基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及生物納米載藥材料及基因革El向輸送領(lǐng)域，具體涉及一種基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]惡性腫瘤(癌癥)具有發(fā)病率高、死亡率高、治療困難及易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新《世界癌癥報(bào)告》，2012年全球有1400萬(wàn)新增癌癥病例，癌癥死亡人數(shù)達(dá)820萬(wàn)。我國(guó)新診斷癌癥病例為307萬(wàn)，占全球總數(shù)的21.8%，癌癥死亡人數(shù)約220萬(wàn)，占全球癌癥死亡人數(shù)的26.9%。而且根據(jù)目前的癌癥發(fā)病趨勢(shì)，到2020年全世界癌癥發(fā)病率將比現(xiàn)在增加50%。腫瘤常規(guī)治療方法主要是手術(shù)切除、放療以及化療，然而無(wú)論放療化療還是手術(shù)治療患者生存期限都不超過(guò)12個(gè)月。因此，腫瘤治療面臨更加艱巨的任務(wù)，而目前RNA干擾(RNAinterference, RNAi)因具有序列和結(jié)構(gòu)的特異性、高效性以及放大效應(yīng)等特點(diǎn)，為惡性腫瘤治療提供一條新途徑，通過(guò)RNAi手段可以沉默腫瘤特異性基因，從而達(dá)到治療腫瘤的目的。然而，易被核酸酶降解、半衰期短、不能有效的穿過(guò)細(xì)胞膜、穩(wěn)定性及靶向性差等因素限制了 siRNA的有效應(yīng)用。因此，如何將siRNA安全、高效地輸送到靶細(xì)胞或靶組織成為RNAi應(yīng)用的主要瓶頸問(wèn)題。也就是說(shuō)，輸送載體能否安全、有效地將siRNA基因系統(tǒng)運(yùn)輸?shù)街付ú课?，并轉(zhuǎn)入細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用，是RNAi發(fā)揮基因沉默功能的重要前提。目前，以病毒和脂質(zhì)體為載體輸送siRNA都存在一定缺陷。例如，病毒載體轉(zhuǎn)染效率高，但具有潛在的致癌性和免疫原性；脂質(zhì)體則具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性和不穩(wěn)定性。因此，理想的siRNA運(yùn)輸載體是將RNAi技術(shù)成功應(yīng)用于腫瘤靶向治療的關(guān)鍵前提。無(wú)毒、高效的基因轉(zhuǎn)染載體構(gòu)建是一個(gè)急需解決、非常關(guān)鍵的問(wèn)題。從理論上講，理想的siRNA輸送載體應(yīng)具有較高的轉(zhuǎn)染效率、良好的靶向性和穩(wěn)定性、生物相容性無(wú)毒或低細(xì)胞毒性等特點(diǎn)。磁性納米顆粒因具有這些特性，因而成為s iRNA抑制系統(tǒng)的理想輸送載體。
[0003]siRNA作為沉默基因的新方法已成功用于腫瘤學(xué)研究，為惡性腫瘤治療提供了一條非常有效的途徑。然而，由于靶細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率低、穩(wěn)定性及靶向性差等問(wèn)題，在一定程度上影響了 siRNA作用效果。因此，在利用siRNA基因抑制系統(tǒng)進(jìn)行腫瘤靶向治療時(shí)，如何高效、特異地將siRNA基因運(yùn)送到腫瘤靶細(xì)胞并選擇性的在“病灶”部位發(fā)揮作用，以及如何實(shí)時(shí)、原位追蹤siRNA體內(nèi)行為，以便于實(shí)時(shí)了解腫瘤的發(fā)展及治療情況等，這些都是需要考慮和亟待解決的問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于針對(duì)目前基因轉(zhuǎn)染效率低、易降解、穩(wěn)定性及靶向性差等迫切需要解決的問(wèn)題，構(gòu)建一種具有抗體及陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑特異性雙靶向功能的納米基因輸送體系O
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案為:基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系，基因輸送體系以超順磁性氧化鐵納米顆粒作為磁核，以羧甲基殼聚糖為包被材料，并在羧甲基殼聚糖表面修飾靶向分子CD133抗體及陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺。
[0006]進(jìn)一步地，所述磁核為超順磁性能的y-Fe203納米顆粒。
[0007]進(jìn)一步地，所述基因?yàn)樾「蓴_RNA。
[0008]基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的制備方法，包括以下步驟:
①磁核的制備:利用部分還原三氯化鐵溶液共沉淀法制備四氧化三鐵納米顆粒作為前提材料，以鹽酸酸化、空氣氧化法制備γ -Fe2O3納米顆粒；
②磁核包被:通過(guò)多聚磷酸鈉介導(dǎo)的離子凝膠法在γ-Fe2O3納米顆粒表面包被羧甲基殼聚糖，得到CTS -TPPiSP1 NPs；
③聚乙烯亞胺修飾CTS-TPP0SP10NPs:采用EDC/NHS交聯(lián)法制備PEI修飾的CTS -TPPiSP1 NPs，得到PE1-CTS-TPPOSP1 NPs；
④CD133抗體偶聯(lián):利用Traut’ s Reagent及異源雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC將CD133抗體與載體PE1-CTS-TPPOSP1 NPs偶聯(lián)，得到CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。
[0009]進(jìn)一步地，基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的制備方法，包括以下步驟:
①利用部分還原三氯化鐵(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力攪拌條件下制備載體核的前體材料四氧化三鐵納米顆粒溶液，然后利用稀鹽酸酸化、空氣氧化法制備γ -Fe2O3納米顆粒；去離子水洗滌、真空干燥、研磨過(guò)濾即得γ -Fe2O3納米顆粒納米顆粒；
②羧甲基殼聚糖(CMC)作為磁核包被材料，利用多聚磷酸鈉(TPP)介導(dǎo)的離子凝膠法在超聲乳化分散器的超聲狀態(tài)下，進(jìn)行包被羧甲基殼聚糖(CTS)，所得產(chǎn)物在外加磁場(chǎng)的條件下用PBS緩沖液進(jìn)行磁分離洗滌，即可得CTS-TPP0SP10 NPs;
③利用H3C/NHS交聯(lián)法制備聚乙烯亞胺(PEI)修飾的CTS-TPPOSP1NPs,首先在MES緩沖液中利用EDC/NHS活化CTS -TPPiSP1 NPs。然后在PBS緩沖液中交聯(lián)PEI，將制備的產(chǎn)物用PBS緩沖液洗滌，即得PE1-CTS-TPPOSP1 NPs；
④CD133抗體與載體PE1-CTS-TPPOSP1NPs的偶聯(lián)采用Traut ’ s Reagent及異源雙功能交聯(lián)劑Sulfo-SMCC:首先在含EDTA的硼酸緩沖液中利用Traut’s Reagent試劑，在室溫條件下對(duì)CD133抗體進(jìn)行硫醇化修飾；同時(shí)，制備Sulfo-SMCC與PE1-CTS-TPPOSP1 NPs交聯(lián)物;然后，將硫醇化的CD133抗體加入Sulfo-SMCC交聯(lián)的PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用PBS緩沖液洗滌，即得CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。
[0010]進(jìn)一步地，步驟④中⑶133抗體硫醇化修飾的方法為:取240yL⑶133抗體，加入含EDTA的硼酸緩沖液，然后加入Traut ’ s Reagent，室溫下，振蕩反應(yīng)；Sulfo-SMCC交聯(lián)物的制備方法為:另取適量PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，WAsuf0-SMCC;將混合液在室溫下振蕩反應(yīng);將得到的產(chǎn)物用含EDTA的I3BS緩沖液洗滌2-3次；將硫醇化的CD133抗體加入Sulfo-SMCC交聯(lián)的PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，室溫下振蕩反應(yīng);將得到的反應(yīng)產(chǎn)物用I3BS緩沖液洗滌2-3次，即得CDl33-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。
[0011 ] CD133是細(xì)胞表面一種糖蛋白抗原，又稱ACl33，也被稱為proinin-Ι，是一種相對(duì)分子量為120kD具有獨(dú)特五次跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)大的N-糖基化細(xì)胞外環(huán)的跨膜糖蛋白。
[0012]CD133是腦腫瘤干細(xì)胞特異性表面標(biāo)志物，具有很高的腦膠質(zhì)瘤特異性。正常腦組織中⑶133表達(dá)水平很低，在惡性程度較高的腫瘤中⑶133呈強(qiáng)表達(dá)。因此，CD133是一個(gè)非常具有前景的腦腫瘤靶向診斷和治療標(biāo)志物。
[0013]因此，我們選擇CD133抗體作為修飾磁納米顆粒的靶向分子，通過(guò)CD133抗原與CD133抗體在細(xì)胞膜上特異性結(jié)合，構(gòu)建CD133抗體靶向的磁納米顆粒作為基因輸送載體，提尚基因的革G向性和選擇性。
[0014]聚乙烯亞胺(PEI)是一種陽(yáng)離子聚合物，是最為常見(jiàn)的非病毒載體，常用于基因的體內(nèi)遞送。PEI這種材料被稱為“proton sponge”，說(shuō)明該材料具有很強(qiáng)的吸附性。又因其帶正電，故能和帶負(fù)電的核酸相結(jié)合。PEI的表面結(jié)構(gòu)決定了這種聚合物的高轉(zhuǎn)染效率。
[0015]本發(fā)明以磁納米顆粒為載體、以⑶133抗體及陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑聚乙烯亞胺(PEI)為靶向分子，構(gòu)建了一種無(wú)毒、高效、特異的雙靶向納米基因輸送體系。該體系以超順磁性氧化鐵納米顆粒作為磁核，以羧甲基殼聚糖為包被材料，并在羧甲基殼聚糖表面修飾靶向分子CDl 33抗體及陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑PEI ο本發(fā)明的雙靶向基因納米輸送體系具有生物相容性好、穩(wěn)定性高及革G向性特異的特點(diǎn)，使得該體系對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高度的革G向選擇性，可定向釋放輸送靶基因于腫瘤部位，進(jìn)而發(fā)揮靶向抑制和殺死腫瘤細(xì)胞的作用，為腫瘤靶向治療提供一個(gè)新策略。本發(fā)明納米載體和基因輸送體系的制備方法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和，制備產(chǎn)物可作為基因的廣泛載體，為高效的基因靶向輸送載體研究提供了一種新的策略。
[0016]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明制備的基于磁納米顆粒的陽(yáng)離子轉(zhuǎn)染劑PEI及CDl 33抗體雙靶向基因輸送載體，具有高度的靶向選擇性，相比非靶向的基因體系，顯著提高基因的利用效率，減少對(duì)正常組織細(xì)胞的毒副作用。本發(fā)明納米載體和基因輸送體系的制備方法操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)條件溫和，制備產(chǎn)物可作為基因運(yùn)載的廣泛載體，為高效的基因靶向輸送載體研究提供了一種新方法。
【附圖說(shuō)明】
[0017]圖1為基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的構(gòu)建示意圖。
[0018]圖2為實(shí)施例1所構(gòu)建納米基因輸送體系載體核的透射電子顯微鏡(TEM)圖。
[0019]圖3為實(shí)施例1基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系紅外光譜(FT-1R)圖。
[0020]圖4為實(shí)施例1基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系XRD圖。
[0021]圖5為實(shí)施例1基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的磁化曲線圖。
[0022]圖6為實(shí)施例1基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的磁響應(yīng)圖。
[0023]圖7為實(shí)施例1基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的PEI含量圖。
[0024]圖8為實(shí)施例1⑶133抗體偶聯(lián)載體的活性分析圖。
[0025]圖9為實(shí)施例3基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系的細(xì)胞吸收?qǐng)D。
[0026]圖10為實(shí)施例4基于磁納米顆粒的雙靶向基因輸送載體對(duì)細(xì)胞增殖的影響。
[0027]圖11為實(shí)施例5基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系對(duì)腫瘤干細(xì)胞活性影響。
[0028]圖12為實(shí)施例6基于磁納米顆粒的新型雙靶向基因輸送體系對(duì)腫瘤干細(xì)胞細(xì)胞周期影響。
[0029]圖13為實(shí)施例7納米載體與siRNA的結(jié)合能力與凝膠阻滯分析圖。
[0030]圖14為實(shí)施例8 siRNA轉(zhuǎn)染分析圖。