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液對膠原纖維的纖維內(nèi)礦化。所合成的纖維內(nèi)鈣化膠原支架材料以膠原纖維為支架材料，納米級的羥基磷灰石晶體在膠原纖維內(nèi)有序排列，羥基磷灰石晶體對膠原起增強作用，膠原對羥基磷灰石晶體起增韌作用，由此賦予材料良好的力學性能。此外，膠原纖維模擬了活體內(nèi)細胞外基質(zhì)的重要構成骨架，具有良好的生物相容性；而羥基磷灰石屬于多孔性網(wǎng)狀結構，具有天然的孔隙及孔隙率，為新生骨樣組織的長入和各種營養(yǎng)物質(zhì)的輸入提供了場所，同時也為誘導新骨生成的物質(zhì)提供所需空間，具有優(yōu)異的生物穩(wěn)定性和生物功能性。這種合成速度快、免疫原性低、機械強度好、生物活性高的多分級仿生礦化骨替代材料為骨缺損的修復提供了更好的解決途徑，具有傳統(tǒng)骨替代材料無法比擬的優(yōu)越性。

此外，本發(fā)明進一步通過改良的液相色譜法、分子動力學模擬和液相原子力顯微鏡技術反復推導、驗證，提出了基于滲透壓和電荷雙平衡(即gibbs-donnan平衡)的纖維內(nèi)仿生礦化理論。這一新理論的提出顛覆了傳統(tǒng)上認為庫倫引力是形成纖維內(nèi)礦化的唯一機制的認識，極大地豐富了生物礦化機制的理論基礎。

以下是發(fā)明人提供的具體實施例，以對本發(fā)明的技術方案作進一步解釋說明。

實施例1：

(1)以10mmhepes緩沖液為溶劑分別制備9mmcacl2·2h2o溶液及4.2mmk2hpo4溶液，將上述溶液等容混合，制得磷酸鈣溶液(終濃度：4.5mmcacl2·2h2o/2.1mmk2hpo4)；

(2)按200ug/ml的比例將聚丙烯氯化銨(平均分子量150kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚丙烯氯化銨對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液。

(3)將膠原海綿或是完全脫礦的骨膠原基質(zhì)置于聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

按照實施例1所述，本發(fā)明所構建新型仿生鈣化膠原支架材料具有以下特點：

如圖1所示，通過tem觀察發(fā)現(xiàn)，實施例1構建的聚陽離子誘導的纖維內(nèi)仿生鈣化膠原支架材料實現(xiàn)了羥基磷灰石晶體在膠原纖維內(nèi)部有序沉積及膠原纖維內(nèi)部的完全礦化。

如圖2所示，未經(jīng)鈣化處理的重組膠原海綿干燥情況下塌陷明顯(圖2c)，濕潤后體積有所增加(圖2d)，仿生鈣化處理后，由于無機礦物質(zhì)含量的大量增加，體積明顯增大，硬度及彈性明顯增加(圖2e)。

如圖3所示，仿生鈣化處理后重組膠原海綿的microct重建圖像可見支架內(nèi)外得到了均勻一致的鈣化。

如圖4所示，傅里葉紅外光譜觀察膠原鈣化前后官能團的變化，仿生鈣化處理后，在960cm^-1、1020cm^-1處出現(xiàn)了羥基磷灰石晶體中磷酸根離子的伸縮振動峰，560cm^-1、602cm^-1處出現(xiàn)的吸收峰代表羥基磷灰石o-p-o鍵的彎曲振動，873cm^-1、1413cm^-1處出現(xiàn)的吸收峰表示羥基磷灰石晶體內(nèi)c-o鍵的伸縮、彎曲振動。以上峰型互為補充，綜合說明鈣化后的膠原纖維內(nèi)存在著羥基磷灰石晶體的官能團。

如圖5所示，廣角x射線衍射檢測發(fā)現(xiàn)膠原纖維鈣化后出現(xiàn)了礦物質(zhì)晶體的衍射峰，在衍射角(2θ)＝25.86°、31.5°、32.2°、32.8°、34.0°、39.5°、46.6°處出現(xiàn)的002、211、112、300、202、310、222特征性衍射峰表明纖維內(nèi)礦物質(zhì)的主要形式為羥基磷灰石(ca5(po4)3(oh))。

如圖6所示，通過熱重分析表征鈣化膠原纖維的熱穩(wěn)定性和組份。由質(zhì)量保留曲線和微分質(zhì)量保留曲線可見鈣化膠原纖維加熱過程中主要出現(xiàn)了五個熱峰：15～200℃時物理吸附于膠原纖維上的水分子分解；250℃時與膠原連接較為松散的水分子分解；336℃時緊密連接在膠原上的水分子分解；478℃時膠原有機質(zhì)降解；580℃時膠原纖維內(nèi)的無定形磷酸鈣開始轉化為磷酸八鈣和羥基磷灰石并逐漸達到穩(wěn)定的平臺期，此時質(zhì)量保留率為64.6％，即鈣化后的膠原纖維礦物質(zhì)含量達64.6％。

表1不同分子量的化合物進入膠原纖維內(nèi)的體積分數(shù)

如表1所示，膠原纖維自身具有選擇性滲透的功能，分子量大于40kda的粒子會被完全排斥在膠原分子外，分子量小于6kda的粒子可以自由通過膠原纖維內(nèi)的任何空間，而介于二者之間的粒子則可以部分進入膠原纖維內(nèi)部。這構成了纖維內(nèi)礦化的尺寸排斥假說。為了證實這一假說適用于高分子陽離子聚電解質(zhì)(如聚丙烯氯化銨、聚乙烯亞胺、聚二烯丙基二甲基氯化銨)介導的纖維內(nèi)鈣化并探索可以自由通過膠原纖維內(nèi)的低聚電解質(zhì)會對這一過程產(chǎn)生的影響，我們使用改良的尺寸排阻色譜法，以二甲基亞砜(dmso，分子量78da)為低分子量對照，以牛血清白蛋白(bsa，分子量66kda)為高分子量對照，以脫礦骨粉為固定相，測定不同分子量的物質(zhì)可以進入膠原纖維分子內(nèi)部的體積百分數(shù)。在表1中，低分子量的二甲基亞砜可以自由通過固定相——骨粉膠原分子內(nèi)的任何區(qū)域，其洗脫體積即代表了膠原纖維分子內(nèi)的總體積(100％)；而高分子量的牛血清白蛋白(洗脫體積分數(shù)0.33％)則基本上全部被排斥在膠原纖維外，由于不用穿過膠原纖維，這部分流動相的洗脫圖會更早的出現(xiàn)。因此，含有不同尺寸分子的混合液體(如聚天冬氨酸+檸檬酸、聚丙烯氯化銨+精胺)的洗脫圖會出現(xiàn)與分子量相對應的兩個洗脫峰。根據(jù)上述理論，檢測出聚天冬氨酸分子可以進入膠原纖維分子內(nèi)的體積分數(shù)為32.67％，聚丙烯氯化銨為50.50％；精胺為98.64％；檸檬酸為99.34％；聚天冬氨酸+檸檬酸混合液體可以進入膠原纖維分子內(nèi)的體積分數(shù)分別為33.33％和99.17％，聚丙烯氯化銨+精胺則分別為49.67％和99.83％。

如圖7所示，分子動力學模擬觀察仿生鈣化過程中膠原纖維內(nèi)外的分子及離子變化情況，纖維內(nèi)的水分子不斷被納米級的無定形磷酸鈣前體取代，表現(xiàn)為鈣離子含量的持續(xù)增加和水分子、鈉離子、氯離子含量的持續(xù)減少(圖a、b、c)。均方根偏差法(rmsd)(圖d)分析結果顯示，膠原支架上原子的位置隨著動力學模擬時間的增加明顯偏離初始位置，表明膠原分子出現(xiàn)收縮；溶劑可及表面積(sasa)(圖e)測試顯示在陽離子/陰離子聚電解質(zhì)穩(wěn)定的礦化體系中，膠原分子的溶劑可及表面積分別降低了0.99％和1.16％，從另一個側面證實了隨著水分子從纖維內(nèi)大量遷出，膠原結構出現(xiàn)收縮，為納米級的無定形磷酸鈣前體滲透進入纖維內(nèi)提供了所需的空間。

如圖8所示，聚陽離子誘導纖維內(nèi)鈣化前后膠原纖維內(nèi)、外環(huán)境中的離子變化示意圖，據(jù)此提出了基于滲透壓和電荷雙平衡(即gibbs-donnan平衡)的纖維內(nèi)仿生礦化新機制：1.由于高分子量的陽離子聚電解質(zhì)不能全部滲入膠原纖維內(nèi)的空間里(如表1所示)，有一部分的聚電解質(zhì)存在于膠原纖維外，這部分電解質(zhì)本身攜帶正電荷，因此會在其周圍吸引負價離子并排斥正價離子，使膠原纖維外陽離子濃度降低。2.大量陽離子(如鈉離子)(圖a)會從纖維內(nèi)擴散至纖維外以降低膠原內(nèi)、外離子的濃度梯度差，大量正價離子的遷入使纖維外環(huán)境的電勢能升高，為了維持纖維內(nèi)、外的電勢能平衡，大量陰離子(如氯離子)(圖b)隨后擴散到纖維外環(huán)境中。3.陰、陽離子的遷入造成了纖維外環(huán)境中的離子濃度劇烈增加，滲透壓升高，為了維持纖維內(nèi)、外環(huán)境的滲透平衡，纖維內(nèi)的水分子隨之擴散至纖維外(圖c)。4.纖維內(nèi)的空間由于大量水分子、離子的遷出而形成負壓環(huán)境，促使具有流體性質(zhì)的磷酸鈣納米前體滲透進入纖維內(nèi)(圖d)，隨著磷酸鈣納米前體在纖維內(nèi)的有序沉積并發(fā)生一系列的相轉換，最終形成了纖維內(nèi)鈣化。

實施例2：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按400μg/ml的比例將聚丙烯氯化銨(平均分子量150kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚丙烯氯化銨對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液。

(3)將完全脫礦的骨膠原置于聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育14天，每天更換新鮮的聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化骨膠原支架材料。

實施例3：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按800μg/ml的比例將聚丙烯氯化銨(平均分子量150kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚丙烯氯化銨對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的無定型液相磷酸鈣前體溶液。

(3)將完全脫礦的骨膠原置于聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育14天，每天更換新鮮的聚丙烯氯化銨穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化骨膠原支架材料。

實施例4：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按1.44％體積分數(shù)的比例將高分子量的聚乙烯亞胺(平均分子量70kda)粘稠液體與磷酸鈣溶液混合，利用聚乙烯亞胺對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例5：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按4.32％體積分數(shù)的比例將高分子量的聚乙烯亞胺(平均分子量70kda)粘稠液體與磷酸鈣溶液混合，利用聚乙烯亞胺對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例6：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按2.5％體積分數(shù)的比例將聚二烯丙基二甲基氯化銨(平均分子量100kda)與磷酸鈣溶液混合，利用聚乙烯亞胺對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例7：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按5％體積分數(shù)的比例將聚二烯丙基二甲基氯化銨(平均分子量100kda)與磷酸鈣溶液混合，利用聚乙烯亞胺對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚乙烯亞胺穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例8：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按75μg/ml的比例將聚天冬氨酸(平均分子量50kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚天冬氨酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例9：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按200μg/ml的比例將聚天冬氨酸(平均分子量50kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚天冬氨酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例10：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按300μg/ml的比例將聚天冬氨酸(平均分子量50kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚天冬氨酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚天冬氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例11：

該實施例與實施例1不同之處在于：

(2)按50μg/ml的比例將高分子量的聚丙烯酸(平均分子量450kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚丙烯酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例12：

(2)按500μg/ml的比例將高分子量的聚丙烯酸(平均分子量450kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚丙烯酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例13：

(2)按1000μg/ml的比例將高分子量的聚丙烯酸(平均分子量450kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚丙烯酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚丙烯酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例14：

(2)按50μg/ml的比例將聚谷氨酸(平均分子量200kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚谷氨酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例15：

(2)按500μg/ml的比例將聚谷氨酸(平均分子量200kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚谷氨酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

實施例16：

(2)按1000μg/ml的比例將聚谷氨酸(平均分子量200kda)溶于磷酸鈣溶液中，利用聚谷氨酸對超飽和磷酸鈣溶液的穩(wěn)定作用，制得穩(wěn)定的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液；

(3)將膠原海綿置于聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液中，37℃恒溫下孵育7天，每天更換新鮮的聚谷氨酸穩(wěn)定的磷酸鈣礦化液，使用蒸餾水反復沖洗后，干燥備用，制得膠原纖維內(nèi)仿生鈣化材料。

以上內(nèi)容是結合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定本發(fā)明的具體實施方式僅限于此，對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干簡單的推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明由所提交的權利要求書確定專利保護范圍。