專利名稱：治療藥的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用巨噬細(xì)胞的吞噬能力、實(shí)現(xiàn)功能異常巨噬細(xì)胞的正?；?、或?qū)Ω鞣N的感染性病原體有效的治療藥。本發(fā)明的治療藥(藥物或制劑)是根據(jù)治療上和/或診斷上的目的所賦予的一切物質(zhì)及這些物質(zhì)的集合體為對(duì)象、其制劑是藥物(有時(shí)含藥物載體)與藥物載體的合劑。
背景技術(shù)：
I.巨噬細(xì)胞首先，對(duì)在本發(fā)明的治療藥的作用中發(fā)揮主要功能的巨噬細(xì)胞進(jìn)行簡(jiǎn)述。
對(duì)巨噬細(xì)胞的形態(tài)、功能，例如高橋潔等著“維持生命的巨噬細(xì)胞”(文光堂，2001年)中已有詳細(xì)，但有關(guān)本發(fā)明的背景描述如下。所謂巨噬細(xì)胞是構(gòu)成單核吞噬細(xì)胞體系(MPSMononuclear PhagocyteSystem)的細(xì)胞。血中的單核細(xì)胞(monocyte)來自骨髓細(xì)胞中的造血干細(xì)胞，在骨髓中分裂、分化流到血中，固定在各種的組織上向以各種名稱命名的單核細(xì)胞(monocytic cell)分化。該細(xì)胞在結(jié)合組織中稱組織細(xì)胞，在肝臟中稱肝竇星形細(xì)胞(Kupper cell)，在肺中稱肺胞巨噬細(xì)胞，在淋巴節(jié)/脾臟中稱巨噬細(xì)胞，在體腔中稱胸腔/腹腔巨噬細(xì)胞，在骨骼中稱破骨細(xì)胞，在皮膚中稱蘭格漢斯細(xì)胞，在神經(jīng)組織中稱微膠細(xì)胞，在腦中稱小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞，在滑膜中稱A型細(xì)胞，具有組織獨(dú)特的性質(zhì)。
1.一般特性(1)是直徑約15～20μm的單核細(xì)胞，富含細(xì)胞質(zhì)，易粘在玻璃或塑料表面上，利用偽足運(yùn)動(dòng)、具有強(qiáng)的異物吞噬作用。
(2)擔(dān)當(dāng)防御生物的細(xì)胞。
(3)具有排除異物功能和免疫功能。
(4)對(duì)T淋巴球提示抗原信息建立免疫。
(5)被干擾素活化形成細(xì)胞性免疫的效應(yīng)物(effector)。
(6)比淋巴球耐X射線。
2.巨噬細(xì)胞的生理性意義(1)吞噬功能作為巨噬細(xì)胞的功能，最熟知的是吞噬作用。這種功能可視為生命誕生、生命進(jìn)化時(shí)自單細(xì)胞的時(shí)代所具備的最基本的功能之一。因此，巨噬細(xì)胞的特征之一，是巨噬細(xì)胞的存在具有種橫斷(species-transversely)的普遍性。該特征估計(jì)提供研究巨噬細(xì)胞功能為對(duì)象的一大優(yōu)點(diǎn)。即，假如是進(jìn)行哺乳動(dòng)物的疾病為對(duì)象的治療藥的開發(fā)研究時(shí)，哺乳動(dòng)物以外的巨噬細(xì)胞也可以功能性地作為研究材料使用。這方面，取決于巨噬細(xì)胞是系統(tǒng)發(fā)育所保存的細(xì)胞。
(2)防御生物功能作為巨噬細(xì)胞的功能，次重要的是防御生物作用。這種作用稱作非特異性防生物作用，近年的研究在逐漸搞清巨噬細(xì)胞的防生物作用也有特異性。原來非特異性的叫法是對(duì)T細(xì)胞賦予特征的抗原特異性或與免疫記憶相對(duì)應(yīng)的叫法，由于現(xiàn)在還沒證明嚴(yán)格意義上的抗原特異性或免疫記憶存在于巨噬細(xì)胞中，所以巨噬細(xì)胞的防生物作用稱非特異性并不錯(cuò)。然而，例如根據(jù)病原體的種類，似乎巨噬細(xì)胞的應(yīng)答呈現(xiàn)質(zhì)的不同，而且該質(zhì)的不同的應(yīng)答的一部分，呈現(xiàn)與識(shí)別巨噬細(xì)胞表面病原體的受體的不同相對(duì)應(yīng)的狀態(tài)，如果從細(xì)胞應(yīng)答對(duì)異物(或環(huán)境)的刺激角度考慮，則也可以說巨噬細(xì)胞的作用是特異性。
現(xiàn)在，根據(jù)上述觀點(diǎn)，一般在不斷地對(duì)巨噬細(xì)胞為中心的防生物作用尋找先天免疫系統(tǒng)(The innate immune system)，對(duì)T細(xì)胞為中心的防生物作用尋找獲得免疫系統(tǒng)(The acqnired immune system)。此外，如果考慮巨筮細(xì)胞的系統(tǒng)發(fā)生的普遍性，雖然理所當(dāng)然，但先天免疫系統(tǒng)也還是系統(tǒng)發(fā)生的高度被保存的防生物系統(tǒng)。
(3)先天免疫系統(tǒng)巨噬細(xì)胞為中心的先天免疫系統(tǒng)當(dāng)然在不具有獲得免疫系統(tǒng)的生物種，即使是具有獲得免疫系統(tǒng)的生物種，也發(fā)揮稱之為異物識(shí)別、排除系統(tǒng)的防生物系統(tǒng)的主要作用。既使是具有獲得免疫系統(tǒng)的生物，病原體等的異物的識(shí)別、排除在大部分的情況下也由先天免疫系統(tǒng)的功能維持，但這種功能不充分的情況則動(dòng)員獲得免疫系統(tǒng)。這種情況，特異性異物識(shí)別也必須由巨噬細(xì)胞等的抗原提示，排除外來異物時(shí)，發(fā)揮排除系統(tǒng)主要作用的還是巨噬細(xì)胞等的構(gòu)成先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞。
(4)排除異物另外，內(nèi)因性的異物(例如，除去病毒感染細(xì)胞)等，雖然獲得免疫是利用特征性的細(xì)胞傷害性T細(xì)胞排除，但該細(xì)胞傷害性T細(xì)胞的增殖與成熟兩方，都必須是接受巨噬細(xì)胞等的抗原提示的另外的T細(xì)胞。即，獲得免疫為了發(fā)揮充分的功能，則先天免疫系統(tǒng)以完全且按照目的起作用為前提。
(5)功能不全因此，巨噬細(xì)胞的吞噬或抗原提示等的功能不全，毫無疑問地變成免疫缺陷的潛在性的原因。具體地來講，首先，作為與I.1(巨噬細(xì)胞的一般特性)中所述的諸點(diǎn)有關(guān)的功能不全與疾病已知以下所述的幾點(diǎn)。即1)作為吞噬異物作用異常的吞噬功能異常癥，已知白血球粘接缺乏癥、謝迪亞克-東綜合癥等。任何一種情況吞噬功能均有異常，后者時(shí)，由于溶酶體酶向吞噬空腔的輸送有異常，故殺菌能力降低，吞噬能力明顯地亢進(jìn)。
2)作為防生物功能異常的疾病，可列舉慢性粘膜皮膚念珠菌病?；歼@種病患者的巨噬細(xì)胞移遷能力降低，念珠菌的殺菌能力也降低。
3)作為排除異物功能和免疫能力異常的疾病，可列舉維-奧綜合癥(免疫力降低)?；颊叱尸F(xiàn)巨噬細(xì)胞活動(dòng)異常、抗體依賴性細(xì)胞傷害作用缺乏等復(fù)雜的免疫異常。
4)作為抗原信息提示功能異常，已知不論T細(xì)胞，B細(xì)胞正常還是重病引起免疫缺陷的主要組織適合(MHC)類別II抗原缺乏病。
5)作為被干擾來活化、有關(guān)細(xì)胞性免疫效應(yīng)基因問題的功能異常，已知缺干擾素受體的幼兒成為不能防結(jié)核菌感染的結(jié)核菌感染致死的干擾素受體缺乏癥。
此外，缺乏獲得免疫細(xì)胞的哺乳動(dòng)物雖然存在且可生存，但缺乏巨噬細(xì)胞，動(dòng)物不能存在。而且，識(shí)別、排除異物為中心的防生物系統(tǒng)，在不斷探明總稱為進(jìn)行細(xì)胞間的信息傳遞的細(xì)胞因子的生理活動(dòng)物質(zhì)起重要的作用。巨噬細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)生分泌的細(xì)胞因子的種類極富有多樣性。因此，就識(shí)別、排除異物來看，對(duì)個(gè)體的動(dòng)態(tài)平衡性維持也必須有巨噬細(xì)胞的功能。
(6)解剖學(xué)的特征巨噬細(xì)胞解剖學(xué)的特征依具有固定在各種組織上固有性格的組織獨(dú)特的巨噬細(xì)胞而不同。這也可由作為個(gè)體與環(huán)境接點(diǎn)的粘膜組織看出在呼吸器官、消化器官、泌尿生殖器官的粘膜下層分別存在獨(dú)特的巨噬細(xì)胞。這些組織獨(dú)特的巨噬細(xì)胞進(jìn)行與組織獨(dú)特的內(nèi)外環(huán)境的生物應(yīng)答。這顯示巨噬細(xì)胞對(duì)超越異物的識(shí)別、排除而對(duì)生體動(dòng)態(tài)平衡性的維持起重要的作用。組織獨(dú)特的巨噬細(xì)胞生理上的意義大多是未知的問題。而從新的觀點(diǎn)評(píng)價(jià)組織獨(dú)特的巨噬細(xì)胞的存在意義時(shí)，當(dāng)然在與各種病態(tài)的關(guān)系上會(huì)引人注目。
(7)與病態(tài)的關(guān)系因?yàn)?，如果根?jù)巨噬細(xì)胞與處于免疫系統(tǒng)重要位置的生理上的意義，則組織獨(dú)特的巨噬細(xì)胞的功能異常是極大地顯示關(guān)系到誘發(fā)組織特性的病態(tài)的緣故。事實(shí)上，作為炎癥性腸疾病之一的克朗氏病(Crohn′s disease)，還有很多類風(fēng)濕病等的自身免疫疾病、骨質(zhì)疏松癥等的高令性疾病等難治性疾病，往往以某些形式伴有巨噬細(xì)胞的功能異常。與結(jié)核菌等的分枝桿菌的慢性感染、或分枝桿菌本身的問題不同，肺胞巨噬細(xì)胞的功能異常估計(jì)在于病態(tài)的背景。因此，開發(fā)治療藥以增大作為標(biāo)的細(xì)胞的巨噬細(xì)胞的吞噬能力，結(jié)果增大巨噬細(xì)胞內(nèi)治療藥的濃度，在提供包括現(xiàn)在沒有有效治療法的結(jié)核等感染病的難治性疾病的新型治療法方面，可以稱之為是極重要的且有合理性的課題。
II.巨噬細(xì)胞的功能異常與疾病(1)作為感染性病原體的巨噬細(xì)胞據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查，結(jié)核、艾滋病、瘧疾等是世界性規(guī)模且最應(yīng)該重視的慢性難治性感染性。據(jù)說，例如每年發(fā)生800萬以上的人患結(jié)核病，死亡300萬人。對(duì)這些疾病開發(fā)有效的治療藥(藥物/制劑)是當(dāng)急的課題，其社會(huì)意義極大。
然而，有關(guān)病原體感染的預(yù)防、除去，在人體內(nèi)起最主要作用的細(xì)胞之一是巨噬細(xì)胞。實(shí)際上，巨噬細(xì)胞分布在生物體內(nèi)的臟器、器官等的所有部位上。這些巨噬細(xì)胞其形態(tài)、功能根據(jù)所存在的臟器、器官而不同，但在發(fā)揮預(yù)防和除去病原體感染方面是共同的。
另外，感染性病原體在進(jìn)化的過程中，獲得回避巨噬細(xì)胞攻擊的種種手段。此外，感染性病原體中，有很多潛伏在巨噬細(xì)胞中，宿主巨噬細(xì)胞的病原體。這樣寄生在巨噬細(xì)胞中成功的病原體，當(dāng)然成為慢性的且反復(fù)引起感染癥的原因，導(dǎo)致致命的結(jié)果也不少。即，這種情況，本應(yīng)當(dāng)預(yù)防、除去病原體感染的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為起感染性病原體媒體作用的細(xì)胞。
(2)巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體在結(jié)核中可以發(fā)現(xiàn)其典型例。即，雖然病原體(結(jié)核分支桿菌、或牛分支桿菌)被作為初期感染途徑的肺胞巨噬細(xì)胞吞噬，但仍穩(wěn)定地存在于此時(shí)形成的吞噬體中。即，病原體本來應(yīng)被消化的這些吞噬細(xì)胞可作為“掩蔽所”生存。此外，以往作為原因菌的麻風(fēng)分支桿菌、作為非定型分枝桿菌癥原因菌的鳥分支桿菌、或作為衣原體癥原因菌的肺炎衣原體、沙眼衣原體、或鸚武熱衣原體等尚未確立根治療法，但發(fā)現(xiàn)擔(dān)心漫延的難治性感染疾病的許多原因菌、或在巨噬細(xì)胞成為感染病原體媒體方面有共同性。
現(xiàn)在，對(duì)預(yù)防結(jié)核菌、艾滋病毒等傾注于極大的精力。然而，一旦出現(xiàn)了感染并不存在有效的治療法。姑且，即使對(duì)感染病原體存在直接具有殺菌作用的化合物，但一般通過簡(jiǎn)單地給與適用的治療藥，對(duì)殺滅特定的病原體(本發(fā)明中的殺滅意味著殺死消滅病原體的全部或一部)要在保持病原體巨噬細(xì)胞內(nèi)達(dá)到足夠的濃度當(dāng)然不容易。

發(fā)明內(nèi)容
因此，通過給與有效的治療藥，即使可以殺滅細(xì)胞外的病原體，但作為病原體媒體的巨噬細(xì)胞依然作為病原體供給源存在，仍在繼續(xù)供給病原體。對(duì)現(xiàn)在寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體的沒有完全根治療法的理由可在如上所述的方面而知。本發(fā)明把這種問題作為課題，反之，如果可以殺滅作為病原體媒體的病原體感染巨噬細(xì)胞、或殺滅病原體感染巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體，則可以從根本上治療上述許多的慢性難治性感染癥。因此，本發(fā)明的目的在于提供根據(jù)巨噬細(xì)胞的功能異常、或以巨噬細(xì)胞為媒體對(duì)所患疾病的治療藥。
本發(fā)明者們潛心進(jìn)行研究的結(jié)果，把殺滅作為病原體媒體的病原體感染巨噬細(xì)胞、殺滅病原體感染巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體、或?qū)σ蚣膊」δ墚惓５木奘杉?xì)胞發(fā)生作用為目的，形成了全新的構(gòu)想，從而完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的治療藥，其特征在于使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體。
另外，本發(fā)明的治療藥，其特征在于使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，誘導(dǎo)保持病原體的巨噬細(xì)胞至細(xì)胞死亡。
此外，本發(fā)明的治療藥，其特征在于使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，對(duì)處于功能異常狀態(tài)的巨噬細(xì)胞發(fā)生作用。
另外，期望本發(fā)明的治療藥是用于分枝桿菌癥、艾滋病、衣原體癥或弓漿蟲病任何一種的藥。因此，可以有效地治療由巨噬細(xì)胞保持病原體造成的疾病。
此外，期望本發(fā)明的治療藥是用于克朗氏病、類風(fēng)濕病、癌或免疫缺陷綜合癥的藥。因此，可以有效地治療巨噬細(xì)胞處于功能異常狀態(tài)造成的疾病。艾滋病被包括在免疫缺陷綜合癥中。
另外，期望前述巨噬細(xì)胞是存在粘膜組織中的細(xì)胞。因此，可以有效地治療在呼吸器、消化器或生殖器等的引起病原體初感染的部位的疾病。
此外，期望前述巨噬細(xì)胞是存在腹腔、大網(wǎng)膜、乳色斑、肺胞、肺間質(zhì)、肺臟、門靜脈區(qū)域、脾臟、骨髓、胸腺、消化管、腭扁桃體、腎上腺、腦垂體、甲狀腺間質(zhì)、胰島、副甲狀腺、松果體、睪丸、卵巢、輸卵管、子宮、胎盤、皮膚、髓膜、腦質(zhì)、脈絡(luò)叢的任何一個(gè)部位的細(xì)胞，或者，期望前述巨噬細(xì)胞是小膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的前體細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞的前體細(xì)胞、前述存在巨噬細(xì)胞的前體細(xì)胞、存在巨噬細(xì)胞類緣細(xì)胞、或存在巨噬細(xì)胞類緣細(xì)胞的前體細(xì)胞。因此，可以有效地治療在體內(nèi)種種的臟器或組織中產(chǎn)生的疾病。
此外，本發(fā)明的治療藥，其特征在于含有PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)，是用于結(jié)核的藥。
另外，還期望含有利福平。因此，可提供殺滅結(jié)核菌的治療藥。
此外，期望含分子量1500～150000的PLGA。因此，可以提供被巨噬細(xì)胞吞噬且生物降解性的微粒子制劑。
另外，期望含分子量1500～75000的PLGA。因此，可提供被巨噬細(xì)胞吞噬且在巨噬細(xì)胞內(nèi)易放出藥物的微粒子制劑。
此外，還期望再含有PVA(聚乙烯醇)、PEG(聚乙二醇)、PEO(聚環(huán)氧乙烷)、糖、蛋白質(zhì)、肽、磷脂質(zhì)或膽甾醇的至少一種。因此，可提供對(duì)應(yīng)于巨噬細(xì)胞的種類而被急劇吞噬的微粒子制劑。
還有，還提供再含有PVA、PEG、PEO、糖、蛋白質(zhì)、肽、磷脂質(zhì)或膽甾醇的至少一種，其主要的粒徑為1～6μm的微粒子制劑。因此，有效利用巨噬細(xì)胞的吞噬功能可有效地進(jìn)行巨噬細(xì)胞內(nèi)。
還有，優(yōu)選通過吞噬使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮。
還有，優(yōu)選是含有分子量5000～20000的PLGA、針對(duì)結(jié)核的治療藥。
還有，優(yōu)選是通過膜乳化法制備的治療藥。
還有，特別優(yōu)選是含有成團(tuán)泛菌的脂多糖、針對(duì)艾滋病的治療藥。
還有，特別優(yōu)選是含有成團(tuán)泛菌的脂多糖、對(duì)于肺癌細(xì)胞具有細(xì)胞阻礙作用的治療藥。
本說明書也包含作為本申請(qǐng)優(yōu)先權(quán)基礎(chǔ)的特愿2002-247871的說明書和/或附圖所述的內(nèi)容。


圖1是對(duì)比說明本發(fā)明與以往的治療藥的巨噬細(xì)胞內(nèi)藥劑濃度的圖。
圖2是表示本發(fā)明實(shí)施方案的微粒子制劑的粒徑分布的圖。
圖3是對(duì)比說明利福平采用本發(fā)明給與和以往所用的溶液給予進(jìn)入NR8383細(xì)胞的量為何種程度不同的圖。
圖4是說明RFP-PLGA微粒子的利福平保持能力因PLGA微粒子的組成不同所放出的利福平量不同的圖(其1)。實(shí)驗(yàn)值包括誤差5％。
圖5是說明RFP-PLGA微粒子的利福平保持能力因PLGA微粒子的組成不同所放出的利福平量不同的圖(其2)。實(shí)驗(yàn)值包括誤差5％。
圖6是說明吞噬結(jié)核菌的巨噬細(xì)胞通過吞噬RFP-PLGA微粒子可殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的圖。生存率按5個(gè)等級(jí)進(jìn)行評(píng)價(jià)、15％以下、25～25％、325～50％、450～75％、575％以上。再者，給與的利福平單獨(dú)給與(圖中用RFP表示)時(shí)為100μg/mL，利用RFP-PLGA給與(圖中用RFP-PLGA表示)時(shí)為5μg/mL(估算值)。
圖7是通過使用脂多糖使肺胞巨噬細(xì)胞NR8383的吞噬能活化，利用與佐藤肺癌細(xì)胞的共培養(yǎng)增強(qiáng)對(duì)處于功能異常狀態(tài)的NR8383的佐藤肺癌細(xì)胞影響的細(xì)胞毒性效果的圖。(□)表示沒有進(jìn)行脂多糖處理的NR8383對(duì)佐藤肺癌的細(xì)胞傷害效果、(■)表示脂多糖(1μg/mL)處理的NR8383對(duì)佐藤肺癌細(xì)胞的細(xì)胞傷害性效果(共培養(yǎng)4小時(shí))。再者，細(xì)胞傷害效果(％)由培養(yǎng)液中放出的乳酸脫氫酶量算出，進(jìn)行評(píng)價(jià)。
具體實(shí)施例方式
以下，邊參照附圖邊對(duì)本發(fā)明的適用實(shí)施方案詳細(xì)地進(jìn)行說明。但本發(fā)明其技術(shù)范圍不受這些實(shí)施方案限制。
全面地具備巨噬細(xì)胞，而且巨噬細(xì)胞的一種特異機(jī)能可例舉吞噬作用。吞噬作用是使尺寸大約1μm左右以上的固體物積極地進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的功能。
然而，如果積極地吞噬人工制的固體物，則可能在巨噬細(xì)胞內(nèi)以通常不能達(dá)到的濃度使固體物積累。這樣的固體物雖然一般可制成粒子提供但要使之積極吞噬，必須將有利于吞噬的粒徑、粒子的表面特性(應(yīng)當(dāng)帶有電荷、應(yīng)當(dāng)具有一定的柔軟結(jié)構(gòu)等)等最優(yōu)化。例如，聚乳酸酯與聚乙二醇混合的材料作為基材可以制備被巨噬細(xì)胞容易吞噬的粒子。
此外，如果混合作用于感染病原體或病原體感染巨噬細(xì)胞的藥物制備的粒子，則隨著粒子的吞噬，藥物也積極地進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)。
本發(fā)明的根本在于積極地利用巨噬細(xì)胞具有的吞噬功能，治療巨噬細(xì)胞功能異常相關(guān)的疾病(I.2的(5)、(7)、II.(1)、分枝桿菌癥、艾滋病、衣原體病、弓漿蟲病或癌等)。此外通過制備使對(duì)這些病有效的藥物含有巨噬細(xì)胞可吞噬的微粒子(藥物載體)中的制劑，期望達(dá)到上述目的。
通常，作為藥物載體與藥劑的合劑的制劑，當(dāng)然回避基于巨噬細(xì)胞的吞噬用的設(shè)計(jì)很必要。然而本發(fā)明基于與以往完全不同的構(gòu)想，在積極地利用巨噬細(xì)胞的吞噬活性方面具有新穎性。
如前述巨噬細(xì)胞防御生物的一種功能是具有吞噬作用。吞噬作用是巨噬細(xì)胞特征性地識(shí)別的固有的功能，可以卷入巨噬細(xì)胞以外的細(xì)胞所不能卷入的大尺寸的粒子。細(xì)菌等的病原微生物被巨噬細(xì)胞吞噬在巨噬細(xì)胞內(nèi)被分解。因此巨噬細(xì)胞的吞噬功能的生物學(xué)上的意義之一是對(duì)病原微生物給予傷害。但巨噬細(xì)胞因吞噬被活化，有時(shí)可能發(fā)生抗病原微生物。這是作為吞噬導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活化所熟知的現(xiàn)象，因此，就連癌細(xì)胞，巨噬細(xì)胞也可進(jìn)行傷害。所以，利用吞噬將巨噬細(xì)胞活化，如果能增強(qiáng)吞噬活性，則可以更有力地殺滅病原微生物。
被巨噬細(xì)胞吞噬的粒子，估計(jì)需要具備以下的性質(zhì)(可吞噬性)。
即，ο粒徑為1～6μm，把這樣的粒子稱微粒子。
ο粒子表面使用巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液(生物體內(nèi)巨噬細(xì)胞周邊的體液)潤濕，但不應(yīng)立即溶解而作為一定時(shí)間粒子存在。
ο粒子在20～45℃的溫度范圍內(nèi)是固體。
ο粒子的比重比巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液(生物體內(nèi)巨噬細(xì)胞周邊的體液)的比重大。
ο粒子在表面具有可滲透水或離子的表面層。
另外，如果考慮向生物體內(nèi)給與粒子，則粒子表面必須具有生物體適合性高的高分子層，至到進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)一直保持粒子的形態(tài)，另外進(jìn)入巨噬細(xì)胞后，或沒進(jìn)入的情況也必須在生物體內(nèi)分解代謝變成對(duì)生物體無毒的成分(生物體內(nèi)分解性)。
作為滿足以上的2個(gè)條件、可容易地成型加工成粒子的高分子，聚(乳酸/乙醇酸)共聚物(以下稱“PLGA”)或聚乳酸(以下稱“PL”)成為候補(bǔ)對(duì)象。PL疏水性比PLGA高，分解需要的時(shí)間長(zhǎng)。另外，PLGA分解速度依賴于單體的比例進(jìn)行變化。分子量大的PLGA分解需要的時(shí)間長(zhǎng)。PLGA的分子量在1000以下時(shí)，在20～4℃的范圍有成為液體存在的可能性。因此，在20～45℃的溫度范圍內(nèi)成為固體存在的PLGA的分子量?jī)?yōu)選1,500以上。
此外，PLGA粒子中含有的藥物從粒子內(nèi)的放出，在分子量20000左右PLGA的情況大致以0次放出藥物。即，放出量往往保持一定。然而，觀察到從分子量44000及75000左右的PLGA粒子中不是0次放出，一定時(shí)間后變成脈沖型放出藥物。而且，觀測(cè)脈沖型的藥物放出的時(shí)間，使用分子量大的PLGA制劑時(shí)慢。即，從PLGA粒子中放出藥物的方式依賴于PLGA的分子量。此外，與藥物放出相關(guān)的PLGA的分解速度，不僅隨著PLGA的分子量增加而變慢，而且由于預(yù)測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)等生物體內(nèi)的分解速度比試管內(nèi)快，因此估計(jì)如果是分子量到150000的范圍可有效地在生物體內(nèi)使用。
從以上的觀點(diǎn)看出，由分子量1500～150000、乳酸與乙醇酸的摩爾比50∶50～75∶25的PLGA制的粒徑1～6μm的微粒子制劑(容許范圍)、由分子量5000～75000、乳酸與乙醇酸的摩爾比50∶50～75∶25的PLGA制的粒徑1～6μm的微粒子制劑(適用的范圍)容易被巨噬細(xì)胞吞噬，而且，估計(jì)對(duì)在巨噬細(xì)胞內(nèi)從內(nèi)包藥物的微粒子制劑中邊保持一定的持續(xù)性邊放出藥物的目的最適用。
提供可特異性地殺滅保持感染癥病原體的巨噬細(xì)胞的新型治療藥積極地利用保持以結(jié)核菌為首的種種感染性病原體的巨噬細(xì)胞的特異性的吞噬活性，下述的治療藥對(duì)殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體或保持病原體的巨噬細(xì)胞本身有效果。
(1)使巨噬細(xì)胞吞噬活性亢奮的治療藥(2)對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)的感染病原體有直接殺滅效果的治療藥(3)對(duì)巨噬細(xì)胞作用的治療藥(1)的治療藥優(yōu)選對(duì)感染病原體保持/非保持的巨噬細(xì)胞選擇性地有可吞噬的性質(zhì)。以前，熟知存在使巨噬細(xì)胞的吞噬能力活化的物質(zhì)(公知事項(xiàng))。然而，完全沒有開發(fā)積極利用這種性質(zhì)作用于巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體的治療藥物的嘗試(新型事項(xiàng))。(2)、(3)的類型不僅直接作用于病原體的各種藥物成為對(duì)象，而且具有改變病原體保持/非保持巨噬細(xì)胞生理功能作用的DNA或RNA等遺傳基因本身也可作藥物使用。以前完全沒有開發(fā)(1)、(2)、(3)組合的對(duì)除去感染性病原體的有效的治療藥的探索，本發(fā)明的治療藥是針對(duì)感染性病原體的治療有效的新型的治療藥(新型事項(xiàng))。
例如，Antimicrobial Agents and Chemotherapy 1998年第42卷第10號(hào)pp.2682-2689中，公開了PLGA中含有利福平的粒子的抗結(jié)核作用。然而，該論文中完全沒有敘述有關(guān)利用PLGA粒子使吞噬活性亢奮。此外，含有利福平的PLGA粒子，由于作為抗結(jié)核藥的藥效并沒有比單獨(dú)的利福平提高，所以明確可知具有與本發(fā)明的粒子不同的性狀。此外，如圖4及圖5所示，PLGA的分子量對(duì)控制利福平的放出很重要。但上述論文中沒有記載制備PLGA時(shí)使用的PLGA的分子量。由于可能使用具有與本發(fā)明的粒子不同分子量的PLGA，因此推測(cè)不會(huì)達(dá)到具有作為抗結(jié)核藥的功能。制備有抗結(jié)核藥活性的PLGA粒子時(shí)，必須正確地使用有關(guān)PLGA的分子量、單體比及制得粒子的直徑，必須評(píng)價(jià)利用吞噬細(xì)胞吞噬的粒子的進(jìn)入和巨噬細(xì)胞內(nèi)的抗結(jié)核活性。綜述上述的各點(diǎn)，則上述論文中所述的PLGA粒子，并沒有記載PLGA的單體比、粒子的直徑處于本發(fā)明中的“適用范圍”等，有關(guān)涉及材料確認(rèn)一定的通用性的PLGA粒子的正確的性狀，也沒有抗結(jié)核藥作用。因此，是不可能成為否定本發(fā)明的新穎性、進(jìn)步性的引用文獻(xiàn)的論文。
此外，Pharmaceutical Research 2000年第17卷第8號(hào)pp.955-961中公開了使用分子量82500的PLGA制的含利福平粒子的制備方法，但該粒子的制備方法與本發(fā)明不同。PharmaceuticalResearch 2001年第18卷第9號(hào)pp.1315-1319中公開了使用分子量82500的PLGA的含利福平PLGA粒子的結(jié)核菌殺滅效果。觀察該效果，含利福平PLGA粒子的抗結(jié)核活性也沒到達(dá)到試管內(nèi)利福平單獨(dú)的效果，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也不能說有明顯的治療效果。為了含利福平PLGA粒子呈現(xiàn)抗結(jié)核作用，粒子必須具有適度的分解性與高的利福平內(nèi)包率。然而，上述論文中沒有進(jìn)行有關(guān)控制這種活性的性狀的研究，僅調(diào)查了抗結(jié)核活性。眾知由于分子量大的PLGA粒子其分解性與內(nèi)包率降低，故估計(jì)使用82500這種高分子量的PLGA是不呈現(xiàn)抗結(jié)核作用的原因。如上所述以往雖然進(jìn)行了與本發(fā)明公開的內(nèi)容相類似的研究，但迄今還沒有進(jìn)行如本發(fā)明想到利用巨噬細(xì)胞的吞噬活性，且通過實(shí)現(xiàn)活化，謀求殺滅細(xì)胞內(nèi)寄生病原體的探索。另外，雖然制備了含利福平PLGA，但沒有進(jìn)行有關(guān)可達(dá)到本發(fā)明的目的的制備方法或材料特性的適用的研究。只略微地在Pharmaceutical Research 2001年第18卷第10號(hào)pp.1405-1410中有假想含利福平PLGA粒子進(jìn)入巨噬細(xì)胞中的記載。然而，該情況并不是積極地使含利福平PLGA粒子進(jìn)入巨噬細(xì)胞，或制備打算活化的制劑，實(shí)際上也沒有研究含利福平PLGA粒子的吞噬率等。即，試管內(nèi)使用該論文所述的含利福平PLGA粒子的利福平在巨噬細(xì)胞內(nèi)濃度僅微量地停留在0.45μg/106細(xì)胞中。使用本發(fā)明的含利福平PLGA微粒子的情況不僅使吞噬活化，而且使利福平在巨噬細(xì)胞內(nèi)的濃度達(dá)到6μg/106細(xì)胞，達(dá)到13倍以上。以上說明想對(duì)巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)吞噬殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原微生物，只單一地使微粒子含藥劑則難達(dá)到目的。而且迄今的任何論文也沒有報(bào)道使用作為結(jié)核菌的標(biāo)的細(xì)胞的肺胞巨噬細(xì)胞研究含利福平PLGA粒子殺滅細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌。如參照前述的“維持生命的巨噬細(xì)胞”所知，巨噬細(xì)胞不能把使用組織特異性高、存在于血中的巨噬細(xì)胞得到的結(jié)果直接地對(duì)組織特異性巨噬細(xì)胞，例如，肺胞巨噬細(xì)胞作為可能適用的結(jié)果是眾所周知的事實(shí)。即，本發(fā)明的新穎性不用說概念的新穎性，而且作為支持該概念的實(shí)施例，可列舉使用肺胞巨噬細(xì)胞，而且誘導(dǎo)該細(xì)胞的吞噬活性，又實(shí)際上在肺胞巨噬細(xì)胞內(nèi)保持高的藥物濃度，且制造提供該制劑實(shí)際上殺滅肺胞巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌比單一利福平明顯優(yōu)異的含利福平PLGA粒子。
另外，眾知通過使巨噬細(xì)胞吞噬粒子，由巨噬細(xì)胞增強(qiáng)非特異性的抗菌物質(zhì)，例如過氧化氫、氧自由基的產(chǎn)生。例如European Journalof Pharmaceutical Sciences 2000年第15卷pp.197～207中公開了通過使巨噬細(xì)胞吞噬PLGA粒子，由性格與血中單核細(xì)胞類似的培養(yǎng)巨噬細(xì)胞增強(qiáng)過氧化氫的產(chǎn)生。然而，沒有記載巨噬細(xì)胞通過吞噬PLGA增強(qiáng)吞噬活性。此外，由于巨噬細(xì)胞的活化極富多樣性，所以利用吞噬增強(qiáng)過氧化氫的產(chǎn)生，不能立即直接地與吞噬增強(qiáng)相連系。
實(shí)際的感染癥治療時(shí)，使(1)型的治療藥含有(2)或(3)型的治療藥的制劑有效果。即，為了(2)、(3)型的治療藥在巨噬細(xì)胞內(nèi)有效地發(fā)揮作用，(1)的治療藥使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，發(fā)揮將(2)、(3)型的治療藥運(yùn)搬到巨噬細(xì)胞內(nèi)的作用。即，本發(fā)明為對(duì)象的治療藥如圖1所示，容易被巨噬細(xì)胞吞噬，由于通過吞噬使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，巨噬細(xì)胞內(nèi)治療藥物的濃度比只單一地給與治療藥的情況高。即，與右邊以往進(jìn)入存在于藥液中的巨噬細(xì)胞的藥劑相比，左邊本發(fā)明封入藥劑的微粒子積極地進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)使巨噬細(xì)胞內(nèi)的藥劑濃度升高。因此，權(quán)利要求書中所述的所謂“使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮”，意味著通過提高該治療藥的巨噬細(xì)胞的吞噬能力，巨噬細(xì)胞內(nèi)的治療藥的濃度比單一地給與治療藥的情況高。
具體的適用例結(jié)核作為本發(fā)明所公開的有關(guān)治療藥有效性的一個(gè)例子，對(duì)結(jié)核加以描述。結(jié)核菌由于飛散通過呼吸道進(jìn)入肺胞中，被肺胞巨噬細(xì)胞吞噬。通常被吞噬的病原體，處于在細(xì)胞內(nèi)由于蛋白質(zhì)分解酶的攻擊而被分解命運(yùn)。然而，結(jié)核菌回避蛋白質(zhì)分解酶的攻擊，在巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生存。該巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌移動(dòng)到巨噬細(xì)胞外，繼續(xù)地向宿主體內(nèi)供給結(jié)核菌。作為現(xiàn)在抗結(jié)核菌藥劑，使用雷米封、利福平、硫酸鏈霉素、乙胺丁醇等的藥物。任何一種藥物對(duì)巨噬細(xì)胞外的結(jié)核菌均有效，但對(duì)肺胞巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌沒有效果。這可以得出主要原因是對(duì)殺滅肺胞巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌不能獲得足夠的藥物濃度。
因此，利用肺胞巨噬細(xì)胞的吞噬作用要在肺胞巨噬細(xì)胞內(nèi)殺滅結(jié)核菌，如果得到足夠的藥物濃度，也可以殺滅肺胞巨噬細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌。此時(shí)吞噬作用變成選擇性地使巨噬細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度升高而得到利用。
A.增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力的治療藥以PLGA為例，說明增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力的治療藥的制法及其效果。
I.利用PLGA微粒子制劑增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力(本項(xiàng)中PLGA微粒子本身就是藥效成分)1.PLGA微粒子制劑制備方法(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩爾比為75∶25、分子量20000(和光純藥公司PLGA-7520)(2)PVA(聚乙烯醇)聚合度500(b)PLGA微粒子制劑的制備(1)把PLGA500mg溶解于二氯甲烷1.5mL中。
(2)使PVC溶解于水成為0.3％(w/v)。
(3)把(2)的PVA水溶液8mL加到(1)的溶液中攪拌3分鐘形成水包油型(o/w型)乳液。
(4)把(3)加到(2)的PVA水溶液200mL中，在520轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，室溫?cái)嚢?小時(shí)。
(5)采用離心分離(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，使微粒子制劑沉降、分離，再加2次蒸餾水10mL，經(jīng)離心分離進(jìn)行洗滌。
(6)在干燥器內(nèi)減壓干燥一晝夜。
(7)把制得的微粒子制劑的粒徑分布示于圖2。由圖2清楚地看出制得的微粒子制劑在直徑約2μm有峰、在1～10μm之間具有分布。該粒子在常溫下是固體。由制備使用的PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計(jì)算出收率為約90％。
(8)其他的例把其他制得的PLGA微粒子(分子量及組成)的性狀歸納如下。
1.PLGA-5005(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸50∶50)2.PLGA-5010(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸50∶50)3.PLGA-5020(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸50∶50)4.PLGA-7505(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸75∶25)5.PLGA-7510(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸75∶25)PLGA微粒子制劑制備方法，除了PLGA的種類以外，其他與1.(b)(1)～(6)相同。
制得的微粒子制劑的平均粒徑使用任何一種PLGA的情況均約為2μm。由制劑使用的PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計(jì)算的收率約為90％。
2.通過吞噬PLGA微粒子制劑的肺胞巨噬細(xì)胞的吞噬增強(qiáng)效果(1)在培養(yǎng)基(Ham F-12K、15％牛胎兒血清)中把肺胞巨噬細(xì)胞(NR8383細(xì)胞)制成1×106個(gè)/mL，加到24孔板中，然后添加PLGA-7520微粒子制劑0.04、0.4、4μg，在三氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器(37℃)中進(jìn)行培養(yǎng)。
(2)培養(yǎng)1小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，添加含0.25％胰蛋白酶/磷酸緩沖液的生理食鹽水(以下稱PBS)0.1mL在室溫下放置5分鐘后，除去培養(yǎng)上清液，進(jìn)行洗滌。
(3)然后，加0.1mL的培養(yǎng)基與80％硅石蝕態(tài)懸浮液(percoll)(Pharmacia公司制)0.1mL混合制備40％Percoll溶液，在1.5mL的樣品管中重層成加有該溶液的70％Percoll 0.1mL，進(jìn)行離心分離(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘).
(4)離心分離后回收界面上存在的細(xì)胞，用PBS對(duì)細(xì)胞洗滌后添加培養(yǎng)基1mL，添加用粒徑2.0μl的熒光素硫代異氰酸酯(FITC)標(biāo)記的聚苯乙烯膠乳粒子(FITC-PSLP)1×107個(gè)，進(jìn)行培養(yǎng)1小時(shí)。使用熒光性的FITC進(jìn)行標(biāo)記是為了容易進(jìn)行定量。
(5)培養(yǎng)后進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，向沉降層的巨噬細(xì)胞中加入PBS1mL，反復(fù)進(jìn)行2次離心操作。
(6)除去PBS后，向細(xì)胞中添加10％甲醛水/PBS0.1mL，固定5分鐘后，加蒸餾水1mL，除去上清液，再加蒸飽水1mL，除去上清液。除去上清液后，加0.1mL的蒸餾水使細(xì)胞懸浮，取該懸浮液0.02mL，擴(kuò)展在玻璃片上使之干燥。
(8)在熒光顯微鏡下進(jìn)行多視野攝影，測(cè)定每100個(gè)細(xì)胞中有卷入了FITC-PSLP的NR8383細(xì)胞的數(shù)。
(8)巨噬細(xì)胞的FITC-PSLP吞噬量因使用PLGA微粒子制劑的變化如表1所示。低量添加PLGA微粒子制劑時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的效果不顯著，而添加0.4(μg/mL)使吞噬能力活化的效果特別明顯。
表1PLGA微粒子制劑對(duì)吞噬細(xì)胞吞噬能力的增強(qiáng)作用

II.利用脂多糖增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力1.脂多糖制備方法(a)材料
(1)革蘭氏陰性菌pantoea屬成團(tuán)泛菌(b)脂多糖的制備(1)在7L的肉汁培養(yǎng)基(胰胨10g/L，酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、葡萄糖1g/L、pH7.5)中加入成團(tuán)泛菌，在35℃振動(dòng)培養(yǎng)1夜，收集約70g的濕菌體。
(2)把約70g的菌體懸浮在500mL的蒸餾水中，添加500mL的90％熱苯酚，在65～70℃攪拌20分鐘、冷卻、回收水層。將回收的水層透析1夜除去苯酚，使用分子量20萬分離膜在2個(gè)大氣壓的氮?dú)庀聦?duì)透析內(nèi)液進(jìn)行超濾濃縮。
(3)將得到的粗脂多糖冷凍干燥物溶解在蒸餾水中，裝入陰離子交換層析(Pharmacia公司制，Q-Sepharose Fast Flow)中，使用含10mM三-HCl(pH7.5)及10mM的NaCl的緩沖液將試料溶液通入色譜柱，使用200～400mM NaCl/10mM三-HCl(pH7.5)使Limulus活性級(jí)分洗出。在與前述相同條件下對(duì)該洗出液進(jìn)行超濾，脫鹽及濃縮、冷凍干燥，可以由約70g的濕菌體得到約300g的精制脂多糖。
2.肺胞巨噬細(xì)胞利用脂多糖的吞噬增強(qiáng)效果(1)在培養(yǎng)基(Ham F-12k、15％牛胎兒血清)中制備肺胞巨噬細(xì)胞(NR8383)1×106個(gè)/mL，加到24孔板中，然后添加脂多糖使之成為1μg/mL，使用二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器(37℃)進(jìn)行培養(yǎng)。
(2)培養(yǎng)1小時(shí)后，把細(xì)胞移到1.5mL的樣品管中，采用離心分離(2000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)除去培養(yǎng)液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS0.01mL在室溫下放置5分鐘后，進(jìn)行離心分離(2000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)除去培養(yǎng)上清液，使用PBS進(jìn)行洗滌。
(3)然后，加入0.1mL的培養(yǎng)基與60％Percoll 0.1mL混合制備30％Percoll溶液，進(jìn)行離心分離(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)。
(4)離心分離后，回收液表面上存在的細(xì)胞，使用PBS將細(xì)胞洗2次后，添加培養(yǎng)基1mL，添加粒徑2.0μm的FITC-PSLP 1×107個(gè)，培養(yǎng)1小時(shí)。
(5)培養(yǎng)后，除去上清液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室溫下放置5分鐘后，添加培養(yǎng)基1mL，進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)。
(6)向沉降層的巨噬細(xì)胞中加入PBS 1mL進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，除去上清液，再添加PBS 1mL后，進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)除去上清液。
(7)除去上清液后，向細(xì)胞中添加10％甲醛水/PBS 0.1mL，固定5分鐘后，加蒸餾水1mL，除去上清液，再加蒸餾水1mL，除去上清液。
(8)除去上清液后，加0.1mL的蒸餾水使細(xì)胞懸浮，取該懸浮液0.02mL，擴(kuò)展在玻璃片上，使之干燥。
(9)在熒光顯微鏡下進(jìn)行多視野攝影，測(cè)定每500個(gè)細(xì)胞中卷入了FITC-PSLP的NR8383細(xì)胞的數(shù)。
(10)利用脂多糖的巨噬細(xì)胞的FITC-PSLP吞噬量的增加如表2所示。由表2看出由于脂多糖，巨噬細(xì)胞的吞噬能力被活化。
表2利用脂多糖的巨噬細(xì)胞吞噬能力的活化

B.作用于巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體的治療藥利福平(抗結(jié)核菌藥)利用吞噬RFP-PLGA微粒子制劑向巨噬細(xì)胞內(nèi)的有效遷移1.內(nèi)包利福平的PLGA微粒子制劑的制備(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩爾比為75∶25或50∶50，分子量5000、10000或20000，和光純藥公司PLGA-5005、5010、5020、7505、7510、7520。
(2)利福平(3)PVA(聚乙烯醇)聚合度500(b)RFP-PLGA微粒子制劑的制備
(1)將PLGA 500mg與利福平(0、50、100、200mg)溶解于二氯甲烷1.5mL中。
(2)把PVA溶解于水使之成為0.3％(w/v)。
(3)向(1)的溶液中加入(2)的PVA水溶液8mL攪拌3分鐘形成o/w型乳液。
(4)向(2)的PVA水溶液200mL中加入(3)，在520轉(zhuǎn)/分鐘的條件下，室溫?cái)嚢?小時(shí)。
(5)采用離心分離(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)使微粒子制劑沉降分離，再加蒸餾水10mL2次，經(jīng)離心分離進(jìn)行洗滌。
(6)在干燥器內(nèi)減壓和干燥1晝夜。
(7)把制得的RFP-PLGA粒子(分子量及組成)歸納如下。
1.RFP-PLGA 5005(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸50∶50)2.RFP-PLGA 5010(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸50∶50)3.RFP-PLGA 5020(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸50∶50)4.RFP-PLGA 7505(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸75∶25)5.RFP-PLGA 7510(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸75∶25)6.RFP-PLGA 7520(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75∶25)制得的微粒子制劑的粒度分布與性狀完全與單一PLGA微粒子制劑(A.I.1.(b)(7))相同。
(8)把500mg的PLGA中含有利福平0、50、100、200mg的微粒子制劑4mg溶解于二氯甲烷1mL中后，使用分光光度計(jì)測(cè)定475nm的吸光度。
(9)把RFP-PLGA微粒子制劑(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75∶25制的微粒子PLGA-7520)中的回收利福平量示于表3。由該結(jié)果明顯地看出利福平被高效地制劑化。
表3RFP-PLGA微粒子制劑的內(nèi)包利福平量


2.其他的RFP-PLGA微粒子制劑的制備方法(膜乳化法公知)使用膜乳化法制備RFP-PLGA微粒子制劑膜乳化法是對(duì)兩種不互混的液體的一方(分散相)進(jìn)行加壓，借助多孔玻璃膜(SPG膜)分散在另一方液體(連續(xù)相)中的乳化方法，采用這種方法可以制得具有均勻粒徑的乳液。
(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙醇酸)共聚物)摩爾比為75∶25、分子量10000，和光純藥公司PLGA 7510(2)利福平(3)PVC(聚乙烯醇)聚合度500(b)RFP-PLGA微粒子制劑的制備(1)把PLGA 500mg與利福平100mg溶解于二氯甲烷10mL中。
(2)把PVA溶解于水中使之成為0.3％(w/v)。
(3)借助SPG膜(伊勢(shì)化學(xué)工業(yè)、細(xì)孔徑0.49μm)把(1)的溶液分散在(2)的PVA水溶液10mL中，形成水包油型(o/w型)。
(4)向(2)的PVA水溶液200mL中加入(3)，采用520轉(zhuǎn)/分鐘，在室溫下攪拌3小時(shí)。
(5)采用離心分離(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)，使微粒子制劑沉降進(jìn)行分離，再加蒸餾水10mL 2次，采用離心分離進(jìn)行洗滌。
(6)在干燥器內(nèi)減壓干燥1晝夜。
(7)制得的微粒子制劑的平均粒徑是1.98μm。由制劑使用的PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計(jì)算的PLGA的收率是約90％。而，利福平的收率是約75％。該粒子在常溫是固體。
3.采用膜乳化法的其他例把采用膜化法制備的RFP-PLGA 7510微粒子制劑以外的RFP-PLGA微粒子(分子量及組成)歸納如下。
1.RFP-PLGA 5005(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸50∶50)
2.RFP-PLGA 5010(PLGA分子量10000，乳酸/乙醇酸50∶50)3.RFP-PLGA 5020(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸50∶50)4.RFP-PLGA 7505(PLGA分子量5000，乳酸/乙醇酸75∶25)5.RFP-PLGA 7520(PLGA分子量20000，乳酸/乙醇酸75∶25)這些的RFP-PLGA微粒子制劑的制備方法，除了PLGA的種類以外，其他與上述的膜乳化法相同。
制得的微粒子制劑的平均粒徑，PLGA 5005為2.20μm、PLGA 5010為2.66μm、PLGA 5020為2.29μm、PLGA 7505為2.00μm、PLGA 7520為1.85μm。由制備使用的PLGA(500mg)與回收的制劑的總重量計(jì)算的PLGA的收率均是約90％。另外，利福平的收率，PLGA 5005為約87％、PLGA 5010為約78％、PLGA 5020為約67％、PLGA 7505為約91％、PLGA7520為約58％。
4.從RFP-PLGA微粒子放出利福平(1)把采用膜乳化法制得的各RFP-PLGA微粒子50mg分散在保持于37 ℃(溫度)的pH7.4磷酸緩沖液(離子強(qiáng)度0.154M)5mL中。
(2)經(jīng)時(shí)地離心分離收集上清液，向殘留的微粒子中加入pH7.4磷酸緩沖液(離子強(qiáng)度0.154M)5mL中。
(3)測(cè)定在上清液中溶出的利福平濃度。測(cè)定使用分光光度計(jì)在475nm的波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定。
(4)把從各RFP-PLGA微粒子中向上清液中放出的利福平的比例示于圖4及圖5。由本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示出利福平從PLGA分子量為5000及10000的PLGA 5005、PLGA 5010和PLGA 7505、PLGA 7510中放出的速度快。由這些結(jié)果顯示出PLGA的組成其分子量為5000～10000、乳酸與乙醇酸的比為50∶50或75∶25借助了巨噬細(xì)胞吞噬的藥劑的遷移優(yōu)異。
5.通過吞噬RFP-PLGA微粒子制劑(PLGA 7520)細(xì)胞內(nèi)利福平濃度的選擇性增加(1)把制得的RFP-PLGA微粒子制劑再分散到PBS中，進(jìn)行離心分離(400轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)除去大的粒子，把制成顯微鏡觀察為約1～3μm尺寸的微粒子制劑(重量約30％)用于以下的實(shí)驗(yàn)。
(2)把在培養(yǎng)基中培養(yǎng)成5×105個(gè)/0.9mL的NR8383細(xì)胞加到24孔板上，然后添加各RFP-PLGA微粒子制劑0.12mg/0.1mL，進(jìn)行培養(yǎng)12小時(shí)。
(3)培養(yǎng)后，除去培養(yǎng)液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室溫放置5小時(shí)后，除去培養(yǎng)上清洗，進(jìn)行洗滌。
(4)然后，加0.1mL的培養(yǎng)基與80％percoll 0.1mL混合成40％percoll，把該溶液與加到1.5mL樣品管中的70％percoll 0.1mL進(jìn)行重層，進(jìn)行離心分離(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)。
(5)離心分離后，回收界面上存在的細(xì)胞，使用PBS洗滌細(xì)胞后，使用二氯甲烷抽提進(jìn)入細(xì)胞中的利福平。
(6)用475nm的吸光度確定利福平的量。
(7)作為對(duì)照，制備含于各RFP-PLGA微粒子制劑0.12mg中的同量的利福平的二甲亞砜(DMSO)溶液。把該溶液加到加有1mL培養(yǎng)基的24孔板上，然后添加NR8383細(xì)胞。
(8)培養(yǎng)細(xì)胞12小時(shí)后，回收細(xì)胞(5×105個(gè))，使用二氯甲烷抽提細(xì)胞中的利福平。
(9)把利福平被巨噬細(xì)胞卷入的量示于圖3。利福平的添加量在40(μg/5×105個(gè)/孔/mL)時(shí)，與過去的含利福平的培養(yǎng)基相比，本實(shí)施例的RFP-PLGA微粒子制劑的情況顯示出卷入了約19倍的利福平。
C.增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬能力作用于巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體的藥物(A+B)通過吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的巨噬細(xì)胞的吞噬活性增強(qiáng)效果1.RFP-PLGA微粒子制劑的制備(a)材料(1)PLGA(聚(乳酸/乙酸酸)共聚物)摩爾比為75∶25或50∶50，分子量5000、10000或20000，和光純藥公司PLGA-5005、5010、5020、7505、7510、7520。
(2)利福平
(3)PVA(聚乙烯醇)聚合度500(b)RFP-PLGA微粒子制劑的制備(1)把PLGA 500mg與利福平100mg溶解于二氯甲烷1.5mL中。
(2)把PVC溶解于水使之成為0.3％(w/v)。
(3)把(2)的PVA水溶液8mL加到(1)的溶液中攪拌3分鐘形成o/w型乳液。
(4)把(3)加到(2)的PVA水溶液200mL中，采用520轉(zhuǎn)/分鐘，在室溫下攪拌3小時(shí)。
(5)采用離心分離(3000轉(zhuǎn)/分鐘，15分鐘)使微粒子制劑沉降分離，再加蒸餾水10mL 2次，采用離心分離進(jìn)行洗滌。
(6)在干燥器內(nèi)減壓干燥一晝夜。
(7)制得的微粒子制劑的粒度分布及性狀與單一PLGA的微粒子制劑(A.I.1.(a)(7))相同。
(8)使微粒制劑分散在PBS中，采用離心分離(400轉(zhuǎn)/分狀，5分鐘)除去大的微粒子制劑，把調(diào)整到用顯微鏡觀察約1～3μm尺寸的微粒子制劑用于以后的實(shí)驗(yàn)。
2.利用吞噬RFP-PLGA微粒子(PLGA-7520)巨噬細(xì)胞增強(qiáng)吞噬活性(1)在培養(yǎng)基(Ham F-12K，15％牛胎兒血清)中制備肺胞巨噬細(xì)胞(NR8383)1×106個(gè)/mL，加到24孔板上，然后添加PLGA微粒子制劑0.012、0.12、1.2μg，在二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器(37℃)中進(jìn)行培養(yǎng)。
(2)培養(yǎng)1小時(shí)后，把細(xì)胞移到1.5mL的樣品管中，除去培養(yǎng)液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室溫下放置5分鐘，除去培養(yǎng)上清液，進(jìn)行洗滌。
(3)然后加0.1mL的培養(yǎng)基和90％percoll 0.1mL使percoll濃度成為45％后，進(jìn)行離心分離(8000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)。
(4)離心分離后，回收液表面的細(xì)胞，用PBS將該細(xì)胞洗2次后，添加與(1)所用相同的培養(yǎng)基1mL，添加粒徑2.0μm的FITC-PSLP1×107個(gè)，進(jìn)行1小時(shí)培養(yǎng)。
(5)培養(yǎng)后，除去上清液，添加0.25％胰蛋白酶/PBS 0.1mL在室溫放置5分鐘后，添加培養(yǎng)基1mL，進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)。
(6)向沉降層的巨噬細(xì)胞中加入PBS進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，除去上清液，再添加PBS 1mL后，進(jìn)行離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)除去上清液。
(7)除去上清液后，向細(xì)胞中添加10％甲醛水/PBS 0.1mL，固定5分鐘后，加蒸餾水1mL，離心分離(700轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘)，除去上清液。然后，加0.1mL的蒸餾水使細(xì)胞懸浮，取該懸浮液0.02mL，擴(kuò)展在玻璃氣上，使之干燥。
(8)在熒光顯微鏡下進(jìn)行多視野攝影，測(cè)定每500個(gè)細(xì)胞中卷入FITC-PSLP的巨噬細(xì)胞(NR8383細(xì)胞)的數(shù)。
(9)巨噬細(xì)胞通過吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的FITC-PSLP吞噬量的增加如表4所示。表明巨噬細(xì)胞的吞噬能力被RFP-PLGA微粒子制劑活化。
表4吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的NR8383細(xì)胞的FITC-PSLP吞噬增強(qiáng)作用

由以上的結(jié)果表明，(1)PLGA微粒子制劑及脂多糖使巨噬細(xì)胞的吞噬能力活化。另外，表明(2)利福平向巨噬細(xì)胞內(nèi)遷移由于包含在PLGA微粒子制劑中格外增大。還表明(3)即使利福平被含在PLGA微粒子制劑內(nèi)，巨噬細(xì)胞吞噬能力也被活化。因此，含利福平PLGA微粒子制劑，活化了巨噬細(xì)胞的吞噬能力，結(jié)果利福平在巨噬細(xì)胞內(nèi)濃度增大，可以達(dá)到對(duì)保持在巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體有效地作用的本發(fā)明的目的。上述的結(jié)果是表示利用作為本發(fā)明基本概念的“使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮”的構(gòu)想，使作用于巨噬細(xì)胞內(nèi)病原體的治療藥有效地進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的新型治療藥的一個(gè)實(shí)例。
3.吞噬RFP-PLGA微粒子制劑的巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌殺滅效果(a)巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌(BCG)的生存率測(cè)定法(1)用生理食鹽水溶解干燥BCG疫苗(12mg/mL)進(jìn)行攪拌后，把KRD培養(yǎng)基(3～4mL)移到T-25培養(yǎng)燒瓶中加入BCG懸浮液40μL，在干式溫育箱37℃下進(jìn)行培養(yǎng)。
(2)實(shí)驗(yàn)是按1∶4的比例把菌液與玻璃球珠加到樣品管中，使用旋渦攪拌機(jī)攪拌1分鐘后，再采用超聲波洗滌機(jī)的5分鐘超聲波處理進(jìn)行菌體的分散。
(3)把1×106個(gè)/mL濃度的NR8383加到6孔板上(總體積5mL)。把結(jié)核菌(BCG)按每個(gè)細(xì)胞10個(gè)(multiplicity ofinfection(MOI)＝10)添加到細(xì)胞培養(yǎng)液中。
(4)在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器中使感染4小時(shí)后，進(jìn)行離心分離2,000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘(SCT 15 B)后，除去上清液。使用無血清培養(yǎng)基同樣地重復(fù)2次離心分離，除去細(xì)胞外的菌。
(5)把濃度1×106個(gè)/mL的NR8383種到24孔板上。
(6)把各RFP-PLGA微粒子按每1個(gè)細(xì)胞10個(gè)的比例添加到NR8383的培養(yǎng)液中。
(7)在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器中使吞噬4小時(shí)后，使用0.25％胰蛋白酶除去細(xì)胞外的粒子。
(8)加80％Percoll制備40％Percoll細(xì)胞液，再加70％Percoll形成密度梯度。進(jìn)行10000轉(zhuǎn)/分鐘，5分鐘(SORVALL Biofuge fresco)離心分離后，回收40％、70％Percoll間界面的細(xì)胞，分離細(xì)胞和RFP-PLGA。
(9)使用PBS同樣地重復(fù)2次離心分離除去Percoll。
(10)使用氟二乙酸酯熒光素(FDA/Fluorescein diacetate)/乙啡啶硼化物(Ethidium bromide，EB)染色法測(cè)定活菌與死菌的比率。FDA按5mg/mL的濃度溶解于丙酮中，使用時(shí)將20μL用1mL的PBS進(jìn)行稀釋。EB按20μg/mL的濃度溶解于PBS中，使用時(shí)將50μL用1mL PBS稀釋使用。染色是將FDA與ED等量混合使用。把該混合液1μL加到玻璃片上，在其上面再放1μL菌液，放在室溫下2分鐘用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察?；罹镁a(chǎn)生的酯酶活性分解FDA，發(fā)出綠色的熒光。而死菌由于沒有酯酶活性，故不出現(xiàn)FDA的染色，被EB染色發(fā)出橙色的熒光。
(b)利用吞噬進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)的RFP-PLGA微粒子制劑殺滅結(jié)核菌的效果(1)為了研究巨噬細(xì)胞內(nèi)RFP-PLGA微粒子殺滅結(jié)核菌的效果，把RFP-PLGA微粒子給與預(yù)先吞噬結(jié)核菌的巨噬細(xì)胞(感染結(jié)核菌巨噬細(xì)胞)，使巨噬細(xì)胞吞噬該微粒子。
(2)把研究吞噬移到巨噬細(xì)胞內(nèi)的RFP-PLGA對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌呈現(xiàn)什么樣的殺滅效果的結(jié)果示于圖6。即使是含利福平約為單獨(dú)利福平(100μg/mL)的1/20的RFP-PLGA微粒子給與量(MOI＝10，估計(jì)利福平是5μg/mL，故微粒子制劑中的利福平相當(dāng)于單獨(dú)給與利福平時(shí)的1/20量)，利福平在巨噬細(xì)胞內(nèi)濃度有意義地增高。RFP-PLGA微粒子對(duì)感染結(jié)核菌肺胞巨噬細(xì)胞的給與，與單獨(dú)給與的利福平相比，以20倍以上的效率殺滅細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核菌。即通過給予借助吞噬粒子的藥劑，無論是藥劑本身的抗結(jié)核作用，也都得到20倍以上治療系數(shù)的提高。
提供使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮對(duì)處于功能異常狀態(tài)的巨噬細(xì)胞發(fā)生作用的治療藥眾知的是癌組織中通常多數(shù)的巨噬細(xì)胞進(jìn)行浸潤。這因?yàn)榘┘?xì)胞對(duì)生物體來講是異物，基于排除癌細(xì)胞的目的，巨噬細(xì)胞發(fā)生積累。巨噬細(xì)胞功能正常時(shí)，傷害消滅癌細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞功能異常時(shí)不能傷害癌細(xì)胞，癌細(xì)胞成長(zhǎng)以至形成腫塊。然而如前所述，通過巨噬細(xì)胞的活化也可以對(duì)癌細(xì)胞給予傷害。因此，通過使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，使功能異常的巨噬細(xì)胞獲得傷害癌細(xì)胞作用，可以有效地治療癌。
另外，如表2所示肺胞巨噬細(xì)胞的作用通過脂多糖(1μg/mL)的處理也增強(qiáng)166％，肺胞巨噬細(xì)胞被脂多糖活化。而且，估計(jì)利用脂多糖活化吞噬能力的肺胞巨噬細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞呈現(xiàn)細(xì)胞傷害作用。在此，例示脂多糖活化肺胞巨噬細(xì)胞傷害肺癌細(xì)胞作用的例。
具體的適用例肺癌列舉活化肺胞巨噬細(xì)胞的傷害肺癌細(xì)胞的效果作為適用例。
1.脂多糖活化肺胞巨噬細(xì)胞及肺胞巨噬細(xì)胞與佐藤肺癌細(xì)胞的共同培養(yǎng)(1)把NR8383按1×106個(gè)/mL的濃度加到24孔板上(總體積1.5mL)。進(jìn)行控制，加5％牛胎兒血清、F-12K培養(yǎng)基159μL、10μg/mL脂多糖150μL。
(2)在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器中放置24小時(shí)。
(3)把佐藤肺癌細(xì)胞調(diào)制成1×105個(gè)/mL的濃度，加到96孔板上，每孔加50μL。
(4)把(1)項(xiàng)處理NR8383調(diào)制成5×105、1×105、5× 104、1×104個(gè)/mL的濃度，加到96孔板上50μL(總體積100μL)。
(5)在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器中放置4小時(shí)。
2.對(duì)與佐藤肺癌細(xì)胞共同培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞對(duì)肺癌細(xì)胞的傷害作用(1)為了由從細(xì)胞內(nèi)向培養(yǎng)液中放出的乳酸脫氫酶量評(píng)價(jià)上述1所述的被脂多糖活化，與佐藤肺癌細(xì)胞共同培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的傷害效果，采用1000轉(zhuǎn)/分鐘離心分離5分鐘后，分取上清液50μL加到另外的96孔板上。
(2)接著加入付屬于試劑盒(Cyto Tox 96 Non-RadioativeCytotoxicity Assay，Promega，cat.G1780)的基質(zhì)溶液50μL測(cè)定乳酸脫氫酶量。再者，作為陽性控制，使用付屬于試劑盒的乳酸脫氫酶酯稀釋液(5000倍稀釋液50μL)。
(3)使用鋁箔遮光、室溫放置30分鐘。
(4)加停止液50μL，使反應(yīng)停止。
(5)使用微量反應(yīng)板讀數(shù)器(Model 550，BIO-RAD公司)測(cè)定495nm下的吸光度。
(6)由各吸光度算出細(xì)胞毒性(％)。
(7)把NR8383對(duì)佐藤肺癌細(xì)胞的毒性效果示于圖7。與沒有進(jìn)行脂多糖處理的NR8383相比，脂多糖處理的NR8383吞噬亢進(jìn)，結(jié)果對(duì)佐藤肺癌的細(xì)胞傷害效果顯示出依賴于細(xì)胞比增大。
提供使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮、誘導(dǎo)保持病原體的巨噬細(xì)胞至細(xì)胞死亡的治療藥本實(shí)施方案的治療藥，其特征在于通過使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮、誘導(dǎo)保持病原體的巨噬細(xì)胞至細(xì)胞死亡。
如表2所示，熟知作為巨噬細(xì)胞活化劑的脂多糖使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮。另外，作為巨噬細(xì)胞活化因子的代表性細(xì)胞因子的干擾素γ也使吞食活性亢奮。即，巨噬細(xì)胞吞噬活性的亢奮是巨噬細(xì)胞活化的指標(biāo)之一。本件所示的利用吞噬使吞噬活性亢奮，可以說所有的吞噬刺激誘導(dǎo)所有的稱為吞噬亢奮的巨噬細(xì)胞的活化。另外，還知道隨著巨噬細(xì)胞利用脂多糖或干擾素γ活化，而誘發(fā)巨噬細(xì)胞的膜結(jié)構(gòu)變化，在巨噬細(xì)胞內(nèi)誘導(dǎo)膜結(jié)合型腫瘤壞死因子(TNF)。因此，隨著利用吞噬這種刺激活化巨噬細(xì)胞而變成誘導(dǎo)膜結(jié)合型TNF。
艾滋病受艾滋病毒感染，破壞了T細(xì)胞，由于免疫應(yīng)答缺陷而發(fā)病。然而，艾滋病毒感染不僅是對(duì)T細(xì)胞感染，而且也對(duì)巨噬細(xì)胞感染。這種感染由于艾滋病毒吸附在共同出現(xiàn)在T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞膜上的CD4蛋白質(zhì)上而開始，感染艾滋病毒的巨噬細(xì)胞不陷于細(xì)胞死亡而繼續(xù)地產(chǎn)生了艾滋病毒，如II.(2)中所述的成為感染病毒媒體。
因此，如果可以誘導(dǎo)感染艾滋病毒的巨噬細(xì)胞至細(xì)胞死亡，則實(shí)現(xiàn)消滅感染病原體媒體。
作為可實(shí)現(xiàn)這種可能性的一個(gè)例子，列舉膜結(jié)合型TNF對(duì)感染艾滋病毒(HIV)的巨噬細(xì)胞作用，可特異性地誘導(dǎo)該細(xì)胞至細(xì)胞死亡。具體的適用例利用呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF細(xì)胞誘導(dǎo)HIV感染細(xì)胞死亡作TNF對(duì)感染病原體的細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的實(shí)施例，列舉TNF對(duì)HIV感染MOLT-4細(xì)胞的作用。
1.呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF細(xì)胞的制備(1)為了穩(wěn)定地呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF按照已經(jīng)發(fā)表的論文(Journalof Virology 1889年，第63卷，pp.2504-2509)制備老鼠及人呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF質(zhì)體(pMT 2β G/Hu-proTNF)。
(2)然后，按10∶1的比例把該質(zhì)體與轉(zhuǎn)換株選擇用酯合耐新霉素遺傳基因的質(zhì)體混合，導(dǎo)入老鼠胎兒產(chǎn)生的纖維芽細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)中。
(3)把上述進(jìn)行轉(zhuǎn)化操作的NIH3T3細(xì)胞，在作為標(biāo)示物的新霉毒800μg/mL的存在下，在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器內(nèi)培養(yǎng)約2個(gè)星期。
(4)培養(yǎng)后，取得結(jié)合在細(xì)胞內(nèi)的TNF的克隆。
(5)得到的克隆，采用酶免疫測(cè)定法確認(rèn)呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF。
2.感染HIV的MOLT4細(xì)胞的制備(1)感染HIV細(xì)胞，在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器內(nèi)，在培養(yǎng)基(添加RPM11640，10％牛胎兒血清及青霉素(100U/mL)、鏈霉素(100μg/mL)中，使用感染HIV細(xì)胞(HTLV-III B株)，按照已發(fā)表論文(Journal of Virology 1889年，第63卷，pp.2504-2509)使MOLT4感染。如果對(duì)MOLT4細(xì)胞感染艾滋病毒成立，則MOLT4細(xì)胞顯示出持續(xù)地繼續(xù)產(chǎn)生艾滋病毒的特征。因此，產(chǎn)生艾滋病毒的話，MOLT4細(xì)胞則是感染艾滋病毒巨噬細(xì)胞的模型。
(2)在這種感染條件下，感染HIV的MOLT4細(xì)胞的90％以上對(duì)HIV抗體成陽性。
(3)因此，借助HIV感染細(xì)胞，將HIV導(dǎo)入MOLT4細(xì)胞的全部中，制得HIV感染MOLT4細(xì)胞。
3.利用呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF細(xì)胞誘導(dǎo)感染HIV細(xì)胞至細(xì)胞死亡(1)在24孔培養(yǎng)板上培養(yǎng)導(dǎo)入TNF質(zhì)體的NIH3T3細(xì)胞使之大致成板一面。
(2)然后，加一定量的HIV感染MOLT4細(xì)胞在37℃，二氧化碳?xì)怏w培養(yǎng)器內(nèi)混合培養(yǎng)3天。
(3)為了研究所發(fā)現(xiàn)的膜結(jié)合型TNF對(duì)感染HIV細(xì)胞的作用，采用錐蟲藍(lán)色素排除法測(cè)定感染HIV細(xì)胞的生存率。
(4)結(jié)果，利用HIV感染MOLT4細(xì)胞的40％與呈現(xiàn)膜結(jié)合型TNF細(xì)胞的混合培養(yǎng)確認(rèn)細(xì)胞死亡。
由以上的例子清楚地說明膜結(jié)合型TNF對(duì)感染艾滋病毒(HIV)的細(xì)胞，特異性地誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。由此可以看出，保持病原體功能異常的巨噬細(xì)胞，通過吞噬病原體而活化，結(jié)果誘導(dǎo)的膜結(jié)合型TNF誘導(dǎo)感染病原體的細(xì)胞至細(xì)胞死亡。
巨噬細(xì)胞帶有病原體形成的疾病有分枝桿菌病、艾滋病、衣原體病、或弓漿蟲病等，分枝桿菌病有結(jié)核分支桿菌或牛分支桿菌為原因菌的結(jié)核，麻風(fēng)分支桿菌為原因菌的ライ或鳥分支桿菌等為原因菌的非定型分枝桿菌病，作為衣原體病的原因菌有肺炎、沙眼衣原體或鸚武熱衣原體，任何一種均可有效地使用本發(fā)明。然而，本實(shí)施方案所示的RFP-PLGA微粒子殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核菌的效果，必須至少通過2次細(xì)胞內(nèi)小胞膜結(jié)構(gòu)，即由吞噬進(jìn)入吞噬體內(nèi)的RFP-PLGA微粒子中游離出利福平，透過吞噬體膜，再透過含結(jié)核菌吞噬體的吞噬體膜才能實(shí)現(xiàn)。上述所示的原因菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的保命戰(zhàn)略多種多樣。分枝桿菌病、軍團(tuán)病、弓漿蟲病通過原因菌在吞噬體內(nèi)保命而在巨噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行生存。李斯特桿菌、衣原體病具有原因菌從吞噬體中脫出的特征。與原因菌在吞噬體內(nèi)存在的情況相比，從藥劑到達(dá)的觀點(diǎn)來看，如果藥劑一度透過巨噬體膜可期待藥效，故估計(jì)這些原因菌的細(xì)胞內(nèi)生存形態(tài)更容易。另外，艾滋病如果藥劑到達(dá)存在于細(xì)胞內(nèi)的原因菌中則在可期待藥效方面與李斯特桿菌等同樣。由以上看出本發(fā)明對(duì)上述所述的原因菌也是有希望的治療。
以下，列舉對(duì)各種疾病可有效地使用本發(fā)明的藥品。
1)分枝桿菌病利福平、雷米封、乙胺丁醇、吡嗪酰胺、抗衣原體藥、卡那霉素、硫酸鏈霉素、恩維霉素、乙硫異煙胺、環(huán)絲氨酸、左氧氟沙星、氨苯砜。
2)艾滋病疊氮胸腺嘧啶、二去氧肌苷。
3)衣原體病二甲胺四環(huán)素鹽酸鹽、多西環(huán)素鹽酸鹽、克拉霉素、司氟沙星、羅紅霉素、左氧氟沙星。
4)弓漿蟲病乙胺嘧啶、磺胺間甲氧嘧啶、乙酰螺旋霉素。
5)瘧疾磷酸氯喹、硫酸奎寧、磺胺多辛、甲氟喹。
6)癌5-氟尿嘧啶、阿霉素、順鉑、依托泊甙、絲裂霉素、長(zhǎng)春新堿、紫杉酚、喜樹堿、長(zhǎng)春堿、環(huán)磷酰胺、鹽酸平陽霉素。
7)克朗氏病抑氮磺胺吡啶、糖皮質(zhì)激素。
8)類類風(fēng)濕病硫代蘋果酸金鈉、青霉胺、布西拉明、糖皮質(zhì)激素。
本說明書引用的一切刊物、專利及專利申請(qǐng)寫入說明書中直接作為參考。
產(chǎn)業(yè)上利用的可能性根據(jù)本發(fā)明可提供可有效地治療因巨噬細(xì)胞功能異常，或巨噬細(xì)胞為媒體所患疾病的治療藥。
權(quán)利要求
1.治療藥，其特征在于含有成團(tuán)泛菌的脂多糖，使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，對(duì)處于功能異常狀態(tài)的巨噬細(xì)胞發(fā)生作用，對(duì)于肺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用。
2.權(quán)利要求1所述的治療藥，其特征在于前述巨噬細(xì)胞是存在與粘膜組織中的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明目的是提供針對(duì)功能異常的巨噬細(xì)胞，或巨噬細(xì)胞為媒體所患疾病的治療藥，該治療藥含有成團(tuán)泛菌的脂多糖，可以使巨噬細(xì)胞的吞噬活性亢奮，對(duì)處于功能異常狀態(tài)的巨噬細(xì)胞發(fā)生作用，對(duì)于肺癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，或者通過積極地被巨噬細(xì)胞吞噬有效地進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)，由此，使功能異常的巨噬細(xì)胞正?；?，殺滅感染病原體的巨噬細(xì)胞，或殺滅感染病原體的巨噬細(xì)胞內(nèi)的病原體的治療藥。
文檔編號(hào)A61K45/00GK1935156SQ20061011492
公開日2007年3月28日 申請(qǐng)日期2003年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月27日
發(fā)明者寺田弘, 牧野公子, 杣源一郎 申請(qǐng)人:寺田弘