本發(fā)明屬于抗氧化肽制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用鱈魚加工副產(chǎn)物制備抗氧化肽的方法。
背景技術(shù)：
抗氧化劑近些年來在國內(nèi)外發(fā)展很快，用途也越來越廣。自從harman提出自由基理論以來，人們認識到人體內(nèi)氧化產(chǎn)生的自由基與人的衰老和許多疾病有關(guān)，因此抗氧化劑不僅用于含脂肪食品的抗氧化，而且作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開發(fā)。
抗氧化劑的種類很多，然而化學(xué)合成的抗氧化劑如bha、bht等，由于其本身具有毒、副作用，各國政府紛紛對其強制規(guī)定了adi值，控制其過量添加?？寡趸钚远嚯挠捎诘投尽⒏咝У忍攸c，作為食品和機體的抗氧化劑，是近年來國內(nèi)外科學(xué)工作者們較熱的研究課題，這些研究使人們對多肽的生物活性有了新的認識，也為保健食品的開發(fā)提供了一個有前途的基料。目前已有多種具有抗氧化作用的海洋生物活性肽從海洋生物中分離得到，如海綿多肽、海鞘多肽、海參多肽和扇貝肽等。
海洋蛋白質(zhì)資源品質(zhì)極高，且包含有多種生物活性序列，近年來研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)酶解有助于改善其營養(yǎng)價值和功能特性。多肽具有比蛋白質(zhì)易于消化吸收、能迅速給機體提供能量、無蛋白質(zhì)變性、分子量小、易溶于水等特點。蛋白酶水解法是提取水解魚蛋白的主要方法。蛋白酶水解法制得產(chǎn)物具有很高的營養(yǎng)價值和良好的理化性質(zhì)。此外,蛋白質(zhì)經(jīng)消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游離氨基酸具有更好的的吸收利用、抗氧化等多種功能。開發(fā)海洋蛋白水解物和分離活性肽物質(zhì)引起了人們的廣泛興趣。向海洋索取食物、獲得生物活性多肽已成為世界各沿海國家海洋開發(fā)的一項重要內(nèi)容。
我國鱈魚年加工量40～50萬噸，在鱈魚食品加工過程中產(chǎn)生的魚皮、魚骨、碎肉等副產(chǎn)物中含有大量的優(yōu)質(zhì)蛋白。目前鱈魚加工產(chǎn)業(yè)主要圍繞生產(chǎn)魚片和魚糜進行，產(chǎn)生的廢棄物如皮、骨、鰭等盡管營養(yǎng)價值相當高，但僅有少量部分被用于生產(chǎn)飼料外，大部分被丟棄，造成環(huán)境污染。因此利用鱈魚排制備活性肽，能變廢為寶，增加附加值。另一方面新型海洋活性肽資源的開發(fā)。天然活性肽在生物體中含量較少，分離成本高，價格昂貴?；瘜W(xué)方法合成的活性肽，副反應(yīng)及副產(chǎn)物較多，限制了其應(yīng)用和發(fā)展。采用有效地酶解手段來釋放、富集或濃縮目標活性肽成為新型海洋活性肽資源開發(fā)的主力軍。值得注意的是鱈魚排來自深海資源，無論是從瘋牛病的角度，還是從民族宗教的角度考慮，都顯示其巨大優(yōu)勢。
國內(nèi)關(guān)于利用蛋白酶水解鱈魚排制取抗氧化肽的研究未見報道。來自鱈魚排的抗氧化肽，安全性高，無毒副作用。利用鱈魚排開發(fā)具有清除自由基、延緩衰老作用的抗氧化肽具有重要的理論依據(jù)和應(yīng)用價值。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種利用鱈魚排制備抗氧化肽的方法，本發(fā)明的制備方法工藝簡單、反應(yīng)溫度低，以鱈魚加工副產(chǎn)物鱈魚排為原料，成本低廉，在避免對環(huán)境污染的同時，加強了對鱈魚排中蛋白質(zhì)資源的綜合利用，制得的抗氧化肽安全性高，無毒副作用，清除自由基能力強，具有很好的保健功效。
本發(fā)明利用鱈魚加工副產(chǎn)物制備抗氧化肽的方法，包括如下的步驟：
1)將鱈魚加工副產(chǎn)物鱈魚排清洗去除殘余內(nèi)臟和魚皮，在100～130℃下高溫高壓蒸煮10～40分鐘后進行勻漿，將獲得的固形物和水按1:1～4加水配制成鱈魚排勻漿液；
2)將鱈魚排勻漿液的ph調(diào)節(jié)到6.0～10.0，然后加入蛋白酶1500～4000u/g，在20～70℃水浴中水解1～8小時得到鱈魚排蛋白水解液；
3)將鱈魚排蛋白水解液于85～100℃水浴滅活蛋白酶5～15分鐘，冷卻至室溫后，在2000～6000r/min轉(zhuǎn)速下離心5～15分鐘，取上清液；用截留分子量≤10000da的超濾膜進行超濾，得到鱈魚排蛋白多肽超濾液；
4)將鱈魚排蛋白多肽超濾液液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥，得到鱈魚排抗氧化肽產(chǎn)品。
其中步驟2)所述的蛋白肽為胰酶。
作為優(yōu)選，所述的步驟1)中是在120℃下高溫高壓蒸煮30分鐘，用勻漿機勻漿，固形物和水按1:4加水配制成鱈魚排勻漿液；
步驟2)中是將鱈魚排勻漿液的ph調(diào)節(jié)到8.18，然后加入蛋白酶2985u/g，在43.74℃水浴中水解5小時，水解在震蕩狀態(tài)下進行，并保持溫度和ph恒定，得到鱈魚排蛋白水解液；
步驟3)中是將鱈魚排蛋白水解液于100℃水浴滅活蛋白酶10分鐘，冷卻至室溫后，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液，用截留分子量為5000da的超濾膜進行超濾，得到鱈魚排多肽超濾液；
步驟4)中是將鱈魚排蛋白多肽超濾液液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥，得到鱈魚排抗氧化肽產(chǎn)品。
本發(fā)明制備的具有清除自由基功能的抗氧化肽分子量較低，極易被人體吸收和利用，活性比較穩(wěn)定，能夠有效地提高免疫力，在保健品領(lǐng)域有著廣闊的市場前景。同現(xiàn)有的抗氧化劑比較，本發(fā)明的原料豐富易得，所用鱈魚排為鱈魚加工的副產(chǎn)物，成本低廉，增加了鱈魚產(chǎn)品的附加值，并且避免了對環(huán)境造成污染；制得的抗氧化肽分子量較低，可快速進入血液循環(huán)被人體吸收利用，活性穩(wěn)定；產(chǎn)品抗氧化效果好，清除自由基能力較強，能有效增強免疫力；抗氧化肽是采用食品級酶在溫和條件下獲得的，安全性高，無毒副作用，為食品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)提供優(yōu)質(zhì)的抗氧化肽。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進行詳細的描述。
實施例1：
a)將鱈魚加工副產(chǎn)物鱈魚排清洗去除殘余內(nèi)臟和魚皮，120℃下高溫高壓蒸煮30分鐘，用勻漿機勻漿，固形物和水按1:4加水配制成鱈魚排勻漿液；
b)將鱈魚排勻漿液的ph調(diào)節(jié)到8.00，然后加入蛋白酶3000u/g，在40℃水浴中水解5小時，水解在震蕩狀態(tài)下進行，并保持溫度和ph恒定，得到鱈魚排蛋白水解液；
c)將鱈魚排蛋白水解液于100℃水浴滅活蛋白酶10分鐘，冷卻至室溫后，在4000r/min轉(zhuǎn)速下離心15分鐘，取上清液，用截留分子量為5000da的超濾膜進行超濾，得到鱈魚排多肽超濾液；
d)將鱈魚排蛋白多肽超濾液液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥，得到鱈魚排抗氧化肽產(chǎn)品。
通過驗證實驗，所制得的鱈魚排蛋白多肽超濾液通過高效液相色譜法進行分子量測定其中多肽分子量為506d，含量可達131.65mg/ml。通過對dpph、氫自由基和超氧陰離子的清除率檢測來評定其抗氧化活性。
1)對dpph·自由基清除率的測定
dpph·是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，在517nm波長處有最大吸收，與抗氧化劑反應(yīng)時，其孤對電子與抗氧化劑中的電子配對使其乙醇溶液由紫色褪色成黃色，褪色程度反映出抗氧化劑的活性強弱。向不同試管加入等體積dpph溶劑、不同濃度的鱈魚排蛋白肽，混勻后25℃反應(yīng)30min，在517nm下測定其od值，平行做3次取平均值。結(jié)果顯示當鱈魚排蛋白肽濃度達到20mg/ml時，其dpph的清除率可達90.3％，其對dpph·清除率的ic50(清除率達50％時的樣品濃度)與天然抗氧化物質(zhì)ve的6mg/ml無顯著差異，顯著高于文獻報道的鱈魚皮膠原蛋白肽在30mg/ml時，清除率為73.84％和牛骨膠原蛋白肽的80g/l時的27.03％，說明鱈魚排蛋白肽有較強的清除dpph的能力。
2)對oh自由基清除率的測定
oh的檢測在自由基損傷研究中有著重要的意義，常作為判斷待測物是否具有抗氧化性的指標。檢測試劑加入鱈魚排蛋白肽后將溶液混合均勻，37℃水浴保溫30min，在510nm下測定其od值，平行做3次取平均值。結(jié)果顯示鱈魚排蛋白肽的濃度達到20mg/ml時，其羥自由基清除率達到80.6％。較好于文獻報道的鱈魚皮膠原蛋白肽30mg/ml時85.76％和牛骨膠原蛋白肽80g/l的99.55％，由此可見，鱈魚皮膠原蛋白肽具有搶的羥自由基的清除能力。
3)對o2-·自由基清除率的測定
鄰苯三酚在弱堿條件下發(fā)生自氧化反應(yīng)產(chǎn)生o2-·，o2-·清除劑能使鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物在325nm處吸收峰受到抑制。檢測試劑加鱈魚排蛋白肽后將溶液混合均勻，于325nm下測定其od值，平行做3次取平均值。結(jié)果顯示，隨著鱈魚排蛋白肽濃度的增加，其超氧陰離子的清除率也隨之增加，當鱈魚排蛋白肽達到20mg/ml時，其超氧陰離子清除率為65.4％。較好于鱈魚皮膠原蛋白肽30mg/ml時，清除率64.09％；而牛骨膠原蛋白肽在80g/l的濃度下，清除率為63.86％，說明鱈魚排蛋白肽對o2-·的清除能力相對較強。
由此可見，鱈魚排蛋白肽對于三種自由基的清除能力較強。利用鱈魚排進行抗氧化肽的研發(fā)并將其應(yīng)用于功能性食品、化妝品及生物制藥等方面具有很好的潛力。
實施例2：
將鱈魚加工副產(chǎn)物鱈魚排清洗去除殘余內(nèi)臟和魚皮，100℃下高溫高壓蒸煮20分鐘，用勻漿機勻漿，固形物和水按1:4加水配制成鱈魚排勻漿液；
將鱈魚排勻漿液的ph調(diào)節(jié)到9.0，然后加入蛋白酶4000u/g，在50℃水浴中水解3小時，水解在震蕩狀態(tài)下進行，并保持溫度和ph恒定，得到鱈魚排蛋白水解液；
將鱈魚排蛋白水解液于85℃水浴滅活蛋白酶15分鐘，冷卻至室溫后，在6000r/min轉(zhuǎn)速下離心10分鐘，取上清液，用截留分子量為5000da的超濾膜進行超濾，得到鱈魚排多肽超濾液；
將鱈魚排蛋白多肽超濾液液進行減壓蒸發(fā)濃縮和真空冷凍干燥，得到鱈魚排抗氧化肽產(chǎn)品。
通過驗證實驗，所制得的鱈魚排蛋白多肽超濾液中多肽分子量為521d，含量可達126.94mg/ml，d當鱈魚排蛋白肽濃度為20mg/ml時，其dpph清除率為88.5％、羥自由基的抑制率為79.6％、超氧陰離子的抑制率為61.2％。