本發(fā)明涉及一種異位妊娠、非孕蛻膜組織差異表達蛋白的篩選方法。

背景技術(shù)：

妊娠與非妊娠子宮內(nèi)膜組織的判定對于臨床來說十分重要，子宮內(nèi)膜從分泌晚期到妊娠早期間的過渡狀態(tài)沒有絕對的界限，但在現(xiàn)實工作中，經(jīng)常遇到妊娠蛻膜和蛻膜樣組織及非妊娠蛻膜組織的鑒別診斷、臨床以刮宮材料要求診斷宮外孕問題等，目前尚無滿意的解決辦法，因子宮內(nèi)膜從分泌晚期到妊娠早期轉(zhuǎn)化過程中激素分泌水平和內(nèi)膜組織對激素反應(yīng)的不同，一些非妊娠因素引起內(nèi)膜的蛻膜變等，在沒有絨毛存在的情況下，在形態(tài)上其間的細微差異是難以分辨的，要做出是否發(fā)生妊娠、是宮內(nèi)還是宮外孕是十分困難的。對于兩者間超微結(jié)構(gòu)及分子生物學上的差異，文獻上很少報道，即使有報道其特異性也不強，或?qū)嶒炿y以重復。子宮內(nèi)膜的間質(zhì)由多能性間充質(zhì)細胞組成，月經(jīng)周期開始時，間質(zhì)細胞呈梭形分化，胞漿突起相互聯(lián)接，核長，染色質(zhì)豐富。在分泌期的后半期，間質(zhì)細胞在性激素的作用下，向兩個方向分化，其中一半細胞變成胖圓形的蛻膜樣細胞，另一半則縮小成小圓形內(nèi)膜顆粒細胞。當胚胎著床后，子宮內(nèi)膜經(jīng)歷一系列復雜的生理、生化和形態(tài)學上的改變，隨著這種變化的發(fā)展，內(nèi)膜由分泌晚期的蛻膜樣組織轉(zhuǎn)變成一種新的類上皮樣結(jié)構(gòu)：蛻膜。在胚胎周圍則有較多的顆粒細胞聚集。子宮內(nèi)膜蛻膜化是人類生殖中胚泡植入與妊娠維持的重要條件之一。蛻膜是一種由多種細胞成分組成的異質(zhì)性組織，除對胎兒、胎盤的營養(yǎng)作用外，它同時還是一種功能復雜的局部免疫器官，在妊娠及維持正常妊娠的過程中，發(fā)揮關(guān)鍵性作用。蛻膜由腺體、免疫細胞和非免疫細胞組成。蛻膜非免疫細胞主要為蛻膜細胞(占全部早孕蛻膜細胞總數(shù)的85％左右％)，在正常妊娠狀態(tài)下，蛻膜中的免疫細胞的免疫學活性受到了抑制，占蛻膜絕大部分的蛻膜非免疫細胞有可能對蛻膜免疫細胞具有免疫調(diào)節(jié)的作用。妊娠后，母體和胎兒均可合成一些特異性蛋白質(zhì)。應(yīng)用不同方法對這些特異性成分進行檢測，均有助于妊娠的診斷。

尋找針對妊娠的特別是能夠分辨宮內(nèi)、外妊娠的特殊標記物，無論對臨、醫(yī)療責任的判定及在法醫(yī)學都具有重要的意義，基礎(chǔ)理論上也將是重大突破。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種異位妊娠、非孕蛻膜組織差異表達蛋白的篩選方法。本研究采用簡便易行、快捷敏感的技術(shù)檢測不同類型細胞的組織因子表達。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種異位妊娠、非孕蛻膜組織差異表達蛋白的篩選方法,其特征在于：進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)各自的特異蛋白及差異蛋白，對其分離、提純，并以此作為鑒別子宮內(nèi)外妊娠的特殊生物學標記物。

所述方法進一步包括進行免疫功能測定：檢測組織培養(yǎng)液、分離提純的特異和差異蛋白及蛻膜細胞超微結(jié)構(gòu)中已發(fā)現(xiàn)的基膜樣物質(zhì)的免疫作用，分析提純及合成其有效成分，應(yīng)用于臨床的免疫性疾??；檢查樹突狀細胞在妊娠、非妊娠及周期子宮內(nèi)膜組織中的分布。

所述方法進一步包括對目的蛋白斑點PMF樣本的制備及質(zhì)譜分析，最后尋找鑒別子宮內(nèi)外妊娠的特殊標記物；

所述方法進一步包括對特異成分免疫功能檢測。

所述方法進一步包括應(yīng)用流式細胞儀等檢查樹突狀細胞在妊娠、非妊娠及周期子宮內(nèi)膜組織中的分布。

所述目的蛋白的制備包括

1)、完成蛋白樣品的制備：將宮內(nèi)外孕分離的蛻膜分別裂解、凍融、研磨、離心分離，測定上清液中蛋白濃度。

2)、用固相梯度雙向凝膠電泳分別分離宮內(nèi)外孕蛻膜的蛋白質(zhì)組，顯色后攝影留存，相應(yīng)軟件圖像分析。

3)、目的蛋白斑點PMF樣本的制備及質(zhì)譜分析，最后找到特異及差異表達蛋白點，以此作為鑒別子宮內(nèi)外妊娠的特殊標記物；

4)、特異成分分離、提純、鑒定及其免疫功能檢測，完成差異表達蛋白的篩選。

在整個研究過程中已完善和擴充病理學、組織培養(yǎng)及分離提純的特異蛋白及差異蛋白數(shù)據(jù)。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明尋找針對妊娠的特別是能夠分辨宮內(nèi)、外妊娠的特殊標記物，無論對臨床、醫(yī)療責任的判定及在法醫(yī)學都具有重要的意義，基礎(chǔ)理論上也將是重大突破。本研究采用簡便易行、快捷敏感的技術(shù)檢測不同類型細胞的組織因子表達。本發(fā)明的成功研發(fā)，將有效提高公司的技術(shù)水平、市場競爭力和研發(fā)能力，為公司擴大服務(wù)范圍提供強有力的支持。項目完成后，將很大程度提高公司實驗室的檢測能力，年收入可望增長過千萬元。與此同時，尋找針對妊娠的特別是能夠分辨宮內(nèi)、外妊娠的特殊標記物，無論對臨床、對醫(yī)療責任的判定及在法醫(yī)學中都具有重要的意義，基礎(chǔ)理論上也將是重大突破，項目的推廣將實現(xiàn)經(jīng)濟效益和社會效益雙豐收。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例中所需要使用的附圖作簡單地介紹，應(yīng)當理解，以下附圖僅示出了本發(fā)明的某些實施例，因此不應(yīng)被看作是對范圍的限定，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他相關(guān)的附圖。

圖1.1：S-100蛋白在蛻膜組織腺體內(nèi)呈陽性反應(yīng)。

圖1.2：S-100蛋白在部分蛻膜細胞中細胞漿和細胞核的陽性反應(yīng)。

圖2：Masson's三色染色顯示蛻膜細胞胞漿中的淡紅色“羽毛狀勝膠原內(nèi)含物”。

圖3.1:蛻膜細胞較大，圓形和橢圓形，胞漿和其內(nèi)的細胞器豐富，細胞膜上有突起及基底膜樣外質(zhì)膜形成（圖左下黑箭頭）18，000X。

圖3.2：示蛻膜細胞間的連接，見橋粒，縫隙聯(lián)接和緊密聯(lián)結(jié)（箭頭所指）12，000X，胞漿內(nèi)見較多擴張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體。

圖3.3：為圖3.2局部放大，箭頭所指為橋粒，縫隙聯(lián)接和緊密聯(lián)結(jié)，較多膠原原纖維（星號處）40，000X。

圖3.4：示蛻膜細胞內(nèi)的張力原纖維（箭頭），右側(cè)大部是細胞核（）55，000X。

圖4.1：常規(guī)HE切片，僅見片狀紅染無結(jié)構(gòu)壞死物。

圖4.2：VG染色檢查，將圖4.1例中常規(guī)切片中難以辨認的殘存壞死絨毛染成猩紅色。

圖4.3：常規(guī)HE切片，主為變性蛻膜細胞。

圖4.4：HPL免疫組織化學檢查，圖4.3例中蛻膜細胞內(nèi)中間型滋養(yǎng)細胞陽性表達。

圖5：組織差異表達蛋白的篩選流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步詳細介紹，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1：

本發(fā)明將對宮內(nèi)、宮外孕時的子宮蛻膜組織分別進行組織培養(yǎng)、光鏡、電鏡和免疫檢查，主要內(nèi)容包括：

1、對兩種蛻膜的分離、細胞培養(yǎng)，對培養(yǎng)液；

2、應(yīng)用流式細胞儀等檢查樹突狀細胞在妊娠、非妊娠及周期子宮內(nèi)膜組織中的分布；

3、應(yīng)用電鏡技術(shù)，研究對不同內(nèi)膜組織超微結(jié)構(gòu)特點，理順蛻膜顆粒細胞同文獻所報道的細胞內(nèi)含有顆粒的淋巴細胞、樹突狀細胞的關(guān)系，闡明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細胞表面的足細胞樣細胞足突屬于哪一種細胞及其功能。

完成蛋白樣品的制備：將宮內(nèi)外孕分離的蛻膜分別裂解、凍融、研磨、離心分離，測定上清液中蛋白濃度，用固相梯度雙向凝膠電泳分別分離宮內(nèi)外孕蛻膜的蛋白質(zhì)組，顯色后攝影留存，相應(yīng)軟件圖像分析。

目的蛋白斑點PMF樣本的制備及質(zhì)譜分析，特異成分分離、提純、鑒定，最后在子宮內(nèi)、外早孕發(fā)蛻膜組織中均發(fā)現(xiàn)了妊娠相關(guān)蛋白及特異性的差異表達蛋白S-100蛋白。所述是一種大分子糖蛋白化合物，分子量為8000KD，為四個相同亞單位組成的四聚體。

實施例2

發(fā)現(xiàn)S-100蛋白在蛻膜腺體內(nèi)呈陽性反應(yīng)，但在內(nèi)膜腺體內(nèi)也有陰性反映，在部分蛻膜細胞中也有陽性的反映(如附圖1-4所示)；

Masson’s三色染色可證明變性蛻膜細胞中的“羽毛狀膠原內(nèi)含物”，而提示曾發(fā)生過妊娠，因其有假陽性的結(jié)果，準確率在85％左右。

電鏡檢查發(fā)現(xiàn)：蛻膜細胞較大，圓形和橢圓形，胞漿和其內(nèi)的細胞器豐富，有發(fā)育良好的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體、吞噬體、包涵體等。細胞表面有纖維素樣類似于基底膜的細胞外質(zhì)膜。相鄰細胞間除見縫隙聯(lián)結(jié)、緊密聯(lián)結(jié)外，還有典型的橋粒形成，而在蛻膜樣細胞間未見這種結(jié)構(gòu)。在部分蛻膜細胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了較多分散和成束的張力絲，這種鱗狀上皮的結(jié)構(gòu)特點，出現(xiàn)在蛻膜組織內(nèi)。

VG、hPL染色可將HE無法顯示的壞死絨毛及形同蛻膜細胞的絨毛外中間型滋養(yǎng)細胞顯示出來，從而可以證明為子宮妊娠。

以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。