專利名稱：：無色渦鞭毛藻抗氧化提取物的生產(chǎn)和用途的制作方法無色渦鞭毛藻抗氧化提取物的生產(chǎn)和用途本發(fā)明涉及無色渦鞭毛藻(Crypthecodiniumsp)的提取物，其生產(chǎn)方法和用途，特別是針對含有一或多種長鏈多不飽和脂肪酸和/或一或多種長鏈多不飽和脂肪酸酯的脂肪酸組合物的抗氧化穩(wěn)定性。長鏈多不飽和脂肪酸(PUFAs)是人體新陳代謝的必需脂肪酸。PUFAs可以細(xì)分為兩大家族，除了其起始于亞油酸的w-6PUFAs家族，還有其起源于a-亞麻酸的"-3PUFAs家族。PUFAs是細(xì)胞膜、視網(wǎng)膜、腦膜的重要組成元件和諸如前列腺素、血栓素和白細(xì)胞三烯這些重要激素的前體。除了作為組成元件的功能外，近年來不斷發(fā)現(xiàn)PUFAs直接對人體器官和疾病具有多重有益效果。大量的臨床研究發(fā)現(xiàn)PUFAs對治愈和減緩病情作出了重要貢獻，例如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、高血壓、神經(jīng)性皮炎和許多其他疾病。在這些情況下二十二碳六烯酸(DHA;全-順-4，7，10,13，16，19-二十二碳六烯酸)及其衍生物，特別是DHA酯，就常常特別具有優(yōu)勢，因為這種酯(特別是乙酯和甘油三酯)傾向于具有宜人的口感，容易被消化系統(tǒng)吸收。這些發(fā)現(xiàn)原先造成了國際機構(gòu)和權(quán)威推薦控制每日需攝入PUFAs的事實。PUFAs不能由人體從頭合成，因為缺少將雙鍵在〉C9位置導(dǎo)入碳鏈中的酶系統(tǒng)(缺少厶12-去飽和酶)。人們只能通過飲食中的脂肪酸前體(如a-亞麻酸)的供應(yīng)合成多不飽和脂肪酸。然而，這個量是否能夠滿足多不飽和脂肪酸的需求有待討論。絕大多數(shù)的必需脂肪酸通過飲食攝取。特別是植物油富含o-6脂肪酸(例如月見草油含有Y-亞油酸(GLA))但鏈長只達(dá)到C18，魚油和微生物來源的油含"-3脂肪酸(例如鮭魚油含有二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA;全-順-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸))。大體上，魚油和微生物來源的油是多不飽和脂肪酸的唯一商業(yè)來源。然而通常所需的PUFAs的含量過低，并且存在于混合物中，這樣也可能存在顯示拮抗作用的PUFAs。為了攝取每日推薦劑量的PUFAs，因此必須要攝入大量的油。特別地，這適用于必須消耗高劑量PUFAs的病人(例如囊性纖維化病)。為了盡可能以耙向方式達(dá)到單獨PUFAs的效果，必須使用富集的或高純度的PUFAs。因此在現(xiàn)有技術(shù)中迫切需要高純度PUFAs。很多方法被單獨或組合起來使用以從大量天然存在的來源中分離(或至少濃縮)和回收脂肪酸及其衍生物。這些方法包括低溫分步結(jié)晶、分子蒸餾、尿素加合物結(jié)晶、金屬鹽溶液提取、反相柱分離超臨界流體分部和HPLC方法?？紤]到PUFAs對氧化作用的敏感，通常必須加入合適的抗氧化劑來穩(wěn)定。為了這個目的，商業(yè)上特別使用天然生育酚，又特別是提取自大豆油的a-、P-、Y-和S-生育酚和/或生育三烯酚類的混合物。此外已知一些化合物，例如棕櫚酸抗壞血酸酯酯，能協(xié)同作用。因此除了生育酚，它們也能被使用。然而天然抗氧化劑的效果并不能隨著濃度的增加而無限增加。例如，a-生育酚早至100ppm其活性就逆轉(zhuǎn)，并且發(fā)生促氧化作用。這意味著過量可能引起不利后果。可替代地，公布的WO03092628提出了一種在溫和條件下作用逐步加強的油的用途。這種情況下必須以該方式進行制備，即首先將含200680002978.5說明書第3/17頁多不飽和脂肪酸的生物量與酶反應(yīng)然后分離脂質(zhì)。盡管該方法獲得的油起初氧化程度不高，然而它還是顯示出多不飽和脂肪酸氧化性質(zhì)的敏感性。根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，因此本發(fā)明的目的是顯示脂肪酸組合物增強的抗氧化穩(wěn)定性的可能。在這種情況下要盡可能增加抗氧化活性，但不能加入對健康有害的物質(zhì)，從而使脂肪酸組合物能無保留地應(yīng)用在食品領(lǐng)域。本發(fā)明的另一個目的是詳細(xì)說明生產(chǎn)本發(fā)明脂肪酸組合物的方法，它使得可以盡可能以簡單的方式大規(guī)模廉價生產(chǎn)。此外還應(yīng)指出本發(fā)明的脂肪酸組合物應(yīng)用于特別有優(yōu)勢的領(lǐng)域。盡管沒有明確指出，但可以從申請文本中明確推出或不可避免地導(dǎo)出的這些或其他目的能通過無色渦鞭毛藻的提取物達(dá)到。權(quán)利要求1的從屬權(quán)利要求描述了本發(fā)明提取物的有利修飾。權(quán)利要求11-19要求保護的范圍是對抗氧化劑穩(wěn)定的脂肪酸組合物。方法權(quán)利要求保護特別適用于生產(chǎn)本發(fā)明脂肪酸組合物的模式，用途權(quán)利要求描述了特別適用于本發(fā)明脂肪酸組合物應(yīng)用的優(yōu)勢領(lǐng)域。通過提供無色渦鞭毛藻的抗氧化提取物，以不容易預(yù)見的方式成功獲得了具有特別高抗氧化活性的提取物，這種提取物特別適用于使脂肪酸組合物抗氧化穩(wěn)定，特別是含有至少一種不飽和脂肪酸和/或至少一種不飽和脂肪酸酯的脂肪酸組合物。這樣根據(jù)本發(fā)明無需添加對健康有害的物質(zhì)就能增加抗氧化活性，即可以放心將本發(fā)明的脂肪酸組合物應(yīng)用到食品領(lǐng)域。例如隱甲藻(Crythecodiniumcohnii)油已用于嬰兒食品中，在美國歸于GRAS(通常認(rèn)為是安全的)一類。本發(fā)明的脂肪酸組合物能以簡單的方式大規(guī)模廉價地生產(chǎn)。本發(fā)明的脂肪酸組合物含有至少一種來自于無色渦鞭毛藻，優(yōu)選隱甲藻的抗氧化提取物。申請文件中"脂肪酸組合物"的表達(dá)不僅包括含有游離脂肪酸的組合物，也包括含有脂肪酸衍生物優(yōu)選脂肪酸酯，特別是脂肪酸甘油三酯的組合物，這樣脂肪酸根大體上一致或不同。本發(fā)明的脂肪酸表示脂肪羧酸，它可以是飽和的，或單不飽和，或多不飽和，優(yōu)選含6-30個碳原子。無色渦鞭毛藻中獲得的提取物本身己知。根據(jù)本發(fā)明，不僅可使用無色渦鞭毛藻野生菌株提取物，還可以使用無色渦鞭毛藻菌株的突變體或重組體。申請文件中"無色渦鞭毛藻提取物"的表達(dá)包括所有用溶劑從無色渦鞭毛藻生物量，優(yōu)選為油中提取獲得的組合物，溶劑優(yōu)選有機溶劑和/或超臨界溶劑，特別是有機溶劑。同樣可以使用溶劑混合物。本發(fā)明的提取物具有優(yōu)選比其來源的生物量具有更大的抗氧化活性。因此優(yōu)選它的過氧化物值小于最初使用的優(yōu)選為新鮮分離的其來源的生物量的過氧化物值，并且優(yōu)選為提取物來源的生物量過氧化物值的最多50.0%，更優(yōu)選最多25.0%，有利地最多10.0%，特別是最多1.0%。這種情況下，過氧化物值優(yōu)選用AOCS(美國油類化學(xué)家協(xié)會)官方方法Cd-3d63的說明測定，有利地在2周的敞開貯存之后。本發(fā)明提取物的抗氧化能力大于15000Trolox等價物，更優(yōu)選為大于20000Trolox等價物，有利地大于25000Trolox等價物，特別優(yōu)選大于30000Trolox等價物，又特別大于35000Trolox等價物(ug/ml)。Trolox⑧是6-羥基-2，5，7,8-四甲基色烷-2-羧酸慣常使用的商品名。根據(jù)本發(fā)明"生物體的生物量"的表達(dá)不僅包括生物體的全部細(xì)胞，還包括生物體的個體細(xì)胞組分。無色渦鞭毛藻提取物通過培養(yǎng)微生物、從培養(yǎng)物收獲生物量、分解生物量和分離提取物有利地獲得。為了分離提取物，優(yōu)選使用有機溶劑提取的方法，特別是用己烷或超臨界液體。本發(fā)明特別優(yōu)選用有機溶劑提取的方法。有利地，用己垸浸透干的生物量從而提取生物量中的提取物。這種用有機溶劑提取在WO9737032、WO9743362和EP515460和其他內(nèi)容一起得到描述。還可以在JournalofDispersionScienceandTechology，10，561-579，1989"BiotechnologicalProcessesfortheProductionofPUFAs"中發(fā)現(xiàn)特別廣泛的描述?？商娲兀部梢圆皇褂萌軇┻M行提取。申請文件中一個特別有利的方法在EP-A-1178118中記載。該方法通過生產(chǎn)生物量的水相懸浮液，利用離心將油相與水相分離而避免使用溶劑。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的變型，通過純機械擠壓來自無色渦鞭毛藻的生物量，接著用至少一種有機溶劑或至少一種超臨界溶劑，優(yōu)選有機溶劑，特別是己垸提取，從而獲得提取物。根據(jù)本發(fā)明的另一種特別優(yōu)選的變型，通過蒸餾獲得提取物。在本發(fā)明的文本中，也證明能特別有優(yōu)勢的是優(yōu)選用具有1-12個碳原子的脂肪醇，優(yōu)選為具有l(wèi)-6個碳原子，特別是具有l(wèi)-4個碳原子將生物量進行酯交換。這樣能夠特別證明甲醇和乙醇，特別是乙醇的用途。酯交換優(yōu)選在酸催化下進行，特別是用硫酸和/或鹽酸。根據(jù)另一種特別優(yōu)選的變型，酯交換通過酶而實現(xiàn)。酯交換后的生物量隨后優(yōu)選用至少一種有機溶劑或至少一種超臨界溶劑提取，優(yōu)選用有機溶劑，特別是己烷。溶劑的總體積與反應(yīng)量(包括所加的水)的比例也能在一個大范圍內(nèi)變化，特別優(yōu)選是1:3到4:3。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，混合物是通過最終組合在一起的多種溶劑提取的。在這個實施方式的上下文中，優(yōu)選使用無色渦鞭毛藻生物量的己烷提取物作為被酯交換的生物量，其然后如上所述被酯交換。這個過程用作抗氧化提取物的濃縮和純化。有利地，基于總重量，用該方式濃縮和純化的提取物的具有6-30個碳原子的脂肪酸的含量，和包含具有6-30個碳原子的脂肪酸烷基根的脂肪酸酯的含量，小于20.0%重量，優(yōu)選小于10.0%重量，特別是小于5.0%重量。提取物的組成可以在寬范圍內(nèi)變化。在本發(fā)明第一個特別優(yōu)選的實施方式中，來自無色渦鞭毛藻的提取物通過以下步驟獲得i)皂化無色渦鞭毛藻生物量，和ii)用溶劑提取被皂化的生物量，該溶劑在25X:時的水溶解度小于0.1g溶劑/克水。優(yōu)選地，在這種情況下，遵循DGF方法F-II1(75)的步驟。生物量能被本身已知的方法皂化。在這種情況下特別證明了在醇溶液中，優(yōu)選為甲醇和/或乙醇溶液中，生物量與至少一種堿金屬氫氧化物，優(yōu)選NaOH和/或KOH，特別是KOH的反應(yīng)。皂化作用特別合適的反應(yīng)溫度范圍為25-100°C。皂化產(chǎn)物混合物的提取可以在寬的范圍內(nèi)變化。根據(jù)一個優(yōu)選的變型，在混合物中加水，用25"C時水溶解度小于0.1g溶劑/克水的溶劑進行提取。溶劑的總體積與反應(yīng)量(包括加入的水)體積的比例在寬的范圍內(nèi)變化，特別優(yōu)選從l:3到4:3。根據(jù)一個特別優(yōu)選的實施方式，混合物是通過最終組合在一起的多種溶劑提取的。本發(fā)明特別適合的溶劑包括有機溶劑二氯甲垸、乙醚、甲乙酮、乙酸乙酯、石油醚、戊烷和己烷，也包括超臨界溶劑丙垸、丁烷和二氧化碳，有機溶劑中特別是乙醚和己垸，最優(yōu)選乙醚。剩余的水可以從提取溶劑層除去，例如通過鹽水洗滌(即是說飽和鹽溶液)該層，通過分子篩干燥和/或無水鹽干燥(例如硫酸鈉或硫酸鎂)。提取以后，優(yōu)選濃縮提取物，有利地通過部分或完全蒸發(fā)溶劑。在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的實施方式中，用具有1-12個，優(yōu)選具有l(wèi)-6個，特別是l-4個碳原子的醇，禾P/或具有3-6個，優(yōu)選3-4個碳原子的酮，提取無色渦鞭毛藻生物量，獲得無色渦鞭毛藻提取物。這種情況下，用醇提取要優(yōu)選于用酮提取。每種情況下，特別適合該目的的單獨的或是在混合物中的醇是甲醇和乙醇。特別適合的酮包括丙酮和/或甲乙酮，特別是丙酮。在該實施方式中，優(yōu)選使用無色渦鞭毛藻的生物量的己烷提取物作為而后用醇和/或酮反提取的生物量。這個過程用作抗氧化提取物的濃縮和純化。有利地，基于總重量，用該方式濃縮和純化的提取物的具有6-30個碳原子的脂肪酸含量，含具有6-30個碳原子的脂肪酸垸基根的脂肪酸酯的含量，小于20.0%重量，優(yōu)選小于10.0%重量，特別是小于5.0%重量。這種情況下醇或酮的總體積與生物量的體積的比例變化范圍廣，特別優(yōu)選是3:l到3:4。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，混合物是通過最終組合在一起的多種醇或酮提取的。提取以后，優(yōu)選濃縮提取物，有利地通過部分或完全蒸發(fā)溶劑。這種方法獲得的提取物再次優(yōu)選用具有3-6個碳原子的酮提取，更優(yōu)選用丙酮和/或甲乙酮，特別是丙酮提取。這種情況下酮的總體積與第一次提取物的體積的比例變化范圍廣，特別優(yōu)選是3:l到3:4。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，第一次的提取物是通過最終組合在一起的多種酮提取的。提取以后，優(yōu)選濃縮得到的第二次提取物，有利地通過部分或完全蒸發(fā)溶劑。本發(fā)明中，脂肪酸組合物另外包含與無色渦鞭毛藻不同的生物量組分，優(yōu)選破囊壺菌(Thraustochytriales)的生物量，特別是Ulkeniasp.的生物量。與無色渦鞭毛藻不同的生物量同樣本身已知。根據(jù)本發(fā)明，不僅能夠使用野生型菌株的生物量，也能使用高效產(chǎn)DHA(全-順-4，7,10，13,16，19-二十二碳六烯酸)和/或DPA(全-順-4，7,10,13,16-二十二碳五烯酸)的突變或重組菌株的生物量。這種突變或重組菌株包括與使用相同基質(zhì)的原始野生型菌株的百分比相比，脂肪中含有更高百分比例DHA和/或DPA的微生物，和/或與使用相同基質(zhì)的原始野生型菌株生產(chǎn)的量相比，含有更高的脂質(zhì)總量。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的脂肪酸組合物包含不同于無色渦鞭毛藻的生物量的提取物。這種情況下的提取物通過培養(yǎng)被討論的微生物、從培養(yǎng)物收獲生物量、分解生物量和分離提取物有利地獲得。本文中非常有利的方法在WO03/033631Al中描述，其公開內(nèi)容在此清楚地引入作為參考。為了分離提取物，優(yōu)選使用有機溶劑提取的方法，特別是己烷，或用超臨界液體提取。有利地，用己烷浸透干的生物量從而提取生物量中的提取物。這種用有機溶劑提取在WO9737032、WO9743362和EP515460和其他內(nèi)容一起得到描述。還可以在JournalofDispersionScienceandTechology，lO,561-579,1989"BiotechnologicalProcessesfortheProductionofPUFAs"中發(fā)現(xiàn)特別廣泛的描述。可替代地，也可以不使用溶劑進行提取。申請文件中一個特別有利的方法在EP-A-1178118中記載。該方法通過生產(chǎn)生物量的水相懸浮液，利用離心將油相與水相分離而避免使用溶劑。根據(jù)本發(fā)明特別優(yōu)選的變型，通過純機械擠壓不同于無色渦鞭毛藻的生物量，接著用至少一種有機溶劑或超臨界溶劑，優(yōu)選用至少一種有機溶劑，特別是己垸提取，從而獲得提取物。在本發(fā)明的文本中，也證明能特別有優(yōu)勢地優(yōu)選用具有l(wèi)-12個碳原子，優(yōu)選為l-6個碳原子，特別是l-4個碳原子的脂肪醇使生物量進行酯交換。這樣能夠特別證明甲醇和乙醇，特別是乙醇的用途。酯交換優(yōu)選在酸催化下進行，特別是利用硫酸和/或鹽酸。酯交換后的生物量隨后優(yōu)選用一種有機溶劑，特別是己垸提取。溶劑的總體積與反應(yīng)量(包括所加的水)體積的比例也能在一個大范圍內(nèi)變化，特別優(yōu)選是l:3到4:3。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，混合物是通過最終組合在一起的多種溶劑提取的。生物量的組成可以在寬范圍內(nèi)變化。優(yōu)選地，不同于無色渦鞭毛藻的生物量包括至少一種多不飽和脂肪酸和/或至少一種脂肪酸酯，有利地為一種脂肪酸烷基酯，優(yōu)選甘油酯，特別是甘油三酯，它含有至少一個多不飽和脂肪酸根，優(yōu)選有6-30個碳原子。根據(jù)特別優(yōu)選的實施方式，生物量中至少10%，特別優(yōu)選至少25。X，特別是至少30%的脂肪酸和/或脂肪酸根是DHA或DHA根。此處用的表達(dá)"甘油酯"是甘油和至少一種脂肪酸的酯，其中甘油的1-3個羥基基團被一個或多個脂肪酸根酯化。當(dāng)存在多個脂肪酸根時，這些脂肪酸根可以是相同的或是不同的。在很多適合的起始材料中，絕大多數(shù)甘油酯是甘油三酯，即是說三個脂肪酸根和甘油的酯。這種情況下每一個脂肪酸根可以是飽和的(即是說碳原子之間的所有鍵是單鍵)或不飽和的(即是說至少有一個碳碳雙鍵或三鍵)。此處不飽和脂肪酸根的類型有時指定"。這個數(shù)字給出了第一個雙鍵的位置，從脂肪酸或脂肪酸根末端的甲基基團開始計數(shù)。本發(fā)明的脂肪酸組合物單獨組分的相對分?jǐn)?shù)大體上可以自由選擇，與各自用途相對應(yīng)。然而本發(fā)明發(fā)現(xiàn)非常特別有利的是，當(dāng)每種情況下基于脂肪酸組合物的總重量包含0.1-50.00%重量，優(yōu)選0.01-25.0Q/^重量，有利地0.2-10.0%重量，特別是0.5-5.0%重量的來自無色渦鞭毛藻的抗氧化提取物，以及50.0-99.9%重量，優(yōu)選75.0-99.9%重量，有利地90.0-99.8%重量，特別是95.0-99.5%重量的不同于無色渦鞭毛藻生物量的組分，與上述相對分?jǐn)?shù)合起來優(yōu)選為100%重量。本發(fā)明的脂肪酸組合物具有相對高分?jǐn)?shù)的多不飽和脂肪酸，每一種情況下基于其總重量優(yōu)選包含至少10.0%重量，有利地為至少25.0%重量，更優(yōu)選為至少50.0。％重量，特別是至少70.0%重量的二十二碳六烯酸(全-順-4，7，10，13,16，19-二十二碳六烯酸)和/或二十二碳六烯酸垸基酯(全-順-4,7，10，13,6,19-二十二碳六烯酸垸基酯)，優(yōu)選二十二碳六烯酸、二十二碳六烯酸甲酯和/或二十二碳六烯酸乙酯。與常規(guī)穩(wěn)定的脂肪酸組合物相比，本發(fā)明的脂肪酸組合物對氧化作用具有更高的穩(wěn)定性而與眾不同。因此不必須添加已知的抗氧化劑，例如a-，e-，Y-和/或S-生育酚。因此，本發(fā)明的脂肪酸組合物根據(jù)第一個優(yōu)選實施方式不含有另外的抗氧化劑。然而，既然本發(fā)明的脂肪酸組合物的抗氧化穩(wěn)定性常常能通過其他抗氧化劑的加入而增強，本發(fā)明的一個特別優(yōu)選實施方式中的脂肪酸組合物包含至少一種抗氧化劑，優(yōu)選能協(xié)同作用的抗氧化劑，優(yōu)選至少一種生育三烯酚，a-,P-，Y-和/或S-生育酚和棕櫚酸抗壞血酸酯酯，每一種情況下基于脂肪酸組合物的總重量該組分的相對分?jǐn)?shù)優(yōu)選為0.01-5.0%重量，特別是0.05-0.5%重量。本發(fā)明的脂肪酸用已知的方法生產(chǎn)，優(yōu)選通過相應(yīng)組分的混合。這種情況下已經(jīng)證明特別有利的是溶解來自無色渦鞭毛藻的抗氧化提取物和在溶劑中將不同于無色渦鞭毛藻的生物量的組分彼此分離，溶劑優(yōu)選石油醚、己烷、戊垸、乙醇、甲醇、乙腈、二氯甲垸、甲乙酮、乙醚和/或乙酸乙酯，有利地為己垸和/或乙醚，特別是乙醚，然后將溶液相互混合，隨即除去溶劑，優(yōu)選通過蒸發(fā)除去。根據(jù)本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方式，組分混合時不用添加溶劑，這樣使用的合適的升高的溫度優(yōu)選的范圍為25'C-8(TC，特別是25t:-60。C。本發(fā)明的脂肪酸組合物可能的應(yīng)用領(lǐng)域?qū)τ诒绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。它們特別適用于PUFAs和PUFA酯所顯示的應(yīng)用。在這些情況下本發(fā)明的脂肪酸組合物常常被直接使用。然而，對于一些應(yīng)用來說，需要提前皂化脂肪酸酯或在液相中提前皂化脂肪酸酯。例如可以通過在乙醇中與KOH反應(yīng)，隨后用無機或有機酸酸化來達(dá)到。本發(fā)明的脂肪酸組合物特別用作藥物組合物中的活性成分或組分、化妝品制劑中的組分、食品添加劑、食物成分、功能食品組分以及用于生產(chǎn)高濃縮的PUFA的二級產(chǎn)品，如酯和酸。本發(fā)明將在稍后的實施例中得到更加詳細(xì)的描述，而不將發(fā)明概念限制于此。確定下列脂肪酸組合物的誘導(dǎo)時間、過氧化物值和/或抗氧化能力對照1使用如Yokochi等人，Appl.Microb.Biotechnol.，(1998)，49,pp.72-76中描述生產(chǎn)的"含DHA的油"。它進行了常規(guī)已知方法步驟的完全精煉，下文指定這種油簡稱作"含DHA的油"。對照2-17表1詳細(xì)列出"含DHA的油"+棕櫚酸抗壞血酸酯酯和/或生育酚混合物(加入0.14X⑧CovioxT70，天然生育酚混合物)的量。實施例1根據(jù)DGF法F-IIl(75)得到提取物。稱重5.02g隱甲藻原油(己垸提取物)放入250ml圓底燒瓶，再與20mg連苯三酚、40ml甲醇、10ml60%強度的氫氧化鉀溶液(g/v)和3塊沸石混合。80'C熱水水浴中，樣品在回流和溫和的氮流中皂化20分鐘。冷卻后，皂液用40ml雙蒸水沖洗三次，50ml乙醚沖洗兩次，放入500ml分液漏斗。用乙醚小心回蕩進行第一次提取。水相放入600ml玻璃燒杯。乙醚相用40ml雙蒸水重新沖洗，水被導(dǎo)入水相。乙醚相被導(dǎo)入1000ml圓底燒瓶。如此描述(加入乙醚，提取等)再次處理水相四次直到變?yōu)闊o色。合并的乙醚相用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮，使用油泵干燥，稱重。產(chǎn)生了921mg提取物。其與4g"含DHA的油"(對照5;含0.1%的生育酚)混合，再加入10ml乙醚而充分混合。移去乙醚后，獲得橙色的油。實施例2稱重41.9g隱甲藻原油放入500ml圓底燒瓶，與120ml甲醇和磁力攪拌棒混合。該批量在磁力攪拌器上劇烈攪拌3小時。上層的甲醇相慢慢倒入250ml圓底燒瓶。該批次的油再次與100ml甲醇混合，再次沖洗一小時。將油-甲醇混合物置于100ml分液漏斗，甲醇相轉(zhuǎn)移到前面的甲醇相中。用旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器濃縮，通過油泵干燥。產(chǎn)生760mg提取物。"含DHA的油"(對照5;含0.1%的生育酚)與2%重量的提取物充分混合。實施例3與實施例2的脂肪酸組合物的方法類似，除了使用的"含DHA的油"(對照1)與4%重量的提取物充分混合。實施例4隱甲藻的干生物量用甲醇直接提取，這樣也一同提取了大分?jǐn)?shù)的磷脂，從而得到粘稠的產(chǎn)物。"含DHA的油"(對照l)與4%重量的提取物充分混合。實施例5隱甲藻的干生物量用甲醇直接提取，這樣也一同提取大分?jǐn)?shù)的磷脂，從而得到非常粘稠的產(chǎn)物。為了除去這些化合物，提取物再次用丙酮洗滌，溶于丙酮的組分形成了隱甲藻丙酮提取物。"含DHA的油"(對照l)與4。Z重量的丙酮提取物充分混合。實施例6與實施例2的脂肪酸組合物的方法類似，除了使用的"含DHA的油"(對照1)與4%重量的提取物充分混合。確定氧化穩(wěn)定性測定儀(Rancimatdertermination)儀器:743Rancimat生產(chǎn)商:Metrohm儀器設(shè)置方法(與AOCS法Cdl2b-92類似)溫度80°C氣體流速20L/h停止標(biāo)準(zhǔn)終點法步驟和測量原理稱取測量用的油(3g)放入反應(yīng)容器，置于加熱塊上，暴露于確定的溫度和氣流中。形成易揮發(fā)的氧化產(chǎn)物，如甲酸，它們經(jīng)由氣體管道轉(zhuǎn)移至測量容器，在其中用導(dǎo)電電極在蒸餾水中測量導(dǎo)電率。隨著時間記錄導(dǎo)電率直到終點。從曲線上可以自動形成二級導(dǎo)數(shù)，在鞍點具有最大值。到達(dá)鞍點的時間叫做誘導(dǎo)時間。各樣品的穩(wěn)定性越高，誘導(dǎo)時間就越長。因此，通過比較檢測的誘導(dǎo)時間，可得出樣品抗氧化狀態(tài)的結(jié)論以及可以有效比較抗氧化劑之間的活性。對于以上列出的材料，測量的誘導(dǎo)時間總結(jié)在表1。表l:氧化穩(wěn)定性測試的誘導(dǎo)時間<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>AP:棕櫚酸抗壞血酸酯Toc:生育酚混合物UvA:未皂化的級分(見上文)MeOH-extr:MeOH提取物(見上文)Ace-extr:丙酮提取物(見上文)過氧化值的確定上述材料室溫下暗處在開口的100ml錐形燒瓶中貯存預(yù)定時間，然后分析它們的過氧化值。按照AOCS(美國油脂化學(xué)家協(xié)會)官方方法Cd-3d63的詳細(xì)說明測定過氧化值。獲得的結(jié)果總結(jié)在表2。它們顯示與未添加穩(wěn)定劑的"含DHA的油"(對照1)或常規(guī)方法穩(wěn)定的"含DHA的油"(對照2)相比，通過使用甲醇提取物(實施例3)可以顯著增加抗氧化穩(wěn)定性。在這些情況下，另外添加生育酚能使抗氧化穩(wěn)定性進一步增加。重量Toc+0.05。/。重量AP11.6對照160.2%重量丁00+0.1%重量AP10.6對照170.2%重量Toc+0.2。/。重量AP7.0實施例118.7。/。重量UVA+0.1。/。重量Toc17,9實施例22.0。/o重量MeOH-extr+0.1。/o重量Toc14.3實施例64.0。/o重量MeOH-extr+O.P/o重量Toc17.6實施例54%重量Ace-extr41.5AP:棕櫚酸抗壞血酸酯表2:開口貯存后的過氧化值<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>抗氧化能力的確定對照1和5以及實施例5的抗氧化活性如下確定方法用Photochem法測量樣品。Photochem⑧根據(jù)光化學(xué)發(fā)光法(PLC)操作。使用光敏劑產(chǎn)生超氧化物陰離子根，可通過它們與化學(xué)發(fā)光物質(zhì)(例如魯米諾)的反應(yīng)來檢測或是通過產(chǎn)生的光來探測。樣品中出現(xiàn)的自由根捕獲劑(抗氧化劑)越多，光化學(xué)發(fā)光以濃度依賴的方式減弱的強度就越強。結(jié)果以等價的Trolox濃度單位報道。使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒操作儀器，從而測量單個抗氧化劑和超氧化物岐化酶的抗氧化能力。為了確定Trolox的等價物，用n-己烷稀釋樣品，直接用來測量。獲得的結(jié)果總結(jié)在表3表3:—些樣品的抗氧化能力<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>可以看出本發(fā)明的實施例具有相對高的抗氧化能力。必須指出本文中加入的提取物的量不等價于混合物中抗氧化活性量。例如，可以進一步純化，產(chǎn)生的提取物具有更大的抗氧化活性。當(dāng)然，保護范圍覆蓋更高度純的濃縮物直到抗氧化活性化合物。權(quán)利要求1.來自無色渦鞭毛藻(Crypthecodiniumsp)的抗氧化提取物。2.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于抗氧化能力大于25000Trolox等價物。3.如權(quán)利要求2所述的提取物，其特征在于提取物通過以下步驟獲得i)皂化無色渦鞭毛藻的生物量，和ii)用在25'C時的水溶解度小于O.lg溶劑/g水的溶劑提取被皂化的生物量。4.如權(quán)利要求所述3的提取物，其特征在于提取物可通過用己烷、戊烷、乙酸乙酯、乙醚、二氯甲烷、二甲乙酮和/或超臨界二氧化碳，提取來自無色渦鞭毛藻的皂化生物量而獲得。5.如權(quán)利要求2所述的提取物，其特征在于提取物可通過用具有1-12個碳原子的醇和/或3-6個碳原子的酮提取無色渦鞭毛藻的生物量而獲得。6.如權(quán)利要求5所述的提取物，其特征在于提取物可通過用甲醇、異丙醇、丙酮和/或乙醇提取無色渦鞭毛藻的生物量而獲得。7.如權(quán)利要求5或6所述的提取物，其特征在于提取物可通過用具有1-12個碳原子的醇提取隨后用酮提取無色渦鞭毛藻的生物量而獲得。8.如上述至少一個權(quán)利要求所述的提取物，其特征在于提取物是來自隱甲藻(Crypthecodiniumcohnii)的提取物。9.如上述至少一個權(quán)利要求所述的提取物，其特征在于提取物可通過將無色渦鞭毛藻的生物量進行酯交換的方法而獲得。10.如上述至少一個權(quán)利要求所述的提取物，其特征在于提取物可通過機械方法提取無色渦鞭毛藻生物量而獲得。11.包含至少一種不飽和脂肪酸的脂肪酸組合物，其特征在于脂肪酸組合物包含如上述至少一個權(quán)利要求所述的至少一種提取物和來自不同于無色渦鞭毛藻的生物量組分。12.如權(quán)利要求ll所述的脂肪酸組合物，其特征在于它包含破囊壺菌(Thraustochytriales)的生物量組分。13.如權(quán)利要求12所述的脂肪酸組合物，其特征在于它包含Ulkeniasp的生物量組分。14.如權(quán)利要求11-13中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物，其特征在于通過將不同于無色渦鞭毛藻的生物量進行酯交換的方法，獲得不同于無色渦鞭毛藻的生物量的組分。15.如權(quán)利要求11-14中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物，其特征在于，每一種情況下基于脂肪酸組合物的總重量，它包含0.1-50.0%重量的如權(quán)利要求1-10至少一個權(quán)利要求所述的至少一種提取物，和50.0-99.9%重量的不同于無色渦鞭毛藻的生物量的組分。16.如之前權(quán)利要求11-15中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物，其特征在于基于其總重量，包含至少25.0%重量的二十二碳六烯酸和/或二十二碳六烯酸垸基酯。17.如之前權(quán)利要求11-16中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物，其特征在于包含至少一種抗氧化劑。18.如權(quán)利要求17所述的脂肪酸組合物，其特征在于包含a-、0-、Y-和/或S-生育酚和/或至少一種生育三烯酚。19.如權(quán)利要求18所述的脂肪酸組合物，其特征在于另外包含棕櫚酸抗壞血酸酯。20.生產(chǎn)如之前權(quán)利要求11-19中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物的方法，其特征在于如權(quán)利要求1-10中至少一個權(quán)利要求所述的至少一種提取物和不同于無色渦鞭毛藻的至少一種生物量的組分互相混合。21.如權(quán)利要求11-19中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物的用途，用作藥物組合物中的活性成分或組分。22.如權(quán)利要求11-19中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物的用途，用作化妝品制劑組分。23.如權(quán)利要求11-19中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物的用途，用作食品添加劑和/或食品成分。24.如權(quán)利要求11-19中至少一個權(quán)利要求所述的脂肪酸組合物的用途，用于動物飼料成分。全文摘要本發(fā)明涉及無色渦鞭毛藻(Crypthecodiniumsp)的抗氧化提取物。本發(fā)明還涉及含有一種或多種多不飽和脂肪酸和/或一種或多種多不飽和脂肪酸酯和根據(jù)本發(fā)明的至少一種提取物和不同于無色渦鞭毛藻生物量的組分的脂肪酸組合物，和涉及生產(chǎn)該脂肪酸組合物的方法和其用途。文檔編號A61K8/97GK101106913SQ200680002978公開日2008年1月16日申請日期2006年1月26日優(yōu)先權(quán)日2005年1月26日發(fā)明者多琳·諾伊曼,德克·法布里蒂烏斯申請人:努特諾瓦營養(yǎng)產(chǎn)品及食品成分有限公司