專利名稱：Glp－1衍生物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及其片段和這些片段的類似物的新衍生物，它們具有更長時間的作用曲線(protracted profile ofaction)，還涉及這些物質(zhì)的制備和使用方法。
發(fā)明的技術(shù)背景肽廣泛用于醫(yī)學(xué)實踐，由于可以用DNA重組技術(shù)制備肽，因此可以預(yù)計在未來一些年內(nèi)其重要性也將會增加。當(dāng)在治療中使用天然肽或其類似物時，通常發(fā)現(xiàn)它們有高的清除率。在需要使治療劑在更長時間的期間內(nèi)保持其高的血液水平的情況下，治療劑的高清除率是不適宜的，因為這將需要重復(fù)給藥。有高清除率的肽例如有ACTH，促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子，血管緊張肽，降鈣素，胰島素，胰高血糖素，胰高血糖素樣肽-1，胰高血糖素樣肽-2，胰島素樣生長因子-1，胰島素樣生長因子-2，腸抑胃肽，生長激素釋放因子，垂體腺苷酸環(huán)化酶活化肽，胰泌素，腸抑胃素(enterogastrin)，促生長素抑制素，生長調(diào)節(jié)素，促生長素，甲狀旁腺素，血小板生成素，紅細(xì)胞生成素，下丘腦釋放因子，促乳素，促甲狀腺素，內(nèi)啡肽，腦啡肽，血管升壓素，催產(chǎn)素，阿片樣物質(zhì)及其類似物，超氧化物歧化酶，干擾素，天冬酰胺酶，精氨酸酶，精氨酸脫氨酶，腺苷脫氨酶和核糖核酸酶。在某些情況下，能使用適宜的藥物組合物以影響肽的釋放曲線，但這種方法存在各種不足之處，一般是不適用的。
調(diào)節(jié)胰島素分泌的激素屬于所謂的腸胰島軸，指的是隨著腸內(nèi)營養(yǎng)素的存在和吸收而從胃腸粘膜釋放的一組激素，它促使胰島素的早期釋放并使之增強。促進胰島素分泌的作用，即所謂的腸降血糖素作用，對于正常的葡萄糖耐受性或許是必需的。包括胃泌素和胰泌素的許多胃腸激素具有促胰島素作用(人的縮膽囊素不具有促胰島素作用)，但生理上重要的、能導(dǎo)致腸降血糖素作用的僅有葡萄糖依賴性促胰島素多肽GIP和胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)。由于GIP的促胰島素作用，它在1973年得到分離(1)后立即在糖尿病學(xué)家中引起相當(dāng)大的興趣。然而，在隨后一些年中進行的大量研究清楚地顯示，GIP分泌缺陷與胰島素依賴性糖尿病(IDDM)或非胰島素依賴性糖尿病(NIDDM)的發(fā)病原因并無關(guān)系(2)。進而還發(fā)現(xiàn)，GIP雖是一種促胰島素激素，但它對于NIDDM幾乎無效(2)。另一種腸降血糖素激素GLP-1，是已知最有效的促胰島素物質(zhì)(3)。不同于GIP，GLP-1在促進NIDDM病人的胰島素分泌方面非常有效。另外，與其它促胰島素激素相比(也許除腸泌素外)，GLP-1也有效地抑制胰高血糖素分泌。由于這些作用，它尤其對于NIDDM病人具有顯著的降血糖效果。
GLP-1是胰高血糖素原(proglucagon)的一種產(chǎn)物(4)，它是胰泌素-VIP族肽中最新成員之一，但它已被確認(rèn)是一種對于葡萄糖代謝和胃腸分泌及代謝具有調(diào)節(jié)功能的重要的胃腸激素(5)。胰高血糖素基因在胰腺和腸內(nèi)加工方式不同。在胰腺內(nèi)(9)，加工導(dǎo)致形成和平行分泌以下物質(zhì)1)胰高血糖素自身，占據(jù)胰高血糖素原(PG)的33-61位；2)一種有30個氨基酸(PG(1-30))的N-末端肽，通常稱之為胰高血糖素樣肽相關(guān)的胰肽，GRPP(10，11)；3)一種對應(yīng)于PG(64-69)的六肽；4)最后還有所謂的主要的胰高血糖素原片段(PG(72-158))，其中藏有兩個胰高血糖素樣序列(9)。胰高血糖素似乎是唯一的生物活性產(chǎn)物。與之相比，在腸粘膜內(nèi)，卻是胰高血糖素被埋藏在一個大分子中，而兩個胰高血糖素樣肽則是分別形成的(8)。以下產(chǎn)物是平行形成并分泌的1)對應(yīng)于PG(1-69)的胰高血糖素樣肽，其中胰高血糖素序列占據(jù)No.33-61殘基(12)；2)GLP-1(7-36)酰胺，即PG(78-107)酰胺(13)，而不是最初認(rèn)為的PG(72-107)酰胺或PG(72-108)酰胺，它是非活性的。也生成少量C-末端甘氨酸延伸的具有同等生物活性的GLP-1(7-37)(PG(78-108))(14)；3)中間肽-2(PG(111-122)酰胺)(15)；和4)GLP-2(PG(126-158))(15，16)。胰高血糖素樣肽的一部分進一步切割成GRPP(PG(1-30))和胃泌酸調(diào)節(jié)素(PG(33-69))(17，18)。在這些肽中，GLP-1有最顯著的生物活性。
由于GLP-1與胰高血糖素樣肽/腸高血糖素平行分泌，因此對腸高血糖素分泌的許多研究(6，7)在某些程度上也可用于GLP-1分泌，但GLP-1代謝更快，其在人血漿中的半衰期為2分鐘(19)。富含糖類或脂肪的膳食能促進分泌(20)，推測這是未吸收的養(yǎng)分與腸粘膜開放型L-細(xì)胞的微絨毛直接相互作用的結(jié)果?？赡艽嬖诖龠MGLP-1分泌的內(nèi)分泌或神經(jīng)機理，但在人體內(nèi)還未得到證實。
用GLP-1受體拮抗劑exendin 9-39進行的實驗已清楚地說明了GLP-1的腸降血糖素作用(29-31)，在此實驗中，exendin 9-39驚人地降低大鼠口服葡萄糖后的腸降血糖素作用(21，22)。激素經(jīng)由屬于G-蛋白耦聯(lián)的7-跨膜穿越受體的胰高血糖素/VIP/降鈣素家族的GLP-1受體與β-細(xì)胞直接相互作用(23)。最近的實驗證明了GLP-1受體在調(diào)節(jié)胰島素分泌方面的重要性，在此實驗中，對小鼠進行了GLP-1受體基因的定向破壞。具有這種破壞的純合動物有顯著退化的葡萄糖耐受性和快速出現(xiàn)的高血糖，甚至雜合動物也不能耐受葡萄糖(24)。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機理主要包括腺苷酸環(huán)化酶活化，但也必須有細(xì)胞內(nèi)Ca2+的升高(25，26)。該激素的作用最好地描述為能增強葡萄糖刺激的胰島素釋放作用(25)，但尚不知道葡萄糖與GLP-1刺激之間的耦聯(lián)機理。它可能包括一個鈣誘發(fā)的鈣釋放(26，27)。如已經(jīng)提到的，糖尿病人的β-細(xì)胞有GLP-1的促胰島素作用。也不知道GLP-1與其賦予分離的胰島素分泌細(xì)胞(26，28)“葡萄糖感應(yīng)性”的能力之間的關(guān)系，這種分離的胰島素分泌細(xì)胞幾乎不對單獨的葡萄糖或GLP-1起反應(yīng)，而是對二者的結(jié)合起反應(yīng)。然而，同等重要的是，該激素也有效地抑制胰高血糖素分泌(29)。其機理還不清楚，但似乎是通過相鄰胰島素或促生長素抑制素細(xì)胞的旁分泌(25)。抑胰高血糖素作用(glucagonostatic action)也是葡萄糖依賴性的，所以當(dāng)血糖降低時，抑制效應(yīng)即降低。由于這種雙重效應(yīng)，如果通過增加分泌或通過外源性灌輸增加血漿中的GLP-1濃度，通過門脈循環(huán)達到肝的血液中胰島素與胰高血糖素之間的摩爾比將顯著增加，而肝糖生成量降低(30)。結(jié)果，血糖濃度降低。由于促胰島素作用和抑胰高血糖素作用的葡萄糖依賴性，葡萄糖降低的效果是自限性的，因此，無論劑量如何，該激素均不導(dǎo)致低血糖(31)。有糖尿癥的病人仍存在這些效應(yīng)(32)，盡管有弱的代謝控制和磺酰脲類附屬性障礙(33)，給這些病人灌輸稍微超出生理劑量的GLP-1可能使血糖值完全正?；Ｒ寻l(fā)現(xiàn)GLP-1在無殘余β-細(xì)胞分泌能力的I型糖尿病人中也能降低血糖(34)，這說明了抑胰高血糖素效應(yīng)的重要性。
除它對于胰島的作用外，GLP-1對胃腸道也具有有力的作用。灌輸生理劑量的GLP-1，能顯著抑制五肽胃泌素誘發(fā)的及膳食誘發(fā)的胃酸分泌(35，36)。GLP-1也抑制胃排空速率和胰酶分泌(36)。人回腸灌輸含有糖或脂的溶液可能對胃、胰分泌和運動性具有相似的抑制效應(yīng)(37，38)。伴隨地，GLP-1分泌得到顯著刺激，并已推測GLP-1可能至少是這種所謂的“回腸閘”(ileal-brake)效應(yīng)的部分原因(38)。實際上，最近的研究表明，生理上，GLP-1的回腸閘效應(yīng)可能比其對胰島的效應(yīng)更重要。因此，在劑量響應(yīng)研究中，至少在影響胰島分泌所需的最小灌輸速度下，GLP-1會影響胃排空速率(39)。
GLP-1似乎對食物攝取有作用。GLP-1的心室內(nèi)給藥極度抑制大鼠的食物攝入(40，42)。這種效應(yīng)看似很特異的。因此，N-末端延伸的GLP-1(PG72-107)酰胺是無活性的，并且適當(dāng)劑量的GLP-1拮抗劑，exendin9-39，能消除GLP-1的效應(yīng)(41)。GLP-1快速外周給藥不會快速地抑制大鼠食物攝入(41，42)。然而，從腸L-細(xì)胞分泌的GLP-1仍有可能作為一個過飽信號。
糖尿病人不僅有促胰島素作用，而且有GLP-1的對胃腸道的作用(43)，這可能有助于減弱膳食引起的葡萄糖偏移，但，更重要的是，也可能影響食物攝入。GLP-1按4ng/kg/min持續(xù)靜脈內(nèi)給藥一周，已證實顯著改善了NIDDM病人的糖血控制而無明顯的副作用(44)。肽在皮下給藥后是完全有效的(45)，但主要由于二肽基肽酶IV樣酶的降解作用，肽會快速降解(46，47)。
尤其是Schmidt等給出了GLP-1的氨基酸序列(糖尿病學(xué)(Diabetologia)，28，704-707(1985))。雖然GLP-1(7-37)及其類似物的令人感興趣的藥理學(xué)性質(zhì)在近年來已引起很大關(guān)注，但關(guān)于這些分子的結(jié)構(gòu)所知甚少。Thorton等描述了GLP-1在膠束(micelle)中的二級結(jié)構(gòu)(生物化學(xué)，33，3532-3539(1994))，但在正常溶液中，GLP-1被認(rèn)為是一種非常易變形的分子。意外地，我們發(fā)現(xiàn)這一較小且很易變形的分子經(jīng)衍生化產(chǎn)生的化合物，其血漿分布曲線大大延長并仍保留了活性。
GLP-1、GLP-1類似物以及它們的片段尤其在治療1型和2型糖尿病中非常有效。然而高清除率限制了這些化合物的有效性，因此在這方面還需要改進。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個目的是提供GLP-1和其類似物的衍生物，這些衍生物具有比GLP-1(7-37)更長時間的作用曲線。本發(fā)明的進一步的目的是提供GLP-1及其類似物的衍生物，這些衍生物具有比GLP-1(7-37)更低的清除率。本發(fā)明的進一步的目的是提供一種含有本發(fā)明化合物的藥物組合物，和使用本發(fā)明的化合物制備這種組合物。本發(fā)明的目的也包括提供一種治療胰島素依賴性和非胰島素依賴性糖尿病的方法。
參考文獻1.Pederson RA.抑胃多肽.Walsh JH，Dockray GJ(編)。腸肽生物化學(xué)與生理學(xué).Raven Press，紐約1994，217259頁.
2.Krarup T.免疫反應(yīng)活性的抑胃多肽.內(nèi)分泌學(xué)綜述，1988；9122-134.
3._rskov C.胰高血糖素樣肽-1，一種新的腸胰島軸激素.糖尿病學(xué)，1992；35701-711.
4.Bell Gl，Sanchez-Pescador R，Laybourn PJ，Najarian RC.人前胰高血糖素原基因中的外顯子復(fù)制和分散.自然，1983；304368-371.
5.Holst JJ.胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)-一種新發(fā)現(xiàn)的GI激素.腸胃病學(xué)，1994；1071848-1855.
6.Holst JJ.腸胰高血糖素，腸高血糖素，腸GLI，胰高血糖素樣肽-當(dāng)前狀況.腸胃病學(xué)，1983；841602-1613.
7.Holst JJ，_rskov C.胰高血糖素和其它胰高血糖素原衍生肽.WalshJH，Dockray GJ編.腸肽生物化學(xué)和生理學(xué)。Raven Press，紐約；305-340頁，1993.
8._rskov C，Holst JJ，Knuhtsen S，Baldissera FGA，Poulsenss，Nielsen OV.，胰高血糖素基因的預(yù)期產(chǎn)物-胰高血糖素樣肽GLP-1和GLP-2在豬小腸而非胰腺中是分別分泌的.內(nèi)分泌學(xué)，1986；1191467-1475.
9.Holst JJ，Bersani M，Johnsen AH，Kofod H，Hartmann B，_rskovC.在豬和人胰腺中的胰高血糖素加工.生物與化學(xué)雜志，1994；26918827-1883.
10.Moody AJ，Holst JJ，Thim L，Jensen SL.豬胰腺內(nèi)胰高血糖素樣肽與胰高血糖素原和胰高血糖素之間的關(guān)系。自然，1981；289514-516.
11.Thim L，Moody AJ，純化和化學(xué)鑒定從豬胰腺得到的與胰高血糖素樣肽相關(guān)的胰肽(胰高血糖素原片段)。生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報，1982；703134-141.
12.Thim L，Moody AJ，胰高血糖素樣肽(胰高血糖素原)的一級結(jié)構(gòu).調(diào)節(jié)肽，1981；2139-151.
13._rskov C，Bersani M，Johnsen AH，H_jrup P，Holst JJ.人和豬小腸胰高血糖素樣肽-1的完整序列.生物與化學(xué)雜志，1989；26412826-12829.
14._rskov C，Rabenh_j L，Kofod H，Wettergren A，Holst JJ.人體內(nèi)酰胺化和甘氨酸延伸的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的產(chǎn)生和分泌.糖尿病，1991；43535-53915.Buhl T，Thim L，Kofod H，_rskov C，Harling H，& Holst JJ在豬和人小腸內(nèi)天然存在的胰高血糖素原111-160產(chǎn)物.生物與化學(xué)雜志，1988；2638621-8624.
16._rskov C，Buhl T，Rabenh_j L，Kofod H，Holst JJ豬和人小腸內(nèi)胰高血糖素樣肽-2C-末端的羧肽酶B樣加工.FEBS letters，1989；247193-106.
17.Holst JJ.腸高血糖素(II)與胰高血糖素樣肽的C-末端序列(殘基33-69)等同的證據(jù)。生物化學(xué)雜志，1980；187337-343.
18.Bataille D，Tatemoto K，Gespach C，Jornvall H，Rosselin G，Mutt V.從豬空腸-回腸(jejuno-ileum)分離胰高血糖素-37(生物活性的腸高血糖素/胃泌酸調(diào)節(jié)素，該肽的鑒定。FEBS letters，1982；14679-86.
19._rskov C，Wttergren A，Holst JJ.健康志愿者體內(nèi)GLP-17-36酰胺和GLP-17-37的代謝速度和生物效應(yīng)是相同的.糖尿病，1993；42658-661.
20.Elliott RM，Morgan LM，Tredger JA，Deacon S，Wright J，Marks V.人體內(nèi)與營養(yǎng)攝取相關(guān)的胰高血糖素樣肽-1(7-36)酰胺和葡萄糖依賴性促胰島素多肽的分泌餐后即刻和24小時的分泌方式。內(nèi)分泌學(xué)雜志，1993；138159-166.
21.Kolligs F，F(xiàn)ehmann HC，Goke R,Goke B.在大鼠體內(nèi)進行的胰高血糖素樣肽-1受體拮抗劑exendin(9-39)酰胺的降低腸降血糖素效應(yīng).糖尿病，1995；4416-19.
22.Wang Z.Wang RM，Owji AA，Smith DM，Ghatei M，Bloom SR.胰高血糖素樣肽-1是大鼠體內(nèi)的一種生理性腸降血糖素.臨床研究雜志，1995；95417-421.
23.Thorens B.糖-腸降血糖素激素胰高血糖素樣肽1的胰腺b細(xì)胞受體的表達克隆.美國國家科學(xué)院院報，1992；898641-4645.
24.Scrocci L，Auerbach AB，Joyner AL，Drucher DJ.具有GLP-1受體基因定向破壞的小鼠糖尿病.糖尿病，1996；4521A.
25.Fehmann HC，Goke R.，Goke B.腸降血糖素激素胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)和葡萄糖依賴性胰島素釋放多肽(GIP)的細(xì)胞和分子生物學(xué).內(nèi)分泌綜述，1995；16390-410.
26.Gromada J，Dissing S，Bokvist K，Renstrom E，F(xiàn)r_kjaer-JensenJ，Wulff BS，Rorsman P.胰高血糖素樣肽1通過促進細(xì)胞內(nèi)鈣轉(zhuǎn)移增加分泌胰島素的bTC3細(xì)胞中的胞質(zhì)鈣.糖尿病，1995；44767-774.
27.Holz GG，Leech CA，Habener JF.促胰島素激素胰高血糖素樣肽-1激活胰腺β-細(xì)胞內(nèi)cAMP調(diào)節(jié)的Ca2+信號通道.生物與化學(xué)雜志，1996；27017749-17759.
28.Holz GG，Kuhltreiber WM，Habener JF.促胰島素激素胰高血糖素樣肽-1(7-37)導(dǎo)致胰腺β-細(xì)胞對葡萄糖能夠感應(yīng).自然，1993；361362-365.
29._rskov C，Holst JJ，Nielsen OV截短的胰高血糖素樣肽-1(胰高血糖素原78-107酰胺)對豬胰腺、竇和胃的內(nèi)分泌的效應(yīng)。內(nèi)分泌學(xué)，1988；1232009-2013.
30.Hvidberg A，Toft Nielsen M，Hilsted J，_rskov C，Holst JJ.胰高血糖素樣肽-1(胰高血糖素原78-107酰胺)對于健康人肝葡萄糖生產(chǎn)的效應(yīng).代謝，1994；43104-108。
31.Qualmann C，Nauck M，Holst JJ，_rskov C，Creutzfeldt W.健康受試者即刻靜脈內(nèi)注射胰高血糖素樣肽-1[7-36酰胺]的促胰島素樣作用.糖尿病學(xué)報，1995；3213-16。
32.Nauck MA，Heimesaat MM.，_rskov C，Holst JJ，Ebert R，Creutzfeldt W.2-型糖尿病人仍具有GLP-1(7-36酰胺)腸降血糖素活性而非合成的人體GIP的活性.臨床研究雜志，1993；91301-307。
33.Nauck MA，Kleine N，_rskov C，Holst JJ，Willms B，CreutzfeldtW.2型糖尿病人中外源性GLP-1(7-36酰胺)所致急性高血糖的正?；?糖尿病學(xué)，1993；36741-744.
34.Creutzfeldt W，Kleine N，Wilms B，_rskov C，Holst JJ，Nauck MA.I型糖尿病人中外源性胰高血糖素樣肽-1(7-36酰胺)所致胰高血糖素樣作用和急性高血糖的降低.糖尿病護理，1996；19580-586.
35.Schjoldager BTG，Mortensen PE，Christiansen J，_rskov C，HolstJJ.GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)和截短的GLP-1，人胰高血糖素原片段，能抑制人胃酸分泌.消化疾病與科學(xué).1989；35703-708.
36.Wettergren A，Schjoldager B，Mortensen PE，Myhre J，ChristiansenJ，Holst JJ.截短的GLP-1(胰高血糖素原72-107酰胺)抑制人的胃、胰功能.消化疾病與科學(xué).1993；38665-673.
37.Layer P，Holst JJ，Grandt D，Goebell H胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的回腸釋放與人的胃酸分泌抑制的關(guān)系.消化疾病與科學(xué).1995；401074-1082.
38.Layer P，Holst JJ.GLP-1人回腸閘的體液介質(zhì)。消化，1993；54385-386.
39.Nauck M，Ettler R，Niedereichholz U，_rskov C，HolstJJ，Schmiegel W.GLP-1(7-36酰胺)或(7-37)抑制胃排空的作用對食后糖血和胰島素分泌的作用.腸摘要，1995；37(增刊2)A124.
40.Schick RR，vorm Walde T，Zimmermann JP，SchusdziarraV，ClassenM.胰高血糖素樣肽1-一種參與攝食調(diào)節(jié)的新的腦肽.Ditschuneit H，Gries FA，Hauner H，Schusdziarra V，Wechsler JG(編)，歐洲肥胖癥.John Libbey &Company ltd，1994；pp.363-367.
41.Tang-Christensen M，Larsen PJ，Goke R，F(xiàn)ink-Jensen A，JessopDS，M_ller M，Sheikh S.腦GLP-1(7-36)酰胺受體在食物和水?dāng)z入的調(diào)節(jié)中起主要作用.美國生理學(xué)雜志，1996，待發(fā)表.
42.Turton MD，O’Shea D，Gunn I，BeakSA，Edwards CMB，Meeran K，等.胰高血糖素樣肽-1在攝食調(diào)節(jié)中的作用.自然，1996；37969-72.
43.Willms B，Werner J，Creutzfeldt W，_rskov C，Holst JJ，Nauck M.胰高血糖素樣肽-1(7-36酰胺)對2型糖尿病人胃排空的抑制作用.糖尿病學(xué)，1994；37，增刊1A118.
44.Larsen J，Jallad N，Damsbo P.連續(xù)一周灌輸GLP-1(7-37)促進NIDDM的糖血控制.糖尿病，1996；45，增刊2233A。
45.Ritzel R，_rskov C，Holst JJ，Nauck MA.健康受試者皮下注射后，GLP-1(7-36酰胺)的藥物動力學(xué)、促胰島素和抑胰高血糖素樣的性質(zhì).劑量-反應(yīng)關(guān)系.糖尿病學(xué)，1995；38720-725.
46.Deacon CF，Johnsen AH，Holst JJ.胰高血糖素樣肽-1通過人血漿體外降解產(chǎn)生一種為主要的內(nèi)源性體內(nèi)代謝物的N-末端截短的肽.臨床內(nèi)分泌學(xué)與代謝雜志，1995；80952-957。
47.Deacon CF，Nauck MA，Toft-Nielsen M，Pridal L，Willms B，HolstJJ.1995.胰高血糖素樣肽-1經(jīng)皮下和靜脈內(nèi)給藥，在II型糖尿病人和健康受試者體內(nèi)均快速從氨基末端降解.糖尿病，441126-1131.
發(fā)明概要人GLP-1是一個37氨基酸殘基的肽，它起源自前胰高血糖素原，前胰高血糖素原主要在遠端回腸L-細(xì)胞、胰腺和腦中合成。由前胰高血糖素原加工產(chǎn)生GLP-1(7-36)酰胺、GLP-1(7-37)和GLP-2的過程主要發(fā)生在L-細(xì)胞中?？捎靡缓唵误w系來描述此肽的片段及類似物。因此，例如Gly8-GLP-1(7-37)表示從GLP-1缺失掉氨基酸殘基Nos.1-6，并在位置8(Ala)用Gly取代天然存在的氨基酸殘基后形成的GLP-1片段。類似地，Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)代表在34位的Lys殘基的ε-氨基已被十四?；腉LP-(7-37)。本文中提到C-末端延伸的GLP-1類似物時，則除非另外說明，在38位的氨基酸殘基均是Arg，在39位的可選氨基酸殘基也是Arg(除非另有說明)，在40位的可選氨基酸殘基是Asp(除非另有說明)。同樣，如果C-末端延伸的類似物延伸到位置41、42、43、44或45，則除非另外說明，此延伸物的氨基酸序列均與人前胰高血糖素原中的對應(yīng)序列一樣。
在最廣泛的方面，本發(fā)明涉及GLP-1及其類似物的衍生物。本發(fā)明的衍生物具有令人感興趣的藥理學(xué)性質(zhì)，尤其它們具有比母體肽更長時間的作用曲線。
在本文中，“類似物”用于代表一種肽，其中母體肽的一或多個氨基酸殘基已被另一氨基酸殘基取代，和/或其中母體肽上的一或多個氨基酸殘基已被缺失，和/或其中向母體肽添加了一或多個氨基酸殘基。這種添加可以發(fā)生在母體肽的N-末端或C-末端，或在兩端均發(fā)生。
在本文中用術(shù)語“衍生物”表示一種肽，該肽在母體肽的一或多個氨基酸殘基發(fā)生了化學(xué)修飾，例如發(fā)生了烷基化，?；?，形成了酯或酰胺。
在本文中用術(shù)語“GLP-1衍生物”表示GLP-1或其類似物的衍生物。在本文中，衍生衍生物的母體肽在一些地方被稱為衍生物的“GLP-1部分”。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中母體肽的至少一個氨基酸殘基連接了一個親脂性取代基，條件是如果只有一個親脂性取代基，并且此取代基連接到母體肽的N-末端或C-末端氨基酸殘基上，那么此取代基是一個烷基或者有一個ω-羧酸基團。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及只有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及僅有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該取代基是烷基或者有一個ω-羧酸基團，并連接到母體肽的N-末端氨基酸殘基上。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及僅有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該取代基是烷基或者有一個ω-羧酸基團，并連接到母體肽的C-末端氨基酸殘基上。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及僅有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該取代基可以連接到母體肽上非N-末端也非C-末端的任一氨基酸殘基上。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及有2個親脂性取代基的GLP-1衍生物。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及有2個親脂性取代基的GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基連接到母體肽的N-末端氨基酸殘基上，另一親脂性取代基連接到母體肽的C-末端氨基酸殘基上。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及有2個親脂性取代基的GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基連接到母體肽的N-末端氨基酸殘基上，另一親脂性取代基連接到母體肽的既非N-末端也非C-末端的氨基酸殘基上。
在一優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明涉及有2個親脂性取代基的GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基連接到母體肽的C-末端氨基酸殘基上，另一親脂性取代基連接到母體肽的既非N-末端也非C-末端的氨基酸殘基上。
在進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1(7-C)衍生物，其中C選自含38、39、40、41、42、43、44和45的一組，該衍生物僅有一個連接到母體肽的C-末端氨基酸殘基上的親脂性取代基。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中親脂性取代基含有4至40個碳原子，更優(yōu)選含有8-25個碳原子。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基以某種方式連接到一個氨基酸殘基上，從而使該親脂性取代基的一個羧基與該氨基酸殘基的一個氨基形成酰胺鍵。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基以某種方式連接到一個氨基酸殘基上，從而使該親脂性取代基的一個氨基與該氨基酸殘基的一個羧基形成酰胺鍵。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個間隔基團連接到母體肽上。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基(任選地通過一個間隔基團)連接到母體肽所含的一個Lys殘基的ε-氨基基團上。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個有1-7個亞甲基、優(yōu)選有2個亞甲基的不分支鏈烷烴α，ω-二羧基間隔基團而連接到母體肽上，此間隔基團在母體肽的一個氨基和該親脂性取代基的一個氨基之間形成一個橋。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個間隔基團而連接到母體肽上，此間隔基團是除Cys外的一個氨基酸殘基，或是一種如Gly-Lys的二肽。在本文中，“一種如Gly-Lys的二肽”這一表達方式指這樣一種二肽，其中的C-末端氨基酸殘基是Lys、His或Trp，優(yōu)選Lys，其中的N-末端氨基酸殘基選自含Ala、Arg、Asp、Asn、Gly、Glu、Gln、Ile、Leu、Val、Phe和Pro之組。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個間隔基團而連接到母體肽上，此間隔基團是一個除Cys外的氨基酸殘基，或是一種如Gly-Lys的二肽，并且其中母體肽的一個羧基與Lys殘基或含有一個Lys殘基的二肽中的一個氨基形成一個酰胺鍵，該Lys殘基或含有一個Lys殘基的二肽中的另一個氨基與該親脂性取代基中的一個羧基形成一個酰胺鍵。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個間隔基團連接到母體肽上，此間隔基團是一個除Cys外的氨基酸殘基，或是一種如Gly-Lys的二肽，其中母體肽的一個氨基與該氨基酸殘基間隔基團或二肽間隔基團中的一個羧基形成一個酰胺鍵，并且該氨基酸殘基間隔基團或二肽間隔基團中的一個氨基與親脂性取代基的一個羧基形成一個酰胺鍵。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個間隔基團連接到母體肽上，此間隔基團是一個除Cys外的氨基酸殘基，或是一種如Gly-Lys的二肽，并且其中母體肽的一個羧基與該氨基酸殘基間隔基團或二肽間隔基團中的一個氨基形成一個酰胺鍵，該氨基酸殘基間隔基團或二肽間隔基團中的羧基與親脂性取代基的一個氨基形成一個酰胺鍵。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基通過一個間隔基團連接到母體肽上，此間隔基團是一個除Cys外的氨基酸殘基，或是一種如Gly-Lys的二肽，并且其中母體肽的一個羧基與作為間隔基團的Asp或Glu、或含有一個Asp或Glu殘基的二肽間隔基團中的一個氨基形成一個酰胺鍵，該間隔基團中的一個羧基與該親脂性取代基中的一個氨基形成一個酰胺鍵。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種具有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該親脂性取代基含有一個部分或完全氫化的環(huán)戊菲(cyclopentanophenathrene)骨架。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個為直鏈或分支烷基的親脂性取代基。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個為直鏈或分支脂肪酸的?；挠H脂性取代基。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該親脂性取代基是選自含CH3(CH2)nCO-之組的一個?；渲衝是4-38的整數(shù)，優(yōu)選4-24的整數(shù)，進一步優(yōu)選該親脂性取代基是選自含CH3(CH2)6CO-，CH3(CH2)8CO-，CH3(CH2)10CO-，CH3(CH2)12CO-，CH3(CH2)14CO-，CH3(CH2)16CO-，CH3(CH2)18CO-，CH3(CH2)20CO-和CH3(CH2)22CO-之組。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種具有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該親脂性取代基是直鏈或分支烷烴α，ω-二羧酸的一個?；?。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種有一個親脂性取代基的GLP-1衍生物，該親脂性取代基是選自含HOOC(CH2)mCO-之組的一個酰基，其中m是4-38的整數(shù)，優(yōu)選4-24的整數(shù)，進一步優(yōu)選該親脂性取代基選自含HOOC(CH2)14CO-，HOOC(CH2)16CO-，HOOC(CH2)18CO-，HOOC(CH2)20CO-和HOOC(CH2)22CO-之組。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-的親脂性取代基，其中p和q是整數(shù)，并且p+q是8-33的整數(shù)，優(yōu)選是12-28的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的親脂性取代基，其中r是10-24的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的親脂性取代基，其中s是8-24的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式COOH(CH2)tCO-的親脂性取代基，其中t是8-24的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3的親脂性取代基，其中u是8-18的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3的親脂性取代基，其中w是10-16的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3的親脂性取代基，其中x是10-16的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)yCH3的親脂性取代基，其中y是0或1-22的整數(shù)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它有一個可以帶負(fù)電荷的親脂性取代基。這樣的親脂性取代基例如可以是有一個羧基的取代基。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其母體肽選自GLP-1(1-45)或其類似物。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，它由選自含GLP-1(7-35)，GLP-1(7-36)，GLP-1(7-36)酰胺，GLP-1(7-37)，GLP-1(7-38)，GLP-1(7-39)，GLP-1(7-40)和GLP-1(7-41)之組的一個GLP-1片段或其類似物衍生得到。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1類似物，它由選自含GLP-1(1-35)，GLP-1(1-36)，GLP-1(1-36)酰胺，GLP-1(1-37)，GLP-1(1-38)，GLP-1(1-39)，GLP-1(1-40)和GLP-1(1-41)之組的GLP-1類似物或其類似物衍生得到。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中所指定類似物包含的衍生物中總數(shù)至多15個、優(yōu)選至多10個氨基酸殘基已被任何α-氨基酸殘基更換。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中所指定類似物包含的衍生物中至多15個、優(yōu)選至多10個氨基酸殘基已被任何可以由遺傳密碼編碼的α-氨基酸殘基更換。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中所指定類似物包含的衍生物中至多6個氨基酸殘基已被另一可以由遺傳密碼編碼的α-氨基酸殘基更換。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1(A-B)衍生物，其中A是1-7的整數(shù)，B是38-45的整數(shù)；或此衍生物的類似物，其中含有一個連接到C-末端氨基酸殘基上的親脂性取代基，并且任選地含有連接到另一氨基酸殘基上的第二個親脂性取代基。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明衍生物的母體肽選自以下成員Arg26-GLP-1(7-37)，Arg34-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)和Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明衍生物的母體肽選自以下成員Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(7-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(7-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(7-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(7-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(7-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(1-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(1-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(1-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(1-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(1-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(1-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(1-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(1-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(2-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(2-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(2-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(2-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(2-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(2-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(2-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(2-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(3-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(3-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(3-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(3-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(3-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(3-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(3-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(3-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(4-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(4-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(4-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(4-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(4-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(4-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(4-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(4-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(5-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(5-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(5-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(5-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(5-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(5-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(5-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(5-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(6-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(6-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(6-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(6-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(6-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(6-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(6-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(6-45)，Arg26Lys38-GLP-1(1-38)，Arg34Lys38-GLP-1(1-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(1-38)，Arg26Lys38-GLP-1(7-38)，Arg34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26Lys39-GLP-1(1-39)，Arg34Lys39-GLP-1(1-39)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(1-39)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg34Lys39-GLP-1(7-39)和Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39).
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中的母體肽選自以下成員[Arg26-GLP-1(7-37)，Arg34-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)和Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37).
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中的母體肽選自以下成員Arg26Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)，Gly8Arg26Lys38-GLP-1(7-38)和Gly8Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38).
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中的母體肽選自以下成員Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)和Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39).
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中的母體肽選自以下成員Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)和Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40).
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及一種GLP-1衍生物，其中的母體肽選自以下成員Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Gly8Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-38)；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；
Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Gly8Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-39)；Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-39)；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-39)；Gly8Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-39)；Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-40)；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Gly8Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)；Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)；Gly8Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)；Arg26Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-36)；Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-35)；Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-35)；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-35)；Gly8Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-35)；
Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-35)；Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)酰胺；Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)酰胺；Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26，34-雙(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-36)酰胺；Arg26Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-十四?；?Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?Arg34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-十四?；?Arg34-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?Arg34-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-十四?；?-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26Lys34(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-十四酰基)Arg34-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-十四酰基)Arg34-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36(N-十四酰基)-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-十四?；?-GLP-1(7-39)；Gly8A1g26Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-十四酰基)Arg34-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-十四?；?Arg34-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-十四?；?-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；
Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-38)；Lys34(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-38)；Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-38)；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-39)；Lys34(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-39)；Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-39)；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-36)；Lys34(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-36)；Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Lys34(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；
Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)GLP-1(7-36)酰胺；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-35)；Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-35)；Lys26，34-雙Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-35)；Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)Arg34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)；Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))Arg34-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-38)；Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)Arg34-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)Arg34-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-39)；Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)Arg34-GLP-1(7-40)；
Gly8Lys26(Nε-(ω-羧基十九?；?)Arg34-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-37)；Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-38)；Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Lys34(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-40)；Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-40)；Gly8Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-40)；
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Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-37)；Arg26Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(7-脫氧膽酰基))-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-38)；Gly8Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽?；?)Arg34-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽酰基))Arg34-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(7-脫氧膽酰基))Arg34-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(7-脫氧膽酰基))Arg34-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；
Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(7-脫氧膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26，34-雙(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-40)；Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)；Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)；Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-36)；Gly8Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)；Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-36)；Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-35)；Lys26，34-雙(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-35)；Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-35)；Lys26(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Lys26，34-雙(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Arg26Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(膽酰基))Arg34-GLP-1(7-37)；
Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)Arg34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(膽?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-38)；Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(膽酰基))Arg34-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)Arg34-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-39)；Lys34(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-39)；Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-39)；
Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-39)；Arg26Lys34(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(膽酰基))Arg34-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(膽?；?)Arg34-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36(Nε-(膽酰基))-GLP-1(7-40)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-40)；Arg26Lys34(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-36)；Lys34(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-36)；Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-36)；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)；Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)；Lys26(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-35)；Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-35)；Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-35)；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-35)；Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-35)；Lys26(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；
Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Lys26，34-雙(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Lys26，34-雙(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-36)酰胺；Gly8Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Lys26(Nε-(石膽酰基))Arg34-GLP-1(7-37)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)Arg34-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys36(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Arg26，34Lys38(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-37)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Lys26(Nε-(石膽?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)Arg34-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys36(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Arg26，34Lys38(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-38)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-39)；Lys26(Nε-(石膽?；?)Arg34-GLP-1(7-39)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)Arg34-GLP-1(7-39)；Arg26，34Lys36(Nε-(石膽酰基))-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-39)；Gly8Arg26Lys34(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；Lys26(Nε-(石膽酰基))Arg34-GLP-1(7-40)；Gly8Lys26(Nε-(石膽?；?)Arg34-GLP-1(7-40)；Arg26，34Lys36(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)；和Gly8Arg26，34Lys36(Nε-(石膽?；?)-GLP-1(7-40)。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及含有一種GLP-1衍生物和一種藥劑學(xué)可接受的載體的藥物組合物。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有比GLP-1(7-37)更長時間的作用曲線的藥劑中的用途。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有更長時間的作用效果的用于治療非胰島素依賴性糖尿病的藥劑中的用途。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有更長時間的作用效果的用于治療胰島素依賴性糖尿病的藥劑中的用途。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有更長時間的作用效果的用于治療肥胖癥的藥劑中的用途。
在一個進一步優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及在需要這種治療的病人中治療胰島素依賴性或非胰島素依賴性糖尿病的方法，該方法包括給病人服用治療有效量的權(quán)利要求1所述的GLP-1衍生物與藥劑學(xué)可接受的載體。
對本發(fā)明的詳細(xì)描述為得到GLP-1衍生物充分長時間的作用曲線，連接到GLP-1部分的親脂性取代基優(yōu)選含有4-40個碳原子，尤其是8-25個碳原子。該親脂性取代基可以通過其羧基和與之相連的氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵而連接到GLP-1部分的氨基上?；蜻x擇地，該親脂性取代基可以通過其氨基和所述氨基酸殘基的羧基形成酰胺鍵而連接到該氨基酸殘基上。作為另外一種選擇，該親脂性取代基可以通過酯鍵而連接到GLP-1部分。正常地，可以通過GLP-1部分的羧基與該取代基的羥基之間的反應(yīng)，或通過GLP-1部分的羥基與取代基的羧基之間的反應(yīng)而形成酯鍵。作為另外一種選擇，該親脂性取代基可以是烷基，它被引入GLP-1部分的伯氨基中。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，該親脂性取代基通過一個間隔基團的一個羧基與GLP-1部分的一個氨基形成酰胺鍵，從而連接到GLP-1部分。適宜的間隔基團的例子有琥珀酸、Lys、Glu或Asp，或一種如Gly-Lys的二肽。當(dāng)間隔基團是琥珀酸時，它的一個羧基可以與氨基酸殘基的一個氨基形成酰胺鍵，并且它的另一個羧基可以與該親脂性取代基的氨基形成酰胺鍵。當(dāng)間隔基團是Lys、Glu或Asp時，其羧基可以與氨基酸殘基的氨基形成酰胺鍵，并且其氨基可以與親脂性取代基的羧基形成酰胺鍵。當(dāng)以Lys作為間隔基團時，在一些情況下可以在Lys的ε-氨基與該親脂性取代基之間插入另外的間隔基團。在一個優(yōu)選的實施方案中，這一另外的間隔基團是琥珀酸，它與Lys的ε-氨基和親脂性取代基中存在的氨基形成酰胺鍵。在另一個優(yōu)選的實施方案中，這一另外的間隔基團是Glu或Asp，它與Lys的ε-氨基形成一個酰胺鍵，與親脂性取代基中出現(xiàn)的羧基形成另一個酰胺鍵，即該親脂性取代基是一個Nε-酰基化的賴氨酸殘基。
在本發(fā)明的另一優(yōu)選實施方案中，該親脂性取代基有一個可以帶負(fù)電的基團。一種優(yōu)選的可以帶負(fù)電荷的基團是羧基。
可以通過這樣一種方法制備母體肽，該方法包括在允許肽表達的條件下，在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)含有編碼該多肽的DNA序列并能表達該肽的宿主細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的肽。
用來培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是用于培養(yǎng)該宿主細(xì)胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，如基本培養(yǎng)基或含有適宜添加物的復(fù)合培養(yǎng)基?？梢酝ㄟ^市售得到適宜的培養(yǎng)基，或根據(jù)已公開的制法制備適宜的培養(yǎng)基(如美國典型培養(yǎng)物保藏中心目錄中介紹的方法)。然后可以通過常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收由該細(xì)胞產(chǎn)生的多肽，這些方法包括通過離心或過濾而從培養(yǎng)基中分離宿主細(xì)胞，用鹽如硫酸銨沉淀上清液或濾液中的蛋白質(zhì)成分，根據(jù)目的肽的種類而選用各種層析方法如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等進行純化。
編碼母體肽的DNA序列可以來源于基因組或cDNA，如通過制備基因組或cDNA文庫，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如，見Sambrook，J，F(xiàn)ritsch，EF和Maniatis，T，分子克隆實驗操作指南，Cold Spring HarborLaboratory Press，紐約，1989)使用合成的寡核苷酸探針，進行雜交而篩選出編碼該肽的全部或部分的DNA序列。也可以通過已建立的標(biāo)準(zhǔn)方法，如Beaucage和Caruthers所述的磷酰胺(phosphoamidite)方法(四面體快報，22(1981)，1859-1869)，或Matthes等所述的方法(歐洲分子生物學(xué)組織雜志，3(1984)，801-805)合成該編碼肽的DNA序列。也可以使用特定的引物，如US4,683,202或Saiki等在《科學(xué)》，239(1988)，487-491所述，通過聚合酶鏈反應(yīng)制備DNA序列。
可以將DNA序列插入任何便于進行DNA重組過程的載體中，并且載體的選擇常常取決于該載體將要被引入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是一種自主復(fù)制型載體，即作為一個染色體外實體存在的載體，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制，如質(zhì)粒?；蛘?，載體可以是這樣一種類型，當(dāng)將其引入宿主細(xì)胞時，它將整合到宿主細(xì)胞基因組中，并與它所整合入的染色體一起復(fù)制。
載體優(yōu)選是一種表達載體，其內(nèi)編碼所述肽的DNA序列與該DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它區(qū)段(如啟動子)有效相連。啟動子可以是在選用的宿主細(xì)胞中有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，它可以來源于編碼宿主細(xì)胞同源性或異源性蛋白質(zhì)的基因。本領(lǐng)域熟知適于在多種宿主細(xì)胞中指導(dǎo)編碼本發(fā)明肽的DNA進行轉(zhuǎn)錄的啟動子例子，參見如Sambrook等，出處同前。
需要時，編碼該肽的DNA序列也可以與合適的終止子、多聚腺苷酸化信號、轉(zhuǎn)錄增強子序列和翻譯增強子序列有效連接。本發(fā)明的重組載體還可以含有能使其在目的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。
載體還可以含有一個選擇標(biāo)記，如一個基因，其基因產(chǎn)物將彌補宿主細(xì)胞內(nèi)的一個缺陷，或者能賦予對藥物如氨芐青霉素、卡那霉素、四環(huán)素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤等的抗性。
為將本發(fā)明的母體肽引入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供一個分泌信號序列(也稱之為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。分泌信號序列以正確讀框與編碼該肽的DNA序列連接。分泌信號序列通常位于編碼該肽的DNA序列的5’側(cè)。分泌信號序列可以是正常地與該肽連接的分泌信號序列，或可以源于編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
用于分別連接編碼本發(fā)明肽的DNA序列、啟動子和可選擇的終止子和/或分泌信號序列，并將其插入到適宜的含有復(fù)制所必需的信息的載體中的方法，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是已知的(參見如Sambrook等，出處同前)。
將導(dǎo)入DNA序列或重組載體的宿主細(xì)胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明肽的任何細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核生物細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知并使用的適宜的宿主細(xì)胞的例子如下，但不限于這些大腸桿菌，釀酒酵母，或哺乳動物BHK或CHO細(xì)胞系。
國際專利申請No.WO87/06941(The General HospitalCorporation)記載了根據(jù)本發(fā)明可以用作GLP-1部分的化合物的例子，該申請涉及一種含有GLP-1(7-37)及其功能性衍生物的肽片段和它作為促胰島素劑的用途。
國際專利申請No.90/11296(The General Hospital orporation)記載了其它GLP-1類似物，該申請涉及含有GLP-1(7-36)及其功能性衍生物的肽片段，這些肽片段具有超過GLP-1(1-36)或GLP-1(1-37)的促胰島素活性，還涉及它們作為促胰島素劑的用途。
國際專利申請No.91/11457(Buckley等)公開了活性GLP-1肽7-34，7-35，7-36和7-37的類似物，根據(jù)本發(fā)明它們也能用作GLP-1部分。
藥物組合物根據(jù)本發(fā)明含有GLP-1衍生物的藥物組合物可以胃腸外施用于需要這種治療的病人?？梢杂米⑸淦鳎蛇x擇地用筆式注射器通過皮下、肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)注射進行胃腸外給藥。另外，可以通過輸液泵進行胃腸外給藥。另外的選擇是一種用于鼻或肺噴霧形式施用的GLP-1衍生物粉狀或液體組合物。本發(fā)明的GLP-1衍生物還可以選擇透皮途徑給藥，如經(jīng)貼劑透皮給藥，可選擇離子透入貼劑；或經(jīng)透粘膜途徑給藥，如透過頰粘膜。
可以用常規(guī)技術(shù)，如Remington的《藥物科學(xué)》，1985或Remington藥物科學(xué)與實踐，19版，1995所述的方法，制備含有本發(fā)明GLP-1衍生物的藥物組合物。
因此，可以用制藥工業(yè)的常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明GLP-1衍生物的注射用組合物，這些技術(shù)包括適當(dāng)?shù)厝芙夂突旌细鹘M分以得到所需的最終產(chǎn)物。
根據(jù)一種方法，將GLP-1衍生物溶解于一定量的水中，其中水的量稍小于所制備的組合物的最終體積。按需要加入等滲劑、防腐劑和緩沖劑，并在需要時用酸如鹽酸、或堿如氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)溶液的pH值。最后，用水調(diào)節(jié)溶液體積得到所需的組分濃度。
等滲劑例如有氯化鈉、甘露糖醇、甘油。
防腐劑例如有苯酚、間甲酚、甲基對羥基苯甲酸酯、芐醇。
適宜的緩沖劑如乙酸鈉和磷酸鈉。
除上述成分外，含有本發(fā)明GLP-1衍生物的溶液也可以含有表面活性劑以改善GLP-1衍生物的溶解性和穩(wěn)定性。
可以按歐洲專利No.272097(Nordisk A/S)或WO93/18785所述制備用于鼻腔給藥的某些肽的組合物。
根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，以適于注射給藥的組合物形式提供GLP-1衍生物的組合物。這種組合物既可以是隨時可用的注射液，也可以是一定量的固態(tài)組合物，如一種凍干制品，需要在注射前將其溶解在溶劑中。此注射用溶液中所含GLP-1衍生物不少于2mg/ml，優(yōu)選不少于5mg/ml，更優(yōu)選不少于10mg/ml，并優(yōu)選不多于100mg/ml。
本發(fā)明的GLP-1衍生物可用于治療各種疾病。病人所用的具體GLP-1衍生物和最佳劑量水平將取決于待治療的疾病和各種因素，包括所用的具體肽衍生物的效能及病人的年齡、體重、身體活動性和飲食，還取決于可能與其它藥物的聯(lián)合用藥以及病情的嚴(yán)重程度。建議本領(lǐng)域的技術(shù)人員針對每個病人確定本發(fā)明GLP-1衍生物的劑量。
具體地說，預(yù)計GLP-1衍生物對于制備具有更長時間的作用曲線的用于治療非胰島素依賴性糖尿病和/或治療肥胖癥的藥物將是有用的。
可以用以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)認(rèn)為這些實施例是對保護范圍的限定。前面的描述和以下實施例所公開的特點分別地或任意組合地，對于以各種方式實現(xiàn)本發(fā)明是重要的。
實施例使用市售化學(xué)制品的以下縮寫DMFN，N-二甲基甲酰胺NMPN-甲基-2-吡咯烷酮EDPAN-乙基-N，N-二異丙胺EGTA乙二醇二(β-氨基乙醚)-N，N，N’，N’-四乙酸GTP鳥苷5’-三磷酸TFA三氟乙酸THF四氫呋喃Myr-ONSu十四烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯Pal-ONSu十六烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯Ste-ONSu十八烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)6-COONSuω-羧基庚酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)10-COONSuω-羧基十一烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)12-COONSuω-羧基十三烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)14-COONSuω-羧基十五烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)16-COONSuω-羧基十七烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯HOOC-(CH2)18-COONSuω-羧基十九烷酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯縮寫PDMS等離子體解吸附質(zhì)譜測定法(Plasma Desorption MassSpectormetry)MALDI-MS基質(zhì)輔助的激光解吸附/電離質(zhì)譜測定法HPLC高效液相層析法amu原子質(zhì)量單位分析等離子體解吸附質(zhì)譜測定法樣品制備將樣品溶于0.1％TFA/EtOH(1∶1)，使其濃度達到1μg/μl。將樣品溶液(5-10μl)置于硝酸纖維素靶(Bio-ion AB，Uppsala，瑞典)上并使其在靶的表面吸收2分鐘。隨后用2×25μl 0.1％TFA將靶清洗并旋轉(zhuǎn)干燥。最后將硝酸纖維素靶置于靶旋轉(zhuǎn)器內(nèi)并放入質(zhì)譜儀中。
質(zhì)譜分析用Bio-ion 20飛行時間裝置(Bio-ion Nordic AB，Uppsala，瑞典)進行PDMS分析。使用15kV的加速電壓，使由252-Cf裂變片段轟擊硝酸纖維素表面形成的分子離子加速射向一終端檢測器。在m/z 1和30分別使用H+和NO+離子將產(chǎn)生的飛行時間譜校正為一種真正的質(zhì)譜。一般累積在15-20分鐘內(nèi)的1.0×106次裂變得到質(zhì)譜。所測得的質(zhì)量均對應(yīng)于同位素平均分子質(zhì)量。質(zhì)量測定的精確度一般好于0.1％。MALDI-MS使用一種安裝有延遲分離裝置并以線性方式工作的Voyager RP儀器(PerSeptive Biosystems Inc.，F(xiàn)ramingham，MA)進行MALDI-MS分析。使用α-氰基-4-羥基-肉桂酸作為基質(zhì)，并基于外部校正法進行質(zhì)量測定。
例1Lys26(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)的合成由GLP-1(7-37)合成得到目標(biāo)化合物。將GLP-1(7-37)(25mg，7.45μm)，EDPA(26.7mg，208μm)，NMP(520μl)和水(260μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入Myr-ONSu(2.5mg，7.67μm)溶于NMP(62.5μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后放置20分鐘。另加入Myr-ONSu(2.5mg，7.67μm)溶于NMP(62.5μl)得到的溶液，將所得混合物溫和搖動5分鐘。經(jīng)過40分鐘的總反應(yīng)時間后，向其中加入甘氨酸(12.5mg，166μmol)溶于50％乙醇水溶液(12.5ml)中制得的溶液終止反應(yīng)。使用氰丙基(cyanopropyl)柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過HPLC法從反應(yīng)混合物中分離目標(biāo)化合物，產(chǎn)量為1.3mg(相當(dāng)于理論產(chǎn)率的4.9％)。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。用PDMS法分析分離出的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化分子離子峰的m/z值為3567.9±3。因此得出的分子量為3566.9±3amu(理論值為3565.9amu)。由金黃色葡萄球菌V8蛋白酶對目標(biāo)化合物進行酶解切割，隨后通過PDMS進行肽片段的質(zhì)量測定，從而確定?；恢?Lys26)。
除目標(biāo)化合物外，用同樣的層析柱和更窄的梯度(60分鐘內(nèi)乙腈35-38％)從反應(yīng)混合物中分離得到其它兩種GLP-1衍生物，見例2和3。
例2Lys34(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)的合成通過HPLC法從例1所述反應(yīng)混合物中分離得到目標(biāo)化合物。經(jīng)PDMS分析得到m/z為3567.7±3的質(zhì)子化分子離子峰。因此發(fā)現(xiàn)分子量為3566.7±3amu(理論值為3565.9amu)。根據(jù)斷裂方式確定酰基化位置。
例3Lys26，34-雙(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)的合成通過HPLC法從例1所述反應(yīng)混合物中分離得到目標(biāo)化合物。PDMS分析得到m/z為3778.4±3的質(zhì)子化分子離子峰。因此發(fā)現(xiàn)分子量為3777.4±3amu(理論值為3776.1amu)。
例4Lys26(Nε-十四?；?Arg34-GLP-1(7-37)的合成由Arg34-GLP-1(7-37)合成得到目標(biāo)化合物。將Arg34-GLP-1(7-37)(5mg，1.47μm)，EDPA(5.3mg，41.1μm)，NMP(105μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入Myr-ONSu(0.71mg，2.2μm)溶于NMP(17.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后放置20分鐘。經(jīng)過30分鐘的總反應(yīng)時間后，向其中加入甘氨酸(25mg，33.3μm)溶于50％乙醇水溶液(2.5ml)中制得的溶液終止反應(yīng)。按例1所述經(jīng)HPLC法純化反應(yīng)混合物。PDMS分析得到m/z值為3594.9±3的質(zhì)子化分子離子峰。得出的分子量為3593.9±3amu(理論值為3593.9amu)。
例5Gly8Arg26，34Lys36(Nε-十四?；?-GLP-1(7-37)的合成由購自QCB的Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)合成得到目標(biāo)化合物。將Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)(1.3mg，0.39μm)，EDPA(1.3mg，10μm)，NMP(125μl)和水(30μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入Myr-ONSu(0.14mg，0.44μm)溶于NMP(3.6ml)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動15分鐘。向其中加入甘氨酸(0.1mg，1.33μm)溶于50％乙醇水溶液(10μl)中制得的溶液終止反應(yīng)。用HPLC法純化反應(yīng)混合物，分離出目標(biāo)化合物(60μg，4％)。
例6Arg26，34Lys36(Nε-十四酰基)-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)-OH(5.0mg，1.477μmol)，EDPA(5.4mg，41.78μmol)，NMP(105μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入Myr-ONSu(0.721mg，2.215μmol)溶于NMP(18μl)得到的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，并使其在室溫另外保持45分鐘。向其中加入甘氨酸(2.5mg，33.3μmol)溶于50％乙醇水溶液(250μl)中制得的溶液終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離目標(biāo)化合物(1.49mg，28％)，然后用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3595±3。因此得出的分子量為3594±3amu(理論值為3594amu)。
例7Lys26，34雙(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將GLP-1(7-37)-OH(70mg，20.85μmol)，EDPA(75.71mg，585.8μmol)，NMP(1.47ml)和水(700μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)18-COONSu(27.44mg，62.42μmol)溶于NMP(686μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，并使其在室溫另外保持50分鐘。向其中加入甘氨酸(34.43mg，458.7μmol)溶于50％乙醇水溶液(3.44ml)中制得的溶液終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離目標(biāo)化合物(8.6mg，10％)，然后用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為4006±3。因而得出的分子量為4005±3amu(理論值為4005amu)。
例8Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-36)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-OH(5.06mg，1.52μmol)，EDPA(5.5mg，42.58μmol)，NMP(106μl)和水(100μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)18-COONSu(1.33mg，3.04μmol)溶于NMP(33.2μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2.5小時。向其中加入甘氨酸(2.50mg，33.34μmol)溶于50％乙醇水溶液(250μl)中制得的溶液終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.46mg，8％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3652±3。因而得出分子量為3651±3amu(理論值為3651amu)。
例9Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十九?；?)-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(5.556mg，1.57μmol)、EDPA(5.68mg，43.96μmol)、NMP(116.6μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)18-COONSu(1.38mg，3.14μmol)溶于NMP(34.5μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2.5小時。向其中加入甘氨酸(2.5mg，33.3μmol)溶于50％乙醇水溶液(250μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.7mg，12％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3866±3。因而得出分子量為3865±3amu(理論值為3865amu)。
例10Arg34Lys26(Nε-(ω-羧基十九酰基))-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(5.04mg，1.489μmol)、EDPA(5.39mg，41.70μmol)、NMP(105μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)18-COONSu(1.31mg，2.97μmol)溶于NMP(32.8μl)而得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置30分鐘。向其中加入甘氨酸(2.46mg，32.75μmol)溶于50％乙醇水溶液(246μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(1.2mg，22％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3709±3。因而得出分子量為3708±3amu(理論值為3708amu)。
例11
Arg34Lys26(Nε-(ω-羧基十七?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(5.8mg，1.714μmol)、EDPA(6.20mg，47.99μmol)、NMP(121.8μl)和水(58μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)16-COONSu(2.11mg，5.142μmol)溶于NMP(52.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2小時。向其中加入甘氨酸(2.83mg，37.70μmol)溶于50％乙醇水溶液(283μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.81mg，13％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3681±3。因而得出分子量為3680±3amu(理論值為3680amu)。
例12Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十七?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)-OH(3.51mg，1.036μmol)、EDPA(3.75mg，29.03μmol)、NMP(73.8μl)和水(35μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)16-COONSu(1.27mg，3.10μmol)溶于NMP(31.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2小時10分鐘。向其中加入甘氨酸(1.71mg，22.79μmol)溶于50％乙醇水溶液(171μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.8mg，21％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3682±3。因而得出分子量為3681±3amu(理論值為3681amu)。
例13Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十七?；?)-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(5.168mg，1.459μmol)、EDPA(5.28mg，40.85μmol)、NMP(108.6μl)和水(51.8μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)16-COONSu(1.80mg，4.37μmol)溶于NMP(45μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動10分鐘，然后在室溫再放置2小時15分鐘。向其中加入甘氨酸(2.41mg，32.09μmol)溶于50％乙醇水溶液(241μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.8mg，14％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3838±3。因而得出分子量為3837±3amu(理論值為3837amu)。
例14Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十七酰基))-GLP-1(7-36)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-OH(24.44mg，7.34μmol)、EDPA(26.56mg，205.52μmol)、NMP(513μl)和水(244.4μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)16-COONSu(9.06mg，22.02μmol)溶于NMP(1.21ml)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置30分鐘。向其中加入甘氨酸(12.12mg，161.48μmol)溶于50％乙醇水溶液(1.21ml)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(7.5mg，28％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3625±3。因而得出分子量為3624±3amu(理論值為3624amu)。
例15Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十一酰基))-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)-OH(4.2mg，1.24μmol)、EDPA(4.49mg，34.72μmol)、NMP(88.2μl)和水(42μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)10-COONSu(1.21mg，3.72μmol)溶于NMP(30.25μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置40分鐘。向其中加入甘氨酸(2.04mg，27.28μmol)溶于50％乙醇水溶液(204μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.8mg，18％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3598±3。因而得出分子量為3597±3amu(理論值為3597amu)。
例16Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十一?；?)-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(5.168mg，1.46μmol)、EDPA(5.28mg，40.88μmol)、NMP(108.6μl)和水(51.7μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)10-COONSu(1.43mg，4.38μmol)溶于NMP(35.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置50分鐘。向其中加入甘氨酸(2.41mg，32.12μmol)溶于50％乙醇水溶液(241μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.85mg，16％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3753±3。因而得出分子量為3752±3amu(理論值為3752amu)。
例17Arg26，34雙(Nε-(ω-羧基十一?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將GLP-1(7-37)-OH(10.0mg，2.98μmol)、EDPA(10.8mg，83.43μmol)、NMP(210μl)和水(100μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)10-COONSu(2.92mg，8.94μmol)溶于NMP(73μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置50分鐘。向其中加入甘氨酸(4.92mg，65.56μmol)溶于50％乙醇水溶液(492μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(1.0mg，9％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3781±3。因而得出分子量為3780±3amu(理論值為3780amu)。
例18Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基十一酰基))-GLP-1(7-36)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-OH(15.04mg，4.52μmol)、EDPA(16.35mg，126.56μmol)、NMP(315.8μl)和水(150.4μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)10-COONSu(4.44mg，13.56μmol)溶于NMP(111μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置40分鐘。向其中加入甘氨酸(7.5mg，99.44μmol)溶于50％乙醇水溶液(250μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(3.45mg，22％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3540±3。因而得出分子量為3539±3amu(理論值為3539amu)。
例19Arg34Lys26(Nε-(ω-羧基十一酰基))-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(5.87mg，1.73μmol)、EDPA(6.27mg，48.57μmol)、NMP(123.3μl)和水(58.7μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)10-COONSu(1.70mg，5.20μmol)溶于NMP(42.5μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置40分鐘。向其中加入甘氨酸(2.86mg，286μmol)溶于50％乙醇水溶液(286μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(1.27mg，20％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3597±3。因而得出分子量為3596±3amu(理論值為3596amu)。
例20Arg34Lys26(Nε-(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(4.472mg，1.32μmol)、EDPA(4.78mg，36.96μmol)、NMP(94μl)和水(44.8μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)6-COONSu(1.07mg，3.96μmol)溶于NMP(26.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置1小時50分鐘。向其中加入甘氨酸(2.18mg，29.04μmol)溶于50％乙醇水溶液(218μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.5mg，11％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3540±3。因而得出分子量為3539±3amu(理論值為3539amu)。
例21Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(5.168mg，1.459μmol)、EDPA(5.28mg，40.85μmol)、NMP(108.6μl)和水(51.6μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)6-COONSu(1.18mg，4.37μmol)溶于NMP(29.5μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置1小時50分鐘。向其中加入甘氨酸(2.40mg，32.09μmol)溶于50％乙醇水溶液(240μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.5mg，9％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3697±3。因而得出分子量為3695±3amu(理論值為3695amu)。
例22Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基庚酰基))-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)-OH(5.00mg，1.47μmol)、EDPA(5.32mg，41.16μmol)、NMP(105μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)6-COONSu(1.19mg，4.41μmol)溶于NMP(29.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2小時。向其中加入甘氨酸(2.42mg，32.34μmol)溶于50％乙醇水溶液(242μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.78mg，15％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3542±3。因而得出分子量為3541±3amu(理論值為3541amu)。
例23Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-36)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-OH(5.00mg，1.50μmol)、EDPA(5.44mg，42.08μmol)、NMP(210μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)6-COONSu(1.22mg，4.5μmol)溶于NMP(30.5μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2小時。向其中加入甘氨酸(2.47mg，33.0μmol)溶于50％乙醇水溶液(247μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.71mg，14％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3484±3。因而得出分子量為3483±3amu(理論值為3483amu)。
例24Arg26，34雙(Nε-(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將GLP-1(7-37)-OH(10mg，2.5μmol)、EDPA(10.8mg，83.56μmol)、NMP(210μl)和水(100μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)6-COONSu(2.42mg，8.92μmol)溶于NMP(60.5μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置2小時35分鐘。向其中加入甘氨酸(4.92mg，65.54μmol)溶于50％乙醇水溶液(492μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離目標(biāo)化合物(2.16mg，24％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3669±3。得出的分子量為3668±3amu(理論值為3668amu)。
例25Arg34Lys26(Nε-(ω-羧基十五?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(4.472mg，1.321μmol)、EDPA(4.78mg，36.99μmol)、NMP(93.9μl)和水(44.7μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)14-COONSu(1.519mg，3.963μmol)溶于NMP(38μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置1小時。向其中加入甘氨酸(2.18mg，29.06μmol)溶于50％乙醇水溶液(218μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.58mg，12％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3654±3。因而得出分子量為3653±3amu(理論值為3653amu)。
例26Arg26，34Lys36(Nε-(ω-羧基庚?；?)-GLP-1(7-36)-OH的合成將Arg26，34Lys36-GLP-1(7-36)-OH(5.00mg，1.50μmol)、EDPA(5.44mg，42.08μmol)、NMP(210μl)和水(50μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入HOOC-(CH2)14-COONSu(1.72mg，4.5μmol)溶于NMP(43μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置1小時。向其中加入甘氨酸(2.48mg，33μmol)溶于50％乙醇水溶液(248μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.58mg，11％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3596±3。因而得出分子量為3595±3amu(理論值為3595amu)。
例27石膽酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯的合成向含有石膽酸(5.44g，14.34mmol)、N-羥基琥珀酰亞胺(1.78g，15.0mmol)、無水THF(120ml)和無水乙腈(30ml)并保持在10℃的混合物中加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(3.44g，16.67mmol)溶于無水THF制得的溶液。反應(yīng)混合物在環(huán)境溫度下攪拌16小時，過濾并真空濃縮。將殘余物溶解于二氯甲烷(450ml)中，用10％碳酸鈉水溶液(2×150ml)和水(2×150ml)洗滌，并干燥(硫酸鎂)。過濾，將濾液真空濃縮得到晶態(tài)殘余物。從二氯甲烷(30ml)和正庚烷(30ml)的混合物中重結(jié)晶殘余物，以結(jié)晶固體形式得到目標(biāo)化合物(3.46g，51％)。
例28Arg34Lys26(Nε-石膽酸基)-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(4.472mg，1.32μmol)、EDPA(4.78mg，36.96μmol)、NMP(94μl)和水(44.8μl)的混合物在室溫溫和搖動10分鐘。向所得混合物中加入由石膽酸2，5-二氧代吡咯烷-1-基酯(1.87mg，3.96μmol)溶于NMP(46.8μl)得到的溶液，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置1小時。加入甘氨酸(2.18mg，29.04μmol)溶于50％乙醇水溶液(218μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(1.25mg，25％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3744±3。因而得出分子量為3743±3amu(理論值為3743amu)。
例29Nα-十四?；?Glu(ONSu)-OBut的合成向H-Glu(OH)-OBut(2.5g，12.3mmol)，DMF(283ml)和EDPA(1.58g，12.3mmol)的懸液中滴加Myr-ONSu(4.0g，12.3mmol)溶于DMF(59ml)制得的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫攪拌16小時，然后真空濃縮至總體積為20ml。將殘余物在5％檸檬酸水溶液(250ml)和乙酸乙酯(150ml)之間分配，分離兩相。有機相真空濃縮后，將殘余物溶于DMF(40ml)中。將所得溶液滴加入保持在0℃的10％檸檬酸水溶液(300ml)中。收集沉淀化合物，并用冰水洗滌，在真空干燥箱中干燥。將干燥后的化合物溶于DMF(23ml)，并加入HONSu(1.5g，13mmol)。向所得混合物中加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(2.44g，11.9mmol)溶于二氯甲烷(47ml)制得的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫攪拌16小時，然后將沉淀化合物過濾。將沉淀從正庚烷/2-丙醇中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物(3.03g，50％)。
例30Glu22，23，30Arg26，34Lys38(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十四酰基)))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Glu22，23，30Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(1.0mg，0.272μmol)、EDPA(0.98mg，7.62μmol)、NMP(70μl)和水(70μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例29方法制得的Nα-十四?；?Glu(ONSu)-OBut(0.41mg，u.816μmol)溶解于NMP(10.4μl)所得溶液，加入所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置45分鐘。向其中加入甘氨酸(0.448mg，5.98μmol)溶于50％乙醇水溶液(45μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(0.9ml)，將所得混合物沖洗到Varian500mg C8Mega Bond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(10ml)清洗已固定的化合物，最終通過用TFA(10ml)洗脫將其從柱中釋放下來。將洗脫物真空濃縮，使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離目標(biāo)化合物(0.35mg，32％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為4012±3。因而得出分子量為4011±3amu(理論值為4011amu)。
例31Glu23，26Arg34Lys38(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十四酰基)))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Glu23，26Arg34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(6.07mg，1.727μmol)、EDPA(6.25mg，48.36μmol)、NMP(425μl)和水(425μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例29方法制得的Nα-十四?；?Glu(ONSu)-OBut(2.65mg，5.18μmol)溶解于NMP(66.3μl)所得溶液，加入所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置45分鐘。向其中加入甘氨酸(2.85mg，38.0μmol)溶于50％乙醇水溶液(285μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(5.4ml)，將所得混合物沖洗到Varian 500mg C8 Mega Bond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(10ml)清洗已固定的化合物，最終通過用TFA(10ml)洗脫將其從柱中釋放下來。將洗脫物真空濃縮，使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.78mg，12％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3854±3。因而得出分子量為3853±3amu(理論值為3853amu)。
例32Lys26，34-雙(Nε-(ω-羧基十三?；?)-GLP-1(7-37)-OH的合成將GLP-1(7-37)-OH(30mg，8.9μmol)、EDPA(32.3mg，250μmol)、NMP(2.1ml)和水(2.1ml)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將HOOC-(CH2)12-COONSu(12.7mg，35.8μmol)溶解于NMP(318μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時40分鐘。向其中加入甘氨酸(3.4mg，44.7μmol)溶于50％乙醇水溶液(335μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。，使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(10mg，29％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3840±3。因而得出分子量為3839±3amu(理論值為3839amu)。
例33Lys26，34-雙(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十四酰基)))-GLP-1(7-37)-OH的合成(NNC 90-1167)將GLP-1(7-37)-OH(300mg，79.8μmol)、EDPA(288.9mg，2.24mmol)、NMP(21ml)和水(21ml)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例29方法制得的Nα-十四?；?Glu(ONSu)-OBut(163mg，319.3μmol)溶解于NMP(4.08ml)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫再放置1小時。向其中加入甘氨酸(131.8mg，1.76mmol)溶于50％乙醇水溶液(13.2ml)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(250ml)，將所得混合物分成4等份。將每份樣品沖洗到Varian 500mg C8 MegaBond Elut_柱體上，用0.1％TFA水溶液(3.5ml)清洗已固定的化合物，最終用70％乙腈水溶液(4ml)洗脫而將其從柱中釋放下來。用0.1％TFA水溶液(300ml)將合并的洗脫物稀釋。離心收集沉淀化合物，用0.1％TFA水溶液(50ml)洗滌，最終離心分離沉淀化合物。向沉淀中加入TFA(60ml)，將所得反應(yīng)混合物在室溫攪拌1小時30分鐘。真空除去多余的TFA，將殘余物傾入水(50ml)中。使用氰丙基柱(Zorbax300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化沉淀化合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(27.3mg，8％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為4036±3。因而得出分子量為4035±3amu(理論值為4035amu)。
例34Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十五酰基))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(30mg，809μmol)、EDPA(32.3mg，250μmol)、NMP(2.1ml)和水(2.1ml)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將HOOC-(CH2)14-COONSu(13.7mg，35.8μmol)溶解于NMP(343μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時。向其中加入甘氨酸(3.4mg，44.7μmol)溶于50％乙醇水溶液(335μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(4.8mg，14％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3894±3。因而得出分子量為3893±3amu(理論值為3893amu)。
例35Nα-十六?；?Glu(ONSu)-OBut的合成向H-Glu(OH)-OBut(4.2g，20.6mmol)，DMF(500ml)和EDPA(2.65g，20.6mmol)的懸液中滴加Pal-ONSu(7.3g，20.6mmol)溶于DMF(100ml)制得的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫攪拌64小時，然后真空濃縮至總體積為20ml。將殘余物在10％檸檬酸水溶液(300ml)和乙酸乙酯(250ml)之間分配，分離兩相。有機相真空濃縮后，將殘余物溶于DMF(50ml)。將所得溶液滴加入保持在0℃的10％檸檬酸水溶液(500ml)中。收集沉淀化合物，并用冰水洗滌，在真空干燥箱中干燥。將干燥后的化合物溶于DMF(45ml)，并加入HONSu(2.15g，18.7mmol)。向所得混合物中加入N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺(3.5g，17mmol)溶于二氯甲烷(67ml)制得的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫攪拌16小時，然后將沉淀化合物過濾。將沉淀從正庚烷/2-丙醇中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物(6.6g，72％)。
例36Lys26，34-雙(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十六?；?))-GLP-1(7-37)-OH的合成將GLP-1(7-37)-OH(10mg，2.9μmol)、EDPA(10.8mg，83.4μmol)、NMP(0.7ml)和水(0.7ml)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例33方法制得的Nα-十六?；?Glu(ONSu)-OBut(163mg，319.3μmol)溶解于NMP(4.08ml)所得溶液，向其中加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時20分鐘。加入甘氨酸(4.9mg，65.6μmol)溶于50％乙醇水溶液(492μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(9ml)，將所得混合物沖洗到一個Varian 1g C8Mega Bond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(10ml)清洗已固定的化合物，最終用TFA(10ml)洗脫而將其從柱上釋放下來。真空濃縮洗脫物，使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化殘余物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(2.4mg，20％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為4092±3。因而得出分子量為4091±3amu(理論值為4091amu)。
例37Arg34Lys26(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十六?；?))-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(3.7mg，1.1μmol)、EDPA(4.0mg，30.8μmol)、乙腈(260μl)和水(260μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例35方法制得的Nα-十六?；?Glu(ONSu)-OBut(1.8mg，3.3μmol)溶解于乙腈(44.2μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時20分鐘。向其中加入甘氨酸(1.8mg，24.2μmol)溶于50％乙醇水溶液(181μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(12ml)和NMP(300μL)，將所得混合物沖洗到Varian 1g C8Mega Bond Elut_膜柱體上，用5％乙腈水溶液(10ml)清洗已固定的化合物，最終用TFA(6ml)洗脫而將其從柱中釋放下來。將洗脫物在室溫放置2小時，然后真空濃縮。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過用柱層析法純化殘余物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.23mg，6％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3752±3。因而得出分子量為3751±3amu(理論值為3751amu)。
例38Arg26，34Lys38(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十四?；?))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(14mg，4.0μmol)、EDPA(14.3mg，110.6μmol)、NMP(980μl)和水(980μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例29方法制得的Nα-十四?；?Glu(ONSu)-OBut(12.1mg，23.7μmol)溶解于NMP(303μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動2小時。向其中加入甘氨酸(6.5mg，86.9mmol)溶于50％乙醇水溶液(652μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(50ml)，將所得混合物沖洗到Varian 1gC8 Mega Bond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(15ml)清洗已固定的化合物，最終用TFA水溶液(6ml)洗脫而將其從柱中釋放下來。將洗脫物在室溫放置1小時45分鐘，然后真空濃縮。使用氰丙基柱(Zorbax300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化殘余物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(3.9mg，26％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3881±3。因而得出分子量為3880±3amu(理論值為3880amu)。
例39Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十五酰基))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(14mg，4.0μmol)、EDPA(14.3mg，111μmol)、NMP(980μl)和水(980μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將HOOC-(CH2)14-COONSu(4.5mg，11.9μmol)溶解于NMP(114μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時45分鐘。另加入HOOC-(CH2)14-COONSu(4.0mg，10.4μmol)溶解于NMP(100μl)所得溶液，將所得混合物在室溫再溫和搖動1小時30分鐘。向其中加入甘氨酸(1.5mg，19.8μmol)溶于50％乙醇水溶液(148μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過用柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(3.9mg，26％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3809±3。因而得出分子量為3808±3amu(理論值為3808amu)。
例40Arg26，34Lys38(Nε-(γ-谷氨酰基(Nα-十六?；?))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(14mg，4.0μmol)、EDPA(14.3mg，110.6μmol)、NMP(980μl)和水(980μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例35方法制得的Nα-十六酰基-Glu(ONSu)-OBut(6.4mg，11.9μmol)溶解于NMP(160μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時20分鐘。向其中加入甘氨酸(6.5mg，87mmol)溶于50％乙醇水溶液(653μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(50ml)，將所得混合物沖洗到Varian 1g C8 MegaBond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(10ml)清洗已固定的化合物，最終用TFA(6ml)洗脫而將其從柱中釋放下來。將洗脫物在室溫靜置1小時30分鐘，然后真空濃縮。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化殘余物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(7.2mg，47％)，用PDMS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3881±3。因而得出分子量為3880±3amu(理論值為3880amu)。
例41Arg18，23，26，30，34Lys38(Nε-十六?；?-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg18，23，26，30，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(1.0mg，0.27μmol)、EDPA(0.34mg，2.7μmol)和DMSO(600μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。向所得混合物中加入Pal-ONSu(0.28mg，0.8μmol)溶于NMP(7μl)制得的溶液。將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動5分鐘，然后在室溫放置6小時。向其中加入甘氨酸(1.6mg，21.7μmol)溶于50％乙醇水溶液(163μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(0.17mg，16％)，用MALDI-MS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3961±3。因而得出的分子量為3960±3amu(理論值為3960amu)。
例42Arg26，34Lys38(Nε-(ω-羧基十三?；?)-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)-OH(14mg，4.0μmol)、EDPA(14.3mg，111μmol)、NMP(980μl)和水(980μl)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將HOOC-(CH2)12-COONSu(4.2mg，11.9μmol)溶解于NMP(105μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動1小時50分鐘。向其中加入甘氨酸(6.5mg，87μmol)溶于50％乙醇水溶液(652μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。使用氰丙基柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化反應(yīng)混合物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(5.8mg，39％)，用MALDI-MS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3780±3。因而得出分子量為3779±3amu(理論值為3781amu)。
例43Arg34Lys26(Nε-(γ-谷氨?；?Nα-十四?；?))-GLP-1(7-37)-OH的合成將Arg34-GLP-1(7-37)-OH(15mg，4.4μmol)、EDPA(16mg，124μmol)、NMP(2ml)和水(4.8ml)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例29方法制得的Nα-十四酰基-Glu(ONSu)-OBut(12.1mg，23.7μmol)溶解于NMP(303μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動2小時。向其中加入甘氨酸(6.5mg，86.9μmol)溶于50％乙醇水溶液(652μl)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(50ml)，將所得混合物沖洗到Varian 1g C8 Mega Bond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(15ml)清洗已固定的化合物，最終用TFA(6ml)洗脫而將其從柱中釋放下來。將洗脫物在室溫放置1小時45分鐘，然后真空濃縮。使用氰丙基(cyanopropyl)柱(Zorbax 300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化殘余物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(3.9mg，26％)，用MALDI-MS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3723±3。因而得出分子量為3722±3amu(理論值為3723amu)。
例44Nα-十八?；?Glu(ONSu)-OBut的合成向H-Glu(OH)-OBut(2.82g，13.9mmol)、DMF(370ml)和EDPA(1.79g，13.9mmol)的懸浮液中滴加Ste-ONSu(5.3g，13.9mmol)溶于DMF(60ml)得到的溶液。加入二氯甲烷(35ml)，將反應(yīng)混合物在室溫攪拌24小時，然后真空濃縮。使殘余物在10％檸檬酸水溶液(330ml)和乙酸乙酯(200ml)之間分配，分離兩相。將有機相真空濃縮，使殘余物溶解于DMF(60ml)。將所得溶液滴加到保持在0℃的10％檸檬酸水溶液(400ml)中。收集沉淀物，并用冰水洗滌，在真空干燥箱內(nèi)干燥。將干燥后的化合物溶于DMF(40ml)，并加入HONSu(1.63g，14.2mmol)。向反應(yīng)混合物中加入DCC(2.66g，12.9mmol)溶于二氯甲烷(51ml)形成的溶液。將所得混合物在室溫攪拌64小時，過濾得到沉淀化合物。將沉淀在正庚烷/2-丙醇中重結(jié)晶得到目標(biāo)化合物(4.96g，68％)。
例45Arg26，34Lys38(Nε-(γ-谷氨酰基(Nα-十八?；?))-GLP-1(7-38)-OH的合成將Arg26，34-GLP-1(7-38)-OH(28mg，7.9μmol)、EDPA(28.6mg，221.5μmol)、NMP(1.96ml)和水(1.96ml)的混合物在室溫溫和搖動5分鐘。將按例44方法制得的Nα-十八?；?Glu(ONSu)-OBut(17.93g，31.6μmol)溶解于NMP(448μl)所得溶液，加入到所得混合物中，將反應(yīng)混合物在室溫溫和搖動2小時。向其中加入甘氨酸(13.1mg，174μmol)溶于50％乙醇水溶液(1.3ml)中制得的溶液以終止反應(yīng)。加入乙酸銨的0.5％水溶液(120ml)，將所得混合物分成2等份。將每份沖洗到Varian5g C8 Mega Bond Elut_柱體上，用5％乙腈水溶液(25ml)清洗已固定的化合物，最終用TFA(25ml)洗脫而將其從柱中釋放下來。將合并的洗脫物在室溫放置1小時25分鐘，然后真空濃縮。使用氰丙基柱(Zorbax300SB-CN)和標(biāo)準(zhǔn)乙腈/TFA系統(tǒng)，通過柱層析法純化殘余物。將柱加熱到65℃，乙腈的濃度梯度為60分鐘內(nèi)0-100％。分離出目標(biāo)化合物(3.6mg，11％)，用MALDI-MS法分析產(chǎn)物。發(fā)現(xiàn)質(zhì)子化的分子離子峰的m/z值為3940±3。因而得出分子量為3939±3amu(理論值為3937amu)。
生物學(xué)觀察GLP-1衍生物皮下給藥后的長時間作用采用下述方法，監(jiān)測健康豬皮下施用GLP-1衍生物后其血漿中的濃度，從而測定本發(fā)明的一些GLP-1衍生物的長時間作用。為了進行比較，也對皮下施用GLP-1(7-37)后其在血漿中的濃度進行了測定。結(jié)果示于表1?？梢园创朔椒y定本發(fā)明其它GLP-1衍生物的長時間作用。
從實驗開始即使豬(50％Duroc，25％Yorkshire，25％DanishLandrace，重約40kg)禁食。每只豬按每公斤體重給以溶于50μM等滲溶液(5mM磷酸鹽，pH7.4，0.02％吐溫_-20(Merck)，45mg/ml甘露糖醇(除去熱原，Novo Nordisk))的0.5nmol測試化合物。在表1所示時間從頸靜脈導(dǎo)管抽取血樣。將5ml血樣倒入含有175μl下述溶液的冰冷玻璃杯中0.18M EDTA，1500KIE/ml抑酶肽(Novo Nordisk)和3％桿菌肽(Sigma)，pH7.4。30分鐘內(nèi)，將樣品在5-6000*g離心10分鐘。將溫度保持在4℃。用吸管將上清液吸至不同的玻璃杯中，貯于一20℃直至使用。
利用對GLP-1(7-37)的N-末端區(qū)域具有特異性的單克隆抗體，通過RIA法測定諸肽的血漿濃度。與GLP-1(1-37)和GLP-1(8-36)酰胺的交叉反應(yīng)小于1％，與GLP-1(9-37)、GLP-1(10-36)酰胺和GLP-1(11-36)酰胺的交叉反應(yīng)小于0.1％。在4℃進行全部反應(yīng)。
如下進行測定將100μl血漿與271μl96％乙醇混合，用渦旋混合器混勻并在2600*g離心30分鐘。將上清液輕輕倒入Minisorp試管中，并完全蒸發(fā)(Savant Speedvac AS290)。將蒸發(fā)殘余物重新溶解在含有80mM磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉、0.1％HSA(Orpha 20/21，Behring)、10mM EDTA，0.6mM乙基汞硫代水楊酸鈉(Sigma)，pH7.5的測定緩沖液中。將試樣溶于適于達到其預(yù)計濃度的體積內(nèi)，并使其溶解30分鐘。向300μl試樣中加入10μl由含有40mM磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉、0.1％HSA，0.6mM乙基汞硫代水楊酸鈉、pH7.5的稀釋緩沖液制成的抗體溶液。將300μl緩沖液與100μl稀釋緩沖液混合制成非特異性樣品。從冷凍干燥貯備物制得各個標(biāo)準(zhǔn)，將其溶解于300μl測定緩沖液中。所有樣品均在Minisorp管中與如上所述的抗體預(yù)保溫72小時。向其中加入溶于稀釋緩沖液中的含有6-7000CPM的示蹤劑200μl，將樣品混合并保溫48小時。在每管中加入在40mM磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉、0.6mM乙基汞硫代水楊酸鈉，pH7.5中的肝素穩(wěn)定的牛血漿200ml/l和18g/l活性碳(Merck)的懸液1.5ml。使用前，將懸液混合并使其在4℃放置2小時。將所有樣品在4℃保溫1小時，然后在3400*g離心25分鐘。離心后立即輕輕取出上清液并在一γ-計數(shù)器內(nèi)計數(shù)。從各個標(biāo)準(zhǔn)物曲線計算樣品中的濃度。測得以下血漿濃度，它們是各個化合物的最大濃度的百分?jǐn)?shù)(n＝2)表1
.)測試用化合物是給出例號的各例目標(biāo)化合物如表1所示，本發(fā)明的GLP-1衍生物具有比GLP-1(7-37)更長時間的作用曲線，并且在血漿中比GLP-1(7-37)遠為持久。表1還顯示，所選的特定GLP-1衍生物不同，它們達到血漿內(nèi)峰濃度的時間變化范圍很大。
對表達克隆的人GLP-1受體的細(xì)胞系內(nèi)cAMP形成的刺激作用為證實GLP-1衍生物的效能，測定了它們在表達克隆的人GLP-1受體的細(xì)胞系內(nèi)刺激cAMP形成的能力。從劑量-響應(yīng)曲線計算出EC50。
使用表達人胰腺GLP-1受體的幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞(Knudsen和Pridal，1996，歐洲藥理學(xué)雜志，318，429-435)。通過在緩沖液(10mmol/l Tris-HCl和30mmol/l NaCl pH7.4，另外還含有1mmol/l二硫蘇糖醇，5mg/l亮抑酶肽(Sigma，St.Louis，MO，USA)，5mg/l抑胃酶肽(Sigma，St.Louis，MO，USA)，100mg/l桿菌肽(Sigma，St.Louis，MO，USA)和16mg/l抑酶肽(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，Denmark))中勻漿制備質(zhì)膜(Adelhorst等，1994，生物化學(xué)雜志，269，6275)。勻漿物在41w/v％蔗糖層上部離心。將兩層之間的白色條帶在緩沖液中稀釋并離心。質(zhì)膜保存在-80℃?zhèn)溆谩?br> 在96孔微量滴定板中以總體積140μl進行測定。所用的緩沖液為50mmol/l Tris-HCl，pH7.4，還加入1mmol/lEGTA、1.5mmol/lMgSO4、1.7mmol/lATP、20mM GTP，2mmol/l3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、0.01％吐溫-20和0.1％人血清白蛋白(Reinst，BehringwerkeAG，Marburg，德國)。將欲測其激動劑活性的化合物溶解并稀釋在緩沖液中，加入到質(zhì)膜制劑中，將混合物在37℃保溫2小時。加入25μl0.05mol/l鹽酸終止反應(yīng)。將樣品稀釋10倍后用閃爍親近測定法(scintillation proximity assay)(RPA 538，Amersham，UK)分析cAMP。得到以下結(jié)果
.)測試用化合物是給出例號的實例的目標(biāo)化合物
權(quán)利要求
1.一種GLP-1衍生物，其中母體肽的至少一個氨基酸殘基連接有一個親脂性取代基，并且如果只有一個親脂性取代基，而該取代基又連接到母體肽的N-末端或C-末端氨基酸殘基上，那么該取代基是烷基或具有一個ω-羧基的基團。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GLP-1衍生物，其中只有一個親脂性取代基。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基連接到N-末端氨基酸殘基上。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基連接到C-末端氨基酸殘基上。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基連接到既非N-末端也非C-末端的一個氨基酸殘基上。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的GLP-1衍生物，其中有兩個親脂性取代基。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的GLP-1衍生物，其中的一個親脂性取代基連接到N-末端氨基酸殘基上，而另一個親脂性取代基連接到C-末端氨基酸殘基上。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的GLP-1衍生物，其中的一個親脂性取代基連接到C-末端氨基酸殘基上，而另一個親脂性取代基連接到既非N-末端也非C-末端的一個氨基酸殘基上。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的GLP-1衍生物，其中兩個親脂性取代基均連接到既非N-末端也非C-末端的氨基酸殘基上。
10.GLP-1(7-C)的衍生物，其中C選自含38，39，40，41，42，43，44和45之組，該衍生物僅有一個連接到C-末端氨基酸殘基上的親脂性取代基。
11.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基含有4-40個碳原子，尤其優(yōu)選8-25個碳原子。
12.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基以其羧基與一個氨基酸殘基的氨基形成一個酰胺鍵，從而連接到該氨基酸殘基上。
13.根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項所述的GLP-1衍生物，其中一個親脂性取代基以其氨基與一個氨基酸殘基的羧基形成酰胺鍵，從而連接到該氨基酸殘基上。
14.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中親脂性取代基通過一個間隔基團而連接到母體肽上。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的GLP-1衍生物，其中的間隔基團是有1-7個亞甲基、優(yōu)選有2個亞甲基的不分支鏈烷烴α，ω-二羧基，該間隔基團在母體肽的氨基和親脂性取代基的氨基之間形成一個橋。
16.根據(jù)權(quán)利要求14所述的GLP-1衍生物，其中的間隔基團是一個除Cys外的氨基酸殘基，或是一種如Gly-Lys的二肽。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的GLP-1衍生物，其中母體肽的一個羧基與Lys或含有Lys殘基的二肽中的一個氨基形成酰胺鍵，并且Lys間隔基團或含有Lys殘基的二肽間隔基團中的另一氨基與親脂性取代基中的羧基形成一個酰胺鍵。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的GLP-1衍生物，其中母體肽的一個氨基與所述氨基酸殘基或二肽間隔基團的一個羧基形成一個酰胺鍵，并且該氨基酸殘基或二肽間隔基團的一個氨基與所述親脂性取代基的一個羧基形成一個酰胺鍵。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的GLP-1衍生物，其中母體肽的一個羧基與所述氨基酸殘基間隔基團或二肽間隔基團的一個氨基形成一個酰胺鍵，并且該氨基酸殘基間隔基團或二肽間隔基團的一個羧基與所述親脂性取代基的一個氨基形成一個酰胺鍵。
20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的GLP-1衍生物，其中母體肽的一個羧基與Asp或Glu間隔基團，或者含有Asp或Glu殘基的二肽間隔基團的一個氨基形成一個酰胺鍵，并且該間隔基團的一個羧基與所述親脂性取代基的一個氨基形成一個酰胺鍵。
21.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基含有一個部分或完全氫化的環(huán)戊菲骨架。
22.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是一個直鏈或分支的烷基。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是直鏈或分支的脂肪酸的?；?br> 24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的GLP-1衍生物，其中的酰基選自含CH3(CH2)nCO-之組，其中n是4-38，優(yōu)選選自下列成員CH3(CH2)6CO-，CH3(CH2)8CO-，CH3(CH2)10CO-，CH3(CH2)12CO-，CH3(CH2)14CO-，CH3(CH2)16CO-，CH3(CH2)18CO-，CH3(CH2)20CO-和CH3(CH2)22CO-。
25.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是直鏈或分支的烷烴α，ω-二羧酸的?；?。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的GLP-1衍生物，其中的?；x自含HOOC(CH2)mCO-之組，其中m是4-38，優(yōu)選4-24，進一步優(yōu)選選自含下述成員之組HOOC(CH2)14CO-，HOOC(CH2)16CO-，HOOC(CH2)18CO-，HOOC(CH2)20CO-和HOOC(CH2)22CO-。
27.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式CH3(CH2)p((CH2)qCOOH)CHNH-CO(CH2)2CO-的一個基團，其中p和q是整數(shù)，并且p+q是8-33的整數(shù)，優(yōu)選為12-28的整數(shù)。
28.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-的一個基團，其中r是10-24的整數(shù)。
29.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-的一個基團，其中s是8-24的整數(shù)。
30.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)uCH3的一個基團，其中u是8-18的整數(shù)。
31.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)wCH3的一個基團，其中w是10-16的整數(shù)。
32.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)xCH3的一個基團，其中x是10-16的整數(shù)。
33.根據(jù)權(quán)利要求1-20中任一項所述的GLP-1衍生物，其中的親脂性取代基是具有式-NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)yCH3的一個基團，其中y是0或1-22的整數(shù)。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一項所述的GLP-1衍生物，其中母體肽選自含GLP-1(1-45)或其類似物或它們的片段的組。
35.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任一項所述的GLP-1(A-B)衍生物，其中A是1-7的整數(shù)，B是38-45的整數(shù)，或其類似物，該類似物有一個親脂性取代基連接到C-末端氨基酸殘基上，并且可選地，有另一個親脂性取代基連接到另一氨基酸殘基上。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的GLP-1衍生物，其中母體肽選自含GLP-1(7-35)，GLP-1(7-36)，GLP-1(7-36)酰胺，GLP-1(7-37)，GLP-1(7-38)，GLP-1(7-39)，GLP-1(7-40)和GLP-1(7-41)及其類似物之組。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的GLP-1衍生物，其中母體肽選自含GLP-1(1-35)，GLP-1(1-36)，GLP-1(1-36)酰胺，GLP-1(1-37)，GLP-1(1-38)，GLP-1(1-39)，GLP-1(1-40)，GLP-1(1-41)和其類似物之組。
38.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中的指定類似物含有總數(shù)不超過15個、優(yōu)選至多10個氨基酸殘基已被任何α-氨基酸殘基更換的衍生物。
39.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中的指定類似物含有總數(shù)至多15個、優(yōu)選至多10個氨基酸殘基已被可以由遺傳密碼編碼的任何α-氨基酸殘基更換掉的衍生物。
40.根據(jù)上述任一權(quán)利要求所述的GLP-1衍生物，其中指定類似物含有總數(shù)至多6個氨基酸殘基已被任何可由遺傳密碼編碼的α-氨基酸殘基更換掉的衍生物。
41.根據(jù)上述任一項所述的GLP-1衍生物，其中母體肽選自Arg26-GLP-1(7-37)，Arg34-GLP-1(7-37)，Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34-GLP-1(7-37)，Gly8Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg34Lys36-GLP-1(7-37)，Gly8Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Gly8Arg34Lys40-GLP-1(7-40)，Gly8Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)和Gly8Arg26，34Lys36，40-GLP-1(7-40)。
42.根據(jù)權(quán)利要求1-40中任一項所述的GLP-1衍生物，其中母體肽選自Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(7-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(7-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(7-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(7-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(7-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(7-44)，Arg26，34Lys45GLP-1(7-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(1-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(1-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(1-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(1-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(1-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(1-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(1-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(1-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(2-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(2-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(2-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(2-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(2-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(2-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(2-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(2-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(3-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(3-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(3-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(3-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(3-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(3-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(3-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(3-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(4-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(4-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(4-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(4-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(4-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(4-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(4-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(4-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(5-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(5-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(5-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(5-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(5-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(5-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(5-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(5-45)，Arg26，34Lys38-GLP-1(6-38)，Arg26，34Lys39-GLP-1(6-39)，Arg26，34Lys40-GLP-1(6-40)，Arg26，34Lys41-GLP-1(6-41)，Arg26，34Lys42-GLP-1(6-42)，Arg26，34Lys43-GLP-1(6-43)，Arg26，34Lys44-GLP-1(6-44)，Arg26，34Lys45-GLP-1(6-45)，Arg26Lys38-GLP-1(1-38)，Arg34Lys38-GLP-1(1-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(1-38)，Arg26Lys38-GLP-1(7-38)，Arg34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys36，38-GLP-1(7-38)，Arg26，34Lys38-GLP-1(7-38)，Arg26Lys39-GLP-1(1-39)，Arg34Lys39-GLP-1(1-39)，Arg26，34Lys36，39-GLP-1(1-39)，Arg26Lys39-GLP-1(7-39)，Arg34Lys39-GLP-1(7-39)和Arg26，34Lys36，39-GLP-1(7-39)
43.一種藥物組合物，其含有本發(fā)明的GLP-1衍生物和藥物學(xué)可接受的賦形劑或載體。
44.本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有比GLP-1(7-37)更長時間的作用曲線的藥物中的用途。
45.本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有更長時間的作用曲線、可用于治療非胰島素依賴性糖尿病的藥物中的用途。
46.本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有更長時間的作用曲線、可用于治療胰島素依賴性糖尿病的藥物中的用途。
47.本發(fā)明的GLP-1衍生物在制備具有更長時間的作用曲線、可用于治療肥胖癥的藥物中的用途。
48.一種用于在需要此種治療的病人中治療胰島素依賴性或非胰島素依賴性糖尿病的方法，包括給病人服用治療有效量的根據(jù)權(quán)利要求1所述的GLP-1衍生物及藥學(xué)上可接受的載體。
全文摘要
GLP－1及其類似物的具有親脂性取代基的衍生物，它們具有令人感興趣的藥物學(xué)性質(zhì)，尤其它們有比GLP－1(7－37)更長時間的作用曲線。
文檔編號A61P5/48GK1951965SQ200610110898
公開日2007年4月25日 申請日期1997年8月22日 優(yōu)先權(quán)日1996年8月30日
發(fā)明者L·B·克努德森, P·O·胡斯菲爾德, P·F·尼爾森 申請人:諾沃挪第克公司