專利名稱：一種抗單核細(xì)胞性白血病的抗體導(dǎo)向藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于治療單核細(xì)胞性白血病的新型抗體導(dǎo)向藥物。

背景技術(shù)：
單核細(xì)胞性白血病是指主要以單核細(xì)胞增多為特征的白血病，包括急性?！獑魏思?xì)胞白血病(M4)、急性單核細(xì)胞白血病(M5)、慢性?！獑魏思?xì)胞白血病、慢性單核細(xì)胞白血病。由于單核細(xì)胞具有游走、吞噬的特點，故臨床上浸潤特征較為突出[丁訓(xùn)杰等，實用血液病學(xué)，上海醫(yī)科大學(xué)出版社，1992286.]。這類白血病在臨床上較常見，其惡性程度較高，易出現(xiàn)髓外浸潤及凝血功能障礙，原發(fā)耐藥者多，缺乏特異性藥物，治療較困難，早期死亡率高，誘導(dǎo)緩解率較低，且預(yù)后差[葛晉源，HA方案治療16例急性單核細(xì)胞性白血病療效觀察，白血病，淋巴瘤，2005；14(5)311-312.]。
針對單核細(xì)胞性白血病的特點以及目前治療的缺陷，本發(fā)明制備了一種具有抗單核細(xì)胞性白血病作用的抗力達(dá)霉素抗體導(dǎo)向藥物。
力達(dá)霉素(Lidamycin，LDM)是從我國湖北省潛江縣土壤中分離得到的—株鏈霉菌(Streptomyces globisporus C-1027)產(chǎn)生的大分子肽類抗腫瘤抗生素，由110個氨基酸組成的輔基蛋白(MW10.5kDa)和烯二炔結(jié)構(gòu)的發(fā)色團(tuán)(MW843 Da)兩部分組成。LDM對體外培養(yǎng)的癌細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，比絲裂霉素和阿霉素強(qiáng)10,000倍以上[ZhenYS，Ming XY，Yu B，et al.A new macromolecular antitumor antibiotics.C-1027，III.antitumor activity.J Antibiot，1989；421294-1298.]，動物體內(nèi)實驗表明，LDM對多種腫瘤有較好的療效[甄永蘇等.烯二炔類新抗生素C-1027的抗腫瘤作用研究.中國抗生素雜志，1994；19164-168.]。
本發(fā)明提供的抗體藥物3H8，是由雜交瘤細(xì)胞株3H8(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.1849)所分泌的單克隆抗體。該抗體為IgG1亞型，其可變區(qū)能與力達(dá)霉素特異性結(jié)合，其Fc段能與高表達(dá)Fc受體的單核細(xì)胞特異性結(jié)合?？贵w3H8的Fc段與單核細(xì)胞的Fc受體結(jié)合后，可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用，使3H8-力達(dá)霉素抗原抗體復(fù)合物進(jìn)入單核細(xì)胞內(nèi)，發(fā)揮靶向性殺傷單核細(xì)胞的作用。
基于以上所述，本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步探索，制備了抗力達(dá)霉素的單克隆抗體，與力達(dá)霉素聯(lián)合應(yīng)用，可以發(fā)揮靶向性抗單核細(xì)胞性白血病的作用。本發(fā)明所說抗單核細(xì)胞性白血病的抗體導(dǎo)向藥物迄今尚未見有相關(guān)報道。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所說的單克隆抗體3H8，是用力達(dá)霉素免疫BALB/c小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選得到的穩(wěn)定型雜交瘤細(xì)胞株3H8(中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No.1849)所產(chǎn)生的單克隆抗體，該細(xì)胞株為國內(nèi)外首次報道。3H8抗體為IgG1亞型單克隆抗體，其可變區(qū)能與力達(dá)霉素特異性結(jié)合。3H8單克隆抗體的Fc段可與高表達(dá)Fc受體的單核細(xì)胞特異性結(jié)合。3H8抗體和力達(dá)霉素的免疫復(fù)合物與單核細(xì)胞的Fc受體結(jié)合后，在受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用下，可使力達(dá)霉素進(jìn)入單核細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮殺傷/誘導(dǎo)單核細(xì)胞凋亡的作用，從而顯示靶向性抗單核細(xì)胞性白血病的功能。其作用機(jī)理如下所示
本發(fā)明的具體內(nèi)容與實施步驟包括 抗力達(dá)霉素單克隆抗體細(xì)胞株3H8的構(gòu)建； 抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8的制備； 抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8的鑒定； 3H8抗體與高表達(dá)Fc受體的人單核白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞的結(jié)合實驗； 力達(dá)霉素聯(lián)用3H8抗體對U937細(xì)胞增殖的影響； 力達(dá)霉素聯(lián)用3H8抗體對U937細(xì)胞凋亡的影響。
實驗研究結(jié)果表明，雜交瘤細(xì)胞株3H8為穩(wěn)定型高表達(dá)3H8單克隆抗體細(xì)胞株。
本發(fā)明所說3H8抗體的特征在于，其可特異性與力達(dá)霉素及其輔基蛋白結(jié)合，而對其它蛋白無交叉反應(yīng)，具有較高的親和力和特異性。
3H8抗體可與Fc受體高表達(dá)的細(xì)胞U937特異性結(jié)合，而不與Fc受體陰性的人宮頸癌Hela細(xì)胞結(jié)合。
LDM聯(lián)合應(yīng)用3H8抗體后，可降低LDM的給藥劑量，對抑制U937細(xì)胞的增殖具有協(xié)同作用。LDM與3H8抗體聯(lián)用對Fc受體陰性的Hela細(xì)胞無增效作用。
LDM聯(lián)合應(yīng)用3H8抗體，對誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。LDM與3H8抗體聯(lián)用，對誘導(dǎo)Fc受體陰性的Hela細(xì)胞凋亡無增效作用。
本發(fā)明的化合物(單克隆抗體)可用于制備抗單核細(xì)胞性白血病的新型抗體導(dǎo)向藥物。
本發(fā)明的3H8細(xì)胞株高表達(dá)抗LDM單克隆抗體，可以采用無血清培養(yǎng)收集細(xì)胞上清以及小鼠腹水純化制備單克隆抗體，并將其制成所需的劑型。
發(fā)明效果 本發(fā)明的優(yōu)點與積極效果在于應(yīng)用雜交瘤單克隆抗體技術(shù)制備了抗力達(dá)霉素的單克隆抗體3H8，它可通過其Fc段靶向性地與高表達(dá)Fc受體的單核細(xì)胞結(jié)合，其可變區(qū)能與力達(dá)霉素相結(jié)合，將力達(dá)霉素帶到單核細(xì)胞周圍，通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使力達(dá)霉素進(jìn)入單核細(xì)胞，靶向性地介導(dǎo)了LDM發(fā)揮抗單核細(xì)胞性白血病的作用。實驗證明聯(lián)合應(yīng)用3H8抗體后，力達(dá)霉素對單核細(xì)胞性白血病U937細(xì)胞株的IC50可以降低13倍，且凋亡率顯著增加。3H8抗體的聯(lián)合應(yīng)用可以降低力達(dá)霉素的使用劑量從而降低其副作用，并顯著增加其抗腫瘤效果，具有良好的應(yīng)用前景。



圖1-梯度稀釋的3H8單抗與LDM親和性曲線 其中X軸為抗體的對數(shù)梯度稀釋度(lg)；Y軸為490nm的吸光度值 圖2-3H8抗體非還原SDS-PAGE蛋白電泳 圖3-3H8抗體與變性后LDM的結(jié)合(Western blot) 圖4-3H8抗體檢測LDM和LDP在HUVEC的定位實驗(激光共聚焦掃描顯微鏡) 其中綠色熒光為LDM輔基蛋白的分布部位；藍(lán)色熒光為Hoechst 33342復(fù)染細(xì)胞核 圖5-3H8抗體檢測LDM和LDP在HUVEC的定位實驗(激光共聚焦掃描顯微鏡) 圖6-3H8抗體檢測LDM和LDP在Hep G2的定位實驗(激光共聚焦掃描顯微鏡) 圖7 3H8抗體與梯度稀釋的LDM親和性曲線 其中X軸為LDM的對數(shù)梯度稀釋度(1gμM)；Y軸為490nm的吸光度值 圖8 3H8抗體與Hela和U937細(xì)胞結(jié)合實驗(熒光顯微鏡×300倍) 其中A 3H8抗體與Fc受體陰性的Hela未結(jié)合，無綠色熒光； B Hela細(xì)胞的細(xì)胞核被Hochest33342染色，呈藍(lán)色熒光； C 3H8與U937細(xì)胞膜表面的Fc受體結(jié)合，呈綠色熒光； D U937細(xì)胞的細(xì)胞核被Hochest33342染色，呈藍(lán)色熒光 圖9力達(dá)霉素聯(lián)合應(yīng)用3H8抗體對U937細(xì)胞增殖的影響 X軸為LDM的對數(shù)劑量(lg M)，Y軸為相比空白對照組的存活細(xì)胞比例 圖10力達(dá)霉素聯(lián)合應(yīng)用3H8抗體對Hela細(xì)胞增殖的影響 X軸為LDM的對數(shù)劑量(lg M)，Y軸為相比空白對照組的存活細(xì)胞比例 實施方案 以下實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
<實施例1>.抗力達(dá)霉素單克隆細(xì)胞株3H8的制備 用紫外照射過的力達(dá)霉素作為免疫原免疫BALB/c小鼠，基礎(chǔ)免疫共5次，間隔3周，每次抗原用量為50μg/只，初次用弗氏完全佐劑混合乳化，皮下多點注射，以后用弗氏不完全佐劑，腹腔注射，在融合前3天尾靜脈注射，不加佐劑加強(qiáng)免疫，抗原用量100μg/只。取免疫小鼠的脾細(xì)胞與SP-2按常規(guī)方法進(jìn)行融合，經(jīng)HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，用ELISA法篩選陽性克隆。采用有限稀釋法，在96孔板中進(jìn)行三次單克隆篩選，挑選強(qiáng)陽性的細(xì)胞3H8，培養(yǎng)條件DMEM高糖+10％胎牛血清(Gibco公司)，pH＝7.0左右，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) <實施例2>.抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8的制備 采用以下兩種方法制備抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8 方法1培養(yǎng)液上清抗體，取生長狀態(tài)良好的3H8細(xì)胞，離心收集細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基(RPMI 1640，Gln 0.3g/L，D-Glu 3g/L，HEPES 2.3g/L，NaHCO3 2g/L)將細(xì)胞稀釋成1×106/mL的濃度，取75cm2培養(yǎng)瓶，每瓶接種50mL，直立式培養(yǎng)，培養(yǎng)4天后，收集細(xì)胞上清，3000rpm離心10分鐘，取上清，硫酸銨沉淀法純化，使用BCA蛋白定量試劑盒(Promga)，按照說明書進(jìn)行蛋白定量，加入0.1％牛血清白蛋白(BSA)分裝，-20℃保存。
方法2小鼠腹水抗體用BALB/c小鼠，無菌石蠟油腹腔注射0.5ml，一周后，腹腔接種3H8雜交瘤細(xì)胞1×106個，7天后，收集腹水，辛酸硫酸銨沉淀法粗提，Protein G親和層析除去白蛋白，紫外分光光度計定量，分裝，-20℃保存。
<實施例3>.抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8效價的測定 采用ELISA法測定力達(dá)霉素單克隆抗體3H8的效價，具體步驟為 (1)LDM用PBS稀釋，按1μg/100μL/孔包被96孔板，4℃放置過夜，PBS洗3次，5分鐘×3； (2)1％BSA 4℃封閉過夜，然后放置于-20℃冷存?zhèn)溆茫? (3)PBST洗板，5分鐘×3； (4)加入不同稀釋度的培養(yǎng)液上清，以LDP為抗原制備的血清多抗為陽性對照，PBS為陰性對照(本底)，37℃1小時，PBST洗板，5分鐘×3； (5)加入1∶2500倍稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG抗體，50μL/孔，37℃反應(yīng)45分鐘～60分鐘，PBS洗板，5分鐘×6； (6)加入HRP的底物反應(yīng)液，100μL/孔，室溫避光反應(yīng)10分鐘； (7)終止液100μL/孔終止反應(yīng)，立即在酶標(biāo)儀上測定492nm吸光值； 用PBS將腹水抗體和培養(yǎng)液上清的抗體稀釋成不同的濃度，ELISA檢測抗體的效價，結(jié)果表明，腹水抗體的效價為1.6×105；培養(yǎng)液上清抗體稀釋度為4×103(圖1)。
<實施例4>.抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8的鑒定 (1)SDS-PAGE蛋白電泳 取培養(yǎng)液上清，抗體采用7.5％非變性SDS-PAGE膠蛋白電泳，可觀察到培養(yǎng)液上清除了主要雜蛋白BSA外，其余的雜蛋白較少(圖2)。
(2)Western blot 制備15％的SDS PAGE膠，以變性還原的力達(dá)霉素和力達(dá)霉素輔基蛋白進(jìn)行蛋白電泳，并設(shè)人類細(xì)胞的總蛋白作對照，常規(guī)Western Blot的實驗。一抗使用稀釋100倍的培養(yǎng)液上清抗體，二抗使用HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG的二抗。結(jié)果表明，3H8抗體可以特異性地與力達(dá)霉素及其輔基蛋白結(jié)合(圖3)。
(3)抗體亞型的測定 采用ELISA法檢測抗體亞型，表明3H8單克隆抗體為IgG1亞型，輕鏈為κ鏈。
(4)免疫熒光細(xì)胞化學(xué) 在6孔板中，分別接種1×105/孔個人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)，1×105/孔個人肝癌細(xì)胞株(Hep G2)，培養(yǎng)24小時后，更換新的培養(yǎng)液，加入終濃度為1μM的LDM和LDP，作用8小時后，棄上清，用PBS洗3次，加入多聚甲醛固定10分鐘，PBS洗3次后，正常山羊血清封閉20分鐘；一抗(自制的培養(yǎng)液上清抗體)4℃孵育過夜，37℃復(fù)溫30分鐘，PBS洗滌，5分鐘×3；加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶100倍稀釋)，37℃孵育60分鐘，PBS洗滌，5分鐘×1；加入Hoechst 33342(5μg/mL)，室溫孵育20分鐘，PBS洗滌，5分鐘×3。棄PBS，加入400μL甘油PBS，熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并照相。實驗設(shè)陰性對照組，即不加LDM，后續(xù)實驗步驟相同。在熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察(圖4、5、6)。HUVEC的對照組(未加LDM)沒有綠色熒光，細(xì)胞核被Hoechst 33342染色，紫外激發(fā)下發(fā)出藍(lán)色熒光；給予LDM組，細(xì)胞質(zhì)中可見到綠色熒光，為LDM輔基蛋白的分布位置，復(fù)染的細(xì)胞核顯示染色質(zhì)凝聚，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡；給予LDP組的，細(xì)胞質(zhì)中也可見到綠色熒光，但細(xì)胞核無凋亡現(xiàn)像；同樣，Hep G2也有相同的實驗結(jié)果。
<實施例5>.抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8對力達(dá)霉素及其輔基蛋白的檢測 (1)ELISA 用PBS將LDM按照10倍比濃度稀釋，濃度梯度為10μM～10-8μM，鋪板包被，進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果表明，3H8抗體可以檢測到0.1μM以上濃度的LDM，達(dá)到最大結(jié)合50％的LDM濃度為4.9×10-4M(圖7)。
(2)Western blot 方法同<實施例4>中的Western blot法。結(jié)果表明，3H8抗體可以特異性地與力達(dá)霉素及其輔基蛋白結(jié)合，稀釋100倍的3H8培養(yǎng)液上清抗體，可以檢測到力達(dá)霉素及其輔基蛋白(圖3)。
(3)免疫熒光細(xì)胞化學(xué) 方法同<實施例4>中的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)方法。結(jié)果表明，3H8抗體可以檢測到進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的力達(dá)霉素及其輔基蛋白(圖4、5、6)。
<實施例6>.抗力達(dá)霉素單克隆抗體3H8與人單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞的結(jié)合實驗 在6孔板中，分別接種1×104/孔個人單核細(xì)胞性白血病細(xì)胞株U937細(xì)胞(培養(yǎng)板包被明膠促進(jìn)U937貼壁)和1×104/孔個人宮頸癌細(xì)胞株HeLa細(xì)胞(Fc受體陰性對照細(xì)胞株)，培養(yǎng)24小時后，更換新的培養(yǎng)液，加入過濾除菌的3H8抗體(終濃度5μg/ml)作用8小時后，棄上清，用PBS洗3次，加入多聚甲醛固定10分鐘，PBS洗3次后，正常山羊血清封閉20分鐘；加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠二抗(1∶100倍稀釋)，37℃孵育60分鐘，PBS洗滌，5分鐘×1；加入Hoechst 33342(5μg/mL)，室溫孵育20分鐘，PBS洗滌，5分鐘×3。棄PBS，加入400μL甘油PBS，熒光顯微鏡。實驗設(shè)陰性對照組，即不加3H8抗體，后續(xù)實驗步驟相同。結(jié)果表明，3H8單抗可特異性的與U937細(xì)胞結(jié)合，而與Fc受體陰性的Hela細(xì)胞不結(jié)合(圖8)。
<實施例7>.3H8單抗聯(lián)合應(yīng)用力達(dá)霉素對U937和Hela細(xì)胞增殖的影響 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計數(shù)后按3×103個細(xì)胞/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，24小時后用抗體(5μg/ml)聯(lián)合不同濃度的LDM處理細(xì)胞48小時，每組至少3個平行孔，同時設(shè)立抗體對照組，不同濃度的LDM對照組，以及對照藥物絲裂霉素(MMC)。MTT用PBS緩沖液配成2mg/mL溶液，每孔加50μl，37℃溫育4小時。U937細(xì)胞96孔培養(yǎng)板2000rpm離心5分鐘，Hela細(xì)胞培養(yǎng)板不離心，吸出上清液，加入150μl DMSO，振蕩15分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。用酶標(biāo)儀在570nm處測定每個孔的光密度OD570。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加MTT，無細(xì)胞)，各平行孔的OD值取平均數(shù)。細(xì)胞的存活率以T/C(％)表示，T為加藥細(xì)胞的OD值，C為對照細(xì)胞的OD值。細(xì)胞存活率％＝(加藥細(xì)胞OD-本底OD)/(對照細(xì)胞OD-本底OD)×100％。采用改進(jìn)寇氏法計算IC50，并計算兩藥相互作用指數(shù)(CDI)。實驗重復(fù)三次。
兩藥相互作用指數(shù)(coefficient ofdrug interaction，CDI)的計算方法是CDI＝AB/(A×B)。AB為兩藥聯(lián)合作用組的T/C比值；A、B是藥物單獨作用組的T/C比值；T/C是指給藥組與對照組的吸光度比值。當(dāng)CDI≤0.85時存在協(xié)同作用。
結(jié)果表明單用LDM對U937細(xì)胞的IC50為2.73×10-12，聯(lián)用3H8抗體后，力達(dá)霉素對U937細(xì)胞的IC50降低為2.01×10-13，降低13.6倍，計算CDI值結(jié)果表明，3H8和LDM聯(lián)用對抑制U937細(xì)胞具有協(xié)同作用；二者聯(lián)用對Fc受體陰性的Hela細(xì)胞無明顯增效作用(圖9、10)，(表1、2)。
表1 3H8抗體聯(lián)合應(yīng)用力達(dá)霉素對Hela和U937細(xì)胞增殖的影響(IC50) 表2 3H8抗體聯(lián)合應(yīng)用力達(dá)霉素對U937細(xì)胞增殖的影響 <實施例8>.3H8單抗聯(lián)合應(yīng)用力達(dá)霉素對U937和Hela細(xì)胞株凋亡的影響 采用Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測法，取對數(shù)生長期的U937和Hela細(xì)胞按104個/孔接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后，加入3H8抗體(5μg/ml)和LDM，使LDM終濃度為1nM、0.1nM、0.01nM，并設(shè)立空白對照組、同劑量的抗體和LDM對照，作用48h后，收集全部細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞1遍，將細(xì)胞重懸于150μL Binding Buffer中，加入10μL Annexin V-FITC和5μL PI(Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒，北京寶賽生物公司產(chǎn)品)，在離心管中輕輕混勻，使細(xì)胞均勻分散，4℃避光孵育40分鐘，再加入150μL Binding Buffer，流式細(xì)胞儀檢測，1個小時之內(nèi)完成。計算早期凋亡率，T/C值和CDI值。
結(jié)果表明，LDM聯(lián)用3H8抗體后，凋亡率顯著增加，1nM、0.1nM、0.01nM時分別增加45.05％，94.71％，84.29％，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異，1nM和0.1nM時的CDI＜0.85，表明LDM聯(lián)合應(yīng)用3H8抗體誘導(dǎo)U937細(xì)胞凋亡有協(xié)同作用。LDM與3H8抗體聯(lián)用對Fc受體陰性的Hela細(xì)胞無增效作用(表3)。
表3 3H8抗體聯(lián)合應(yīng)用力達(dá)霉素對U937和Hela細(xì)胞凋亡的影響(x±s，n＝3)
權(quán)利要求
1、一種單克隆抗體3H8，其特征在于所說抗體是由雜交瘤細(xì)胞株3H8(保藏編號CGMCC No.1849)穩(wěn)定分泌的IgG1型單克隆抗體，可特異性地與力達(dá)霉素相結(jié)合，其Fc段可與Fc受體相結(jié)合。
2、一種如權(quán)利要求1所述抗體的制備方法，其特征在于用力達(dá)霉素為抗原免疫小鼠，取脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)篩選得到的強(qiáng)陽性雜交瘤細(xì)胞株，可穩(wěn)定分泌抗力達(dá)霉素的單克隆抗體，具體步驟如下
A.雜交瘤細(xì)胞株3H8的制備；
B.單克隆抗體3H8的制備；
C.單克隆抗體3H8的鑒定。
3、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是用力達(dá)霉素作為抗原免疫小鼠，取其脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，經(jīng)多次篩選得到強(qiáng)陽性的雜交瘤細(xì)胞株3H8。
4、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是將培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞3H8上清液，經(jīng)硫酸銨沉淀法純化得到3H8抗體；或者將雜交瘤細(xì)胞3H8接種于小鼠腹腔，收集腹水，辛酸硫酸銨沉淀法粗提，Protein G親和層析純化，得到純度較高的單抗3H8。
5、如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是經(jīng)過ELISA、Western blot、免疫熒光細(xì)胞化學(xué)實驗證明，單抗3H8能與力達(dá)霉素及其輔基蛋白特異性結(jié)合。
6、如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體3H8在制備抗單核細(xì)胞性白血病導(dǎo)向藥物中的應(yīng)用。
7、如權(quán)利要求1所述單克隆抗體3H8在檢測力達(dá)霉素及其輔基蛋白中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗單核細(xì)胞性白血病的抗體導(dǎo)向藥，它是由骨髓瘤細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞融合而成的雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生的IgG1單克隆抗體，可特異性地與力達(dá)霉素結(jié)合，其Fc段可特異性與單核細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，3H8抗體的聯(lián)合應(yīng)用可以降低力達(dá)霉素的使用劑量，并顯著增加其抗單核細(xì)胞性白血病的效果，具有良好的臨床應(yīng)用前景，可望成為一種用于臨床治療單核細(xì)胞性白血病的新型靶向抗體藥物。
文檔編號A61P35/00GK1958610SQ200610150800
公開日2007年5月9日 申請日期2006年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2006年10月27日
發(fā)明者歐陽志鋼, 吳淑英, 甄永蘇, 商悅, 劉秀均 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所