專利名稱：Mri可見、肝靶向、可降解納米基因載體的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明與基因治療所用載體的設(shè)計、合成和組裝方法有關(guān)，特別是一種制備MRI可見、肝靶向、核-殼型、可降解納米基因載體的方法。
背景技術(shù)：
基因治療就是將正?；蚧蛴兄委熥饔玫幕蛲ㄟ^一定方式導入活體靶細胞以糾正基因的缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫(yī)學高技術(shù)。載體技術(shù)是基因治療的核心技術(shù)，是制約基因治療能否進入臨床的瓶頸。早期，科學家主要以病毒為載體實施疾病的基因治療，但由于病毒載體的臨床安全問題使得非病毒(合成)基因載體在基因治療中越來越引人注目，然而在非病毒基因載體的研究和應(yīng)用方面目前還存在以下幾方面問題1)由于基因載體表面的Zeta電位為正，導致基因載體進入體內(nèi)后與血管內(nèi)壁、血清組分(如血紅蛋白)及其他不相關(guān)的組織產(chǎn)生非特異性的結(jié)合，使基因的投遞效率非常低；2)顆粒較大的基因載體會誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，同時會激活肝臟導致基因載體到達病變細胞或組織之前就在循環(huán)系統(tǒng)中被迅速清除；3)基因載體系統(tǒng)缺乏對特定組織、器官或細胞的選擇性，在體內(nèi)不能形成有效的分布，作用于病變組織、器官或細胞的同時，對正常組織、器官或細胞也產(chǎn)生嚴重的毒副作用；4)基因載體的不可降解性，使其在體內(nèi)代謝困難，容易產(chǎn)生積累毒性；5)基因載體進入機體后，沒有有效的方法來實時監(jiān)控基因載體在體內(nèi)的分布情況，目前研究藥物最常用的方法是放射性同位素標記法，這種方法需殺死大量的實驗動物，實驗過程繁瑣，研究成本很高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的就是克服上述缺陷提供一種磁共振成像儀(MRI)可見的、對肝具有靶向性的可降解納米基因載體系統(tǒng)的制備新方法。
實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明的上述目的是通過新型的“核-殼”結(jié)構(gòu)基因載體系統(tǒng)來實現(xiàn)的，其中，1)載體系統(tǒng)的核由可降解的聚陽離子與目的基因形成的納米顆粒組成，納米顆粒的粒徑在70-85nm，Zeta電位為正且大于+17mV；2)可降解的殼層帶有肝靶向基團和高分子磁共振成像造影劑，在肝部停留時間大于24小時，比商用小分子造影劑在肝部停留時間長，(商用小分子造影劑在肝部停留時間為6小時)，馳豫率7.77mM-1s-1，優(yōu)于商用小分子造影劑的馳豫率5.95mM-1s-1，Zeta電位為負且小于-10mV；
3)殼層與核層相反的Zeta電位使殼層容易組裝在核層的外圍，通過調(diào)節(jié)殼層與核層的比例，可使納米基因載體系統(tǒng)的Zeta電位為負，避免基因載體進入體內(nèi)后與血管內(nèi)壁、血清組分(如血紅蛋白)及其他不相關(guān)的組織產(chǎn)生非特異性的結(jié)合，提高基因的投遞效率；4)殼層的肝靶向基團使載體系統(tǒng)對肝具有靶向性，同時使載體系統(tǒng)有較大的水合體積，體系儲存穩(wěn)定性和分散性極佳；5)殼層的磁共振成像造影劑提供了一種用磁共振成像造儀實時監(jiān)控基因載體在體內(nèi)分布的有效方法，無須殺死實驗動物，實驗過程簡單，研究成本較低；殼層與核層都是可降解的，不會產(chǎn)生積累毒性；6)殼層與核層的組裝體粒徑為95-105nm，Zeta電位為負，不會誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，在循環(huán)系統(tǒng)中可長效循環(huán)；本發(fā)明的實施步驟如下1)可降解基因轉(zhuǎn)染試劑的合成及其與目的基因的組裝——基因載體系統(tǒng)核的構(gòu)筑如圖1所示，將分子量6000-10000的聚乙烯亞胺(PEI)預(yù)聚物和多元丙烯酸酯的醇溶液混合，加入醇鈉，常溫攪拌反應(yīng)2-6天，除去低沸點溶劑，純化，干燥，包裝，得基因轉(zhuǎn)染試劑，用核磁共振確定結(jié)構(gòu)并研究其降解性能；所述的多元丙烯酸酯選自1，4-丁二醇雙丙烯酯、乙二醇雙丙烯酯、丙三醇三丙烯酯、季戊四醇四丙烯酯等，優(yōu)選用1，4-丁二醇雙丙烯酯。用來溶解的醇為甲醇，所述的醇鈉可以選用甲醇鈉；將上述基因轉(zhuǎn)染試劑與目的基因在緩沖溶液中、無菌條件下組裝使其顆粒粒徑在70-85nm，Zeta電位為正且大于+17mV，即得基因載體系統(tǒng)的核。
a.多元丙烯酸酯的合成稱取一定量的多元醇溶于含有機堿的無水非質(zhì)子溶劑中，低溫攪拌下滴加入丙烯酰氯的無水非質(zhì)子溶劑溶液，攪拌反應(yīng)4h，過濾，減壓蒸餾，收集所需餾分，保存于干燥器中備用。
b.可降解基因轉(zhuǎn)染試劑的合成將聚乙烯亞胺(PEI)預(yù)聚物的醇溶液和多元丙烯酸酯的醇溶液混合，加入醇鈉，常溫攪拌反應(yīng)2-6天，除去低沸點溶劑，純化，干燥，得可降解基因轉(zhuǎn)染試劑，如圖1所示；用核磁確定結(jié)構(gòu)并研究其降解性能。
c.可降解基因轉(zhuǎn)染試劑與目的基因的組裝——基因載體系統(tǒng)核的構(gòu)筑將上述可降解基因轉(zhuǎn)染試劑與目的基因在無菌條件下按一定比例混合均勻，震搖15min，使其顆粒粒徑在70-85nm，Zeta電位為正且大于+17mV，即得基因載體系統(tǒng)的核層。
2)基因載體系統(tǒng)殼層的合成——靶向性高分子造影劑的合成以聚氨基酸為主鏈，藕連上肝靶向基團的的配體(Gd3+的配體)并使其Zeta電位為負且小于-10mV。
在磷酸緩沖溶液中，EDC縮合法將D-乳糖酸或肝導向肽連接到α，β-聚[(2-胺乙基)-L-天冬酰胺上，用定量13C NMR測定糖含量，將二乙三胺五乙酸酐的單活性酯連接到上述載體，用1H NMR確定其結(jié)構(gòu)，動態(tài)光散射測定Zeta電位。根據(jù)D-乳糖酸或肝導向肽投料量的不同，所得基因載體系統(tǒng)殼層中D-半乳糖殘基或肝導向肽殘基的摩爾含量為5％-30％。
將上述載體與Gd3+絡(luò)合，用核磁共振確定結(jié)構(gòu)，電感偶合等離子體光譜測定Gd含量，磁共振成像儀測定其弛豫率，并研究其造影增強性能和肝靶向性。
3)核與殼層的組裝——“核-殼”結(jié)構(gòu)基因載體系統(tǒng)的構(gòu)筑將上述核與殼層按一定方式混合并孵育一定時間即形成“核-殼”結(jié)構(gòu)基因載體系統(tǒng)。
將核與殼層按一定方式混合并孵育一定時間即形成“核-殼”結(jié)構(gòu)基因載體系統(tǒng)。調(diào)控核與殼層的比例，使核與殼層組裝體納米顆粒的粒徑95-105nm、粒徑分布均勻，Zeta電位小于0。用動態(tài)光散射測定核與殼層組裝體納米顆粒的粒徑、粒徑分布及Zeta電位。
用動態(tài)光散射測定核、核與殼層組裝體納米顆粒的粒徑、粒徑分布及Zeta電位。
本發(fā)明的方法實驗過程簡單，研究成本較低；殼層與核層都是可降解的，不會產(chǎn)生積累毒性。制備的基因載體系統(tǒng)殼層的Zeta電位為負且小于-10mV，在肝部停留時間大于24小時，馳豫率高于商用小分子造影劑。
由于載體系統(tǒng)的核由可降解的聚陽離子與目的基因形成的納米顆粒組成，納米顆粒的粒徑在70-85nm，Zeta電位為正且大于+17mV；殼層與核層相反的Zeta電位使殼層容易組裝在核層的外圍，通過調(diào)節(jié)殼層與核層的比例，可使納米基因載體系統(tǒng)的Zeta電位為負，避免基因載體進入體內(nèi)后與血管內(nèi)壁、血清組分(如血紅蛋白)及其他不相關(guān)的組織產(chǎn)生非特異性的結(jié)合，提高基因的投遞效率；基因載體系統(tǒng)核與殼層組裝體的粒徑在95-105nm，不會誘導機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，不會激活肝臟導致基因載體到達病變細胞或組織之前就在循環(huán)系統(tǒng)中被迅速清除，在循環(huán)系統(tǒng)中可長效循環(huán)。
基因載體系統(tǒng)對肝部具有選擇性，在體內(nèi)可形成有效的分布，對正常組織、器官或細胞不會產(chǎn)生嚴重的毒副作用；而且殼層的磁共振成像造影劑提供了一種用磁共振成像造儀實時監(jiān)控基因載體在體內(nèi)分布的有效方法，基因載體系統(tǒng)對磁共振成像儀(MRI)可見，基因載體進入機體后，可用MRI實時監(jiān)控基因載體在體內(nèi)的分布情況，無須殺死實驗動物；可降解的殼層帶有肝靶向基團和高分子磁共振成像造影劑，在肝部停留時間大于24小時，比商用小分子造影劑在肝部停留時間長，(商用小分子造影劑在肝部停留時間為6小時)，馳豫率優(yōu)于商用小分子造影劑的馳豫率，Zeta電位為負且小于-10mV。


圖1基因轉(zhuǎn)染試劑的合成路線圖；圖2基因轉(zhuǎn)染試劑的1H NMR譜圖，其中橫軸代表化學位移；圖3基因轉(zhuǎn)染試劑的降解性能的1H NMR在線研究譜圖；圖4基因轉(zhuǎn)染試劑與基因的組裝過程(即基因載體系統(tǒng)核的形成)；圖5基因載體系統(tǒng)核的粒徑、粒徑分布譜圖，其中橫軸代表粒徑，單位nm；縱軸代表強度，曲線代表粒徑分布；圖6基因載體系統(tǒng)核的Zeta電位譜圖，其中橫軸代表Zeta電位，單位mV；縱軸代表強度；圖7基因載體系統(tǒng)殼層的結(jié)構(gòu)示意圖；圖8基因載體系統(tǒng)殼層的Zeta電位譜圖，其中橫軸代表Zeta電位，單位mV；縱軸代表強度；圖9作為殼層的高分子靶向造影劑與商用造影劑(釓噴酸葡胺)弛豫率；橫軸為造影劑中釓濃度，縱軸為弛豫時間；其中曲線的斜率代表弛豫率；圖10核與殼層的組裝過程；圖11核與殼層的組裝體的粒徑、粒徑分布譜圖，其中橫軸代表粒徑，單位nm；縱軸代表強度；曲線代表粒徑分布；圖12核與殼層組裝體的Zeta電位譜圖，其中橫軸代表Zeta電位，單位mV；縱軸代表強度。
具體實施例方式
實施例11，4-丁二醇雙丙烯酸酯的合成稱取90g(1mol)1，4-丁二醇溶于200mL精制的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入1.2mol無水吡啶，低溫攪拌下滴加入含1.2mol丙烯酰氯的200mL精制的DMF溶液，低溫攪拌反應(yīng)4h，室溫繼續(xù)反應(yīng)4h，過濾，減壓蒸餾，收集所需餾分，得1，4-丁二醇雙丙烯酸酯，避光保存于干燥器中備用。
實施例2可降解基因轉(zhuǎn)染試劑的合成(1)稱取分子量10000的聚乙烯亞胺預(yù)聚物100g溶于200mL絕對無水甲醇中，加入9.9gl，4-丁二醇雙丙烯酸酯及2滴甲醇鈉，常溫避光攪拌反應(yīng)5天，減壓除去溶劑，殘留物溶于蒸餾水，并用0.05mol/L的鹽酸調(diào)溶液pH值至中性，過濾，低溫透析3天，冷凍干燥，真空包裝，得可降解基因轉(zhuǎn)染試劑，用核磁確定結(jié)構(gòu)并研究其降解性能，結(jié)果如圖2和圖3所示。所得基因轉(zhuǎn)染試劑從第2天開始有明顯的降解。
實施例3可降解基因轉(zhuǎn)染試劑與目的基因的組裝——基因載體系統(tǒng)核的構(gòu)筑將實施例2所得可降解基因轉(zhuǎn)染試劑配成7mg/mL的超純水溶液，用0.22μm的針頭濾器過濾純化備用；同法配制0.1mg/mL質(zhì)粒的超純水溶液；將質(zhì)粒溶液按加入基因轉(zhuǎn)染試劑溶液中，基因轉(zhuǎn)染試劑溶液的氮與質(zhì)粒溶液中磷的摩爾比為10∶1(即N/P＝10)；振蕩搖動15min，得到顆粒粒徑在70-85nm，見圖5；Zeta電位為正且大于+17mV，見圖6；即得基因載體系統(tǒng)的核層。
所得納米顆粒的粒徑、粒徑分布、Zeta電位用MARLVEN公司Zetasizer Nano-ZS型動態(tài)光散射(DLS)測試，測試溫度為25℃，入射激光波長為633nm。亦可使用原子力顯微鏡(AFM)、掃描電鏡(SEM)、透射電鏡(TEM)測定納米顆粒的粒徑、粒徑分布及形貌。見實施例5殼層的合成——靶向性高分子造影劑的合成(下面稱為PV)1)α，β-聚(L-天冬酰胺)(下面稱PI)的合成在500ml園底燒瓶中加入25克(0.19mol)L-天冬氨酸粉末和12.5克85％的磷酸，混合均勻，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上185℃減壓反應(yīng)3小時至不再有水蒸汽產(chǎn)生為止。加入100mLDMF攪拌溶解固體物，然后在攪拌下將得到的溶液緩慢滴加到盛有500mL水的燒杯中，得白色沉淀，靜置，傾去上清液，過濾，將固體用水洗至中性，于60℃真空干燥24小時，得粉狀固體17克，產(chǎn)率93％。
2)α，β-聚[(2-胺乙基)-L-天冬酰胺](下面稱為PII)的合成稱取2.5克PI(26mmol)溶于30mLDMF中，快速攪拌下滴加入150mL乙二胺中，室溫反應(yīng)3小時，過濾，減壓濃縮至30mL，殘留物滴加入乙醚得粘稠固體，將粘稠固體溶于20mL甲醇，用乙醚沉淀，真空干燥得淡黃色粉末狀固體(PII)3.5克，產(chǎn)率86％。
3)含D-半乳糖殘基的聚合物的合成(下面稱為PIII)稱取2g乳糖酸(5.58mmol)溶于40mL pH＝5.7的磷酸緩沖液中，冰浴冷卻。加入2.6g(22.3mmol)N-羥基琥珀酰亞胺的20mL磷酸緩沖液和4.3g(22.3mmol)EDC.HCl固體，冰浴攪拌反應(yīng)20分鐘后加入聚合物PII2.9g(18.6mmol)，冰浴反應(yīng)1小時后，常溫繼續(xù)反應(yīng)36小時。反應(yīng)物混合溶液袋透析72小時后，將溶液減壓濃縮至干得淡黃色固體4.4g，產(chǎn)率91％。
4)含酪氨酸殘基的二乙三胺五乙酸單活性酯(Tyr-DTPA-OSu)的合成a)二乙三胺五乙酸(DTPA)雙活性酯的合成稱取8.6g DTPA雙酸酐，6.69g N-羥基琥珀酰亞胺及100mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于100ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中室溫攪拌反應(yīng)24小時。將產(chǎn)物用1∶1的乙醇-乙醚混合液沉淀出，沉淀用甲醇洗滌，再用乙醚浸泡過夜，抽干，得白色粉末狀固體10.7g，產(chǎn)率76％。
b)含酪氨酸殘基的二乙三胺五乙酸單活性酯(Tyr-DTPA-OSu)的合成稱取6.3541g(27.4mmol)酪氨酸甲酯鹽酸鹽溶于30ml DMF，加入4ml三乙胺，攪拌反應(yīng)20分鐘，濾出產(chǎn)生的白色固體，濾液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗中，緩慢滴加到DTPA雙活性酯的40ml DMF溶液中(16.0975g，27.4mmol)，冰鹽浴條件下攪拌反應(yīng)12小時后，室溫繼續(xù)反應(yīng)24小時。產(chǎn)物用1∶1的乙醇-乙醚混合液沉淀出，沉淀用甲醇洗滌，再用乙醚浸泡過夜，抽干，得乳白色粉末狀固體11.4g，產(chǎn)率60％。
5)Tyr-DTPA-OSu與聚合物PIII的藕連(下面稱為PIV)將3.7g PIII的150ml水溶液加入500ml圓底瓶，冰浴冷卻，緩慢滴加入含9.8mmolTyr-DTPA-OSu的52ml DMF溶液，冰浴攪拌反應(yīng)6小時后，室溫繼續(xù)反應(yīng)24小時?；旌先芤涸?℃下用3500透析袋透析72小時后，45℃下將溶液減壓濃縮至干得淡黃色固體8.6g，產(chǎn)率87％。
6)肝靶向型高分子造影劑的合成(下面稱為PV)稱取0.1407g(0.19mmol)PIV和0.0831g(0.22mmol)的GdCl3.6H2O于100ml圓底瓶中，加入10ml蒸餾水溶解固體，用稀鹽酸將溶液pH值調(diào)到6，室溫攪拌反應(yīng)6小時后，將反應(yīng)混合物在-4℃下透析72小時，冷凍干燥透析液得PV，經(jīng)核磁共振定量碳譜的測定，其半乳糖殘基含量為20.22％(mol％)。
7)弛豫率和Zeta電位測定用動態(tài)光散射法測定Zeta電位，作為殼層Zeta電位為負且小于-10mV。
將高分子造影劑(PIV)及商用造影劑(釓噴酸葡胺)配成四種濃度的溶液，釓離子濃度分別為0.24mmol/L，0.12mmol/L，0.06mmol/L，0.03mmol/L。將溶液盛于1.5ml離心管中在0.3T磁共振儀上通過反轉(zhuǎn)恢復(fù)法測五種造影劑不同釓離子濃度溶液的T1值，通過公式(T1w為純水的弛豫時間，T1m為不同濃度造影劑實際測量出的弛豫時間)CGd·1T1+1T1w=1T1m]]>弛豫率r1＝1/T1，用計算機擬合求斜率，可分別算出靶向性高分子造影劑及商用造影劑釓噴酸葡胺的弛豫率。
磁共振成像儀測其弛豫率，結(jié)果見圖9，其中曲線的斜率代表弛豫率。商用造影劑(釓噴酸葡胺)弛豫率為5.95mM-1s-1，本發(fā)明合成的高分子造影劑弛豫率為7.77mM-1s-1，見圖10。
實施例6基因載體核層與殼層的裝配將核與殼層的水溶液在1.5ml試劑瓶中混合并孵育0.5小時，即形成“核-殼”結(jié)構(gòu)基因載體系統(tǒng)。調(diào)控核與殼層的比例至質(zhì)量比為1∶2，使核與殼層組裝體納米顆粒的粒徑95-105nm、粒徑分布均勻，Zeta電位小于0。用動態(tài)光散射測定核與殼層組裝體納米顆粒的粒徑、粒徑分布及Zeta電位，見圖11、12。
上述實施例僅用以說明本發(fā)明，但并不局限于此，應(yīng)該理解在不脫離本發(fā)明的精神范圍內(nèi)還可有多種變通或替換方案。
權(quán)利要求
1.一種磁共振成像儀可見的、對肝具有靶向性的、核-殼型、可降解納米基因載體系統(tǒng)的制備方法，包括以下步驟1)、可降解基因轉(zhuǎn)染試劑的合成；2)、可降解基因轉(zhuǎn)染試劑與目的基因組裝成基因載體系統(tǒng)的核層；3)、基因載體系統(tǒng)殼層的合成即靶向性高分子造影劑的合成；4)基因載體系統(tǒng)核與殼層的組裝。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述可降解基因轉(zhuǎn)染試劑由聚乙烯亞胺和可降解的連接單體經(jīng)常溫攪拌反應(yīng)而成，可降解的連接單體中含酯鍵。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述聚乙烯亞胺為分子量在6000-10000的預(yù)聚物。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述可降解的連接單體選自1，4-丁二醇雙丙烯酯、乙二醇雙丙烯酯、丙三醇三丙烯酯、季戊四醇四丙烯酯。
5.如權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述可降解的連接單體為1，4-丁二醇雙丙烯酯。
6.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，基因載體系統(tǒng)殼層含肝靶向基團的磁共振成像造影劑。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述基因載體系統(tǒng)殼層的磁共振成像造影劑的主鏈為含D-半乳糖殘基或肝導向肽殘基的α，β-聚[(2-胺乙基)-L-天冬酰胺]，含Gd3+離子，以含L-酪氨酸殘基的二乙三胺五乙酸單活性酯為Gd3+的配體。
8.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述基因載體系統(tǒng)殼層中D-半乳糖殘基或肝導向肽殘基的摩爾含量為5％-30％。
9.如權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述基因載體系統(tǒng)殼層的磁共振成像造影劑的主鏈為含D-半乳糖殘基的α，β-聚[(2-胺乙基)-L-天冬酰胺]。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種制備磁共振成像儀(MRI)可見的、對肝具有靶向性的、核－殼型、可降解納米基因載體系統(tǒng)的新方法。本發(fā)明基因載體系統(tǒng)的合成與組裝包括1)基因載體系統(tǒng)核的合成；2)基因載體系統(tǒng)殼層的合成；3)核與殼層的組裝。本發(fā)明所設(shè)計基因載體系統(tǒng)的核層為納米顆粒，粒徑在70－85nm，Zeta電位為正且大于+17mV，由目的基因和可降解聚陽離子組裝而成；可降解的殼層帶有肝靶向基團和高分子磁共振成像造影劑，比商用小分子造影劑在肝部停留時間長，馳豫率7.77mM
文檔編號A61K48/00GK1947798SQ20061011765
公開日2007年4月18日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者余家會, 舒婕, 彭敏, 羅淑芳, 劉順英, 俞磊, 陳群 申請人:華東師范大學