專利名稱：多糖亞硒酸酯的制法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于硒化多糖技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多糖亞硒酸酯的制法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
多糖類是生物體內(nèi)除蛋白質(zhì)和核酸外又一類重要的生物大分子，具有抗感染、免疫促進(jìn)、 腫瘤防治、病毒性肝炎、類風(fēng)濕癥、艾滋病等免疫損傷或免疫缺損癥和抗氧化等多方面功能 和生物活性。影響多糖生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)因素包括多糖的主鏈性質(zhì)、支鏈性質(zhì)和多糖分子的 高級結(jié)構(gòu)，其中多糖主鏈的糖單元組成、糖苷鍵類型均直接決定多糖的活性，多糖支鏈的類 型、聚合度、支鏈在多糖鏈上的分布及其取代度決定了多糖的活性大小，多糖分子的高級結(jié) 構(gòu)如鏈的柔韌性和空間構(gòu)像與多糖的活性緊密相關(guān)。為提高多糖的生物活性，多糖的分子修 飾和結(jié)構(gòu)改造具有重要意義。近年來，有關(guān)多糖的分子修飾研究已大有進(jìn)展。利用糖殘基上 的羥基、羧基、氨基等基團(tuán)運(yùn)用化學(xué)方法進(jìn)行修飾，有可能提高多糖的活性。修飾的方法很 多，有硫酸化、羧甲基化、硒化、甲基化、氧化、部分水解、磷酸酯化、雙基團(tuán)衍生化等。
硒元素是生命活動的必需元素，其存在形式有無機(jī)硒和有機(jī)硒兩種，常見的無機(jī)硒有亞 硒酸鈉和硒酸鈉，有機(jī)硒主要是硒蛋白和硒多糖。硒能構(gòu)成若干氧化酶的活性中心，可增強(qiáng) 機(jī)體的抗氧化能力和對相關(guān)疾病的抵抗能力，這說明了硒與人體健康的直接關(guān)系。多糖具有 多種生理功能，與抗衰老、防治癌癥等密切有關(guān)。無機(jī)硒具有蓄積性毒性和致突變作用，使 用時劑量難以控制，而有機(jī)硒的毒性低，副作用小，不但能夠更好地發(fā)揮硒的作用，而且在 激發(fā)免疫反應(yīng)上比無機(jī)硒顯著，因此，將無機(jī)硒與多糖有機(jī)結(jié)合使之轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒化合物硒 多糖，將會使硒和多糖的生理和藥理功能得到優(yōu)化。
隨著生活水平的提高，各個保健食品公司、醫(yī)藥公司開發(fā)的富硒食品、富硒藥品己成為 了熱潮。近年來關(guān)于富硒的產(chǎn)品和專利也出現(xiàn)了許多。如公開號CN1038454A，硒化卡拉膠 的制法。該方法是以硒粉為原料，用硝酸將其溶解制備成濃度為0.5-l.Omg/ml的硒液，在 將其加入到濃度為0.5-5%的卡拉膠中，再加入Kappa-角叉菜膠或Lambda角叉菜膠溶膠溶液， 進(jìn)行硒化反應(yīng)，在經(jīng)過乙醇沉析后得到粗品硒化卡拉膠。該方法制備的硒化卡拉膠，硒含量 較低，并且在制備方法上使用硒粉和濃硝酸可以生成如硒化氫等有毒的負(fù)產(chǎn)物。專利公開號 CN1069495，專利名稱為硒多糖其制造方法。該方法通過發(fā)酵制備富硒酵母，再經(jīng)過分離提 取，加堿勻漿、中和、濃縮、乙醇沉淀等制成。該方法制備繁瑣，得到的硒含量也很低。而 多糖亞硒酸酯的制備是通過亞硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基團(tuán)實現(xiàn)(CN1288899A)，導(dǎo) 致多糖亞硒酸酯的硒含量除了受反應(yīng)條件限制，還受多糖硫酸酯的硫酸酯基團(tuán)含量控制，導(dǎo) 致這一方法制備多糖亞硒酸酯的硒含量偏低，其最大硒含量為12.5%

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明提供了一種多糖亞硒酸酯的制法，將硒化試劑與在糖 單元的羥基直接發(fā)生反應(yīng)，而不用通過取代硫酸酯基團(tuán)，制備的多糖亞硒酸酯的最高硒含量 可達(dá)45%。
本發(fā)明采用的具體技術(shù)方案如下
一種多糖亞硒酸酯的制法，其特征是本質(zhì)上由多糖或糖復(fù)合物和硒化試劑反應(yīng)制得。
所述的硒化試劑為鹵氧化硒，化學(xué)式為SeOX2， X為氟、氯、溴中的一種；或者硒化 試劑為含有鹵氧硒結(jié)構(gòu)的化合物，化學(xué)式為一SeOX， X為氟、氯、溴中的一種；硒化試劑 與多糖中羥基基團(tuán)的投料摩爾比為l: 0.1-20。
所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是，包括下列步驟
(1) 硒化反應(yīng)將多糖、硒化試劑加入吡啶中，在—15-11(TC下，反應(yīng)0.1-100小時，
然后加入水，反應(yīng)液自然升溫/降溫至室溫；
(2) 沉淀按反應(yīng)液的1-10倍體積量將沉淀劑加入反應(yīng)液，攪拌，過濾，然后用沉淀
劑洗滌濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7~8，再加入 沉淀劑，過濾，然后用沉淀劑洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥；沉淀劑是乙醇、甲醇、丙酮中的一 種或其中幾種的任意比例混合物；
(3) 按需要精制成多糖亞硒酸酯精品，將(2)中的產(chǎn)物溶解，透析，按需要精制成各種 的多糖亞硒酸酯精品。
反應(yīng)可以加入催化劑，催化劑是亞硒酸酯，化學(xué)式為ROSeOOR2， R， R2為H，或 Crdo烷基；催化劑與多糖中羥基基團(tuán)的投料重量比為1: 0.0001-10。
所述的多糖亞硒酸酯，其特征是物化性質(zhì)如下
(1) 溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機(jī)溶劑；
(2) 平均含硒量含硒量為0.1-45%;
(3) 光譜①紫外光譜在波長255nm附近處有特征吸收峰；
②紅外光譜在波長900cm"左右有中強(qiáng)度的伸縮振動特征吸收峰。 多糖亞硒酸酯在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。 多糖亞硒酸酯在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。 本發(fā)明具有的有益效果在于
1)本發(fā)明制備的多糖亞硒酸酯化合物的技術(shù)與其它的方法相比，不再通過亞硒酸根取代 多糖硫酸酯的硫酸酯基團(tuán)，本發(fā)明的硒化試劑與糖單元的羥基發(fā)生反應(yīng)，生成多糖亞硒酸酯，
產(chǎn)品得率和質(zhì)量均比其它的方法高。
2) 利用本發(fā)明的多糖亞硒酸酯的制法，制備的多糖亞硒酸酯多糖，其最高硒含量可達(dá) 45%。然而目前有文獻(xiàn)報道硒化多糖的最高硒含量為12.5%。
3) 在分子結(jié)構(gòu)中引入亞硒酸根，其中硒是正四價，硒是處于中間價態(tài)，既可以被氧化也 可以被還原，因此本發(fā)明的多糖亞硒酸酯在人體內(nèi)具有廣泛的生理功能。
具體實施例方式
實施例1 MTT法體外檢測多糖亞硒酸酯抗癌藥敏試驗
對數(shù)生長期細(xì)胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋為2. 0 X 106個nnL-l， 接種于96孔板中，每孔IOO pL，之后依次加入待測藥物、陰性對照組、陽性對照組，并保 留僅加培養(yǎng)基的空白組。隨后在37°C、 5% C02的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24h，然后每孔加入5 mg mL-l的MTT溶液10 ，連續(xù)培養(yǎng)4 h。吸去上清液，每孔加入DMSO 100 ^L，在 570nm波長處用酶標(biāo)儀測吸收度(A)值。用下面的公式計算細(xì)胞增殖抑制率，并利用公式 T/C(%)=100 X A陰性/A樣品做回歸計算藥物的半數(shù)抑制濃度(IC50)抑制率^A空自一A給藥)/ A空白
各濃度對小鼠腫瘤細(xì)胞S180、 H22及人肝癌細(xì)胞株HepG2的增殖均有顯著的抑制作用，且呈良好的 量效關(guān)系。
實施例2 抗氧化活性研究
1. 對02*的清除作用
含有多糖亞硒酸酯(lmg iri^)pH8.2的Tris—HCl緩沖液于25°C溫育20分鐘后，加入 0.1mol'I^連苯三酚的10mmol'I^鹽酸溶液，快速搖勻，于25。C測定319nm處的吸收度，持 續(xù)測定Ap。
不加多糖亞硒酸酯，同上操作處理，測定其對比吸光值A(chǔ)s。測試表明吸光度Ap相對比 吸光值A(chǔ)s減少。 ' '
結(jié)果表明多糖亞硒酸酯能有效地清除活性氧。
2. 對羥自由基的清除作用和保護(hù)DNA的作用
采用Fenton體系，取0.2mLF eS04-EDTA混合液(10mmo卜L")于試管中，加人0.5m L的 DNA(10mmol'i:1)，然后加多糖亞硒酸酯(0.8mg"mU1)，用磷酸緩沖液(pH 7.4， 0.1 mol'L"使容 至1.8M L，再加人0.2mLH2O2(10mmo卜L"')， 混合后置于37'C恒溫水浴中反應(yīng)lh，然后加 人2.8%(質(zhì)量百分比)三氯乙酸溶液1.0 ML, 1.0。/。(質(zhì)量百分比)硫代巴比妥酸(TBA)溶液1.0 ML，混勻后置沸水浴反應(yīng)15min，冷卻后用在波長532 nm處測吸光度Ap。
不加多糖亞硒酸酯，同上操作處理，測定其對比吸光值A(chǔ)s。測試表明吸光度Ap則相對 比吸光值A(chǔ)s減少。
結(jié)果表明多糖亞硒酸酯能有效地清除羥自由基，對DNA鏈具有良好的保護(hù)作用。 實施例3 糊精亞硒酸酯
在攪拌下，將lg糊精、0.1gCH30SeOOC2Hs和25g氟氧化硒(SeOF2)加入吡啶中，加 熱到100° C，反應(yīng)24小時，加入水。反應(yīng)液降至室溫，按反應(yīng)液的3倍體積量將乙醇加入 反應(yīng)液，攪拌；過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶 液調(diào)節(jié)溶液pH為7-8，再加入乙醇，過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥。產(chǎn)品透析 精制。制得含硒45 %的糊精亞硒酸酯。
實施例4 右旋糖酑亞硒酸酯
在-2° C攪拌下，將2g右旋糖酐、和25g氟氧化硒(SeOF2)加入吡啶中，加熱到100° C， 反應(yīng)90小時，加入水。反應(yīng)液升至室溫，按反應(yīng)液的3倍體積量將乙醇加入反應(yīng)液，攪拌； 過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH 為7~8，再加入乙醇，過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥。產(chǎn)品透析精制。制得含 硒40%的右旋糖酐亞硒酸酯。
實施例5 阿(拉伯)糖基木聚糖亞硒酸酯
阿(拉伯)糖基木聚糖含有吡喃型和呋喃型兩種糖單元，在攪拌下，將2g阿(拉伯)糖基木 聚糖、0.1gCH3OSeOOC2Hs和50g氯氧化硒(SeOCl2)加入吡啶中，反應(yīng)30小時，加入水。 反應(yīng)液升至室溫，按反應(yīng)液的3倍體積量將乙醇加入反應(yīng)液，攪拌；過濾，然后用乙醇洗滌 濾出物，將濾出物干燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7~8，再加入乙醇， 過濾，然后用乙醇洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥。產(chǎn)品透析精制。制得含硒39%的阿(拉伯)糖基 木聚糠亞硒酸酯。 .
權(quán)利要求
1.一種多糖亞硒酸酯的制法，其特征是本質(zhì)上由多糖或糖復(fù)合物和硒化試劑反應(yīng)制得。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是硒化試劑為鹵氧化硒，化學(xué)式 為SeOX2， X為氟、氯、溴中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是硒化試劑為含有鹵氧硒結(jié)構(gòu)的 化合物，化學(xué)式為一SeOX， X為氟、氯、溴中的一種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是硒化試劑與多糖中羥基基團(tuán)的 投料摩爾比為1: 0.1-20。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是，包括下列步驟(1) 硒化反應(yīng)將多糖、硒化試劑加入吡啶中，在-i5-iicrc下，反應(yīng)o.i-ioo小時，然后加入水，反應(yīng)液自然升溫/降溫至室溫；(2) 沉淀按反應(yīng)液的1-10倍體積量將沉淀劑加入反應(yīng)液，攪拌，過濾，然后用沉淀劑洗滌濾出物，將濾出物千燥；將濾出物溶解，用NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH為7~8，再加入沉淀劑，過濾，然后用沉淀劑洗滌濾出物，將產(chǎn)物干燥；沉淀劑是乙醇、甲醇、丙酮中的一 種或其中幾種的任意比例混合物；(3) 按需要精制成多糖亞硒酸酯精品，將(2)中的產(chǎn)物溶解，透析，按需要精制成各種的多糖亞硒酸酯精品。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的多糖亞硒酸酯的制法，其特征是反應(yīng)可以加入催化劑，催化劑 是亞硒酸酯，化學(xué)式為F^OSeOOR2， R!， R2為H，或d-do烷基；催化劑與多糖中羥基 基團(tuán)的投料重量比為h 0.0001-10。
7. 權(quán)利要求1的一種多糖亞硒酸酯，其特征是物化性質(zhì)如下(1) 溶解性能溶于水，而不溶于乙醇、丙酮有機(jī)溶劑；(2) 平均含硒量含硒量為0.1-45%;(3) 光譜①紫外光譜在波長255nm附近處有特征吸收峰；②紅外光譜在波長900cm—1左右有中強(qiáng)度的伸縮振動特征吸收峰。
8. 多糖亞硒酸酯在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
9. 多糖亞硒酸酯在制備抗氧化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
一種多糖亞硒酸酯的制法及其應(yīng)用，屬于硒化多糖技術(shù)領(lǐng)域，其特征是本質(zhì)上由多糖或糖復(fù)合物和硒化試劑反應(yīng)制得；硒化試劑為鹵氧化硒或者含有鹵氧硒結(jié)構(gòu)的化合物；硒化試劑與多糖中羥基基團(tuán)的投料摩爾比為1∶0.1-20。本發(fā)明還包括多糖亞硒酸酯在制備抗癌藥物和抗氧化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明不再通過亞硒酸根取代多糖硫酸酯的硫酸酯基團(tuán)，而是硒化試劑與糖單元的羥基發(fā)生反應(yīng)，生成多糖亞硒酸酯，產(chǎn)品得率和質(zhì)量均比其它的方法高，含硒量也遠(yuǎn)大于現(xiàn)有技術(shù)。
文檔編號A61P35/00GK101104644SQ20061004548
公開日2008年1月16日 申請日期2006年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年7月14日
發(fā)明者陳藝新 申請人:陳藝新