專利名稱：：針對降鈣素基因相關(guān)肽的拮抗劑抗體及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗CGRP拮抗劑抗體用于預(yù)防、改善或治療血管運(yùn)動癥狀如CGRP相關(guān)頭痛(例如偏頭痛)和熱潮紅的用途。
背景技術(shù)：
：CGRP(降鈣素基因相關(guān)肽)是37個氨基酸的神經(jīng)肽，其屬于肽家族，包括降鈣素、腎上腺髓質(zhì)素和淀粉不溶素。在人中，存在兩種形式的CGRP(a-CGRP禾卩(3-CGRP)，它們具有類似的活性。它們有三個氨基酸不同，并顯示不同的分布。至少兩種CGRP受體亞型也可解釋有差異的活性。CGRP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)遞質(zhì)，并已顯示是外周中有效的血管擴(kuò)張藥，含CGRP的神經(jīng)元在外周與血管緊密結(jié)合。CGRP介導(dǎo)的血管擴(kuò)張也與神經(jīng)原性炎癥相關(guān)(其作為導(dǎo)致原生質(zhì)外滲和微脈管系統(tǒng)血管舒張的事件級聯(lián)的一部分)，其存在于偏頭痛中。CGRP因其與血管運(yùn)動癥狀的可能聯(lián)系而被注意(Wyonetal.Scand.J.Urol.Nephrol.35:92-96(2001);Wyonetal.Menopause7(1):25-30(2000))。血管運(yùn)動癥狀(VMS)如熱潮紅和寢汗是與絕經(jīng)相關(guān)的最常見癥狀，發(fā)生在所有在天然或手術(shù)誘導(dǎo)后絕經(jīng)女性的60%到80%中。熱潮紅很可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)對減退的性類固醇的適應(yīng)性應(yīng)答(FreedmanAm.J.HumanBiol.13:453-464(2001))。迄今為止，對于潮紅的最有效的療法是基于激素的治療，所述激素包括雌激素和/或一些黃體酮。激素治療能夠有效緩和潮紅，但是不適合所有女性。觀察到的心理和情緒癥狀(如神經(jīng)質(zhì)、疲勞、易激惹、失眠、抑郁、失憶、頭痛、焦慮、神經(jīng)質(zhì)或不能集中)被認(rèn)為是由熱潮紅和寢汗后的睡眠缺乏引起的(Krameretal.,In:Murphyetal.,3.sup.rdInt'lSymposiumonRecentAdvancesinUrologicalCancerDiagnosisandTreatment-Proceedings,Paris,France:SCI:3-7(1992》。男性類固醇激素(雄激素)減少后也經(jīng)歷熱潮紅。在年齡相關(guān)的雄激素減退的情況下(Katovich,etal.,ProceedingsoftheSocietyforExperimentalBiology&Medicine,1990,193(2):129-35)以及與前列腺癌治療相關(guān)的激素喪失的極端情況下(Berendsen,etal.,EuropeanJournalofPharmacology,2001:419(1):47-54)是這樣的。三分之一的這類患者會經(jīng)歷足夠嚴(yán)重到引起顯著不適和不便的長期和頻繁的癥狀。CGRP是與其它血管運(yùn)動癥狀的病理學(xué)相關(guān)的有效的血管擴(kuò)張劑，所述癥狀例如所有形式的血管性頭痛，包括偏頭痛(有先兆或無先兆)和叢集性頭痛。Durham,N.Engl.J.Med.350:1073-1075,2004?；颊咂^痛期間頸外靜脈中的CGRP水平升高。Goadsbyetal.，Ann.Neurol.28:183-7,1990。靜脈施用人a-CGRP在患有無先兆偏頭痛的患者中誘導(dǎo)頭痛和偏頭痛，這提示CGRP在偏頭痛中具有原因作用。Lassenetal.,Cephalalgia22:54-61,2002.CGRP與偏頭痛的可能相關(guān)性是開發(fā)和測試大量下述化合物的基礎(chǔ)，所述化合物抑制CGRP的釋放(例如叔馬曲坦)、拮抗CGRP受體(例如二肽衍生物BIBN4096BS(BoerhringerIngelheim);CGRP(8-37))或與一種或多種受體相關(guān)蛋白質(zhì)相互作用，所述受體相關(guān)蛋白質(zhì)例如受體活性膜蛋白(RAMP)或受體組件蛋白質(zhì)(RCP)均影響CGRP對其受體的結(jié)合。Brain,S.etal.,TrendsinPharmacologicalSciences23:51-53,2002。A-2腎上腺素受體亞型和腺苷Al受體也調(diào)控(抑制)CGRP釋放和三叉神經(jīng)活化(Goadsbyetal"Brain125:1392-401，2002)。針對GR79236(metrafadil)腺苷Al的受體(其已經(jīng)顯示在人中抑制神經(jīng)原性血管舒張和三叉神經(jīng)傷害感受)也可以具有抗偏頭痛的活性(Arulmanietal.，Cephalalgia25:1082-1090,2005;Gi迅netal.,Cephalalgia23:287-292,2003)。使得該理論混淆的是下述觀察用僅抑制神經(jīng)原性炎癥(例如速激肽NK1受體拮抗劑)或三叉神經(jīng)活化(例如5HTm受體激動劑)的化合物治療顯示作為偏頭痛的急性治療相對無效，引起一些研究人員質(zhì)疑是否抑制CGRP釋放是有效的抗偏頭痛治療的主要作用機(jī)制。Arulmanietal.，Eur.J.Pharmacol.500:315-330，2004。偏頭痛是復(fù)雜的、常見的神經(jīng)原性病癥，其特征在于嚴(yán)重的、偶發(fā)的頭痛和相關(guān)的特征，所述相關(guān)特征可包括惡心，嘔吐，對光、聲音或運(yùn)動敏感。在一些患者中，頭痛之前有前兆或伴隨前兆。頭痛可以是嚴(yán)重的，并在某些患者中也可以是單側(cè)的。偏頭痛發(fā)作對日常生活是破壞性的。在美國和西歐，偏頭痛患者的總體患病率在一般人群中占11%(6%男性；15-18%女性)。另外，個體中發(fā)作的中位頻率是1.5次/月。盡管能夠獲得大量治療來緩和或減少癥狀，但是對每個月具有多于3-4次偏頭痛發(fā)作的患者來說預(yù)防療法是推薦的。Goadsbyetal.NewEngl.J.Med.346(4):257-275,2002。用于治療偏頭痛的藥理學(xué)干涉的變化和患者間應(yīng)答的多樣性是該病癥不同特性的證明。因此，顯示5-羥色胺能以及腎上腺素能、去甲腎上腺素能、和多巴胺能活性的這類相對非選擇性的藥物，如麥角生物堿(例如麥角胺、二氫麥角胺、美西麥角)，已經(jīng)用于治療偏頭痛超過八十年。其它治療包括阿片制劑(例如羥考酮)和^-腎上腺素能拮抗劑(例如普萘洛爾)。一些患者(通常是具有更溫和癥狀的患者)能夠用非處方藥物控制它們的癥狀，所述非處方藥例如一種或多種非甾體抗炎劑(NSAIDs)，如阿司匹林、撲熱息痛和咖啡因(例如Excedrin⑧Migraine)的組合。更近期地，已經(jīng)用托吡酯治療一些偏頭痛患者，托吡酯是封閉電壓依賴性鈉通道和某些谷氨酸受體(AMPA紅藻氨酸鹽)、增強(qiáng)GABA-A受體活性和封閉碳酸酐酶的抗驚厥劑。相對而言更近期地，5-羥色胺5HT-1B/lD和成5HT-la受體激動劑(如叔馬曲坦)在一些患者中的成功已經(jīng)引起研究人員提出了該病癥的5-羥色胺能病因?qū)W。不幸的是，盡管一些患者對該治療反映良好，但是其它的患者對其作用相對有抵抗力。假定氨基酸能腦干細(xì)胞核中的離子通道功能障礙解釋了該疾病，然而偏頭痛的精確病理生理學(xué)仍未被充分理解。一種形式的偏頭痛(.家族性偏癱偏頭痛)已經(jīng)顯示與電壓門控P/Q-型鈣通道的cd亞基中的錯義突變相關(guān)，人們認(rèn)為很可能也在其它患者群體中發(fā)現(xiàn)其它的離子通道突變。盡管血管擴(kuò)張與偏頭痛相關(guān)并加重疼痛癥狀，但是這類神經(jīng)血管事件目前被認(rèn)為是該病癥的結(jié)果而不是起因?？傊{(diào)節(jié)感覺輸入的腦干途徑的功能障礙被認(rèn)為是偏頭痛的統(tǒng)一特征。Goadsby,P丄etal.,NewEngl.J.Med.346(4):257-275,2002。在本申請中引用了多種出版物(包括專利和專利申請)。這些出版物的公開內(nèi)容通過弓(用整體并入本文。
發(fā)明內(nèi)容本文公開的發(fā)明涉及抗CGRP拮抗劑抗體和施用抗CGRP拮抗劑抗體用于治療或預(yù)防血管運(yùn)動癥狀的方法，所述血管運(yùn)動癥狀例如頭痛，如有先兆或無先兆的偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛神經(jīng)痛、久頭痛、緊張性頭痛和由其它醫(yī)療條件(如由腫瘤引起的感染或顱內(nèi)壓升高)引起的頭痛。其它血管運(yùn)動癥狀包括熱潮紅。一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中治療或預(yù)防至少一種血管運(yùn)動癥狀的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中治療或預(yù)防頭痛(例如偏頭痛和叢集性頭痛)的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。另一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少頭痛(例如偏頭痛和叢集性頭痛)發(fā)作或延遲頭痛發(fā)生或發(fā)展的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少頭痛(例如偏頭痛和叢集性頭痛)發(fā)作或延遲頭痛發(fā)生或發(fā)展的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體與至少一種適用于治療頭痛的其它試劑的組合。這類其它試劑包括5-HTl-樣激動劑(作用于其它5-HT1位點(diǎn)上的激動劑)和非甾體類抗炎藥(NSAIDs)?？膳c抗CGRP抗體組合使用的5-HT1激動劑的例子包括已知為曲坦類(triptans)的一類化合物，如叔馬曲坦、佐米曲坦、那拉曲坦、利扎曲坦、伊立曲坦、阿莫曲坦和夫羅曲坦。麥角生物堿和相關(guān)化合物也顯示具有5-HT激動劑活性并被用于治療頭痛如偏頭痛。這些化合物包括麥角胺、馬來酸麥角新堿和甲磺酰麥角堿(例如二氫麥角柯寧堿、雙氫麥角汀、雙氫麥角隱亭和雙氫麥角胺甲磺酸鹽(DHE45))?？梢耘c抗CGRP抗體組合使用的NSAIDs的例子包括萘普生、氟比洛芬、酮洛芬、奧沙普秦、依托度酸、吲哚美辛、酮咯酸、萘丁美酮、邁菲那密酸(mefanamicacid)和吡羅昔康。其它的NSAIDs包括環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑。該組成員包括塞來考昔；羅非考昔；美洛昔康；JTE-522;L-745,337;NS398及其可藥用鹽。另一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少熱潮紅的發(fā)作或延遲其發(fā)生或發(fā)展的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。另一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少熱潮紅的發(fā)作或延遲其發(fā)生或發(fā)展的方法，所述包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體與至少一種適用于治療熱潮紅的試劑的組合。這類其它試劑包括，但不限于基于激素(包括雌激素和/或黃體酮)的治療。在一個實(shí)施方案中，在上述任何方法中使用的抗CGRP拮抗劑抗體是本文所述的任何抗體。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體能識別人CGRP。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體與人a-CGRP禾口/5-CGRP均能結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體能與人和大鼠CGRP結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合具有CGRP的氨基酸25-37的C末端片段。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合CGRP的氨基酸25-37中的C末端表位。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體是人源化的。在一些實(shí)施方案中，抗體是人的。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體是抗體Gl(如本文所述)。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體包含表6所示抗體Gl或Gl變體的一個或多個CDR(例如一個、兩個、三個、四個、五個或在一些實(shí)施方案中包含所有六個CDR)。還在其它實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體包含圖5所示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:l)和圖5所示輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。在一些實(shí)施方案中，抗體包含下述經(jīng)修飾的恒定區(qū)，所述恒定區(qū)例如是免疫惰性的(包括是部分免疫惰性的，其例如不引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解、不刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)、活化小膠質(zhì)細(xì)胞)，或具有降低的一種或多種這些活性。在一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)被修飾，這如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624;PCT申請No.PCT/GB99/01441;和/或UK專利申請No.9809951.8中所述。在其它一些實(shí)施方案中，抗體包含人重鏈IgG2恒定區(qū)，所述恒定區(qū)包含以下突變A330P331至ljS330S331(參考野生型IgG2序列的氨基酸排序)Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624。在一些實(shí)施方案中，抗體的重鏈恒定區(qū)是具有任何以下突變的人重鏈IgGl:1)A327A330P331到G327S330S331;2)E233L234L235G236到P233V234A235，G236被刪除；3)E233L234L235到P233V234A235;4)E233L234L235G236A327A330P331至UP233V234A235G327S330S331，G236被冊U除；5)E233L234L235A327A330P331到P233V234A235G327S330S331和6)N297到A297或除N以外的任何其它氨基酸。在一些實(shí)施方案中，抗體的重鏈恒定區(qū)為帶有任何以下突變的人重鏈IgG4:E233F234L235G236至UP233V234A235，G236被刪除；E233F234L235到P233V234A235;和S228L235到P228E235。還在其它一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)N連接的糖基化不被糖基化(aglycosylated)。在一些實(shí)施方案中，通過突變寡糖附著殘基(如Asn297)和/或側(cè)翼殘基(其為恒定區(qū)中N-糖基化識別序列的一部分)，針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化。在一些實(shí)施方案中，針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化?？赏ㄟ^酶或通過在糖基化缺陷宿主細(xì)胞中表達(dá)使得針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化?？笴GRP拮抗劑抗體對CGRP(例如在合適溫度如25或37。C下通過表面等離振子共振測量的人仏CGRP)的奈合力(Kd)可以是約0.02到約200nM。在一些實(shí)施方案中，親合力為下述任何約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM或約2pM。在一些實(shí)施方案中，親合力少于下述任何約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM?？笴GRP拮抗劑抗體可以在頭痛之前、期間和/或之后被施用。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體在頭痛(例如偏頭痛和叢集性頭痛)發(fā)作之前被施用?？笴GRP拮抗劑抗體的施用可以通過本領(lǐng)域已知的任何手段口服、靜脈內(nèi)、皮下、動脈內(nèi)、肌內(nèi)、賁門內(nèi)、椎管內(nèi)、胸內(nèi)、腹膜內(nèi)、心室內(nèi)、舌下、經(jīng)皮和/或經(jīng)過吸入。施用可以是全身的(例如靜脈內(nèi))或局部的。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體可以與另一試劑(如用于治療頭痛的另一試劑)結(jié)合施用。另一方面，本發(fā)明提供了抗CGRP拮抗劑抗體用于制造本文所述任何方法中使用(例如用于治療或預(yù)防頭痛)的藥物的用途。另一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)防或治療頭痛(例如偏頭痛和叢集性頭痛)的藥物組合物，其包含有效量的抗CGRP拮抗劑抗體，所述抗體與一種或多種可藥用賦形劑組合。另一方面，本發(fā)明提供了用于本文所述任何方法中的試劑盒。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含容器、包含本文所述抗CGRP拮抗劑抗體的組合物(其與可藥用媒介組合)和在本文所述任何方法中使用該組合物的說明書。本發(fā)明還提供了抗CGRP拮抗劑抗體和來自表6所示的抗體Gl或其變體的多肽。因此，一方面，本發(fā)明是由ATCC編號Nos.PTA-6866和PTA-6867的表達(dá)載體生產(chǎn)的抗體Gl(可交換地稱作"G1")。例如，在一個實(shí)施方案中是包含重鏈的抗體，所述重鏈由ATCC編號為No.PTA-6867的表達(dá)載體生產(chǎn)。在再一個實(shí)施方案中為包含輕鏈的抗體，所述抗體由ATCC編號為No.PTA-6866的表達(dá)載體生產(chǎn)。Gl的重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列在圖5中顯示?？贵wGl的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)部分(包括Chothia和KabatCDRs)也顯示在圖5中。應(yīng)理解涉及Gl任何局部或整體區(qū)域包括由具有ATCC編號Nos.PTA-6866和PTA-6867的表達(dá)載體生產(chǎn)的序列和/或圖5中所示的序列。本發(fā)明還提供了具有表6所示氨基酸序列的G1抗體變體。一方面，本發(fā)明是包含VH結(jié)構(gòu)域的抗體，所述VH在氨基酸序列上與SEQIDNO:1至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。另一方面，本發(fā)明是包含VL的抗體，所述VL在氨基酸序列上與SEQIDNO:2至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%相同。另一方面，本發(fā)明是包含表6所示抗體Gl或其變體的片段或區(qū)域的抗體。在一個實(shí)施方案中，片段為抗體Gl的輕鏈。在另一實(shí)施方案中，片段為抗體G1的重鏈。還在另一實(shí)施方案中，片段含有來自抗體G1輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。還在另一實(shí)施方案中，片段含有來自圖5所示輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。還在另一實(shí)施方案中，片段含有來自抗體Gl輕鏈和/或重鏈的一個或多個CDR。另一方面，本發(fā)明提供了多肽(其可以是或不是抗體)，所述多肽含有SEQIDNO:5中公開的VHCDR3，或與SEQIDNO:5因1、2、3、4或5個氨基酸取代而不同的序列。在特別的實(shí)施方案中，這類氨基酸取代是保守的氨基酸取代。另一方面，本發(fā)明提供了多肽(其可以是或不是抗體)，所述多肽含有SEQIDNO:8中公開的VLCDR3，或與SEQIDNO:8因1、2、3、4或5個氨基酸取代而不同的序列。在特別的實(shí)施方案中，這類氨基酸取代是保守的氨基酸取代。另一方面，本發(fā)明提供了多肽(其可以是或不是抗體)，所述多肽包含以下任一種或多種a)來自表6所示抗體Gl或其變體的一個或多個(一個、兩個、三個、四個、五個或六個)CDR;b)來自表6所示抗體Gl重鏈的CDRH3的CDR;和/或c)來自抗體Gl輕鏈的CDRL3的CDR。在一些實(shí)施方案中，CDR為圖5所示的CDR。在一些實(shí)施方案中，來自表6所示抗體Gl或其變體的一個或多個CDR與Gl或其變體的至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或至少六個CDR至少約85%、至少約86%、至少約87%、至少約88%、至少約89%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%相同。在一些實(shí)施方案中，CDR為KabatCDR。在其它實(shí)施方案中，CDR為ChothiaCDR。在其它實(shí)施方案中，CDR為Kabat和ChothiaCDR的組合(也稱作"組合的CDR"或"擴(kuò)展的CDR")。換言之，對于含有多于一個CDR的任何給定的實(shí)施方案而言，CDR可以是Kabat、Chothia禾口/或組合的中任一。在一些實(shí)施方案中，多肽(例如抗體)包含氨基酸序列KASKXaaVXaaTYVS，其中位置5上的Xaa為R、W、G、L或N;且其中位置7的Xaa為T、A、D、G、R、S、W或V。在一些實(shí)施方案中，氨基酸序列KASKXaaVXaaTYVS是抗體輕鏈的CDR1。在一些實(shí)施方案中，多肽(例如抗體)包含氨基酸序列XaaXaaSNRYXaa，其中位置1上的Xaa為G或A;其中位置2的Xaa為A或H;且其中位置7的Xaa為L、T、I或S。在一些實(shí)施方案中，氨基酸序列XaaXaaSNRYXaa是抗體輕鏈的CDR2。在一些實(shí)施方案中，多肽(例如抗體)包含氨基酸序列EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG，其中位置5的Xaa為E、R、K、Q或N;其中位置8的Xaa為A、G、N、E、H、S、L、R、C、F、Y、V、D或P;其中位置9的Xaa為S、G、T、Y、C、E、L、A、P、I、N、R、V、D或M;其中位置12的Xaa為H或F;其中位置15的Xaa為E或D。在一些實(shí)施方案中，氨基酸序列EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG是抗體重鏈的CDR2。在一些實(shí)施方案中，多肽(例如抗體)包含SEQIDN0:1的氨基酸序列，其中SEQIDN0:1位置99的氨基酸殘基為L或被A、N、S、T、V或R取代；且其中SEQIDN0:1位置100的氨基酸殘基為A或被L、R、S、V、Y、C、G、T、K或P取代。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人抗體。在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體是人源化的抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是單克隆的。在一些實(shí)施方案中，抗體(或多肽)被分離。在一些實(shí)施方案中，抗體(或多肽)是基本純的?？贵w的重鏈恒定區(qū)可以來自任何類型的恒定區(qū)(例如IgG、IgM、IgD、IgA和IgE)和任何同種型(如IgGl、IgG2、IgG3禾口IgG4)。在一些實(shí)施方案中，抗體包含本文所述的經(jīng)修飾的恒定區(qū)。另一方面，本發(fā)明提供了一種多核苷酸(其可以是被分離的)，所述多核苷酸包含編碼表6所示抗體Gl或其變體的片段或區(qū)域的多核苷酸。在一個實(shí)施方案中，片段為抗體Gl的輕鏈。在其它實(shí)施方案中，片段為抗體Gl的重鏈。還在另一實(shí)施方案中，片段含有來自抗體Gl輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)。還在另一實(shí)施方案中，片段含有來自抗體Gl輕鏈和/或重鏈的一個或多個(即一個、兩個、三個、四個、五個或六個)互補(bǔ)性決定區(qū)(CDRs)。另一方面，本發(fā)明是一種多核苷酸(其可以是被分離的)，所述多核苷酸含有編碼表6所示抗體Gl或其變體的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包含SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示的多核苷酸之一或二者。另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述任何抗體(包括抗體片段)或多肽的多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了包含本文公開的任何多核苷酸的載體(包括表達(dá)載體和克隆載體)和宿主細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，載體為ATCCNo.PTA-6867的pDb.CGRP.hFcGI。在其它實(shí)施方案中，載體為ATCCNo.PTA-6866的pEb.CGRP.hKGI。另一方面，本發(fā)明是包含多核苷酸的宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本文公開的任何抗體。另一方面，本發(fā)明是被本文所述任何抗體或多肽結(jié)合的CGRP復(fù)合物。在一些實(shí)施方案中，抗體是表6所示的抗體G1或其變體。另一方面，本發(fā)明是藥物組合物，其包含有效量的本文所述任何多肽(包括抗體，如包含一個或多個抗體G1的CDR的抗體)或多核苷酸，和可藥用的賦形劑。另一方面，本發(fā)明是產(chǎn)生抗體Gl的方法，包括在允許生產(chǎn)抗體G1的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞或其后代，其中所述宿主細(xì)胞包含編碼抗體Gl的表達(dá)載體；和在一些實(shí)施方案中純化抗體Gl。在一些實(shí)施方案中，表達(dá)載體包含SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示多核苷酸序列之一或二者。另一方面，本發(fā)明提供了通過在合適的細(xì)胞中表達(dá)一種或多種多核苷酸來生產(chǎn)本文所述任何抗體或多肽(通常隨后回收和/或分離感興趣的抗體或多肽)的方法，所述多核苷酸編碼抗體(其可以被單獨(dú)地表達(dá)為單個輕鏈或重鏈，或從一個載體表達(dá)輕鏈和重鏈二者)或多肽?？笴GRP拮抗劑抗體和多肽和編碼本發(fā)明抗體和多肽的多核苷酸可以用于治療、預(yù)防、改善、控制或減少CGRP異常功能相關(guān)疾病如頭痛(例如偏頭痛、叢集性頭痛、久頭痛和緊張性頭痛)和其它病癥(其可通過拮抗CGRP活性被治療或預(yù)防)的發(fā)作。另一方面，本發(fā)明提供了包含本文所述任一種或多種組合物的試劑盒和組合物。這些試劑盒(其通常被適當(dāng)?shù)匕b并與合適的說明書一起提供)適用于本文所述的任何方法。附圖概述圖l是顯示12種鼠抗體對不同丙氨酸取代的人o;-CGRP片段的親合力的表格。在25匸，下使用Biacore，通過將Fab流過芯片上的CGRP測量親合力?？騼?nèi)數(shù)值代表丙氨酸突變體相對于親本片段25-37(斜體)的親合力喪失，來自19-37親本的K35A除外。"a'表示19-37和25-37片段的親和力是在不同感受芯片上兩個獨(dú)立測量的平均值土標(biāo)準(zhǔn)偏差。"b"表示由于二相解離速率(offrate)，這些相互作用與單一雙分子相互作用模型有所偏差，從而使用構(gòu)象改變模型測定它們的親和力?；覙?biāo)度鍵白色(1.0)指示親本親和力；淺灰(小于0.5')指示比親本更高的親和力；深灰(多于2)指示比親本更低的親和力；黑色指示未檢測到結(jié)合。圖2A和2B顯示了施用CGRP8-37(400nmol/kg)、抗體4901(25mg/kg)和抗體7D11(25mg/kg)對皮膚血流量的作用，這作為電脈沖刺激30秒后的血細(xì)胞通量來測量。在電脈沖刺激之前3-5分鐘，靜脈內(nèi)(iv)施用CGRP8-37。電脈沖刺激前72小時，腹膜內(nèi)(IP)施用抗體。圖中每個點(diǎn)表示指定條件下處理的一只大鼠的AUC。圖中每條線表示在指定條件下處理的大鼠的平均AUC。AUC(曲線下面積)等于A通量xA時間。"A通量"表示電脈沖刺激后通量單位的變化；"A時間"表示血細(xì)胞通量水平恢復(fù)為電脈沖刺激之前水平所需時間。圖3顯示了施用不同劑量的抗體4901(25mg/kg,5mg/kg,2.5mg/kg或1mg/kg)對皮膚血流量的作用，這作為電脈沖剌激30秒后的血細(xì)胞通量來測量。電脈沖刺激之前24小時靜脈內(nèi)(IV)施用抗體。圖中每點(diǎn)表示在指定條件下處理的一只大鼠的AUC。圖中線條表示在指定條件下處理的大鼠的平均AUC。圖4A和4B顯示了施用抗體4901(1mg/kgor10mg/kg,Lv.)、抗體7E9(10mg/kg,i.v.)和抗體8B6(10mg/kg，i.v.)對皮膚血流的作用，這作為電脈沖剌激30秒后的血細(xì)胞通量來測量?？贵w被靜脈內(nèi)(i.v.)施用，然后在抗體施用后30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘進(jìn)行電脈沖刺激。Y軸表示與未施用抗體時(時間0)的AUC水平相比的AUC百分比。X軸表示施用抗體和電脈沖刺激之間的時間(分鐘)。與時間0相比，'，'表示P<0.05，"**"表示P<0.01。使用單向ANOVA用Dunnett's多重比較檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。圖5顯示了抗體Gl的重鏈可變區(qū)(SEQIDNO:l)和輕鏈可變區(qū)(SEQIDNO:2)的氨基酸序列。KabatCDR為黑體，ChothiaCDR加下劃線。重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基被連續(xù)編號。圖6顯示了使用Biacore通過肽競爭對抗體Gl的表位作圖。N生物素化的人a-CGRP被捕獲在SA感受芯片上。沒有競爭肽時或與10/^M競爭肽孵育1小時后，將GlFab(50nM)倒在芯片上。測量芯片上GlFab對人仏CGRP的結(jié)合。Y軸表示與不存在競爭肽時相比，競爭肽的存在封閉的結(jié)合百分比。圖7顯示了使用抗體Gl(1mg/kg或10mg/kg，靜脈內(nèi))或運(yùn)載體(PBS，0.01%Tween20)對皮膚血流的作用，這作為電脈沖刺激30秒后的血細(xì)胞通量來測量。抗體Gl或運(yùn)載體被靜脈內(nèi)(i.v.)施用，然后在抗體施用后30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘進(jìn)行神經(jīng)電脈沖剌激。Y軸表示與未施用抗體或運(yùn)載體時(時間0)的AUC水平(定義為100%)相比的AUC百分比。X軸表示施用抗體和電脈沖刺激之間的時間(分鐘)。與運(yùn)載體相比，"*"表示P<0.05，"**"表示P<0.01。施用雙向ANOVA和Bonferroni后期檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。圖8A顯示了施用抗體Gl(1mg/kg,3mg/kg或10mg/kg，靜脈內(nèi))或運(yùn)載體(PBS，0.01%Tween20)對皮膚血流的作用，這作為給藥后24小時電脈沖剌激30秒后的血細(xì)胞通量來測量?？贵wGl或運(yùn)載體在神經(jīng)電脈沖剌激前24小時被靜脈內(nèi)(i.v.)施用。Y軸表示曲線下的總面積(血細(xì)胞通量變化乘以刺激到通量恢復(fù)基線的時間差，AUC)。X軸表示抗體Gl的不同劑量。與運(yùn)載體相比，""表示P〈0.05，"^"表示P〈0.01。施用單向ANOVA和Dunn's多重比較檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。圖8B顯示了施用抗體Gl(0.3mg/kg,1mg/kg,3mg/kg或10mg/kg，靜脈內(nèi))或運(yùn)載體(PBS,0.01。/。Tween20)對皮膚血流的作用，這作為給藥后7天電脈沖刺激30秒后的血細(xì)胞通量來測量?？贵wGl或運(yùn)載體在神經(jīng)電脈沖刺激前7天被靜脈內(nèi)(i.v.)施用。Y軸表示總AUC。X軸表示抗體Gl的不同劑量。與運(yùn)載體相比，"w表示P〈0.01，"""表示P〈0.001。施用單向ANOVA和Dunn's多重比較檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。圖8C是對來自圖8A和8B的數(shù)據(jù)的曲線擬合分析?？贵wGl或運(yùn)載體在神經(jīng)電脈沖刺激前24小時或7天靜脈(i.v.)施用。Y軸表示總AUC。X軸表示不同的G1劑量，以"mg/kg"為單位，用對數(shù)標(biāo)度以測定EC50。圖9顯示了電場刺激后抗體mu7E9(10mg/kg)、BIBN4096BS或運(yùn)載體(PBS，0.01%Tween20)對腦膜中動脈直徑改變的作用。在建立對電刺激的基線應(yīng)答后0分鐘的時間點(diǎn)靜脈(i.v.)施用抗體mu7E9、BIBN4096BS或運(yùn)載體。Y軸表示電場刺激后腦膜中動脈直徑的改變。靜止直徑對應(yīng)0%。X軸表示電脈沖刺激的時間(分鐘)。與運(yùn)載體相比，"*"指示P<0.05，"**"指示P<0.01。使用單向ANOVA和Dunett's多重比較檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)。圖10顯示了電場刺激后不同劑量的抗體Gl(lmg/kg，3mg/kg或10mg/kg，靜脈)或運(yùn)載體(PBS,0.01%Tween20)對腦膜中動脈直徑改變的作用。在電場剌激前7天靜脈(i.v.)施用抗體Gl或運(yùn)載體。Y軸表示腦膜中動脈直徑的改變。靜止直徑對應(yīng)0%。X軸表示刺激電壓。與運(yùn)載體相比，""指示P〈0.05，"""指示P〈0.01，"""指示P<0.001。使用雙向ANOVA和Bonferroniposttests分析數(shù)據(jù)。圖11A顯示了在嗎啡上癮的大鼠中皮下注射納洛酮(lmg/kg)之前24小時靜脈(i.v.)施用抗體mu4901(10mg/kg)或運(yùn)載體(PBS,0.01%Tween20)對所述皮下注射誘導(dǎo)的體核溫度降低的作用。Y軸表示與基線的溫度差異。X軸表示從注射納洛酮的點(diǎn)開始測量的時間。圖11B顯示了在嗎啡上癮的大鼠中皮下注射納洛酮(lmg/kg)之前24小時靜脈(i.v.)施用抗體mu4901(10mg/kg)或運(yùn)載體(PBS,0.01%Tween20)對所述皮下注射誘導(dǎo)的尾表溫度提高的作用。Y軸表示與基線的溫度差異。X軸表示從注射納洛酮的點(diǎn)開始測量的時間。發(fā)明詳述本文公開的本發(fā)明提供了通過對個體施用治療有效量的抗CGRP拮抗劑抗體，用于在個體中治療和/或預(yù)防血管運(yùn)動癥狀如頭痛(例如偏頭痛、叢集性頭痛、久頭痛和緊張性頭痛)或熱潮紅的方法。本文公開的本發(fā)明還提供了來自表6所示Gl或其變體的抗CGRP拮抗劑抗體和多肽。本發(fā)明還提供了這些抗體和多肽的制造和使用方法。一般技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實(shí)踐將使用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，其在本領(lǐng)域技術(shù)的范圍內(nèi)。這類技術(shù)已在文獻(xiàn)中被充分解釋，所述文獻(xiàn)例如MolecularCloning:ALaboratoryManual,secondedition(Sambrooketal.,1989)ColdSpringHarborPress;OligonucleotideSynthesis(MJ.Gait,ed.,1984);MethodsinMolecularBiology,HumanaPress;CellBiology:ALaboratoryNotebook(J.E.Cellis,ed.,1998)AcademicPress;AnimalCellCulture(R.I.Freshney,ed.,1987);IntroductiontoCellandTissueCulture(J.P.MatherandP.E.Roberts,1998)PlenumPress;CellandTissueCulture:LaboratoryProcedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,andD.G.Newell,eds.,1993-1998)J.WileyandSons;MethodsinEnzymoiogy(AcademicPress,Inc.);HandbookofExperimentalImmunology(D.M.WeirandCC.Blackwell,eds.);GeneTransferVectorsforMammalianCells(J.M.MillerandM.P.Calos,eds.，1987》CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubeletal.,eds.，1987》PCR:ThePolymeraseChainReaction,(Mullisetal.,eds.,1994);CurrentProtocolsinImmunology(J.E.Coliganetal.,eds.,1991);ShortProtocolsinMolecularBiology(WileyandSons,1999);lmmunobiology(CA.JanewayandP.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:apracticalapproach(D.Catty.,ed"IRLPress,1988-1989);Monoclonalantibodies:apracticalapproach(P.ShepherdandCDean,eds.,OxfordUniversityPress,2000);Usingantibodies:alaboratorymanual(E.HarlowandD.Lane(ColdSpringHarborLaboratoryPress,1999);TheAntibodies(M.ZanettiandJ.D.Capra,eds.,HarwoodAcademicPublishers,1995)。定義"抗體"是能夠通過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一個抗原識別位點(diǎn)特異結(jié)合靶標(biāo)(如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)、多肽等)的免疫球蛋白分子。本文使用的該術(shù)語不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且包括其片段(如Fab,Fab',F(ab')2,Fv)、單鏈(ScFv)、突變體、包含抗體部分的融合蛋白(如結(jié)構(gòu)域抗體)和免疫球蛋白分子的包含抗原識別位點(diǎn)的任何其它經(jīng)修飾的構(gòu)型?？贵w包括任何種類的抗體，如IgG、IgA或IgM(或其亞家族)，且抗體不必須是任何特別的種類?？梢愿鶕?jù)抗體重鏈恒定結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，將免疫球蛋白指定為不同的種類。存在五種主要的免疫球蛋白IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些可以被進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2。對應(yīng)于不同免疫球蛋白家族的重鏈恒定結(jié)構(gòu)域分別被稱作O!、S、e、7和y。不同家族免疫球蛋白的亞基結(jié)構(gòu)和三維構(gòu)型是公知的。本文使用的"單克隆抗體"是指從一群基本均質(zhì)的抗體獲得的抗體，即除了可少量存在的可能的天然存在的突變外，包含該種群的個體抗體是相同的。單克隆抗體是高度特異的，其針對單個抗原性位點(diǎn)。另外，與多克隆抗體制劑(其典型地包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體)相反，每種單克隆抗體針對抗原上的單個決定簇。修飾詞"單克隆的"指示抗體的特性是得自基本均質(zhì)的抗體種群，并不應(yīng)被理解為要求通過任何特定的方法生產(chǎn)抗體。例如，可以通過首先由KohlerandMilstein,1975,Nature,256:495描述的雜交瘤方法來制造，或可以通過U.S.PatNo.4,816,567中所述的重組DNA方法來制造根據(jù)本發(fā)明待使用的單克隆抗體。單克隆抗體也可以分離自噬菌體文庫，所述噬菌體文庫使用例如McCaffertyetal.,1990,Nature,348:552-554中所述的技術(shù)產(chǎn)生。本文使用的"人源化的"抗體是指非人(例如鼠)抗體的下述形式，其為特異的嵌合體免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其含有來自非人免疫球蛋白的最小序列的片段(例如Fv,Fab,Fab'，F(xiàn)(ab')2或抗體的其它抗原結(jié)合亞序列)。對于大部分而言，人源化的抗體是下述人免疫球蛋白(受體抗體)，所述人免疫球蛋白中來自受體的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)被替換為來自非人物種的CDR(供體抗體)的殘基，所述非人物種如小鼠、大鼠或兔，所述來自非人物種的CDR具有所需的特異性、親和力和生物活性。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv框架區(qū)(FR)殘基被替換為相應(yīng)的非人殘基。另外，人源化抗體可包含下述殘基，所述殘基既不存在于受體抗體中，也不存在于引入的CDR或框架區(qū)中，但是被包括在內(nèi)以進(jìn)一步精制和優(yōu)化抗體表現(xiàn)。通常，人源化抗體基本包含所有的(至少一個，典型地兩個)可變結(jié)構(gòu)域，其中所有或幾乎所有的CDR區(qū)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的CDR區(qū)，所有或幾乎所有的FR區(qū)是人免疫球蛋白共有序列的FR區(qū)。人源化抗體最適當(dāng)?shù)匾舶辽僖徊糠置庖咔虻鞍缀愣▍^(qū)或結(jié)構(gòu)域(Fc)，典型地為人免疫球蛋白的恒定區(qū)或結(jié)構(gòu)域?？贵w可具有如WO99/58572中所述被修飾的Fc區(qū)。其它形式的人源化抗體具有一個或多個CDR(—個、兩個、三個、四個、五個、六個)，其根據(jù)原始抗體被改變，也稱作"來自"一個或多個原始抗體CDR的一個或多個CDR。本文使用的"人抗體"是指具有對應(yīng)于下述抗體氨基酸序列的抗體，所述抗體由人生產(chǎn)和/或使用本領(lǐng)域己知或本文公開的用于制造人抗體的任何技術(shù)制造。人抗體的該定義包括包含至少一個人重鏈多肽或至少一個人輕鏈多肽的抗體。一個這樣的例子是包含鼠輕鏈和人重鏈多肽的抗體。人抗體可以使用本領(lǐng)域己知的多種技術(shù)生產(chǎn)。在一個實(shí)施方案中，人抗體選自噬菌體文庫，其中該噬菌體文庫表達(dá)人抗體(Vaughanetal.,1996,NatureBiotechnology,14:309-314;Sheetsetal.，1998,PNAS,(USA)95:6157-6162;HoogenboomandWinter,1991,J.Mol.Biol.,227:381;Marksetal.,1991,J.Mol.Biol.，222:581)。也可以通過將人免疫球蛋白基因座引入轉(zhuǎn)基因動物(例如小鼠，其中內(nèi)源免疫球蛋白基因已經(jīng)被部分或完全滅活)中制造人抗體。該途徑描述于U.S.專利Nos.5，545，807;5,545，806;5,569,825;5,625,126;5,633,425和5,661，016?；蛘撸梢酝ㄟ^使生產(chǎn)針對耙抗原的抗體的人B淋巴細(xì)胞(這類B淋巴細(xì)胞可從個體回收或可以在體外被免疫)永生來制備人抗體。參見例如Coleetal.,MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy,AlanR.Liss，p.77(1985);Boemeretal.，1991,J,Immunol.,147(l):86-95和U.S.專利No.5，750,373。本文使用的術(shù)語"降鈣素基因相關(guān)肽"和"CGRP"是指維持至少部分CGRP活性的任何形式的降鈣素基因相關(guān)肽及其變體。例如，CGRP可以是a-CGRP或/3-CGRP。本文使用CGRP包括所有哺乳動物種類的天然序列CGRP，例如人、犬、貓、馬和牛。本文使用的"抗CGRP拮抗劑抗體"(可與"抗CGRP抗體"互換使用)是指下述抗體，所述抗體能夠結(jié)合CGRP并抑制CGRP生物活性和/或CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的下游途徑。抗CGRP拮抗劑抗體包括下述抗體，所述抗體能夠(包括顯著地)封閉、拮抗、抑制或降低CGRP生物活性，包括由CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的下游途徑如受體結(jié)合和/或?qū)GRP細(xì)胞應(yīng)答的激發(fā)。就本發(fā)明的目的而言，應(yīng)明確地理解術(shù)語"抗CGRP拮抗劑抗體"包括所有先前定義的術(shù)語、題目和功能狀態(tài)和特征，由此，CGRP自身、CGRP生物活性(包括但不限于其介導(dǎo)任何方面頭痛的能力)或生物活性的后果以任何有意義的程度上被實(shí)質(zhì)上無效、降低或中和。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合CGRP并防止CGRP結(jié)合CGRP受體。在其它實(shí)施方案中，抗CGRP抗體結(jié)合CGRP并防止CGRP受體的激活。本文提供了抗CGRP拮抗劑抗體的例子。本文使用的術(shù)語"Gl"和"抗體Gl"可互換地使用，它們指由具有保藏號ATCCPTA-6867和ATCCPTA-6866的表達(dá)載體生產(chǎn)的抗體。圖5顯示了重鏈和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列?？贵wGl的CDR部分(包括Chothia和KabatCDRs)圖示于圖5中。編碼重鏈和輕鏈可變區(qū)的多核苷酸顯示于SEQIDNO:9和SEQIDNO:IO中。Gl的表征描述于實(shí)施例中。術(shù)語"多肽"、"寡肽"、"肽"和"蛋白質(zhì)"在本文可互換使用，來表示任何長度的氨基酸多聚體。該多聚體可以是線性的或分支的，其可含有經(jīng)修飾的氨基酸，其可以被非氨基酸阻斷。所述術(shù)語還包括已經(jīng)被天然修飾或通過干涉被修飾的氨基酸多聚體；例如二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙?；?、磷酸化或任何其它加工或修飾，如與標(biāo)簽組分的綴合。還包括在定義中的是例如含有有一個或多個氨基酸類似物(包括例如非天然的氨基酸等)以及本領(lǐng)域已知的其它修飾的多肽。理解到因?yàn)楸景l(fā)明的多肽是以抗體為基礎(chǔ)的，所以所述多肽能夠作為單鏈或結(jié)合的鏈存在。本文可互換地使用的"多核苷酸"或"核酸"指任何長度的核苷酸多聚體，并包括DNA和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)修飾的核苷酸或堿基，和/或它們的類似物，或可以由DNA或RNA聚合酶摻入多聚體中的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)修飾的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它們的類似物。如果存在對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾，該修飾可以在多聚體裝配之前或之后給予。核苷酸的序列可以被非核苷酸組件阻斷。多核苷酸可在多聚化后被進(jìn)一步修飾，例如通過與標(biāo)簽組件綴合來修飾。其它類型的修飾包括例如"帽子"、用類似物取代一個或多個天然存在的核苷酸、核苷酸間修飾，以及未修飾形式的多核苷酸，所述核苷酸間21修飾例如為用不帶電的鍵(例如甲基磷酸酯、磷酸三酯、磷酸酰胺、氨基甲酸酯等)修飾和用帶電的鍵(硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)修飾、含有懸掛部分如蛋白質(zhì)(例如核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-賴氨酸等)的修飾、用插入劑(例如吖啶、補(bǔ)骨脂素等)修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化金屬等)的修飾、含有alkylator的修飾、用經(jīng)修飾的鍵(例如a異頭核酸)修飾。另外，任何通常存在于糖中的羥基基團(tuán)可以被磷酸酯基團(tuán)、磷酸基替換，被標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基團(tuán)保護(hù)，或被激活來制備與額外的核苷酸的額外鍵，或可以與固體支持物綴合。5'和3'端的OH可以被磷酸化或被胺或1到20個碳原子的有機(jī)加帽基團(tuán)部分取代。其它羥基也可以被演化為標(biāo)準(zhǔn)的保護(hù)基團(tuán)。多核苷酸還可以含有本領(lǐng)域一般已知的類似形式的核糖或脫氧核糖，包括例如2'-O-甲基-、2'-0-烯丙基、2'-氟-或2'-疊氮基-核糖，碳環(huán)糖類似物，D-異頭糖，差向異構(gòu)體糖如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖，吡喃糖，呋喃糖，景天庚酮糖，非環(huán)狀類似物和非堿性核苷類似物如甲基核糖核苷。一個或多個磷酸二酯鍵可以被替換為備選的連接基團(tuán)。這些備選的連接基團(tuán)包括，但不限于其中磷酸鹽被替換為P(O)S("硫代酸鹽")、P(S)S("二硫代酸鹽")、(0)NR2("酰胺化物")、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH2("formacetai")的實(shí)施方案，其中每個R或R'獨(dú)立地為H或被任選地含有(-O-)鍵、芳基、鏈烯基、環(huán)垸基、環(huán)鏈烯基或araldyl的烷基(1-20C)取代或未取代。多核苷酸中所有的鍵不必須是相同的。前文的敘述適用于本文所指的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。抗體的"可變區(qū)"是指抗體輕鏈的可變區(qū)或抗體重鏈的可變區(qū)，其為單獨(dú)的或組合的。重鏈和輕鏈的可變區(qū)各由四個框架區(qū)(FR)組成，所述四個框架區(qū)被三個互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)連接，所述互補(bǔ)性決定區(qū)也稱作超變區(qū)。每個鏈中的CDR通過FR被緊密結(jié)合在一起，并與來自另一條鏈的CDR—起有助于形成抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)。存在至少兩種用于確定CDR的技術(shù)(l)以跨物種序列變異性為基礎(chǔ)的途徑(即Kabatetal.SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,(5thed.,1991,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMD));和(2)以抗原一抗體復(fù)合物的晶體學(xué)研究為基礎(chǔ)的途徑(Al-lazikanietal(1997)J.Molec.Biol.273:927-948)。本文使用的CDR可表示由任一途徑或兩個途徑的組合定義的CDR?？贵w的"恒定區(qū)"指抗體輕鏈的恒定區(qū)或抗體重鏈的恒定區(qū)，其為單獨(dú)的或組合的。與抗體或多肽"優(yōu)先結(jié)合"或"特異結(jié)合"(在本文可互換使用)的表位是本領(lǐng)域公知的術(shù)語，確定這類特異或優(yōu)先結(jié)合的方法也是本領(lǐng)域公知的。如果一個分子與特定細(xì)胞或物質(zhì)反應(yīng)或結(jié)合比起它與其它細(xì)胞或物質(zhì)的反應(yīng)或結(jié)合而言更頻繁、更快速、有更長持續(xù)時間和/或有更大親和力，則稱該分子顯示"特異結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"。如果抗體與靶標(biāo)結(jié)合比起它與其它物質(zhì)的結(jié)合具有更大親和力、親合力、更容易和/或具有更長持續(xù)時間，則該抗體"特異結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"該靶標(biāo)。例如，與CGRP特異或優(yōu)先結(jié)合的抗體是下述抗體，所述抗體與該表位的結(jié)合比起它與其它CGRP表位或非CGRP表位的結(jié)合具有更大的親和力、親合力、更容易和/或具有更長的持續(xù)時間。通過閱讀該定義還應(yīng)理解到例如，與第一靶標(biāo)特異或優(yōu)先結(jié)合的抗體(或部分或表位)可與第二靶標(biāo)特異或優(yōu)先結(jié)合，或不特異或優(yōu)先結(jié)合。同樣，"特異結(jié)合"或"優(yōu)先結(jié)合"不必須要求(盡管其可包括)專一結(jié)合。通常但不必須地，涉及結(jié)合時表示優(yōu)先么士A本文使用的"基本純"是指至少50%純(即不含污染物)、更優(yōu)選至少90%純、更優(yōu)選至少95%純、更優(yōu)選至少98%純、更優(yōu)選至少99%純的材料。"宿主細(xì)胞"包括可以是或已經(jīng)是載體受體的個體細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)物，所述載體用于摻入多核苷酸插入物。宿主細(xì)胞包括單個宿主細(xì)胞的后代，并且因?yàn)樘烊?、偶然或故意的突變，所述后代不必須與原始的親本細(xì)胞(在形態(tài)學(xué)或基因組DNA補(bǔ)體上)完全相同。宿主細(xì)胞包括用本發(fā)明的多核苷酸體內(nèi)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。術(shù)語"Fc區(qū)"用于定義免疫球蛋白重鏈C末端區(qū)域。"Fc區(qū)"可以是天然序列Fc區(qū)或變體Fc區(qū)。盡管免疫球蛋白重鏈的Fc區(qū)邊界可變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常被定義為從位置Cys226的氨基酸殘基或Pro230開始到其羧基端的一段。Fc區(qū)中殘基的排序是如Kabat中的EU索引排序。Kabatetal.,SequencesofProteinsoflmunologicalInterest,5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，Md.,1991。免疫球蛋白的Fc區(qū)通常含有兩個恒定結(jié)構(gòu)域CH2和CH3。本文使用"Fc受體"和"FcR"描述了結(jié)合抗體Fc區(qū)的受體。優(yōu)選的FcR為天然序列人FcR。另外，優(yōu)選的FcR是結(jié)合IgG抗體(y受體)的FcR，并包括Fc7RI、FqRII和Fc7Rin亞類的受體，包括這些受體的等位基因變體或者間接形式。Fc7RII受體包括Fc7RIIA("激活受體")和Fc7RIIB("抑制受體")，其具有主要在其胞漿區(qū)差異的類似的氨基酸序列。RavetchandKinet,1991,Ann.Rev.Immunol"9:457-92;Capeletal"1994,Immunomethods,4:25-34;和deHaasetal.，1995,J.Lab.Clin.Med.,126:330-41中綜述了FcR。"FcR"也包括新生兒受體FcRn，其負(fù)責(zé)母體IgG到胎兒的轉(zhuǎn)移(Guyeretal.,1976，J.Immunol.,117:587;andKimetal.,1994，J.Immunol.,24:249)。"補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性"和"CDC"是指存在補(bǔ)體時靶標(biāo)的溶解。補(bǔ)體系統(tǒng)的第一個組件(Clq)和與同種抗原復(fù)合的分子(例如抗體)的結(jié)合啟動補(bǔ)體激活途徑。為了評價補(bǔ)體活化，可進(jìn)行例如Gazzano-Santoroetal.,J.Immunol.Methods,202:163(1996)中所述的CDC實(shí)驗(yàn)。"功能性Fc區(qū)"擁有天然序列Fc區(qū)的至少一個效應(yīng)子作用。示范性的"效應(yīng)子作用"包括Clq結(jié)合；補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC);Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細(xì)胞接到的細(xì)胞毒性(ADCC);吞噬作用；細(xì)胞表面受體(例如B細(xì)胞受體；BCR)的下調(diào)等。這類效應(yīng)子作用通常要求Fc區(qū)與結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如抗體可變結(jié)構(gòu)域)組合并可使用本領(lǐng)域已知用于評估這類抗體效應(yīng)子作用的多種實(shí)驗(yàn)評價。"天然序列Fc區(qū)"包含與天然存在的Fc區(qū)氨基酸序列相同的氨基酸序列。"變體Fc區(qū)"包含與天然序列Fc區(qū)通過至少一個氨基酸修飾而不同、但是維持天然序列Fc區(qū)至少一個效應(yīng)子作用的氨基酸序列。優(yōu)選地，與天然序列Fc區(qū)相比或與親本多肽的Fc區(qū)相比，變體Fc區(qū)具有至少一個氨基酸取代，例如天然序列Fc區(qū)中或親本多肽的Fc區(qū)中從約一個到約十個氨基酸取代，優(yōu)選地從約一個到約五個氨基酸取代。本文的變體Fc區(qū)優(yōu)選地與天然序列Fc區(qū)和/或與親本多肽FC區(qū)具有至少約80%的序列同一性，最優(yōu)選與之有至少約90%的序列同一性，更優(yōu)選與之有至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%的序列同一性。本文使用的"抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性"和"ADCC"是指細(xì)胞介導(dǎo)的反應(yīng)，其中表達(dá)Fc受體(FcRs)的非特異性的細(xì)胞毒性細(xì)胞(例如天然殺傷(NK)細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)識別耙細(xì)胞上的結(jié)合抗體，隨后引起耙細(xì)胞裂解。感興趣的分子的ADCC活性可以使用體外ADCC實(shí)驗(yàn)評估，例如描述于U.S.專利No.5,500，362或5,821,337中的實(shí)驗(yàn)。適用于這些實(shí)驗(yàn)的效應(yīng)子細(xì)胞包括外周血單核細(xì)胞(PBMC)和NK細(xì)胞?；蛘呋蛄硗獾?，感興趣的分子的ADCC活性可以體內(nèi)評估，例如在如Clynesetal.,1998，PNAS(USA),95:652-656中公開的動物模型中評估。本文使用的"治療"是用于獲得有益的或所期望的臨床結(jié)果的途徑。就本發(fā)明的目的而言，有益的或所期望的臨床結(jié)果包括，但不限于以下一種或多種在頭痛的任何方面改進(jìn)，包括減輕嚴(yán)重性、緩和疼痛強(qiáng)度和其它相關(guān)癥狀、減少復(fù)發(fā)頻率、提高患有頭痛患者的生活質(zhì)量和減少治療頭痛所需其它藥物的劑量。對于偏頭痛而言，其它相關(guān)癥狀包括，但不限于惡心、嘔吐和對光、聲音和/或運(yùn)動敏感。對于叢集性頭痛而言，其它相關(guān)癥狀包括，但不限于眼下方或周圍腫脹、多淚、紅眼、鼻漏或鼻充血和潮紅的臉。"降低"頭痛"發(fā)生率"表示任何降低的嚴(yán)重性(其可包括降低通常用于該病癥的其它藥物和/或治療的需要和/或用量(例如暴露)，所述其它藥物包括例如用于偏頭痛的麥角胺、雙氫麥角胺或triptan)、持續(xù)時間和/或頻率(包括例如在個體中延遲或提高到下次偶然發(fā)作的時間)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，個體可在它們對治療的應(yīng)答方面不同，同樣，例如"減少個體中頭痛發(fā)作的方法"表現(xiàn)了在合理期望(這類施用很可能在特定個體中導(dǎo)致這樣的發(fā)病率降低)的基礎(chǔ)上施用抗CGRP拮抗劑抗體。"改善"頭痛或頭痛的一種或多種癥狀表示與未施用抗CGRP拮抗劑抗體相比，頭痛的一種或多種癥狀的減少或改進(jìn)。"改善"也包括縮短或減少癥狀的持續(xù)時間。本文使用的"控制頭痛"是指在個體中維持或降低頭痛的一種或多種癥狀的嚴(yán)重性或持續(xù)時間或頭痛發(fā)作的頻率(與治療前的水平相比)。例如，與治療前水平相比，個體中頭痛持續(xù)時間或嚴(yán)重性或發(fā)作頻率被降低至少約10%、20%、30%、40%、50%、60%或70%之任一。本文使用的"延遲"頭痛的發(fā)生是指延遲、妨礙、減緩、延緩、穩(wěn)定和/或推遲疾病的進(jìn)展。該延遲可以是不同長度的時間，取決于疾病史和、或被治療的個體。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所明白的，足夠或顯著的延遲可以有效地包括預(yù)防，因?yàn)閭€體不會發(fā)生頭痛(例如偏頭痛)。"延遲"癥狀發(fā)生的方法是與未使用該方法相比時，降低給定時間范圍內(nèi)發(fā)生癥狀的可能性和/或降低給定時間范圍內(nèi)癥狀程度的方法。這類比較典型地以臨床研究為基礎(chǔ)，使用統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)量的受試者。頭痛的"發(fā)生"或"發(fā)展"表示表示該病癥的最初表現(xiàn)和/或隨后的進(jìn)展。頭痛的發(fā)生是可檢測的，并使用本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)評價。然而，發(fā)生也表示不可檢測的進(jìn)展。就本發(fā)明的目的而言，發(fā)生或發(fā)展表示癥狀的生物學(xué)過程。"發(fā)生"包括發(fā)作、復(fù)發(fā)和發(fā)病。本文使用頭痛的"發(fā)病"或"發(fā)作"包括初始發(fā)病和/或復(fù)發(fā)。本文使用的藥物、化合物或藥物組合物的"有效劑量"或"有效量"是足夠產(chǎn)生有益的或期望的結(jié)果的量。對于預(yù)防性用途而言，有益的或期望的結(jié)果包括例如如消除或降低風(fēng)險、減輕嚴(yán)重性或延遲疾病開始的結(jié)果，包括疾病的生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為癥狀，其并發(fā)癥和在疾病發(fā)生時存在的中間病理學(xué)表型。對于治療學(xué)用途而言，有益或期望的結(jié)果包括下述結(jié)果，例如降低疼痛強(qiáng)度、持續(xù)時間、或頭痛發(fā)作頻率和減少頭痛引起的一種或多種(生物化學(xué)、組織學(xué)和/或行為)癥狀(包括其并發(fā)癥和在疾病發(fā)生時存在的中間病理學(xué)表型)、提高該疾病患者的生活質(zhì)量、減少治療該疾病所需其它藥物療法的劑量、增強(qiáng)另一藥物療法的作用和/或延遲患者疾病的發(fā)展。有效劑量可以在一次或多次施用中被施用。就本發(fā)明的目的而言，有效的藥物、化合物或藥物組合物劑量是足夠直接或間接完成預(yù)防性或治療性治療的用量。如臨床語境中所理解的，有效的藥物、化合物或藥物組合物劑量可以與其它藥物、化合物或藥物組合物結(jié)合或不結(jié)合地達(dá)到。因此，在施用一種或多種治療劑的語境中如果可以達(dá)到或達(dá)到了期望的結(jié)果，則可認(rèn)為是"有效劑量"；單一劑量與一種或多種其它試劑組合時，如果可以達(dá)到或達(dá)到了期望的結(jié)果，則可認(rèn)為是以有效的劑量提供的。"個體"或"受試者"是哺乳動物，更優(yōu)選為人。哺乳動物還包括但不限于農(nóng)業(yè)動物、運(yùn)動動物、寵物、靈長類、馬、犬、貓、小鼠和大眠。本文使用的"載體"表示一種構(gòu)建體，其能夠?qū)⒁粋€或多個感興趣的基因或序列遞送進(jìn)宿主細(xì)胞并優(yōu)選在其中表達(dá)。載體的例子包括，但不限于病毒載體、裸DNA或RNA表達(dá)載體、質(zhì)粒、粘?；蚴删w載體、與陽離子冷凝劑結(jié)合的DNA或RNA表達(dá)載體、包裹在脂質(zhì)體中的DNA或RNA表達(dá)載體，和某些真核生物細(xì)胞如生產(chǎn)者細(xì)胞。本文使用的"表達(dá)調(diào)控序列"是指指導(dǎo)核酸轉(zhuǎn)錄的核酸序列。表達(dá)調(diào)控序列可以是啟動子(如組成型或誘導(dǎo)型啟動子)或增強(qiáng)子。表達(dá)調(diào)控序列與待轉(zhuǎn)錄的核酸序列可操作地連接。本文使用的"可藥用的運(yùn)載體"或"可藥用的賦形劑"包括任何下述材料，其與活性成分組合時允許該成分維持生物活性，并且對受試者的免疫體系是無反應(yīng)性的。例子包括但不限于任何標(biāo)準(zhǔn)的藥物運(yùn)載體，如磷酸鹽緩沖的鹽水溶液、水、乳劑(如油/水乳劑)和多種類型的濕潤劑。用于氣霧劑或腸胃外施用的優(yōu)選稀釋劑為磷酸鹽緩沖的鹽水或生理(0.9%)鹽水。包含這類運(yùn)載體的組合物通過公知的常規(guī)方法配制(參閱例如Remington'sPharmaceuticalSciences,18thedition,A.Gennaro，ed.，MackPublishingCo.,Easton，PA,1990;禾卩Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEd.MackPublishing,2000)。本文使用術(shù)語"k。n"旨在表示抗體與抗原的結(jié)合速率常數(shù)。本文使用術(shù)語"k。ff"旨在表示抗體從抗體/抗原復(fù)合物解離的速率常數(shù)。'本文使用術(shù)語"KD"旨在表示抗體-抗原相互作用的平衡解離常數(shù)。本文使用術(shù)語"血管運(yùn)動癥狀"旨在表示與血管舒張相關(guān)的病癥，包括但不限于特別是由溫度調(diào)節(jié)功能障礙導(dǎo)致的頭痛(例如偏頭痛、……其它)、熱潮紅、冷潮紅(或瞬間熱潮紅(hotflashes))、失眠、睡眠紊亂、心境障礙、易激惹、大汗、寢汗、晝汗、疲勞等等。本文使用術(shù)語"面紅"、"熱潮紅"和"瞬間熱潮紅"是本領(lǐng)域認(rèn)可的術(shù)語，其表示體溫偶發(fā)性紊亂，典型地由突發(fā)的皮膚潮紅組成，通常伴隨受試者的排汗。A.用于預(yù)防或治療血管運(yùn)動癥狀的方法一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中治療或預(yù)防至少一種血管運(yùn)動癥狀如頭痛(例如偏頭痛)或熱潮紅的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體或來自該抗體的多肽。另一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少至少一種血管運(yùn)動癥狀發(fā)作或延遲其發(fā)生或發(fā)展的方法，所述癥狀如頭痛(例如偏頭痛)或熱潮紅，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。另一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少頭痛(例如偏頭痛)發(fā)作或延遲其發(fā)生或發(fā)展的方法，包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體與至少一種適用于治療頭痛的其它試劑的組合。這類其它試劑包括但不限于5-HT激動劑和NSAID。例如，抗體和至少一種其它試劑可以伴隨施用，即它們可以以足夠接近的時間接近度施用從而允許它們個體的治療作用重疊。例如，與抗CGRP抗體組合施用的5-HT激動劑或NSAID的量應(yīng)當(dāng)足以降低患者中頭痛復(fù)發(fā)的頻率，或產(chǎn)生與施用這些試劑中的一種而不存在其它時相比更長的持久作用。該步驟可用于治療落入多種種類之任一中的頭痛，包括有先兆或無先兆的偏頭痛；叢集性頭痛；偏頭痛性神經(jīng)痛；久頭痛；緊張性頭痛；其它醫(yī)學(xué)病癥(例如感染或腫瘤引起的顱內(nèi)壓升高)導(dǎo)致的頭痛；慢性發(fā)作性偏頭痛；與結(jié)構(gòu)損傷無關(guān)的多種頭痛；與非血管性顱內(nèi)病癥相關(guān)的頭痛；與物質(zhì)施用及其停藥相關(guān)的頭痛；與非頭感染相關(guān)的頭痛；與代謝紊亂相關(guān)的頭痛；與顱、頸、眼、耳、鼻、竇房結(jié)、牙、口或其它面部或顱結(jié)構(gòu)病癥相28關(guān)的頭痛；腦神經(jīng)痛和神經(jīng)干痛和去傳入(deafferentiation)痛。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定與抗CGRP抗體組合使用的特定試劑的合適劑量。例如，可以以從約0.01到約300mg的劑量施用舒馬曲坦。當(dāng)非腸胃外施用時，舒馬曲坦的典型劑量為從約25到約100mg。通常優(yōu)選約50mg，當(dāng)腸胃外施用時，優(yōu)選的劑量為約6mg。然而，這些劑量可以根據(jù)本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法改變，從而將其針對特定患者或特定的組合治療最優(yōu)化。另外，例如塞來考昔可以以50和500mg之間的用量被施用。另一方面，本發(fā)明提供了用于在個體中改善、控制、減少熱潮紅發(fā)作或延遲其發(fā)生或發(fā)展的方法，包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體與至少一種適用于治療熱潮紅的其它試劑的組合。這類其它試劑包括，但不限于基于激素的治療，所述激素包括雌激素和/或一些黃體酮。關(guān)于本文所述的所有方法，提及抗CGRP拮抗劑抗體時也包括包含一種或多種這些試劑的組合物。這些組合物可進(jìn)一歩包含本領(lǐng)域公知的合適賦形劑，如包括緩沖液的可藥用賦形劑。本發(fā)明可單獨(dú)使用或與其它常規(guī)治療方法組合使用?？笴GRP拮抗劑抗體可以通過任何合適的途徑施用給個體。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白本文所述的實(shí)施例不旨在限制，而是對可用技術(shù)的闡述。因此在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體根據(jù)已知的方法施用給個體，例如靜脈施用(例如作為推注施用或通過一段時間內(nèi)的連續(xù)輸注施用)，通過肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、腦脊髓內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、舌下、滑膜內(nèi)，通過吹入、椎觀內(nèi)、口內(nèi)、吸入或局部途徑。施用可以是全身性的(例如靜脈施用)或局部的?？缮虡I(yè)獲得的用于液體制劑的噴霧器(包括噴射霧化器和超聲噴霧器)適用于施用。液體制劑可直接噴霧，低壓凍干粉末可以在重建后噴霧。或者，可以使用碳氟化合物制劑和壓力定量氣霧劑將抗CGRP拮抗劑抗體霧化，或作為低壓凍干的和研細(xì)的粉末被吸入。在一個實(shí)施方案中，通過位點(diǎn)特異或靶向局部遞送技術(shù)施用抗CGRP拮抗劑抗體。位點(diǎn)特異或靶向局部遞送技術(shù)的例子包括抗CGRP拮抗劑抗體的多種可植入補(bǔ)給來源(depotsources)或局部遞送導(dǎo)管，如輸注導(dǎo)管、留置導(dǎo)管或套針、合成移植物、外膜覆膜(adventitialwraps)、分流器和支架或其它可植入的設(shè)備，位點(diǎn)特異的運(yùn)載體、直接注射或直接應(yīng)用。參閱例如PCT公開No.WO00/53211和U.S.專利No.5，981,568。抗CGRP拮抗劑抗體的多種制劑可用于施用。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體可以單獨(dú)施用。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體和可藥用的賦形劑可存在于多種制劑中?？伤幱玫馁x形劑是本領(lǐng)域已知的并是相對惰性的物質(zhì)，其有助于藥理學(xué)有效物質(zhì)的施用。例如，賦形劑可以有形狀或稠度，或作為稀釋劑作用。合適的賦形劑包括但不限于穩(wěn)定劑、濕潤劑和乳化劑、不同滲量的鹽、包膠劑、緩沖液和皮膚穿透促進(jìn)劑。賦形劑以及用于腸胃外和非腸胃外藥物遞送的制劑公開于Remmgton,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEd.MackPublishing(2000)中。在一些實(shí)施方案中，這些試劑被配制為用于通過(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等)注射施用。因此，這些試劑可與可藥用媒介如鹽水、Ringer's溶液、葡萄糖溶液等等組合。特定的給藥方案(即劑量、時間和重復(fù))將取決于特定的個體和該個體的醫(yī)療史?？笴GRP抗體可以使用任何合適的方法施用，所述方法包括注射(例如腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、肌內(nèi)等)。抗CGRP抗體也可以如本文所述通過吸入施用。通常，對于抗CGRP抗體的施用而言，初始的候選劑量可以為約2mg/kg。就本發(fā)明的目的而言，典型的每日劑量可以從約3yg/kg到30/ig/kg到300/xg/kg到3mg/kg，到30mg/kg到100mg/kg或更多的范圍內(nèi)，取決于上述因素。例如可使用約1mg/kg、約2.5mg/kg、約5mg/kg、約10mg/kg和約25mg/kg的劑量。對于在若干天或更久的重復(fù)施用而言，根據(jù)病癥持續(xù)治療，直到發(fā)生期望的癥狀抑制或直到達(dá)到足夠的治療水平，例如降低疼痛。示范性的給藥方案包括施用約2mg/kg的初始劑量，然后是約1mg/kg抗CGRP抗體的每周維持劑量，或然后是每隔一周約1mg/kg的維持劑量。然而，其它給藥方法可以是有用的，取決于醫(yī)生希望達(dá)到的藥物代謝動力學(xué)衰變模式。例如，在一些實(shí)施方案中，考慮一周一到四次的給藥。該療法的過程容易地通過常規(guī)技術(shù)和實(shí)驗(yàn)檢測。給藥方案(包括使用的CGRP拮抗劑)可隨時間變化。就本發(fā)明的目的而言，抗CGRP拮抗劑抗體的適當(dāng)劑量取決于使用的抗CGRP拮抗劑抗體(或其組合物)、待治療的頭痛(例如偏頭痛)類型和嚴(yán)重性、試劑是否就預(yù)防或治療的目的被使用、先前療法、患者的醫(yī)療史和對試劑的應(yīng)答，以及主治醫(yī)師的判斷。典型地，臨床醫(yī)師會施用抗CGRP拮抗劑抗體，直到達(dá)到完成期望結(jié)果的劑量。劑量和/或頻率可隨治療進(jìn)程改變。經(jīng)驗(yàn)性考慮(例如半衰期)通常有助于劑量的確定。例如，與人免疫系統(tǒng)相容的抗體(如人源化抗體或全人抗體)可用于延長抗體的半衰期和預(yù)防抗體被宿主的免疫系統(tǒng)攻擊。施用頻率可隨著治療進(jìn)程確定和調(diào)整，并通常(但非必須)以頭痛(例如偏頭痛)的治療和/或抑制和/或改善和/或延遲為基礎(chǔ)?；蛘?，抗CGRP拮抗劑抗體的持久連續(xù)釋放制劑可以是適當(dāng)?shù)?。用于達(dá)到持久釋放的多種制劑和設(shè)備是本領(lǐng)域已知的。在一個實(shí)施方案中，可以按經(jīng)驗(yàn)確定已經(jīng)被給予一次或多次抗CGRP拮抗劑抗體施用的個體中抗CGRP拮抗劑抗體的劑量。個體被給予增加劑量的抗CGRP拮抗劑抗體。為了評估抗CGRP拮抗劑抗體的效力，可依照該疾病的指征來進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明方法的抗CGRP拮抗劑抗體的施用可以是連續(xù)的或間斷的，取決于例如受體的生理?xiàng)l件、施用目的是治療性的還是預(yù)防性的，以及熟練醫(yī)生已知的其它因素?？笴GRP拮抗劑抗體的施用可以在預(yù)選的時間段中基本上是連續(xù)的，或可以是一系列間隔的劑量，例如發(fā)生頭痛(例如偏頭痛)之前、期間或之后之任一；之前；期間；之前和之后；期間和之后；之前和期間；或發(fā)生頭痛之前、期間和之后。施用可以在可能引起頭痛的任何事件之前、期間和/或之后。在一些實(shí)施方案中，可存在多于一種抗CGRP拮抗劑抗體?？梢源嬖谥辽僖环N、至少兩種、至少三種、至少四種、至少物種不同的或更多的抗CGRP拮抗劑抗體。通常這些抗CGRP拮抗劑抗體可以具有彼此不會不利影響的互補(bǔ)活性。措抗劑抗CGRP抗體也可以用于與其它CGRP拮抗劑或CGRP受體拮抗劑結(jié)合。例如，可使用一種或多種以下的CGRP拮抗劑針對CGRP的抗反義分子(包括針對編碼CGRP的核酸的抗反義分子)、CGRP抑制化合物、CGRP結(jié)構(gòu)類似物、結(jié)合CGRP的CGRP受體的顯性負(fù)相突變、抗CGRP受體抗體?？笴GRP拮抗劑抗體也可以與其它試劑結(jié)合使用，所述其它試劑起到增強(qiáng)和/或補(bǔ)充試劑有效性的作用。按下文所述，將根據(jù)本發(fā)明使用的抗CGRP拮抗劑抗體的治療性制劑制備為低壓凍干制劑或水性溶液的形式用于儲存將具有期望純度的抗體與任選的可藥用運(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑混合(Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEd.MackPublishing(2000》?？山邮艿倪\(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在使用的劑量上對于受體是無毒的，并可包含緩沖液如磷酸、檸檬酸和其它有機(jī)酸；鹽如氯化鈉；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如氯化十八垸基二甲基芐基銨；氯化六甲雙銨；氯化苯甲烴銨、氯化苯乙銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸垸基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和m-甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)的多肽;蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水多聚體如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽的反例子如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；禾口/或非離子型表面活性劑，如TWEENtm、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)。通過本領(lǐng)域已知方法制備含有抗CGRP拮抗劑抗體的脂質(zhì)體，所述方法例如描述于Epstein,etal.,Pro"Natl.Acad.Sci.USA82:3688(1985);Hwang,etal.,Proc.NatlAcad.Sci.USA77:4030(1980);和U.S.Pat.Nos.4，485，045和4，544，545中。具有增強(qiáng)的循環(huán)時間的脂質(zhì)體公開于U.S.專利No.5,013,556中。尤其有用的脂質(zhì)體可以通過反相蒸發(fā)法用脂質(zhì)組合物產(chǎn)生，所述脂質(zhì)組合物含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)。通過將脂質(zhì)體濾過確定孔徑的濾器得到具有期望直徑的脂質(zhì)體。在膠體給藥系統(tǒng)(例如脂質(zhì)體、白蛋白微球、微乳劑、納米顆粒和納米膠囊)或大乳劑中，活性成分也可以被捕獲在微膠囊中例如分別被捕獲在羥甲基纖維素或明膠微膠囊和多聚(methylmethacylate)微膠囊中，所述微膠囊例如通過凝聚技術(shù)或通過界面聚合法制備。這類技術(shù)公開于Remington,TheScienceandPracticeofPharmacy20thEd.MackPublishing(2000)中。可制備緩釋制劑。緩釋制劑的合適例子包括含有抗體的固體疏水多聚體的半滲透性基質(zhì)，所述基質(zhì)是有形狀物體(例如薄膜或微膠囊)的形式。緩釋基質(zhì)的例子包括聚酯、水凝膠(例如多聚(2-羥乙基-異丁烯酯)或多聚(乙烯醇))、多聚乳酸化合物(U.S.Pat.No.3,773,919)、L-谷氨酸共聚物和7乙基-L-谷氨酸鹽、非降解性的乙烯-醋酸乙烯酯、降解性的乳酸-羥乙酸共聚物如LUPRONDEPOT(由乳酸-羥乙酸共聚物和醋酸亮丙瑞林組成的可注射微球)、乙酸異丁酸蔗糖酯和多聚-D-(-)-3-羥基丁酸。用于體內(nèi)施用的配方必須是無菌的。這通過例如濾過無菌濾膜容易地實(shí)現(xiàn)。治療性的抗CGRP拮抗劑抗體組合物通常被置于具有無菌接入口的容器(例如帶有可被皮下注射針穿透的塞子的靜脈注射溶液袋或瓶)中。根據(jù)本發(fā)明的組合物可以是用于口、腸胃外或直腸施用或通過吸入或吹入施用的單位劑型，如片劑、丸劑、膠囊、粉末、顆粒、溶液或懸浮液或栓劑。為了制備固體組合物如片劑，將主要的活性成分與藥物運(yùn)載體(例如常規(guī)的壓片成分，如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨糖醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸鎂、磷酸二鈣或樹膠)和其它藥物稀釋劑(例如水)混合，形成含有本發(fā)明化合物或其無毒可藥用鹽的均相混合物的固體預(yù)配制組合物。當(dāng)提到這些預(yù)配制組合物是均相的時，表示活性成分遍及組合物被均一地分散，從而組合物可以被容易地再分為等效的單位劑型，如片劑、丸劑和膠囊。然后將該固體預(yù)配制組合物再分為上述類型的單位劑型，其含有從0.1到約500mg的本發(fā)明活性成分。新組合物的片劑或丸劑可以被包被或者以其它方式復(fù)合，得到給予長效的優(yōu)點(diǎn)的劑型。例如，片劑或丸劑可以包含內(nèi)部劑量和外部劑量組分，后者是前者上外膜的形式。這兩種組分可以被腸道層分開，所述腸溶層(entericlayer)作用在于抵抗胃中的崩解并允許內(nèi)部組分完整地進(jìn)入十二指腸或被延遲釋放。多種材料可被用于這類腸溶層或包衣，這類材料包括大量多聚酸和多聚酸與如紫膠、鯨蠟醇和醋酸纖維素類材料的混合物。合適的表面活性劑尤其包括非離子型試劑，例如聚氧乙烯山梨聚糖(例如Tween20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如Span20、40、60、80或85)。含有表面活性劑的組合物應(yīng)便利地包含0.05%和5%之間的表面活性劑，并可以在0.1%和2.5%之間。應(yīng)當(dāng)理解如果必需的話可添加其它成分，例如甘露醇或其它可藥用的媒介。合適的乳劑可以使用可商業(yè)獲得的脂肪乳劑來制備，所述脂肪乳劑例如Intralipid、LiposynTM、Infonutrol、LipofondinTM和Lipiphysan?；钚猿煞挚杀蝗苡陬A(yù)先混合的乳劑組合物中，或者其可溶于油(例如大豆油、紅花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)或通過將磷脂(例如卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)與水混合形成的乳劑中。應(yīng)當(dāng)理解可添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以調(diào)節(jié)乳劑的張力。合適的乳劑典型地含有多至20%的油，例如5%和20%之間。脂肪乳劑包含0.1和1.0Im之間、尤其是0.1禾口0.5Im之間的脂肪微滴，并具有5.5至lj8.0范圍內(nèi)的pH。乳劑組合物可以是通過將抗CGRP拮抗劑抗體與IntmlipidTM或其組分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合制備的組合物。用于吸入或吹入的組合物包括在可藥用的、水性或有機(jī)溶劑或其混合物中的溶液和懸浮液和粉末。液體或固體組合物可含有上文公開的合適的可藥用賦形劑。在一些實(shí)施方案中，通過口或鼻呼吸途徑施用組合物用于局部或全身作用。優(yōu)選地在無菌可藥用溶劑中的組合物可以通過使用氣體被噴灑。被噴灑的溶液可以從噴霧設(shè)備直接被呼吸，或噴霧設(shè)備可以與面罩、帷罩或間歇性正壓呼吸機(jī)結(jié)合。溶液、懸浮液或粉末組合物可以從以適當(dāng)方式遞送配方的設(shè)備中(優(yōu)選口或鼻地)被施用。頭痛的診斷或評估是本領(lǐng)域充分確定的。評估可以根據(jù)受試者測量(例如癥狀的患者特征)來確定。例如，偏頭痛可以基于以下標(biāo)準(zhǔn)診斷1)頭痛的偶發(fā)性發(fā)作持續(xù)4到72個小時；2)具有兩種以下癥狀單側(cè)疼痛、博動、運(yùn)動時加重，和中度或嚴(yán)重強(qiáng)度的疼痛；和3)以下癥狀之一惡心或嘔吐，和畏光或恐聲(phonophobia)。Goadsbyetal.,N.Engl.J.Med.34346:257-270,2002。治療有效性可以通過本領(lǐng)域公知的方法評估。例如，可評估疼痛緩解。因此，在一些實(shí)施方案中，在施用抗CGRP抗體后1、2或幾個小時后主觀地觀察到疼痛緩解。在一些實(shí)施方案中，在施用抗CGRP抗體后主觀地觀察頭痛發(fā)作的頻率。B.抗CGRP拮抗劑抗體本發(fā)明的方法使用抗CGRP拮抗劑抗體，所述CGRP拮抗劑抗體表示封閉、抑制或降低(包括顯著地)CGRP生物活性的任何抗體分子，所述生物活性包括由CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介導(dǎo)的下游途徑，例如受體結(jié)合和/或?qū)GRP的細(xì)胞應(yīng)答的激發(fā)。抗CGRP拮抗劑抗體應(yīng)顯示以下特征中的任一種或多種(a)結(jié)合CGRP;(b)封閉CGRP與其受體結(jié)合；(c)封閉或降低CGRP受體活化(包括cAMP活化)；(d)抑制CGRP生物活性或下調(diào)由CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游途徑；(e)預(yù)防、改善或治療頭痛(例如偏頭痛)的任何方面；(f)提高CGRP的清除率；禾Q(g)抑制(減少)CGRP合成、生產(chǎn)或釋放?？笴GRP拮抗劑抗體是本領(lǐng)域已知的。參閱例如Tanetal.,Clin.Sci.(Lond).89:565-73，1995;Sigma(Missouri,US)，產(chǎn)品編號C7113(clone#4901);Plourdeetal.,Peptides14:1225-1229,1993。就本發(fā)明的目的而言，抗體與CGRP以下述方式反應(yīng)，所述方式抑制CGRP和/或CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游途徑。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體識別人CGRP。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體與人a-CGRP和/3-CGRP均結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體與人和大鼠CGRP結(jié)合。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合具有CGRP的氨基酸25-37的C末端片段。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合CGRP的氨基酸25-37中的C末端表位。適用于本發(fā)明的抗體可包括單克隆抗體、多克隆抗體、抗體片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、Fc等)、嵌合抗體、雙特異性抗體、雜綴合物抗體、單鏈(ScFv)、其突變體、包含抗體部分的融合蛋白(例如結(jié)構(gòu)域抗體)、人源化抗體，和免疫球蛋白分子的包含所需特異性的抗原識別位點(diǎn)的任何其它經(jīng)修飾的構(gòu)型，包括抗體的糖基化變體、抗體的氨基酸序列變體和共價修飾的抗體?？贵w可以是犬的、大鼠的、人的，或任何其它來源的(包括嵌合的或人源化的抗體)。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體是單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體被人源化。在一些實(shí)施方案中，抗體是人的。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體是抗體Gl(如本文所述)。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體包含表6所示抗體Gl或Gl變體的一個或多個CDR(例如一個、兩個、三個、四個、五個或在一些實(shí)施方案中包含所有六個CDR)。還在其它實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體包含圖5所示重鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:l)和圖5所示輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列(SEQIDNO:2)。在一些實(shí)施方案中，抗體包含經(jīng)修飾的恒定區(qū)，例如本文所述是免疫惰性的恒定區(qū)。在一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624;PCT申請No.PCT/GB99/01441;禾口/或UK專利申請No.9809951.8中所述被修飾。在其它實(shí)施方案中，抗體包含人重鏈IgG2恒定區(qū)，所述恒定區(qū)包含以下突變A330P331到S330S331(參考野生型IgG2序列的氨基酸排序)。Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624。在一些實(shí)施方案中，抗體包含帶有以下突變的IgG4恒定區(qū)E233F234L235到P233V234A235。還在其它實(shí)施方案中，針對N連接的糖基化而言，恒定區(qū)不被糖基化(aglycosylated)。在一些實(shí)施方案中，通過突變寡糖附著殘基(如Asn297)和/或側(cè)翼殘基(其為恒定區(qū)中N-糖基化識別序列的一部分)，使得針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化。在一些實(shí)施方案中，針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化?？赏ㄟ^酶或通過在糖基化缺陷宿主細(xì)胞中表達(dá)使得針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化?？笴GRP拮抗劑抗體對CGRP(例如人G!-CGRP)的親合力(Ko)可以是約0.02到約200nM。在一些實(shí)施方案中，親合力為下述任何約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM或約2pM。在一些實(shí)施方案中，親合力少于下述任何約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM。測定抗體對CGRP的親合力的一種方式是通過測量抗體的單功能Fab片段的親合力。為了獲得單功能的Fab片段，可以用木瓜蛋白酶切割抗體(例如IgG)或重組表達(dá)?？梢酝ㄟ^裝備有固定的鏈霉親和素感受芯片(SA)的表面等離振子共振(Biacore3000TM表面等離振子共振(SPR)系統(tǒng)，Biacore,INC,PiscatawayNJ)使用HBS-EP電泳緩沖液(0.01MHEPES,pH7.4、0.15NaCl、3mMEDTA、0.005%v/v表面活性劑P20)測定抗體的抗CGRPFab片段的親和力?？梢栽贖BS-EP緩沖液中將生物素化的人CGRP(或任何其它CGRP)稀釋為少于0.5ug/mL的濃度，并使用不同的接觸時間將其注射越過個體芯片通道，以達(dá)到兩種范圍的抗原密度用于詳細(xì)動力學(xué)研究的50-200響應(yīng)單位(RU)或用于篩選實(shí)驗(yàn)的800-1,000RU。再生研究顯示25%v/v乙醇中25mMNaOH有效地去除了結(jié)合的Fab同時維持芯片上多于200個注射的CGRP活性。典型地，將純化的Fab樣品的連續(xù)稀釋(針對0.1-10x評估的Ko的濃度)以100Ad7分鐘注射1分鐘，并允許至多2小時的解離時間。通過ELISA禾tV或SDS-PAGE電泳，使用已知濃度的Fab(通過氨基酸分析測定)作為標(biāo)準(zhǔn)測定Fab蛋白質(zhì)的濃度。使用BlAevaluation程序，通過將數(shù)據(jù)整體與1:1Langmuir結(jié)合模型(Karlsson,R.Roos,H.Fagerstam,L.Petersson，B.(1994).MethodsEnzymology6.99-110)擬合，同時獲得動力學(xué)結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。平衡解高常數(shù)(Kd)值作為k。ff/k。n計算。該方案適用于測定抗體對任何CGRP的親合力，所述CGRP包括人CGRP、另一哺乳動物的CGRP(例如小鼠CGRP、大鼠CGRP、靈長類CGRP)以及不同形式的CGRP(例如a和/3形式)。抗體的親合力通常在25。C下測量，但是也可以在37C測量。可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法來制造抗CGRP拮抗劑抗體。免疫宿主動物的途徑和時間表通常與如本文所進(jìn)一步描述的、用于抗體刺激和生產(chǎn)的'、確定的和常規(guī)的技術(shù)一致。用于生產(chǎn)人和小鼠抗體的一般技術(shù)是本領(lǐng)域已知的并在本文被描述了。本發(fā)明包括任何哺乳動物受試者(包括人)或來自其中的生產(chǎn)抗體的細(xì)胞可以被加工，用作生產(chǎn)哺乳動物(包括人)雜交瘤細(xì)胞系的基礎(chǔ)。典型地，用一定量的免疫原(包括本文所述的免疫原)腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、口、皮下、腳掌內(nèi)和/或皮內(nèi)接種宿主細(xì)胞?？梢允褂肒ohler，B.andMilstein，C.(1975)Nature256:495-497的或被Buck,D.W.,etal.，InVitro,18:377-381(1982)修飾的一般體細(xì)胞雜交技術(shù)，從淋巴細(xì)胞和無限增殖化骨髓瘤細(xì)胞制備雜交瘤?？梢垣@得的骨髓瘤株系(包括但不限于X63-Ag8.653和來自SalkInstitute,CellDistributionCenter,SanDiego,Calif.,美國的骨髓瘤株系)可用于雜交中。通常，該技術(shù)涉及使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的促融劑(如聚乙二醇)或通過電手段融合骨髓瘤細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。融合后將細(xì)胞從融合培養(yǎng)基中分離并在選擇性生長培養(yǎng)基如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸腺嘧啶(HAT)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以消除未雜交的親本細(xì)胞。可用本文所述的補(bǔ)充了血清或未補(bǔ)充血清的任何培養(yǎng)基lai培養(yǎng)分泌單克隆抗體的雜交瘤。作為細(xì)胞融合技術(shù)的另一選擇，可以使用EBV無限增殖化B細(xì)胞生產(chǎn)本發(fā)明的抗CGRP單克隆抗體。如果需要，將雜交瘤擴(kuò)展并亞克隆，并通過常規(guī)免疫測定步驟(例如放射免疫測定、酶免疫測定或熒光免疫測定)來測試上清液的抗免疫原活性?？捎米骺贵w來源的雜交瘤包括生產(chǎn)對CGRP特異的單克隆抗體或其部分的親本雜交瘤的所有衍生的后代細(xì)胞?？梢允褂靡阎襟E體外或體內(nèi)培養(yǎng)生產(chǎn)這類抗體的雜交瘤。如果需要的化，可以通過常規(guī)免疫球蛋白純化步驟(如硫酸銨沉淀、凝膠電泳、透析、色譜法和超濾)從培養(yǎng)基或體液中分離單克隆抗體。如果存在不期望的活性，可例如通過將制劑流過吸附劑并將期望的抗體從免疫原上洗脫或釋放來去除，所述吸附劑由附著在固相上的免疫原組成。用人CGRP或含有靶氨基酸序列的片段免疫宿主動物能夠得到一群抗體(例如單克隆抗體)，所述靶氨基酸序列使用雙功能試劑或衍生試劑與在要免疫的物種中是免疫原性的蛋白質(zhì)綴合，所述蛋白質(zhì)為例如鑰孔蟲戚血藍(lán)素(keyholelimpethemocyanin)、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制劑，所述雙功能試劑或衍生試劑為例如馬來酰亞胺苯甲酰硫代琥珀酰亞胺(maleimidobenzoylsulfosuccinimide)酉旨(通過半胱氨酸歹戔基纟叕合)、N-羥基琥珀酰亞胺酯(通過賴氨酸殘基)、丙烯醛、琥珀酸酐、SOC12或R1N=C=NR，其中R或R1是不同的烷基。如果需要的話，可以對感興趣的抗CGRP拮抗劑抗體(單克隆或多克隆)進(jìn)行測序，隨后可將多核苷酸序列克隆進(jìn)載體中用于表達(dá)或繁殖。編碼感興趣的抗體的序列可以在宿主細(xì)胞中的載體中維持，然后可以將宿主細(xì)胞擴(kuò)展或冷凍用于進(jìn)一步的用途?；蛘?，可將多核苷酸序列用于遺傳操作，以"人源化"抗體或改善抗體的親和力或其它特性。例如，恒定區(qū)可以被改造得更像人恒定區(qū)，從而如果抗體被用于臨床試驗(yàn)和在人中治療時避免免疫應(yīng)答?？梢云谕z傳改造抗體序列，以獲得對CGRP的更大親和力和在抑制CGRP中的更強(qiáng)效力。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，可以對抗CGRP拮抗劑抗體進(jìn)行一個或多個多核苷酸改變并仍然維持其對CGRP的結(jié)合能力。人源化單克隆抗體存在四個一般步驟。這些步驟為(l)確定初始抗體輕和重可變結(jié)構(gòu)域的核苷酸和預(yù)測的氨基酸序列(2)設(shè)計人源化抗體，即決定在人源化過程中使用何種抗體框架區(qū)(3)實(shí)際的人源化方法/技術(shù)和(4)人源化抗體的轉(zhuǎn)染和表達(dá)。參閱例如U.S.專利Nos.4,816,567、5,807,715、5,866,692、6,331,415、5,530,101、5,693,761、5,693,762、5,585,089禾口6,180,370。包含來自于非人免疫球蛋白的抗原結(jié)合位點(diǎn)的大量"人源化"抗體分子已經(jīng)被描述過，包括下述嵌合抗體，所述嵌合抗體具有與人恒定區(qū)融合的嚙齒動物V區(qū)或經(jīng)修飾的嚙齒動物V區(qū)以及它們結(jié)合的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。參閱例如Winteretal.Nature349:293-299(1991),Lobuglioetal.Proc.Nat.Acad.Sci.USA86:4220-4224(1989),Shawetal.JImmunol.138:4534-4538(1987)和Brownetal.CancerRes.47:3577-3583(1987)。其它參考文獻(xiàn)描述了在與適當(dāng)?shù)娜丝贵w恒定區(qū)融合之前移植進(jìn)人支持框架區(qū)(FR)的嚙齒動物CDR。參閱例如Riechmannetal.Nature332:323-327(1988),Verhoeyenetal.Science239:1534-1536(1988)和JonesetaLNature321:522-525(1986)。另一參考文獻(xiàn)描述了被重組修飾的嚙齒動物框架區(qū)支持的嚙齒動物CDR。參閱例如歐洲專利申請No.0519596。這些"人源化"分子被設(shè)計為最小化對嚙齒動物抗人抗體分子的不期望的免疫應(yīng)答，所述免疫應(yīng)答限制了這些部分在人受體中治療性應(yīng)用的持續(xù)時間和有效性。例如，可以工程改造抗體恒定區(qū)，使得其為免疫惰性的(例如不引發(fā)補(bǔ)體裂解)。參閱例如PCT公開No.PCT/GB99/01441;UK專利申請No.9809951.8。還可以使用的人源化抗體的其它方法由Daughertyetal.，Nucl.AcidsRes.19:2471-2476(1991)和U.S.專利Nos.6,180,377;6,054,297;5,997,867;5,866,692;6,210,671和6,350,861和PCT公開No.WO01/27160中公開。再或者，可以通過使用可商業(yè)獲得的小鼠獲得完全的人抗體，所述小鼠已經(jīng)被工程改造為表達(dá)特異的人免疫球蛋白蛋白質(zhì)。被設(shè)計為生產(chǎn)更期望的(例如完全人抗體)或更有活力的免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)基因動物也可以用于產(chǎn)生人源化的抗體或人抗體。這類技術(shù)的例子為來自Abgenix,Inc.(Fremont,CA)的Xenomousetm和來自Medarex,Inc.(Princeton,NJ)的TCMouse?；蛘?，可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法重組制造和表達(dá)抗體。又或者，可以通過噬菌體展示技術(shù)重組制造抗體。參閱例如U.S.專利Nos.5,565，332;5,580,717;5,733，743;和6,265,150;和Winteretal.,Amrn.Rev.Immunol.12:433-455(1994)。或可以使用噬菌體展示技術(shù)(McCaffertyetal.,Nature348:552-553(1990))從來自未免疫的供體的免疫球蛋白可變(V)結(jié)構(gòu)域基因倉庫中體外生產(chǎn)人抗體和抗體片段。根據(jù)該技術(shù)，將抗體V結(jié)構(gòu)域在讀碼框內(nèi)克隆進(jìn)絲狀噬菌體(如MB或fd)的主要或次要外殼蛋白中，并作為噬菌體顆粒表面上的功能性抗體片段展示。因?yàn)榻z狀顆粒含有噬菌體基因組的單鏈DNA拷貝，所以基于抗體功能特征的選擇也導(dǎo)致選擇編碼顯示這些特征的抗體的基因。因此，噬菌體模擬B細(xì)胞的一些特征。噬菌體展示可以以多種形式進(jìn)行；綜述參閱例如Johnson,KevinS.andChisweli,DavidJ.，CurrentOpinioninStructuralBiology3:564-571(1993)?？梢允褂萌舾煞N來源的V基因區(qū)段用于噬菌體展示。Clacksonetal.,Nature352:624-628(1991)從來自免疫小鼠脾中的V基因小量隨機(jī)組合文庫中分離的不同的抗噁唑酮抗體陣列?；疽勒誐arketal.,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)或Griffithetal.,EMBOJ.12:725-734(1993)所述的技術(shù)可以構(gòu)建來自未免疫的人供體的V基因倉庫并分離針對不同抗原(包括自身抗原)陣列的抗體。天然免疫應(yīng)答中，抗體基因以高速率累積突變(體細(xì)胞高度突變)。一些引入的改變會賦予更高的親和力，并且在隨后的抗原激發(fā)中優(yōu)先地復(fù)制和分化展示高親和力表面免疫球蛋白的B細(xì)胞?？梢酝ㄟ^使用已知為"鏈改組(chainshuffling)"(Marks，etal.,Bio/Teclmol.10:779-783(1992))的技術(shù)模擬該天然過程。在該方法中，通過噬菌體展示獲得的"原始"人抗體的親和力可以如下被改進(jìn)用得自未免疫的供體的V結(jié)構(gòu)域基因天然存在的變體倉庫(倉庫)連續(xù)地置換重鏈和輕鏈的V區(qū)域基因。該技術(shù)允許生產(chǎn)具有pM-nM范圍內(nèi)親和力的抗體和抗體片段。制造非常大的噬菌體抗體倉庫(也已知為"所有之母文庫(themother-of-alllibraries)")的策略已經(jīng)由Waterhouseetal"Nucl.AcidsRes.21:2265-2266(1993)描述。基因改組也可以用于從嚙齒動物抗體中衍生人抗體，其中人抗體具有與初始的嚙齒動物抗體相似的親和力和特異性。根據(jù)該方法(其也被稱作"表位印記")，通過噬菌體展示技術(shù)獲得的嚙齒動物抗體的重鏈或輕鏈V結(jié)構(gòu)域基因被置換為人V結(jié)構(gòu)域基因倉庫，創(chuàng)建了嚙齒動物-人嵌合體。在抗原上的選擇導(dǎo)致能夠重建功能性抗原結(jié)合位點(diǎn)(即表位支配(印記)配偶體的選擇)的人可變區(qū)的分離。重復(fù)該過程從而置換剩余的嚙齒動物V結(jié)構(gòu)域時，獲得人抗體(參閱1993年四月1日公開的PCT公開No.WO93/06213)。與通過CDR移植對嚙齒動物抗體的常規(guī)人源化不同，該技術(shù)提供了完全的人抗體，其不具有嚙齒動物來源的框架或CDR殘基。顯然，盡管上文的討論僅涉及人源化的抗體，但是所討論的一般性原則適用于定制用于例如犬、貓、靈長類、馬和牛的抗體。還顯而易見的是本文所述的人源化抗體的一個或多個方面(例如CDR移植、框架突變和CDR突變)可以組合。可按下文所述來重組制造抗體首先將生產(chǎn)多種抗體或一種抗體的細(xì)胞從宿主動物中分離，獲得基因序列，并使用該基因序列在宿主細(xì)胞(例如CHO細(xì)胞)中重組表達(dá)抗體?？墒褂玫牧硪环椒ㄊ窃谥参?例如煙草)或轉(zhuǎn)基因乳中表達(dá)抗體序列。用于在植物或乳中重組表達(dá)抗體的方法已經(jīng)被公開。參閱例如Peeters,etal.Vaccine19:2756(2001);Lonberg,N.andD.HuszarInt.Rev.Immunol13:65(1995);禾口Pollock,etal.，JImmunolMethods231:147(1999)。用于制造抗體衍生物(例如人源化的、單鏈的等)的方法是本領(lǐng)域己知的。免疫測定和流式細(xì)胞分選技術(shù)如熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)也可以用于分離對CGRP特異的抗體。抗體可以結(jié)合與許多不同的運(yùn)載體結(jié)合。運(yùn)載體可以是活性的和/或惰性的。公知的運(yùn)載體的例子包括聚丙烯、聚苯乙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龍、淀粉酶、玻璃、天然和經(jīng)修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁石。就本發(fā)明的目的而言，運(yùn)載體的特性可以是可溶的或不溶的。本領(lǐng)域技術(shù)人員會直到用于結(jié)合抗體的其它合適運(yùn)載體，或應(yīng)該能夠使用常規(guī)實(shí)驗(yàn)確定。在一些實(shí)施方案中，運(yùn)載體包括耙向心肌膜的部分。容易使用常規(guī)步驟(例如通過使用能夠特異結(jié)合下屬基因的寡核苷酸探針，所述基因編碼單克隆抗體的重鏈和輕鏈)對編碼單克隆抗體的DNA進(jìn)行分離和測序。雜交瘤細(xì)胞左右這類DNA優(yōu)選的來源作用。一旦被分離，可以將DNA置于表達(dá)載體(例如PCT公開No.WO87/04462中公開的表達(dá)載體)中，然后將其轉(zhuǎn)染進(jìn)宿主細(xì)胞中獲得重組宿主細(xì)胞中單克隆抗體的合成，所述宿主細(xì)胞例如以其它方式不生產(chǎn)免疫球蛋白蛋白質(zhì)的大腸桿菌細(xì)胞、猿猴COS細(xì)胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞或骨髓瘤細(xì)胞。參閱例如PCT公開No.WO87/04462。DNA也可以被修飾，例如通過將同源鼠序列位置替換為人重鏈和輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域的編碼序列(Morrisonetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.81:6851(1984))，或通過將編碼非免疫球蛋白多肽的序列的全部或部分與免疫球蛋白編碼序列共價接合。以該方式制備"嵌合的"或"雜交的"抗體，其具有本文的抗CGRP單克隆抗體的結(jié)合特異性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的方法鑒定或表征來自抗體的抗CGRP拮抗劑抗體和多肽，從而探測和/或測量CGRP生物活性的降低、緩和或中和。例如，也可以通過將候選試劑與CGRP孵育并監(jiān)測任一種或多種以下特性來鑒定抗CGRP拮抗劑抗體(a)結(jié)合CGRP;(b)封閉CGRP與其受體結(jié)合；(c)封閉或降低CGRP受體活化(包括cAMP活化)；(d)抑制CGRP生物活性或由CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游途徑；(e)預(yù)防、改善或治療頭痛(例如偏頭痛)的任何方面；(f)提高CGRP的清除率；和(g)抑制(減少)CGRP合成、生產(chǎn)或釋放。在一些實(shí)施方案中，通過將候選試劑與CGRP孵育并監(jiān)測CGRP的結(jié)合和/或伴隨的生物活性降低或中和來鑒定抗CGRP拮抗劑抗體或多肽?？梢杂媒?jīng)純化的CGRP多肽，或用天然表達(dá)CGRP多肽或被轉(zhuǎn)染以表達(dá)CGRP多肽的細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合測定。在一個實(shí)施方案中，結(jié)合測定是競爭性的結(jié)合測定，其中評價候選抗體與已知抗CGRP拮抗劑競爭結(jié)合CGRP的能力。該測試可以以多種形式進(jìn)行，包括ELISA形式。在其它實(shí)施方案中，通過將候選試劑與CGRP孵育，并監(jiān)測結(jié)合和伴隨的對細(xì)胞表面上表達(dá)的CGRP受體活化抑制來鑒定抗CGRP拮抗劑抗體。在最初的鑒定后，可以通過生物測定進(jìn)一步證實(shí)和精制候選抗CGRP拮抗劑抗體的活性，所述生物測定已知用于檢驗(yàn)靶向的生物活性。或者，可以使用生物測定直接篩選候選者。例如，CGRP促進(jìn)響應(yīng)細(xì)胞中大量可測量的改變。這些改變包括但不限于細(xì)胞(例如SK-N-MC細(xì)胞)中cAMP的刺激。也可以使用動物模型測量拮抗劑活性，例如測量由刺激大鼠隱神經(jīng)誘導(dǎo)的皮膚血管擴(kuò)張。Escottetal.,Br.J.Pharmacol.110:772-776,1993?？蛇M(jìn)一步使用頭痛(例如偏頭痛)的動物模型檢驗(yàn)拮抗劑抗體或多肽的效力。Reuter,etal.,FunctionalNeurology(15)Suppl.3,2000。用于鑒定和表征抗CGRP拮抗劑抗體的方法中的一些在實(shí)施例中詳細(xì)描述?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的方法表征抗CGRP拮抗劑抗體。例如，一種方法是鑒定其結(jié)合的表位，或"表位作圖"。存在本領(lǐng)域已知的用于對蛋白質(zhì)上的表位位置作圖和表征的許多方法，包括解答抗體-抗原復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)、競爭測定、基因片段表達(dá)測定，和基于合成肽的測定，例如描述于Chapter11ofHarlowandLane,UsingAntibodies,aLaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor，NewYork,1999中。在額外的例子中，可使用表位作圖確定抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合的序列。表位作圖可以從多種來源商業(yè)獲得，例如PepscanSystems(Edelhertweg15,8219PHLelystad,荷蘭)。表位可以是線性表位(即包含在單鏈氨基酸中)或通過氨基酸的三維相互作用形成的構(gòu)型表位(其不必須包含在單鏈中)。多種長度(例如至少4-6個氨基酸長)的肽可以被分離或(例如重組地)合成，并用于與抗CGRP拮抗劑抗體的結(jié)合測定中。在另一例子中，抗CGRP拮抗劑抗體結(jié)合的表位可以通過使用來自CGRP序列的重疊肽并測定抗CGRP拮抗劑抗體的結(jié)合而在系統(tǒng)性篩選中確定。根據(jù)基因片段表達(dá)測定，隨機(jī)地或通過特異的遺傳構(gòu)建使編碼CGRP的開放讀碼框成為片段，并測定待所表達(dá)的CGRP片段與待檢驗(yàn)的抗體的反應(yīng)性。例如可以通過PCR生產(chǎn)基因片段，隨后在存在放射性氨基酸的情況下體外轉(zhuǎn)錄和翻譯為蛋白質(zhì)。然后通過免疫沉淀和凝膠電泳測定抗體與放射性標(biāo)記的CGRP片段的結(jié)合。也可以通過使用在噬菌體顆粒表面上展示的隨機(jī)肽序列大文庫(噬菌體文庫)鑒定某些表位?；蛘?，可以在簡單的結(jié)合測定中測試確定的重疊肽片段文庫對測試抗體的結(jié)合。在一個額外的例子中，可以進(jìn)行抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域誘變、結(jié)構(gòu)域切換實(shí)驗(yàn)和丙氨酸掃描誘變，來鑒定表位結(jié)合所需的、充分的和/或必要的殘基。例如，可以使用突變體CGRP進(jìn)行結(jié)構(gòu)域切換實(shí)驗(yàn)，其中CGRP多肽的多個片段已經(jīng)被置換(切換)為來自密切相關(guān)的、但是抗原性不同的蛋白質(zhì)(例如神經(jīng)營養(yǎng)因子蛋白質(zhì)家族的另一成員)的序列?？梢酝ㄟ^評估抗體與突變體CGRP的結(jié)合，來評估特定CGRP片段對抗體結(jié)合的重要性。可用于表征抗CGRP拮抗劑抗體的又一方法是使用競爭測定法(其使用已知結(jié)合相同抗原的其它抗體，即CGRP上的多個片段)來確定抗CGRP拮抗劑抗體是否與其它抗體結(jié)合相同的表位。競爭測定法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的?？梢允褂帽磉_(dá)載體來指導(dǎo)抗CGRP拮抗劑抗體的表達(dá)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉使用表達(dá)載體體內(nèi)獲得外源蛋白質(zhì)的表達(dá)。參閱例如U.S.專利Nos.6,436,908;6,413,942;和6,376,471。表達(dá)載體的施用包括局部或全身施用，包括注射、口施用、基因槍或插入導(dǎo)管施用和局部施用。在另一實(shí)施方案中，表達(dá)載體被直接施用至交感千或神經(jīng)節(jié)，或施用進(jìn)冠狀動脈、心房、腦室或心包中。也可以使用含有表達(dá)載體或亞基因組多核苷酸的治療性組合物的定向遞送。受體介導(dǎo)的DNA遞送技術(shù)描述于例如Findeisetal.,TrendsBiotechnol.(1993)11:202;Chiouetal.,GeneTherapeutics:MethodsAndApplicationsOfDirectGeneTransfer(J.A.Wolff,ed.)(1994);Wuetal"J.Biol.Chem.(1988)263:621;Wuetal.,J.Biol.Chem.(1994)269:542;Zenkeetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655;Wuetal.,J.Biol.Chem.(1991)266:338中。在基因治療方案中，對局部施用而言，含有多核苷酸的治療性組合物在約100mg到約200mgDNA的范圍內(nèi)被施用。在基因治療方案中也可以使用約500ng到約50mg、約1//g到約2mg、約5/xg到約500/ig和約20將到約100DNA范圍內(nèi)的濃度。可以使用基因遞送媒介遞送治療性多核苷酸和多肽?；蜻f送媒介可以是病毒或非病毒來源的(一般參閱Jolly,CancerGeneTherapy(1994)1:51;Kimura,HumanGeneTherapy(1994)5:845;Connelly,HumanGeneTherapy(1995)1:185;和Kaplitt,NatureGenetics(1994)6:148)。這類編碼序列的表達(dá)可以使用內(nèi)源哺乳動物或異源啟動子誘導(dǎo)。編碼序列的表達(dá)可以是組成型的或受調(diào)節(jié)的。用于遞送期望的多核苷酸并在期望的宿主細(xì)胞中表達(dá)的、基于病毒的載體是本領(lǐng)域公知的。示范性的基于病毒的媒介包括，但不限于重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒(參閱例如PCT公開Nos.WO90/07936;WO94/03622;WO93/25698;WO93/25234;WO93/11230;WO93/10218;WO91/02805;U.S.專利Nos.5，219,740和4,777,127;GB專利No.2,200,651;和EP專利No.0345242)、基于a病毒的載體(例如Sindbis病毒載體、Semliki森林病毒(ATCCVR-67;ATCCVR-1247)羅斯河病毒(ATCCVR-373;ATCCVR-1246)和Venezuelan馬腦炎病毒(ATCCVR-923;ATCCVR-1250;ATCCVR1249;ATCCVR-532))和腺伴隨病毒(AAV)載體(參閱例如PCT公開Nos.WO94/12649,WO93/03769;WO93/19191;WO94/28938;WO95/11984和WO95/00655)。也可以使用如Curiel，Hum.GeneTher.(1992)3:147中所述的與殺死的腺病毒連接的DNA的施用。也可以使用非病毒的遞送媒介和方法，包括但不限于與殺死的腺病毒單獨(dú)連接或不連接的聚陽離子凝縮的DNA(參閱例如Curiel,Hum.GeneTher.(1992)3:147);配體連接的DNA(參閱例如Wu,丄Biol.Chem.(1989)264:16985);真核細(xì)胞遞送媒介細(xì)胞(參閱例如U.S.專利No.5,814,482;PCT公開Nos.WO95/07994;WO96/17072;WO95/30763;和WO97/42338)和核電荷中和或與細(xì)胞膜融合。也可以使用裸DNA。示范性的裸DNA引入方法描述于PCT專利No.WO90/11092禾UU.S.專利No.5,580,859中?？勺鳛榛蜻f送媒介作用的脂質(zhì)體描述于U.S.專利No.5,422,120;PCT公開Nos.WO95/13796;WO94/23697;WO91A4445;和EP0524968中。其它途徑描述于PWlip，Mol.CellBiol.(1994)14:2411,和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sd.(1994)91:1581中。C.抗體G1和相關(guān)抗體、多肽、多核苷酸、載體和宿主細(xì)胞本發(fā)明包括組合物(包括藥物組合物)，所述組合物包含表6所示的抗體G1及其變體，或來自表6所示抗體G1及其變體的多肽；和包含編碼抗體Gl及其變體或多肽的序列的多核苷酸。本文使用組合物包括與CGRP結(jié)合的一種或多種抗體或多肽(其可以是或不適抗體)和/或一種或多種多核苷酸，所述多核苷酸包含編碼與CGRP結(jié)合的一種或多種抗體或多肽的序列。這些組合物可進(jìn)一步包含本領(lǐng)域公知的合適賦形劑，如可藥用的賦形劑(包括緩沖液)。本發(fā)明的抗CGRP拮抗劑抗體和多肽通過以下任何(一種或多種)特征表征(a)結(jié)合CGRP;(b)封閉CGRP與其受體結(jié)合；(c)封閉或降低CGRP受體活化(包括cAMP活化)；(d)抑制CGRP生物活性或下調(diào)由CGRP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能介導(dǎo)的下游途徑；(e)預(yù)防、改善或治療頭痛(例如偏頭痛)的任何方面；(f)提高CGRP的清除率；禾Q(g)抑制(減少)CGRP合成、生產(chǎn)或釋放。因此，本發(fā)明提供以下之任何，或包含以下之任何的組合物(包括藥物組合物)(a)表6所示抗體Gl或其變體；(b)表6所示抗體Gl或其變體的片段或區(qū)域；(c)表6所示抗體Gl或其變體的輕鏈；(d)表6所示抗體Gl或其變體的重鏈；(e)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)；(f)來自表6所示抗體Gl或其變體的一個或多個CDR(一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR);(g)來自抗體Gl重鏈的CDRH3;(h)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈的CDRL3;(i)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈的三個CDR;(j)來自表6所示抗體Gl或其變體重鏈的三個CDR;(k)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈的三個CDR和重鏈的三個CDR;和(I)包含從(b)到(k)中任一項(xiàng)的抗體。本發(fā)明還提供了包含上述之一個或多個的多肽。抗體Gl的CDR部分(包括Chothia和Kabat的CDR)在圖5中圖解說明。CDR區(qū)的確定屬于本領(lǐng)域的技術(shù)。應(yīng)理解在一些實(shí)施方案中，CDR可以是Kabat禾HChothiaCDR的組合(也稱作"組合CDR"或"擴(kuò)展的CDR")。在一些實(shí)施方案中，CDR是KabatCDR。在其它實(shí)施方案中，CDR是ChothiaCDR。換言之，在有多于一種CDR的實(shí)施方案中，CDR可以是Kabat、Chothia、組合CDR之任何或其組合。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了下述多肽(其可以是或不是抗體)，所述多肽包含至少一個CDR、至少兩個、至少三個、或至少四個、至少五個、或至少所有六個CDR，所述CDR與表6所示Gl或其變體的至少一個CDR、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個或所有六個CDR基本相同。其它實(shí)施方案包括具有至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR的抗體，所述CDR與Gl的或來自Gl的至少兩個、三個、四個、五個或六個CDR基本相同。在一些實(shí)施方案中，所述至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR與表6所示Gl或其變體的至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR為至少約85%、86%、87%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。應(yīng)理解就本發(fā)明的目的而言，結(jié)合特異性和/或總體活性通常恒定，盡管活性程度與表6所示Gl或其變體相比可改變(可以更大或更小)。本發(fā)明還提供了一種多肽(其可以是或不是抗體)，所述多肽包含表6所示G1或其變體的氨基酸序列，所述氨基酸具有以下之任何表6所示Gl或其變體序列的至少5個連續(xù)氨基酸、至少8個連續(xù)氨基酸、至少約IO個連續(xù)氨基酸、至少約15個連續(xù)氨基酸、至少約20個連續(xù)氨基酸、至少約25個連續(xù)氨基酸、至少約30個連續(xù)氨基酸，其中至少三個氨基酸來自表6所示G1或其變體的可變區(qū)(圖5)。在一個實(shí)施方案中，可變區(qū)來自Gl的輕鏈。在另一實(shí)施方案中，可變區(qū)來自Gl的重鏈。示范性的多肽具有來自Gl重鏈和輕鏈二者可變區(qū)的連續(xù)氨基酸(長度如上所述)。在另一實(shí)施方案中，5個(或更多的)連續(xù)氨基酸來自圖5所示的G1的互補(bǔ)性決定區(qū)(CDR)。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)氨基酸來自Gl的可變區(qū)?？笴GRP拮抗劑抗體和多肽對CGRP(例如人ce-CGRP)的奈合力(Kd)可以是約0.06到約200nM。在一些實(shí)施方案中，親合力為約200nM、100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM、約60pM、約50pM、約20pM、約15pM、約10pM、約5pM或約2pM之^壬何。在一些實(shí)施方案中，親合力少于約250nM、約200nM、約100nM、約50nM、約10nM、約1nM、約500pM、約100pM或約50pM之任何。本發(fā)明還提供了制造任何這些抗體或多肽的方法?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的步驟來制造本發(fā)明的抗體?？梢酝ㄟ^抗體的蛋白水解或其它降解，通過如上所述的重組方法(即單個或融合的多肽)或通過化學(xué)合成來生產(chǎn)多肽?？贵w的多肽，特別是最多約50個氨基酸的較短多肽，通過化學(xué)合成被便利地制造。化學(xué)合成的方法是本領(lǐng)域已知的，并可商業(yè)獲得。例如，可以通過自動多肽合成儀使用固相方法生產(chǎn)抗體。也參閱U.S.專利Nos.5,807,715;4，816,567;和6,331,415。又或者，可使用本領(lǐng)域公知的步驟重組制造抗體。在一個實(shí)施方案中，多核苷酸包含SEQIDN0:9和SEQIDNO:IO中所示編碼抗體Gl的重鏈和/或輕鏈可變區(qū)的序列。在另一實(shí)施方案中，包含SEQIDNO:9和SEQIDNO:10中所示核苷酸序列的多核苷酸被克隆進(jìn)一個或多個載體中用于表達(dá)或繁殖。編碼感興趣的抗體的序列可以在宿主細(xì)胞中維持于載體中，然后可以將宿主細(xì)胞擴(kuò)展或冰凍用于將來的用途。載體(包括表達(dá)載體)和宿主細(xì)胞在本文進(jìn)一步描述。本發(fā)明還包括本發(fā)明抗體(如Gl)的單鏈可變區(qū)片段("scFv")。Gl單鏈可變區(qū)片段通過使用短連接肽將輕鏈和/或重鏈的可變區(qū)連接制造。Birdetal.(1988)Science242:423-426。連接肽的一個例子是(GGGGS)3，其在一個可變區(qū)的羧基端和其它可變區(qū)的氨基端之間連接大約3.5nm。已經(jīng)設(shè)計和使用了其它序列結(jié)構(gòu)。Birdetal.(1988)。接頭隨后可以被修飾具有額外的功能，例如與藥物結(jié)合或與固體支持物結(jié)合?？梢灾亟M地或合成地生產(chǎn)單鏈變體。對于scFv的合成生產(chǎn)而言，可以使用自動化合成儀。對于scFv的重組生產(chǎn)而言，可以將含有編碼scFv的多核苷酸的合適質(zhì)粒引入合適的宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞為真核(如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細(xì)胞)或原核(如大腸桿菌)的。編碼感興趣的scFv的多核苷酸可以通過常規(guī)操作如多核苷酸的連接來制造?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)純化技術(shù)分離得到的scFv。本發(fā)明還也包括其它形式的單鏈抗體如雙體。雙體為二價的、雙特異性的抗體，其中VH和VL結(jié)構(gòu)域在單多肽鏈上表達(dá)，但是使用的接頭太短而不允許相同鏈上兩個結(jié)構(gòu)域之間配對，從而迫使該結(jié)構(gòu)域與另一鏈的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)域配對并產(chǎn)生兩個抗原結(jié)合位點(diǎn)(參閱例如Holliger,P.,etal.(1993)Proc.Natl.AcadSci.USA90:6444-6448;Poljak,R.J.，etal.(1994)Structure2:1121-1123)。例如，雙特異性抗體、對至少兩種不同抗原具有結(jié)合特異性的單克隆抗體可以使用本文公開的抗體制備。用于制造雙特異性抗體的方法是本領(lǐng)域已矢口的(參閱例如Sureshetal.,1986，MethodsinEnzymology121:210)。傳統(tǒng)上，雙特異性抗體的重組生產(chǎn)是以兩種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對的共表達(dá)為基礎(chǔ)的，其中兩個重鏈具有不同的特異性(MillsteinandCuello,1983,Nature305,537-539)。根據(jù)制造雙特異性抗體的一種途徑，將具有期望的結(jié)合特異性(抗體-抗原結(jié)合位點(diǎn))的抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白恒定區(qū)序列融合。該融合物優(yōu)選帶有免疫球蛋白重鏈恒定結(jié)構(gòu)域，其包含至少一部分鉸鏈，CH2和CH3區(qū)。優(yōu)選第一重鏈恒定區(qū)(CH1)存在于至少一個融合物中，所述恒定區(qū)含有輕鏈結(jié)合必需的位點(diǎn)。編碼免疫球蛋白重鏈融合物和期望時編碼免疫球蛋白輕鏈的DNA被插入獨(dú)立的表達(dá)載體中，并轉(zhuǎn)染進(jìn)合適的宿主生物中。這提供了在下述實(shí)施方案中調(diào)節(jié)三個多肽片段相互間比例的巨大靈活性，所述實(shí)施方案的構(gòu)建中等比例的三種多肽鏈的使用得到最適的產(chǎn)率。然而，當(dāng)?shù)缺壤闹辽賰煞N多肽鏈導(dǎo)致高產(chǎn)率時，或當(dāng)比例不具特別的重要性時，可能將兩種或三種多肽鏈插入一個表達(dá)載體中。在一種途徑中，雙特異性抗體由一個臂上具有第一結(jié)合特異性的雜種免疫球蛋白重鏈與另一臂上的雜種免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(提供第二種結(jié)合特異性)組成。該不對稱的結(jié)構(gòu)(免疫球蛋白輕鏈僅在雙特異性分子的一半中)便于將期望的雙特異性化合物從不期望的免疫球蛋白鏈組合中分離。該途徑描述于1994年3月3日公開的PCT公開No.WO94/04690。包含兩種共價連接的抗體的雜綴合物抗體也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。這類抗體已經(jīng)被用于將免疫系統(tǒng)細(xì)胞靶向不期望的細(xì)胞(U.S.專利No.4,676,980)和用于治療HIV感染(PCT申請公開Nos.WO91/00360和WO92/200373;EP03089)。雜綴合物抗體可以使用任何便利的交聯(lián)方法制造。合適的交聯(lián)劑和技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并被描述于U.S.專利No.4，676,980中。也可以使用已知的合成蛋白質(zhì)化學(xué)體外制備嵌合抗體或雜種抗體，包括涉及交聯(lián)劑的化學(xué)。例如，可以使用二硫化物交換反應(yīng)或通過形成硫醚鍵來構(gòu)建免疫毒素。用于該目的的合適試劑包括亞氨硫醇(iminothiolate)和甲基_4_巰基丁基咪唑(mercaptobutyrimidate)?？梢允褂萌魏伪绢I(lǐng)域已知的方法制造人源化的抗體，其包含表6所示抗體Gl或其變體的一種或多種CDR，或衍生自表6所示抗體Gl或其變體的一種或多種CDR。例如，可使用四個一般步驟人源化單克隆抗體。本發(fā)明包括對表6所示抗體Gl或其變體的修飾，包括不顯著影響其特性的功能等效抗體和具有增強(qiáng)的或降低的活性和/或親合力的變體。例如，表6所示抗體Gl或其變體的氨基酸序列可以被突變，以獲得具有期望的對CGRP親合力的抗體。多肽的修飾是本領(lǐng)域的常規(guī)實(shí)踐并不需要在本文詳細(xì)描述。多肽的修飾在實(shí)施例中例證。經(jīng)修飾的多肽的例子包括下述多肽，所述多肽具有氨基酸殘基保守取代、一個或多個氨基酸刪除或添加(其不顯著有害地改變功能活性)、或化學(xué)同系物的使用。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基端融合(其長度范圍從一個殘基到50含有一百或更多個殘基的多肽)，以及單個或多個氮基酸殘基的序列內(nèi)插入。末端插入的例子包括具有N末端甲二磺酰殘基的抗體或與表位標(biāo)簽融合的抗體?？贵w分子的其它插入變體包括酶或多肽與抗體N端或C端的融合，其提高抗體的血清半衰期。取代變體是抗體分子中至少一個氨基酸殘基被去除并在其位置中插入不同的殘基。用于取代誘變的最感興趣的位點(diǎn)包括超變區(qū)，但是也考慮FR變更。保守取代在題目"保守取代"下顯示于表1中。如果這類取代導(dǎo)致生物活性的改變，則可引入更多的重大改變(在表1中稱作"示范性取代")或如下關(guān)于氨基酸家族所進(jìn)一步描述的改變。表l:氨基酸取代<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>抗體生物特征中的取代修飾通過選擇取代來完成，所述取代維持(a)取代區(qū)域中多肽主鏈結(jié)構(gòu)，例如片層或螺旋構(gòu)象，(b)分子靶位點(diǎn)處的電荷或疏水性，或(C)側(cè)鏈體積的作用有顯著差異。天然存在的殘基根據(jù)常見的側(cè)鏈特征被分組(1)非極性的正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、lie;(2)極性不帶電Cys、Ser、Thr、Asn、Gln;(3)酸性(帶負(fù)電):Asp、GIu;(4)堿性(帶正電)Lys、Arg;(5)影響鏈方向的殘基Gly、Pro;和(6)芳香族的Trp、Tyr、Phe、His。可以通過將這些種類之一的成員與另一種類交換進(jìn)行非保守性取代。任何不涉及維持抗體適當(dāng)構(gòu)型的半胱氨酸殘基也可以被取代(通常用絲氨酸)以促進(jìn)分子的氧化穩(wěn)定性并阻止異常的交聯(lián)。相反，可以對抗體添加半胱氨酸鍵以促進(jìn)其穩(wěn)定性，特別是當(dāng)抗體是抗體片段例如Fv片段時。氨基酸修飾的范圍從改變或修飾一個或多個氨基酸到完全重新設(shè)計一個區(qū)域，如可變區(qū)?？勺儏^(qū)中的改變可改變親合力和/或特異性。在一些實(shí)施方案中，在CDR結(jié)構(gòu)域中制造不多于一個到五個保守的氨基酸取代。在其它實(shí)施方案中，在CDR結(jié)構(gòu)域中制造不多于一個到三個保守的氨基酸取代。還在其它實(shí)施方案中，CDR結(jié)構(gòu)域?yàn)镃DRH3和/或CDRL3。修飾還包括糖基化的和未糖基化的多肽，以及帶有其它翻譯后修飾的多肽，例如用不同的糖糖基化、乙?；土姿峄？贵w在它們的恒定區(qū)中保守的位置被糖基化(JefferisandLimd,1997,Chem.Immunol.65:111-128;WrightandMorrison,1997,TibTECH15:26-32)。免疫球蛋白的寡糖側(cè)鏈影響蛋白質(zhì)的功能(Boydetal.，1996,Mol.Immunol.32:1311-1318;WittweandHoward,1990,Biochem.29:4175-4180)和糖蛋白部分之間的分子內(nèi)相互作用，這可影響糖蛋白的構(gòu)象和所表現(xiàn)的三維表面(HefferisandLund，supra;WyssandWagner,1996,CurrentOpin.Biotech.7:409-416)。寡糖也可以作用于將給定的糖蛋白靶向基于特異識別結(jié)構(gòu)的某些分子?？贵w的糖基化也被報導(dǎo)為影響抗體依賴性的細(xì)胞毒性(ADCC)。特別地，具有四環(huán)素調(diào)節(jié)的/3(1，4)-N-乙酰葡糖胺基轉(zhuǎn)移酶III(GnTin)(—種催化二等分GlcNac形成的糖基轉(zhuǎn)移酶)表達(dá)的CHO細(xì)胞被報導(dǎo)為具有改進(jìn)的ADCC活性(Umanaetal.,1999,MatureBiotech.17:176-180)。典型地，抗體的糖基化是N連接的或O連接的。N連接是指碳水化合物部分與天冬酰胺殘基的側(cè)鏈結(jié)合。天冬酰胺-X-絲氨酸、天冬酰胺-X-蘇氨酸和天冬酰胺-X-半胱氨酸的三肽序列是碳水化合物部分與天冬酰胺側(cè)鏈酶結(jié)合的識別序列，其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸。因此，多肽中這些三肽序列的存在創(chuàng)建了可能的糖基化位點(diǎn)。O連接的糖基化是指N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一與羥基氨基酸的結(jié)合，所述羥基氨基酸最經(jīng)常為絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥基脯氨酸或5-羥基賴氨酸。對抗體添加糖基化位點(diǎn)如下文所述便利地完成改變氨基酸序列使得其含有一個或多個上述三肽序列(對N連接的糖基化位點(diǎn)而言)。也可以通過對原始抗體序列添加或取代為一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基來制造改變(對O連接的糖基化位點(diǎn)而言)。也可以改變抗體的糖基化模式而不改變根本的(underlying)核苷酸序列。糖基化主要取決于用于表達(dá)抗體的宿主細(xì)胞。因?yàn)橛糜诒磉_(dá)作為可能療法的重組糖蛋白(例如抗體)的細(xì)胞類型很少是天然細(xì)胞，所以可以期望抗體糖基化模式中的變更(參閱例如Hseetal.,1997,J.Biol.Chem.272:9062-9070)。除了對宿主細(xì)胞的選擇以外，重組生產(chǎn)抗體期間影響糖基化的因素還包括生長模式、培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)密度、氧合作用、pH、純化流程等等。已經(jīng)提出多種方法用于改變在特定宿主生物中達(dá)到的糖基化模式，包括引入或過表達(dá)涉及寡糖生產(chǎn)的某些酶(U.S.專利Nos.5,047，335;5,510,261和5.278,299)。可以從糖蛋白上酶去除糖基化或某些類型的糖基化，例如使用內(nèi)切糖苷酶H(EndoH)、N-糖苷酶F、內(nèi)切糖苷酶F1、內(nèi)切糖苷酶F2、內(nèi)切糖苷酶F3來進(jìn)行。另外，可以遺傳工程改造重組的宿主細(xì)胞，使其在加工某些類型的多糖時缺陷。這些技術(shù)和類似的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。'修飾的其它方法包括使用本領(lǐng)域已知的偶合技術(shù)，包括但不限于酶手段、氧化取代和螯合?？梢允褂眯揎椑缃Y(jié)合用于免疫測定的標(biāo)簽。經(jīng)修飾的Gl多肽使用本領(lǐng)域確定的步驟制造，并可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)篩選，所述實(shí)驗(yàn)中的一些在下文和實(shí)施例中描述。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，抗體包含經(jīng)修飾的恒定區(qū)，如免疫惰性或部分惰性的恒定區(qū)，例如不引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解、不刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，或不激活小膠質(zhì)細(xì)胞；或在以下之任一個或多個中具有降低的活性(與未經(jīng)修飾的抗體相比)引發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解、刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)或激活小膠質(zhì)細(xì)胞。恒定區(qū)的不同修飾可用于達(dá)到效應(yīng)子作用的最佳水平和/或組合。參閱例如Morganetal"Immunology86:319-324(1995);Lundetal.，J.Immunology157:4963-9157:4963-4969(1996);ldusogieetal.,J.Immunology164:4178-4184(2000);Taoetal"J.Immunology143:2595-2601(1989);和Jefferisetal.,ImmunologicalReviews163:59-76(1998)。在一些實(shí)施方案中，恒定區(qū)如Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624;PCT申請No.PCT/GB99/01441;和/或UK專利申請No.9809951.8中所述被修飾。在其它實(shí)施方案中，抗體包含含有以下突變的人重鏈IgG2恒定區(qū)A330P331到S330S331(氨基酸排序參考野生型IgG2序列)。Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624。還在其它實(shí)施方案中，針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)是不被糖基化的。在一些實(shí)施方案中，在一些實(shí)施方案中，通過將糖基化的氨基酸殘基或側(cè)翼殘基(其為恒定區(qū)中N-糖基化識別序列的一部分)突變，使得針對N連接的糖基化而言恒定區(qū)不被糖基化。例如，N糖基化位點(diǎn)N297可以被突變?yōu)锳、Q、K或H，參閱Taoetal.,J.Immunology143:2595-2601(1989);和Jefferisetal"ImmunologicalReviews163:59-76(1998)。在一些實(shí)施方案中，針對N連接的糖基化而言，恒定區(qū)不被糖基化?？赏ㄟ^酶(例如通過酶PNGase去除碳水化合物)或通過在糖基化缺陷的宿主細(xì)胞中表達(dá)使得針對N連接的糖基化而言，恒定區(qū)不被糖基化。其它抗體修飾包括如1999年11月18日公開的PCT公開No.WO99/58572中所述被修飾的抗體。除針對靶分子的結(jié)合結(jié)構(gòu)域外，這些抗體包括具有下述氨基酸序列的效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域，所述氨基酸基本與人免疫球蛋白重鏈的所有或部分恒定結(jié)構(gòu)域同源。這些抗體能夠結(jié)合靶分子而不引發(fā)顯著的補(bǔ)體依賴性裂解或細(xì)胞介導(dǎo)的耙標(biāo)破壞。在一些實(shí)施方案中，效應(yīng)子結(jié)構(gòu)域能夠特異地結(jié)合FcRn和/或Fc7RIIb。這些典型地基于來自兩個或更多人免疫球蛋白重鏈CH2結(jié)構(gòu)域的嵌合結(jié)構(gòu)域。以該方式修飾的抗體特別適用于慢性抗體療法，以避免炎癥和對常規(guī)抗體療法的其它不良反應(yīng)。本發(fā)明包括親和力成熟的實(shí)施方案。例如，可以通過本領(lǐng)域已知的歩驟生產(chǎn)親和力成熟的抗體(Marksetal.，1992,Bio/Technology，10:779-783;Barbasetal.,1994,ProcNatAcad.Sci，USA91:3809-3813;Schieretal.,1995，Gene,169:147-155;Yeltonetal.，1995,J.Immunol"155:1994-2004;Jacksonetal.,1995,J.Immunol.,154(7):3310-9;Hawkinsetal,1992，J.Mol.Biol"226:889-896;和WO2004/058184)?？墒褂靡韵碌姆椒▉碚{(diào)節(jié)抗體的親和力及表征CDR。表征抗體CDR和/或改變(例如促進(jìn))多肽如抗體的親合力的一種方法稱作"文庫掃描誘變"。通常，文庫掃描誘變?nèi)缦伦饔?。使用本領(lǐng)域認(rèn)可的方法，用兩個或更多(例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個)氨基酸取代CDR中的一個或多個氨基酸位置。這產(chǎn)生了小的克隆文庫(在一些實(shí)施方案中，每個分析的氨基酸位置一個文庫)，每個克隆具有兩個或更多成員的復(fù)雜性(如果在每個位置取代兩個或更多個氨基酸的話)。通常文庫還包括包含天然(未取代的)氨基酸的克隆。篩選小量克隆例如約20-80個克隆(取決于文庫的復(fù)雜性)對靶多肽(或其它結(jié)合靶標(biāo))的親合力，并鑒定具有提高的、同樣的、降低的或無結(jié)合的候選者。用于測定親合力的方法是本領(lǐng)域公知的。可以使用Biacore表面等離振子共振分析測定親合力，高方法監(jiān)測約2倍或更大的親合力差異。當(dāng)初始抗體已經(jīng)以相對高的親和力(例如約10mM或更低的KD)結(jié)合時，Biacore特別適用。適用Biacore表面等離振子共振的篩選描述于本文的實(shí)施例中。可以使用KinexaBiocensor、閃爍近似測定、ELISA、ORIGEN免疫領(lǐng)ij定(IGEN)、熒光淬滅、熒光轉(zhuǎn)移和/或酵母展示來測定親合力。也可以使用合適的生物測定篩選親合力。在一些實(shí)施方案中，使用被認(rèn)可的誘變方法(其中一些在本文中描述)用20個天然氨基酸取代(在一些實(shí)施方案中，每次一個)CDR中的每個氨基酸位置。這產(chǎn)生小的克隆文庫(在一些實(shí)施方案中，每個分析的氨基酸位置一個文庫)，每個具有20個成員的復(fù)雜性(如果每個位置上取代了所有20個氨基酸的話)。在一些實(shí)施方案中，待篩選的文庫在兩個或更多位置中包含取代，所述位置其可以在相同的CDR或兩個或更多的CDR中。因此，該文庫可在一個CDR中的兩個或更多的位置中包含取代。該文庫可在兩個或更多CDR的兩個或更多位置中包含取代。文庫可在3、4、5或更多位置中包含取代，所述位置存在于兩個、三個、四個、五個或六個CDR中?？梢允褂玫腿哂嗝艽a子制備取代。參閱例如Balintetal.,(1993)Gene137(1):109-18)的表2。CDR可以是CDRH3禾口/或CDRL3。CDR可以是CDRL1、CDRL2、CDRL3、CDRH1、CDRH2和/或CDRH3中的一個或多個。CDR可以是KabatCDR、ChothiaCDR、經(jīng)擴(kuò)展的CDR。可以對具有改進(jìn)的結(jié)合的候選者進(jìn)行測序，從而鑒定出導(dǎo)致改進(jìn)的親和力的CDR取代突變體(也稱作"改進(jìn)的"取代)。也可以對結(jié)合的候選者測序，從而鑒定保持結(jié)合的CDR取代?？梢赃M(jìn)行多輪篩選。例如，具有改進(jìn)的結(jié)合的候選者(每個在一個或多個CDR的一個或多個位置上包含氨基酸取代)也適用于設(shè)計第二文庫，所述第二文庫至少在每個改進(jìn)的CDR位置(即CDR中的氨基酸位置，該位置上的取代突變體顯示改進(jìn)的結(jié)合)上含有原始的和經(jīng)取代的氨基酸。該文庫的制備、篩選或選擇在下文進(jìn)一步討論。文庫掃描誘變也提供了用于表征CDR的手段，至于具有改進(jìn)的結(jié)合、相同的結(jié)合、降低的結(jié)合或無結(jié)合的克隆的頻率也提供了涉及每個氨基酸位置對于抗體-抗原復(fù)合物穩(wěn)定性的重要性。例如，如果改變?yōu)樗?0個氨基酸時CDR的位置維持結(jié)合，則該位置被鑒定為不太可能是抗原結(jié)合所需的位置。相反，如果CDR的一個位置僅在小部分取代時維持結(jié)合，則該位置被鑒定為對CDR功能重要的位置。因此，文庫掃描誘變方法產(chǎn)生下述信息，所述信息涉及CDR中可以改變?yōu)樵S多不同氨基酸(包括所有20種氨基酸)的位置和CDR中不能被改變或僅能改變?yōu)樯倭堪被岬奈恢?。具有改進(jìn)的親和力的候選者可以組合于第二個文庫中，所述文庫包括改進(jìn)的氨基酸、該位置上的原始氨基酸，并可進(jìn)一步包括該位置上的其它取代，取決于所期望的或使用期望的篩選或選擇方法所允許的文庫的復(fù)雜'性。另外，如果期望的話，可以將鄰近的氨基酸位置隨機(jī)化為至少兩個或更多的氨基酸。鄰近的氨基酸的隨機(jī)化可以允許突變體CDR中額外的構(gòu)象柔性，這可隨后允許或便于引入更大量的改進(jìn)型突變。該文庫也包括在第一輪篩選中不顯示改進(jìn)的親和力的位置上的取代?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的任何方法來篩選或選擇第二個文庫中具有改進(jìn)的和/或改變的親合力的文庫成員，所述方法包括使用Biacore表面等離振子共振分析篩選，和使用本領(lǐng)域已知用于選擇的任何方法(包括噬菌體展示、酵母展示和核糖體展示)選擇。本發(fā)明還包括融合肽，其包含來自本發(fā)明抗體(如Gl)或多肽的一個或多個片段或區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，提供包含SEQIDNO:2(圖5)中所示可變輕鏈區(qū)至少10個連續(xù)氨基酸和/或SEQIDNO:l(圖5)中所示可變重鏈區(qū)至少IO個氨基酸的融合肽。在其它實(shí)施方案中，提供包含SEQIDNO:2(圖5)中所示可變輕鏈區(qū)的至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個、或至少約30個連續(xù)氨基酸和/或SEQIDNO:l(圖5)中所示可變重鏈區(qū)的至少約10個、至少約15個、至少約20個、至少約25個或至少約30個連續(xù)氮基酸的融合多肽。在另一實(shí)施方案中，如圖5的SEQIDNO:2和SEQIDNO:l所示，融合多肽包含Gl輕鏈的可變區(qū)和/或重鏈可變區(qū)。在另一實(shí)施方案中，融合多肽包含Gl的一個或多個CDR。還在其它實(shí)施方案中，融合多肽包含抗體Gl的CDRH3和/或CDRL3。就本發(fā)明的目的而言，Gl融合蛋白含有一個或多個Gl抗體和另一氨基酸序列(例如異源序列或來自另一區(qū)域的同源序列)，所述另一氨基酸序列在天然分子中不與所述Gl抗體結(jié)合。示范性的異源序列包括，但不限于"標(biāo)簽"，例如FLAG標(biāo)簽或6His標(biāo)簽。標(biāo)簽是本領(lǐng)域公知的?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法(例如合成或重組地)創(chuàng)造Gl融合多肽。典型地，通過使用本文所述重組方法制備編碼它們的多核苷酸來制造本發(fā)明的Gl融合蛋白，盡管也可以通過本領(lǐng)域已知的其它手段(包括例如化學(xué)合成)來制備。本發(fā)明還提供了包含來自Gl的、與下述試劑綴合(例如連接)的抗體或多肽的組合物，所述試劑便于銅固體支持物(例如生物素或抗生物素蛋白)的偶合。簡言之，通常提及Gl或抗體時應(yīng)激烈這些方法應(yīng)用于本文所述的任何CGRP結(jié)合實(shí)施方案。綴合通常是指如本文所述將這些成分連接?？梢砸源罅糠椒ㄖ械娜魏瓮瓿蛇B接(其通常以至少用于施用的緊密結(jié)合將這些成分固定)。例如，.當(dāng)一種物質(zhì)上具有能夠與其它物質(zhì)反應(yīng)的亞基時，試劑和抗體之間可能直接反應(yīng)。例如一種物質(zhì)上的親核基團(tuán)(如氨基或巰基)可以能夠與其它物質(zhì)上的含羰基基團(tuán)(例如酸酐或酸性鹵化物)或含良好離去基團(tuán)(例如鹵化物)的烷基反應(yīng)。本發(fā)明的抗體或多肽可以與與標(biāo)簽劑(或者稱作"標(biāo)簽")如熒光分子、放射性分子或本領(lǐng)域已知的任何其它標(biāo)簽連接。通常(直接或間接)提供信號的標(biāo)簽是本領(lǐng)域已知的。本發(fā)明還提供了下述組合物(包括藥物組合物)和試劑盒，其包含抗體Gl和(如本公開內(nèi)容所明確的)本文公開的任何或所有抗體和/或多肽。本發(fā)明還提供了經(jīng)分離的下述多核苷酸和包含所述多核苷酸的載體和宿主細(xì)胞，所述多核苷酸編碼本發(fā)明的抗體和多肽(包括包含圖5所示輕鏈和重鏈可變區(qū)的多肽序列的抗體)。因此，本發(fā)明提供了包含下述多核苷酸的多核苷酸(或組合物，包括藥物組合物)，所述多核苷酸編碼以下任何(a)表6所示抗體Gl或其變體；(b)表6所示抗體Gl或其變體的片段或區(qū)域；(c)表6所示抗體Gl或其變體的輕鏈；(d)表6所示抗體Gl或其變體的重鏈；(e沐自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈和/或重鏈的一個或多個可變區(qū)；(f)來自表6所示抗體Gl或其變體的一個或多個CDR(—個、兩個、三個、四個、五個或六個CDR);(g)來自抗體Gl重鏈的CDRH3;(h)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈的CDRL3;(i)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈的三個CDR;(j)來自表6所示抗體Gl或其變體重鏈的三個CDR;(k)來自表6所示抗體Gl或其變體輕鏈的三個CDR和重鏈的三個CDR;和(I)包含從(b)到(k)中任一項(xiàng)的抗體。在一些實(shí)施方案中，多核苷酸包括SEQIDNO:9和SEQIDNO:10中所示的一個或兩個多核苷酸。另一方面，本發(fā)明提供了編碼本文所述任何抗體(包括抗體片段)和多肽的多核苷酸，所述抗體和多肽例如具有受損的效應(yīng)子作用的抗體和多肽。多核苷酸可以通過本領(lǐng)域已知的步驟制造。另一方面，本發(fā)明提供了包含本發(fā)明任何多核苷酸的組合物(例如藥物組合物)。在一些實(shí)施方案中，所述組合物包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼本文所述Gl抗體的多核苷酸。在其它實(shí)施方案中，該組合物包含表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含編碼本文所述任何抗體或多肽的多核苷酸。還在其它實(shí)施方案中，該組合物包含SEQIDNO:9和SEQIDNO:IO中所示的一種或兩種多核苷酸。表達(dá)載體和多核苷酸組合物的施用在本文中進(jìn)一步描述。另一方面，本發(fā)明提供了制造本文所述任何多核苷酸的方法。與任何這類序列互補(bǔ)的多核苷酸也包括在本發(fā)明內(nèi)。多核苷酸可以是單鏈的(編碼鏈或反義鏈)或雙鏈的，并可以是DNA(基因組、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子包括HnRNA分子(其含有內(nèi)含子并以一對一的方式對應(yīng)于DNA分子)和mRNA分子(其不含有內(nèi)含子)。額外的編碼或非編碼序列可以(但不必須)存在于本發(fā)明的多核苷酸內(nèi)，多核苷酸可以(但不必須)與其它分子和/或支持材料連接。多核苷酸可包含天然序列(即編碼抗體或其部分的內(nèi)源序列)或可包含這類序列的變體。多核苷酸變體含有一個或多個取代、添加、刪除和/或插入，使得所編碼的多肽的免疫反應(yīng)性相對于天然的免疫反應(yīng)性分子不被減小。對所編碼的多肽免疫反應(yīng)性的作用通?？梢匀绫疚乃鲈u估。變體通常顯示與編碼天然抗體或其片段的多核苷酸序列至少約70%的同一性、更優(yōu)選地至少約80%的同一性和最優(yōu)選至少約99%的同一性。當(dāng)如下文所述針對最大對應(yīng)進(jìn)行比對時，如果兩個序列中核苷酸或氨基酸的序列是相同的，則稱作這兩種多核苷酸或多肽序列是"同一的"。典型地，通過將序列在比較窗口比較以鑒定和比較局部區(qū)域的序列相似性來進(jìn)行兩個序列之間的比較。本文使用"比較窗口"是指至少約20個連續(xù)位置(通常為30到約75個、40到約50個)的區(qū)段，其中在兩個序列最適排列后可以將序列與參考序列的相同數(shù)量的連續(xù)位置進(jìn)行比較。用于比較的序列的最適比對可以使用Lasergene生物信息學(xué)軟件套裝(DNASTAR,Inc.,Madison,Wl)軟件中的Megalign程序，使用默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行。該程序收錄了以下參考文獻(xiàn)中描述的若干比對流程Dayhoff,M.0.(1978)Amodelofevolutionarychangeinproteins-Matricesfordetectingdistantrelationships.InDayhoff,M.O.(ed.)AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDCVol.5,Suppl.3，pp.345-358;HeinJ.,1990,UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenespp.626-645MethodsinEnzymologyvol.183,AcademicPress,Inc.:SanDiego，CA;Higgins,D.G.andSharp,P.M.,1989,CABIOS5:151-153;Myers,E.W.andMullerW.,1988,CABIOS4:11-17;Robinson,E.D.,1971,Comb.Theor.11:105;Santou，N.,Nes,M.，1987,Mol.Biol.Evol.4:406-425;Sneath,P.RA.andSokal,R.R.,1973,NumericalTaxonomythePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy,FreemanPress,SanFrancisco,CA;Wilbur,W丄andLipman，D.J.，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA80:726-730。優(yōu)選地，通過將兩個最優(yōu)排列的序列在至少20個位置的比較窗口上進(jìn)行比較來測定"序列同一性百分比"，其中比較窗口中的那部分多核苷酸或多肽序列與用于兩種序列最適比對的參考序列(其不包含添加或刪除)相比可包含20%或更少、通常5%到15%或10%到12%的添加或刪除(即缺口)。百分比如下計算確定兩序列中均存在同一核酸堿基或氨基酸殘基的位置的數(shù)量得到匹配位置數(shù)量，用匹配位置數(shù)量除以參考序列中的位置總數(shù)(即窗口尺寸)并將結(jié)果乘以100，得到序列同一性百分比。變體也(或可選地)可以與天然基因或其補(bǔ)體的部分基本同源。這類多核苷酸變體能夠在中度嚴(yán)格的條件下與編碼天然抗體的天然存在的DNA序列(或其互補(bǔ)序列)雜交。合適的"中度嚴(yán)格條件"包括在5XSSC,0.5°/oSDS，1.0mMEDTA(pH8.0)溶液中預(yù)洗滌；在50°C-65。C,5XSSC下過夜雜交；然后在65°C下分別用含有0.1%SDS的2X、0.5X和0.2XSSC洗滌兩次，每次20分鐘。本文使用的"高度嚴(yán)格條件"或"高嚴(yán)格度條件"是指(l)使用低離子強(qiáng)度和高溫用于洗滌，例如在5(TC用0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1%十二垸基硫酸鈉；(2)在42'C雜交時使用變性劑如甲酰胺，例如含有0.1%牛血清白蛋白/0.1%Fico11/0.1%聚乙烯吡咯酮/50mMpH6.5的磷酸鈉緩沖液，和750mM氯化鈉、75mM檸檬酸鈉；或(3)在42。C使用50%甲酰胺，5xSSC(0.75MNaCl、0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1%焦磷酸鈉、5xDenhardt's溶液、聲處理的鮭精DNA(50//g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖，在42T:選于0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)中和在55。C下于50%甲酰胺中洗滌，然后是55。C下由含EDTA的0.1xSSC組成的高嚴(yán)格度洗滌。技術(shù)人員明白如何調(diào)節(jié)溫度、離子強(qiáng)度等，這是適應(yīng)如探針長度等的因素所必需的。本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白作為遺傳密碼子簡并的結(jié)果，存在編碼本文所述多肽的許多核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些具有與任何天然基因核苷酸序列的最小同源性。但是，由于密碼子使用差異而改變的多核苷酸被本發(fā)明特別關(guān)注。另外，包含本文提供的多核苷酸序列的基因的等位基因?qū)儆诒景l(fā)明的范圍內(nèi)。等位基因是由一個或多個突變(例如核苷酸的刪除、添加和/或取代)導(dǎo)致改變的內(nèi)源基因。得到的mRNA和蛋白質(zhì)可以(但不必須)具有改變的結(jié)構(gòu)或功能。可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(例如雜交、擴(kuò)增和/或數(shù)據(jù)庫序列比較)鑒定等位基因。本發(fā)明的多核苷酸可以使用化學(xué)合成、重組方法或PCR獲得。化學(xué)多核苷酸合成的方法是本領(lǐng)域公知的并不需要在本文詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用本文提供的序列和商業(yè)的DNA合成儀生產(chǎn)期望的DNA序列。為了使用重組方法制備多核苷酸，如本文所進(jìn)一步討論的，可以將包含期望的序列的多核苷酸插入合適的載體中，然后可以將載體引入合適的宿主細(xì)胞中用于復(fù)制和擴(kuò)增。可以通過本領(lǐng)域已知的任何途徑將多核苷酸插入宿主細(xì)胞中。通過引入(通過直接攝取、胞吞作用、轉(zhuǎn)染、F交配或電穿孔)外源多核苷酸轉(zhuǎn)化細(xì)胞。外源多核苷酸被引入后可以作為未整合的載體(例如質(zhì)粒)或整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中來在細(xì)胞中維持。這樣擴(kuò)增的多核苷酸可以通過本領(lǐng)域公知的方法從宿主細(xì)胞中分離。參閱例如Sambrooketal.(1989)?；蛘?，PCR允許再生產(chǎn)DNA序列。PCR技術(shù)是本領(lǐng)域公知的并描述于U.S.專利Nos.4,683,195,4,800,159,4,754,065和4,683,202，以及PCR:ThePolymeraseChainReaction,Mullisetal.eds.,BirkauswerPress,Boston(1994)中?？梢允褂煤线m載體中經(jīng)分離的DNA并將其插入合適的宿主細(xì)胞來獲得RNA。當(dāng)細(xì)胞復(fù)制和DNA被轉(zhuǎn)錄為RNA時，可以隨后使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法將RNA分離，例如如Sambrooketal.,(1989)中所公開?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建合適的克隆載體，或從本領(lǐng)域可獲得的大量克隆載體中選擇。盡管所選擇的克隆載體可根據(jù)要使用的宿主細(xì)胞而變化，但是有用的載體通常會具有自我復(fù)制的能力、可具有特定限制性內(nèi)切核酸酶的單個耙標(biāo)，和/或可帶有用于標(biāo)記物的基因，所述標(biāo)記物可用于選擇含有該載體的克隆。合適的例子包括質(zhì)粒和細(xì)菌病毒例如pUC18、pUC19、Bl薦ript(例如pBSSK+)及其衍生物mpl8、mpl9、pBR322、pMB9、CoIEI、pCRl、RP4，噬菌體DNA和穿梭載體如pSA3和pAT28。存在可得自商業(yè)賣主如BioRad、Strategene和Invitrogen的許多其它克隆載體。表達(dá)載體通常是含有本發(fā)明多核苷酸的可復(fù)制的多核苷酸構(gòu)建體。這意味著表達(dá)載體必須在宿主細(xì)胞中可以作為附加體或作為染色體DNA的整合部分復(fù)制。合適的表達(dá)載體包括但不限于質(zhì)粒、病毒(包括腺病毒、腺相關(guān)病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒)載體、粘粒和PCT公開No.WO87/04462中公開的表達(dá)載體。載體組件通常包括，但不限于以下的一種或多種單個序列；復(fù)制起點(diǎn)；一個或多個標(biāo)記物基因；合適的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(例如啟動子、增強(qiáng)子和終止子)。對于表達(dá)(即翻譯)而言，通常也需要一種或多種翻譯調(diào)控元件，例如核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)和終止密碼子。含有感興趣的多核苷酸的載體可以通過大量合適手段中的任何被引入宿主細(xì)胞中，所述手段包括電穿孔，使用氯化鈣、氯化銣、磷酸鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質(zhì)的轉(zhuǎn)染；微粒轟擊；脂質(zhì)轉(zhuǎn)染；和感染(例如其中載體是感染劑如痘苗病毒)。引入載體或多核苷酸的選擇通常取決于宿主細(xì)胞的特征。本發(fā)明還提供了包含本文公開的任何多核苷酸的宿主細(xì)胞。任何能夠過表達(dá)異源DNA的宿主細(xì)胞可以用于分離下述基因的目的，所述基因編碼感興趣的抗體、多肽或蛋白質(zhì)。哺乳動物宿主細(xì)胞非限制性的例子包括，但不限于COS、HeLa和CHO細(xì)胞。還參閱PCT公開No.WO87/04462。合適的非哺乳動物宿主細(xì)胞包括原核生物(例如大腸桿菌或B.subtillis)和酵母(例如S.cerevisae,S.pombe;或K.lactis)。優(yōu)選地，如果宿主細(xì)胞中存在相應(yīng)的感興趣的內(nèi)源抗體或蛋白質(zhì)，宿主細(xì)胞以比其高約5倍的水平、更優(yōu)選高約10倍、甚至更優(yōu)選高20倍的水平表達(dá)cDNA。篩選與ADl-40特異結(jié)合的宿主細(xì)胞通過免疫測定或FACS進(jìn)行。可以鑒定過表達(dá)感興趣的抗體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞。D.組合物本發(fā)明方法中使用的組合物包含有效量的本文所述的抗CGRP拮抗劑抗體或抗CGRP拮抗劑抗體衍生的多肽。這類組合物的例子以及如何配制的方法也描述于先前的章節(jié)和下文中。在一個實(shí)施方案中，組合物還包含CGRP拮抗劑。在另一實(shí)施方案中，組合物包含一種或多種抗CGRP拮抗劑抗體。在其它實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體識別人CGRP。還在其它實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體被人源化。還在其它實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體包含下述恒定區(qū)，所述恒定區(qū)不引發(fā)不想要的或不期望的免疫應(yīng)答，如抗體介導(dǎo)的裂解或ADCC。在其它實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體包含抗體Gl的一個或多個CDR(例如一個、兩個、三個、四個、五個或在一些實(shí)施方案中所有六個來自Gl的CDR)。在一些實(shí)施方案中，抗CGRP拮抗劑抗體是人的。應(yīng)當(dāng)理解組合物可包含多于一種抗CGRP拮抗劑抗體(例如識別CGRP不同表位的抗CGRP拮抗劑抗體的混合物)。其它的示范性組合物包含多于一種識別相同表位的抗CGRP拮抗劑抗體，或與CGRP的不同表位結(jié)合的不同種類的抗CGRP拮抗劑抗體。本發(fā)明中使用的組合物可進(jìn)一步包含低壓凍干配方或水性溶液形式的可藥用的運(yùn)載體、貝武開;齊U或禾急定齊U(Remington:TheScienceandpracticeofPharmacy20thEd.(2000)LippincottWilliamsandWilkins,Ed.K.E.Hoover)?？山邮艿倪\(yùn)載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在劑量和濃度上對受體是無毒的，并可包含緩沖液如磷酸、檸檬酸或其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(例如氯化十八烷基二甲基芐基銨；氯化六甲雙銨；氯化苯甲烴銨、氯化苯乙銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；禾nm-甲酚)；低分子量(少于約10個殘基)的多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水多聚體如聚乙烯吡咯酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑如EDTA;糖如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽的反例子如鈉；金屬絡(luò)合物(例如Zn-蛋白質(zhì)絡(luò)合物)；和/或非例子型表面活性劑，如TWEENTM、PLURONICStm或聚乙二醇(PEG)?？伤幱玫馁x形劑在本文進(jìn)一步描述。抗CGRP拮抗劑抗體及其組合物也可以與其它試劑組合使用，所述其它試劑起到增強(qiáng)和/或補(bǔ)充試劑有效性的作用。E.試劑盒本發(fā)明還提供了快速方法中使用的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包括一個或多個包含本文所述抗CGRP拮抗劑抗體(例如人源化的抗體)或多肽的容器，和根據(jù)本文所述的任何本發(fā)明方法使用的說明書。通常，這些說明書包括根據(jù)本文所述的任何方法，施用抗CGRP拮抗劑抗體以治療、改善或預(yù)防頭痛(例如偏頭痛)的描述。該試劑盒還包括選擇適合治療的個體的描述，所述選擇基于鑒定個體是否具有頭痛或個體是否處于頭痛的風(fēng)險下。還在其它實(shí)施方案中，該說明書包括對處于頭痛(例如偏頭痛)風(fēng)險下的個體施用抗CGRP拮抗劑抗體的描述。在一些實(shí)施方案中，抗體是人源化抗體。在一些實(shí)施方案中，抗體是人。在其它實(shí)施方案中，抗體是單克隆抗體。還在其它實(shí)施方案中，抗體包含抗體Gl的一個或多個CDR(例如一個、兩個、三個、四個、五個，或在一些實(shí)施方案中來自Gl的所有六個CDR)。涉及抗CGRP拮抗劑抗體使用的說明書通常包括如用于計劃治療的劑量、給藥時間表和施用途徑的信息。容器可以是單位劑量、大量包裝(例如多劑量包裝)或亞單位劑量。本發(fā)明的試劑盒中提供的說明書典型地是標(biāo)簽或包裝內(nèi)頁(例如包括在試劑盒中的紙片)上的書面說明書，但是也可以是可機(jī)讀的說明書(例如磁性或光學(xué)存儲盤上承載的說明書)。標(biāo)簽或包裝內(nèi)頁指出組合物用于治療、改善和/或預(yù)防頭痛(例如偏頭痛)?？梢蕴峁┯糜趯?shí)踐本文所述任何方法的說明書。本發(fā)明的試劑盒在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限于管、瓶、廣口瓶、柔軟包裝(例如密封的Mylar或塑料袋)等。還注意到的是用于同特定器具組合施用的包裝，所述特定器具例如吸入器、鼻施用器具(例如噴霧器)或融合器具如迷你泵。試劑盒可具有無菌接入口(例如容器可以是帶有可被皮下注射針穿透的塞子的靜脈注射溶液袋或瓶)。容器也可以具有無菌接入口(例如容器可以是帶有可被皮下注射針穿透的塞子的靜脈注射溶液袋或瓶)。組合物中至少一種活性劑是抗CGRP拮抗劑抗體。容器還可包含第二種藥物活性劑。試劑盒可任選的提供其它成分如緩沖液和說明信息。通常，試劑盒含有容器和容器上或與容器結(jié)合的標(biāo)簽或包裝內(nèi)頁。提供以下的實(shí)施例用于闡述而非限制本發(fā)明。實(shí)施例65實(shí)施例l:針對CGRP的單克隆抗體的產(chǎn)生和表征產(chǎn)生抗CGRP抗體。為了產(chǎn)生對大鼠和人CGRP具有跨物種反應(yīng)性的抗cgrp抗體，以不同的間隔用佐劑(每只足墊50m1，每只小鼠100/xl)中與KLH綴合的25-100yg人a-CGRP或P-CGRP免疫小鼠。免疫通常如GeerligsHJetal.,1989,J.Immunol.Methods124:95-102;KenneyJSetal.,1989,J.Immunol.Methods121:157-166;和WicherKetal.,1989，Int.Arch.AllergyAppl.Immunol.89:128-135中所述進(jìn)行。首先用CFA(完全弗氏佐劑)中與KLH綴合的50人a-CGRP或/3-CGRP免疫小鼠。21天后用IFA(不完全弗氏佐劑)中與KLH綴合的25/zg人/3-CGRP(對于首先用人o;-CGRP免疫的小鼠而言)或ce-CGRP(對于首先用人0-CGRP免疫的小鼠而言)第二次免疫小鼠。第二次免疫后二十三天用IFA中與KLH綴合的25/xg大鼠a-CGRP進(jìn)行第三次免疫。十天后，使用ELISA檢驗(yàn)抗體效價。第三次免疫后34天用IFA中25Mg肽(大鼠a-CGRP-KLH)進(jìn)行第四次免疫。第四次免疫后32天用100/xg溶解肽(大鼠ce-CGRP)進(jìn)行最后的強(qiáng)化。從被免疫小鼠獲得脾細(xì)胞并與NSO骨髓瘤細(xì)胞以10:1的比例用聚乙二醇1500融合。將雜種96孔板中含有20%馬血清和2-草酰乙酸鹽/丙酮酸鹽/胰島素(Sigma)的DMEM中，并開始次黃嘌呤/氨基蝶吟/胸腺嘧啶選擇。在第8天向所有孔中添加含有20%馬血清的100/dDMEM。通過使用抗體捕獲免疫測定法篩選雜種的上清液。對抗體種類的確定用種類特異的第二抗體來進(jìn)行。根據(jù)它們與人和大鼠CGRP的結(jié)合性，選出一組生產(chǎn)單克隆抗體的細(xì)胞系，以進(jìn)一步分析。這些抗體和特征顯示在下文表2和表3中。純化和Fab片段制備。使用蛋白A親和層析從雜交瘤培養(yǎng)物的上清液中純化選用來進(jìn)一步分析的單克隆抗體。將上清液平衡至pH8。然后將上清液上樣在用PBS平衡至pH8的蛋白A柱MabSelect(AmershamBiosciences#17-5199-02)上。用5倍體積的PBS，pH8洗滌柱。用50mM檸檬酸一磷酸緩沖液,pH3洗脫抗體。用1M磷酸緩沖液，pH8中和洗脫的抗體。用PBS，pH7.4透析經(jīng)純化的抗體。通過SDS-PAGE使用鼠單克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)曲線測定抗體濃度。使用ImmunopureFab試劑盒(Pierce#44885)通過全抗體的木瓜蛋白酶解制備Fab并依照制造商的說明書通過流經(jīng)蛋白A色譜純化。通過ELISA禾口/或SDS-PAGE電泳使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)Fab(通過氨基酸分析測定)，和通過A280使用lOD=0.6mg/ml(或基于氨基酸序列的理論當(dāng)量)測定濃度。Fab的親和力測定?？笴GRP單克隆抗體的親和力在25。C或37。C下使用Biacore3000TM表面等離振子共振(SPR)體系(Biacore,INC，PiscatawayNJ)與制造商自己的電泳緩沖液HBS-EP(10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3mMEDTA、0.005%v/vpolysorbateP20)測定。通過由SA芯片上預(yù)先固定的鏈霉親和素捕獲N端生物素化的CGRP肽(來自GenScriptCorporation,NewJersey或GlobalPeptideServices,Colorado的定帝'J產(chǎn)品)并測量越過CGRP表面滴定的抗體Fab的結(jié)合動力學(xué)來測定親和力。生物素化的CGRP被稀釋進(jìn)HBS-EP中并以少于0.001mg/ml的濃度注射在芯片上。使用越過個體芯片通道的不同流動時間，達(dá)到了兩種抗體密度范圍用于詳細(xì)動力學(xué)研究的<50個響應(yīng)單位(RU)和用于濃度研究和篩選的約800個RU。將典型地跨越1ptM-0.1nM(針對0.1-10x估計的KD)濃度的經(jīng)純化的Fab片段的兩倍或三倍連續(xù)稀釋以100/iL/分鐘注射并允許10分鐘的解離時間。每個結(jié)合循環(huán)后，用25。/。v/v乙醇中25mMNaOH再生表面，所述表面可耐受數(shù)百個循環(huán)。通過使用BIAevahiation程序?qū)?shù)據(jù)與Langmuir結(jié)合模型(Karlsson，R.Roos,H.Fagerstam，L.Petersson,B.(1994).MethodsEnzymology6.99-110)擬合同時獲得動力學(xué)結(jié)合速率(k。n)和解離速率(k。ff)。從比例KD二k。ff/k。n計算整體平衡解離常數(shù)(KD)。鼠Fab片段的親和力在表2和表3中顯示。鼠抗CGRP抗體的表位作圖。為了測定抗CGRP抗體結(jié)合在人a-CGRP上的表位，如上所述通過在SA感受芯片上捕獲N端生物素化的CGRP片段氨基酸19-37和氨基酸25-37測量Fab片段對多種CGRP片段的親合力。圖l'顯示在25"C測量的它們的親合力。如圖1所示，除抗體4901外的任何抗體，以它們對全長人a-CGRP(l-37)的親合力相似的親和力與人a-CGRP片段19-37和25-37結(jié)合。抗體4901以比結(jié)合全長人a-CGRP片段低六倍的親和力結(jié)合人a-CGRP片段25-37，主要因?yàn)槊撾x速率的喪失。數(shù)據(jù)指出抗CGRP抗體通常與CGRP的C末端結(jié)合。進(jìn)行丙氨酸掃描，來進(jìn)一步表征人a-CGRP中涉及抗CGRP抗體結(jié)合的氨基酸。通過肽合成產(chǎn)生帶有單個丙氨酸取代的不同的人Qf-CGRP變體。它們的氨基酸序列與Biacore分析中使用的所有其它肽一起顯示于表4中。如上所述使用Biacore測定抗CGRP抗體的Fab片段對這些變體的親和力。如圖1中所示，所有12中抗體革巴向C末端的表位，氨基酸F37是最重要的殘基。F37突變?yōu)楸彼犸@著地降低了抗CGRP抗體對肽的親和力或甚至完全封閉了抗CGRP抗體對肽的結(jié)合。另一最重要的氨基酸殘基為G33，然而，僅高親和力抗體(7E9、8B6、10A8和7D11)受該位置上丙氨酸取代的影響。氨基酸殘基S34也在這四種高親和力抗體的結(jié)合中起到顯著的、但是較小的作用。表2.抗CGRP單克隆抗體結(jié)合人ce-CGRP的特征及其拮抗劑活性<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table>注意抗體4901可商業(yè)獲得(Sigma,產(chǎn)品No.C7113)。n.d.=未領(lǐng)!]定表3.抗CGRP單克隆抗體結(jié)合大鼠"-CGRP的特征和拮抗劑活性<table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table>實(shí)施例2:使用體外實(shí)驗(yàn)篩選抗CGRP拮抗劑抗體使用基于細(xì)胞的cAMP活化實(shí)驗(yàn)和結(jié)合實(shí)驗(yàn)，對鼠抗CGRP抗體在體外針對拮抗劑活性進(jìn)行進(jìn)一歩篩選。通過cAMP實(shí)驗(yàn)測量拮抗劑活性。在存在或不存在抗CGRP抗體(終濃度1-3000nM)或大鼠a-CGRP或人a-CGRP(終濃度0.1nM-10/xM;作為c-AMP活化的陽性對照)時，將五微升人或大鼠a-CGRP(終濃度50nM)分散在384-孔平板(Nunc,Cat.No.264657)中。向平板的孔中添加十微升刺激緩沖液(如果使用人a-CGRP則為人SK-N-MC，如果使用大鼠a-CGRP則為來自ATCC的大鼠L6)中的細(xì)胞(20mMHEPES，pH7.4、146mMNaCl、5mMKC1、1mMCaCl2、1mMMgCl2和5003-異丙基-l-甲基黃嘌呤(IBMX))。將平板在室溫孵育30分鐘。孵育后，使用HitHimterTM酶片段互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)(AppliedBiosystems)依照制造商的說明書進(jìn)行cAMP活化。該實(shí)驗(yàn)以經(jīng)遺傳工程操作的/5-半乳糖苷酶為基礎(chǔ)，所述酶由稱作酶受體(EA)和酶供體(ED)的兩個片段組成。當(dāng)這兩個片段被分離時，酶失活。當(dāng)片段在一起時，它們能夠通過稱作互補(bǔ)的過程自發(fā)地重組形成活性酶。EFC測試平臺使用ED-cAMP肽綴合物，其中cAMP被抗cAMP識別。該ED片段能夠與EA再結(jié)合形成活性酶。在該測定中，抗cAMP抗體被最優(yōu)地滴定以結(jié)合ED-cAMP綴合物和抑制酶形式。細(xì)胞裂解物樣品中的cAMP水平與ED-cAMP綴合物競爭結(jié)合抗cAMP抗體。測定中游離的ED量與cAMP的濃度成比例。因此，通過活性酶的形成測量cAMP，所述活性酶的形成通過/3-半乳糖苷酶發(fā)光底物的反轉(zhuǎn)定量。通過添加10/xl裂解緩沖液和抗cAMP抗體(1:1比例)，然后在室溫下孵育60分鐘進(jìn)行cAMP活化實(shí)驗(yàn)。然后向每孔中添加10//1ED-cAMP試劑并在室溫下孵育60分鐘。孵育后向每孔中添加20ylEA試劑和CL混合物(含有底物)(1:1比例)并在室溫下孵育1-3小時或過夜。在PMT器具上以1秒/孔或在圖像儀上以30秒/板對平板讀數(shù)。通過a-CGRP抑制cAMP活化的抗體在上表2和表3中鑒定(稱作"是")。表2和3中的數(shù)據(jù)指示測定中被證明有拮抗劑活性的抗體通常具有高的親和力。例如，對人a-CGRP具有約80nM或更少的KD(在25'C下測定)或?qū)Υ笫骯-CGRP具有約47nM或更少的KD(在37。C下測定)的抗體在該測定中顯示拮抗劑活性。放射性配體結(jié)合測定。如前所述進(jìn)行結(jié)合測定以測量抗CGRP抗體在封閉CGRP結(jié)合受體中的IC50。Zimme腿nnetal.,Peptides16:421-4,1995;Malleeetal.，J.Biol.Chem.277:14294-8,2002。將來自SK-N-MC細(xì)胞中的膜(25^g)在總體積為lmL的含有10pM1251-人a-CGRP孵育緩沖液(50mMTris-HCL,pH7.4,5mMMgCL2,0.1%BSA)中于室溫下孵育90分鐘。為了測定抑制濃度(ICs())，將來自約IOO倍的更高濃度的儲存溶液的抗體或未標(biāo)記的CGRP(作為對照)在孵育緩沖液中溶解為不同的濃度，并與膜和10pM1251-人a-CGRP孵育相同的時間。通過濾過被0.5%polyethylemimine封閉的玻璃微纖維(GF/B,lym)終止孵育。繪制劑量應(yīng)答曲線并通過使用等式KI=ICs。/(l+([配體]/KD)測定Id值；其中對于人a-CGRP對存在于SK-N-MC細(xì)胞中的CGRP1受體而言，平衡解離常數(shù)KD=8pM，Bmax=0.025pmol/mg蛋白質(zhì)。報導(dǎo)的ICs。值(依照IgG分子)被轉(zhuǎn)化為結(jié)合位點(diǎn)(乘以2)，從而其能夠與通過Biacore測定的親和力(Ko)比較(見表2)。表2顯示了鼠抗體7E9、8B6、6H2和4901的1。5()值。數(shù)據(jù)指示抗體親和力通常對應(yīng)于IC5Q:具有更高親和力(更低Ko值)的抗體在放射性配體結(jié)合測定中具有更低的IC5()。實(shí)施例3:抗CGRP拮抗劑抗體對大鼠隱神經(jīng)刺激誘導(dǎo)的皮膚血管擴(kuò)張的作甩為了測試抗CGRP抗體的拮抗劑活性，使用先前描述的大鼠模型測試抗體對大鼠隱神經(jīng)剌激引起的皮膚血管擴(kuò)張的作用。Escottetal.，Br.J.Pharmacol.110:772-776，1993。在該大鼠模型中，隱神經(jīng)電刺激誘導(dǎo)從神經(jīng)末梢釋放CGRP，導(dǎo)致皮膚血流增加。在隱神經(jīng)刺激后測量雄性SpragueDwaley大鼠(170-300g，來自CharlesRiverHollister)足部皮膚中的血流。用2%異氟烷將大鼠維持麻醉。在實(shí)驗(yàn)開始時給予溴芐銨(30mg/kg，靜脈施用)以最小化隱神經(jīng)的交感神經(jīng)纖維伴隨刺激引起的血管收縮。通過使用與溫度受控的加熱毯連接的直腸探頭將體溫維持在37°C。除了圖3所示的實(shí)驗(yàn)將測試化合物和對照通過尾靜脈注射外，通過右股靜脈將包括抗體、陽性對照(CGRP8-37)和媒介(PBS,0.01%吐溫20)的化合物靜脈給予，對圖2A和2B所示實(shí)驗(yàn)而言，腹膜內(nèi)(IP)注射抗體4901和7D11。由于陽性對照化合物CGRP8-37(血管擴(kuò)張拮抗劑)的段半衰期，其在神經(jīng)剌激前3-5分鐘以400nmol/kg(200/xl)給予。Tanetal.,Clin.Sci.89:656-73,1995?？贵w以不同的劑量給予(lmg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg禾口25mg/kg)。對圖2A和2B所示實(shí)驗(yàn)而言，在電脈沖刺激前72小時腹膜內(nèi)(IP)施用抗體4901(25mg/kg)、抗體7D11(25mg/k)或媒介對照(含0.01%吐溫20的PBS)。對圖3所示實(shí)驗(yàn)而言，在電脈沖刺激前24小時靜脈施用抗體4901(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg或25mg/kg)或媒介對照(含0.01X吐溫20的PBS)。施用抗體或媒介對照后，手術(shù)暴露右后肢的隱神經(jīng)，最接近地切割并用塑料膜覆蓋以防干燥。將激光多普勒探頭置于后爪皮膚的背中部側(cè)上，其為隱神經(jīng)支配的區(qū)域。用激光多普勒流量計監(jiān)測皮膚血流(測量為血細(xì)胞通量)。當(dāng)穩(wěn)定的基線通量(少于5%的變化)被建立至少5分鐘時，將神經(jīng)置于鉑雙極電極上并用電刺激(2Hz，IOV，1ms,持續(xù)30秒)60個脈沖，20分鐘后再次刺激。對于應(yīng)答電脈沖剌激的每個通量而言，通過通量-時間曲線下的面積(AUC，其等于通量的改變乘以時間的改變)評價皮膚血流的累積變化。計算應(yīng)答這兩次刺激的血流的平均值。將動物在一到三小時的時間段中保持麻醉。如圖2A和2B中所示，與對照相比，通過在隱神經(jīng)上施用電脈沖刺激的血流增加被CGRP8-37(400nmol/kg，靜脈施用)、抗體4901(25mg/kg，腹膜內(nèi)施用)或抗體7D11(25mg/kg，腹膜內(nèi)施用)的存在抑制。CGRP8-37在隱神經(jīng)刺激前3-5分鐘施用；抗體在隱神經(jīng)刺激前72小時施用。如圖3所示，通過在隱神經(jīng)上應(yīng)用電脈沖剌激的血流增加被抗體4901的存在抑制，所述抗體在隱神經(jīng)剌激前24小時以不同劑量(1mg/kg、2.5mg/kg、5mg/kg禾口25mg/kg)靜脈施用。對于圖4A和4B中所示實(shí)驗(yàn)而言，在抗體施用前手術(shù)暴露隱神經(jīng)。手術(shù)暴露右后肢的隱神經(jīng)，最接近地切割并用塑料膜覆蓋以防干燥。將激光多普勒探頭置于后爪皮膚的背中部上，其為隱神經(jīng)支配的區(qū)域。用激光多普勒流量計監(jiān)測皮膚血流(測量為血細(xì)胞通量)。在注射溴芐銨后三十到四十五分鐘，穩(wěn)定的基線通量(少于5%的變化)被建立至少5分鐘時，將神經(jīng)置于鉑雙極電極上并用電刺激(2Hz,10V,1ms，持續(xù)30秒)，20分鐘后再次刺激。使用應(yīng)答這兩次刺激的血流通量的平均值建立對電刺激的基線應(yīng)答(時間0)。然后靜脈(i.v.)施用抗體4901(1mg/kg或10mg/kg)、抗體7E9(10mg/kg)、抗體8B6(10mg/kg)或媒介(含0.01%吐溫20的PBS)。隨后，在抗體或媒介施用后30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘刺激(2Hz,IOV，1ms，持續(xù)30秒)神經(jīng)。在大約三小時的時間段中保持動物麻醉。對于應(yīng)答電脈沖刺激的每個通量而言，通過通量-時間曲線下的面積(AUC，其等于通量的改變乘以時間的改變)評價皮膚血流的累積變化。如圖4A中所示，當(dāng)在抗體施用后60分鐘、90分鐘和120分鐘應(yīng)用電刺激時，通過在隱神經(jīng)上應(yīng)用電脈沖刺激的血流增加被靜脈施用的1mg/kg的抗體4901的存在顯著抑制；當(dāng)在抗體施用后30分鐘、60分鐘90分鐘和120分鐘應(yīng)用電剌激時，通過在隱神經(jīng)上應(yīng)用電脈沖刺激的血流增加被靜脈施用的10mg/kg的抗體4901的存在顯著抑制。圖4B顯示當(dāng)在抗體施用后30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘應(yīng)用電脈沖刺激時，通過在隱神經(jīng)上應(yīng)用電脈沖刺激的血流增加被抗體7E9(10mg/kg，靜脈施用)的存在顯著抑制；當(dāng)在抗體施用后30分鐘應(yīng)用電脈沖刺激時，被抗體8B6(10mg/kg，靜脈施用)的存在顯著抑制。這些數(shù)據(jù)表明，如通過刺激大鼠隱神經(jīng)誘導(dǎo)的皮膚血管擴(kuò)張所測量的，抗體4901、7E9、7D11和8B6在封閉CGRP活性中是有效的。實(shí)施例4:對抗CGRP抗體Gl及其變體的表征抗CGRP抗體Gl重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列在圖5中顯示。使用以下的方法表達(dá)和表征抗體G1及其抗體。使用的表達(dá)載體。抗體Fab片段的表達(dá)位于與Barbas(2001)Phagedisplay:alaboratorymanual,ColdSpringHarbor,NY,ColdSpringHarborLaboratoryPresspg2.10.VectorpComb3X中所述相似的IPTG誘導(dǎo)型啟動子lacZ的控制下，然而，修飾包括以下的額外結(jié)構(gòu)域的添加和表達(dá)人ic輕鏈恒定結(jié)構(gòu)域和IgG2人免疫球蛋白的CHI恒定結(jié)構(gòu)域、IgY-2鏈C區(qū)、蛋白質(zhì)編號P01859;免疫球蛋白k輕鏈(人)，蛋白質(zhì)編號CAA09181。小規(guī)模Fab制備。從用Fab文庫轉(zhuǎn)化(使用電穿孔感受態(tài)TGI細(xì)胞或化學(xué)感受態(tài)T叩10細(xì)胞)的大腸桿菌(E.Coli)中，使用單個克隆接種母板(瓊脂LB+羧芐西林(50ug/mL)+2。/。葡萄糖)和工作板(2mL/孔，96孔/板)，其中每個孔含有1.5ml—LB+羧芐西林(50ug/mL)+2%葡萄糖。對平板使用透氣的粘合封條(ABgene,Surrey,UK)。將每個平板在3(TC孵育12-16小時；劇烈搖動工作板。將母板儲存于4'C直到需要，而將來自工作板的細(xì)胞離心(400rpm，4°C，20分鐘)并重懸于1.0mLLB+羧芐西林(50ug/mL)+0.5mMIPTG中，通過在30。C劇烈搖動5小時誘導(dǎo)Fab的表達(dá)。將經(jīng)誘導(dǎo)的細(xì)胞在4000rpm,4°C離心20分鐘并重懸于0.6mLBiacoreHB-SEP緩沖液(IOmMHepespH7.4,150mMNaCl、3mMEDTA、0.005%v/vP20)中。通過冰凍(-80°C)然后在37'C融化完成經(jīng)HB-SEP懸浮的細(xì)胞的裂解。將細(xì)胞裂解液在4000rpm,4。C離心l小時，將碎片與含F(xiàn)ab的上清液分離，隨后使用MilliporeMultiscreenAssaySystem96-孔濾板和真空多頭管(vacuummanifold)過濾(0.2/xm)上清液。通過將經(jīng)過濾的上清液越過感受芯片上的CGRP注射，使用Biacore對其進(jìn)行分析。從母板上復(fù)蘇表達(dá)Fab的親和力選擇性克隆，所述克隆提供了用于PCR、測序和質(zhì)粒制備的模板DNA。大規(guī)模Fab制備。為了獲得動力學(xué)參數(shù)，如下大規(guī)模表達(dá)Fab。用1mL"初始"過夜培養(yǎng)物接種含有150mLLB+羧芐西林(50ug/mL)+2%葡萄糖的錐形瓶，所述培養(yǎng)物來自親和力選擇的表達(dá)Fab的大腸桿菌克隆。使用初始培養(yǎng)物的剩余部分(3mL)制備質(zhì)粒DNA(QIAprepmini-prep，Qiagen試劑盒)用于測序和進(jìn)一步加工。將大的培養(yǎng)物在3(TC劇烈搖動培養(yǎng)直到達(dá)到1.0的OD600nm(典型地用12-16小時)。通過在4000rpm,4。C離心20分鐘沉淀細(xì)胞，并重懸于150mLLB+羧節(jié)西林(50ug/mL)+0.5mMIPTG中。在3CTC表達(dá)5小時后，通過在4000rpm,4°C離心20分鐘沉淀細(xì)胞、懸浮于10mLBiacoreHBS-EP緩沖液中，并使用單個凍(-80。C)/融(37。C)循環(huán)裂解。通過在4000rpm,4。C離心1小時沉淀細(xì)胞裂解物，將上清液收集并過濾(0.2um)。將經(jīng)過濾的上清液上樣在用PBS,pH8平衡的Ni-NTAuperflowsepharose(Qiagen，Valencia.CA)柱上，然后用5倍體積的PBS,pH8洗滌。個體Fab用PBS(pH8)+300mM咪唑洗脫在不同的級分中。將含F(xiàn)ab的級分合并并在PBS中透析，然后在親和力表征之前通過ELISA定量。完整抗體制備。為了表達(dá)完整的抗體，將重鏈和輕鏈可變區(qū)克隆進(jìn)哺乳動物表達(dá)載體中并使用lipofectamine轉(zhuǎn)染進(jìn)HEK293細(xì)胞中用于瞬時表達(dá)。使用蛋白A用標(biāo)準(zhǔn)方法純化抗體。載體pDb.CGRP.hFcGI是包含Gl抗體重鏈的表達(dá)載體，并適用于重鏈的瞬時或穩(wěn)定表達(dá)。載體pDb.CGRP.hFcGI具有對應(yīng)于以下區(qū)域的核苷酸序列鼠巨細(xì)胞病毒啟動子區(qū)(核苷酸7-613);合成的內(nèi)含子(核苷酸613-1679);DHFR編碼區(qū)(核苷酸688-1253);人生長激素信號肽(核苷酸1899-1976);Gl的重鏈可變區(qū)(核苷酸1977-2621);含有以下突變的人重鏈IgG2恒定區(qū)A330P331到S330S331(氨基酸編碼參考野生型IgG2序列；參閱Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624)。載體pDb.CGRP.hFcGI在2005年七月15日保藏于ATCC，并被命名為ATCC編號No.PTA-6867。載體pEb.CGRP.hKGI是包含Gl抗體輕鏈的載體，并適用于輕鏈的瞬時表達(dá)。載體pEb.CGRP.hKGI具有對應(yīng)于以下區(qū)域的核苷酸序列鼠巨細(xì)胞病毒啟動子區(qū)(核苷酸2-613);人EF-1內(nèi)含子(核苷酸614-1149);人生長激素信號肽(核苷酸1160-1237);抗體Gl輕鏈可變區(qū)(核苷酸1238-1558);人k鏈恒定區(qū)(核苷酸1559-1882)。載體pEb.CGRP.hKGI在2005年七月15日保藏于并被命名為ATCC編號No.PTA-6866。用于親和力測定的Biacore測定。Gl單克隆抗體及其變體的親和力在25。C或37。C下使用Biacore3000TM表面等離振子共振(SPR)體系(Biacore,INC,PiscatawayNJ)測定。通過由預(yù)先固定的鏈霉親和素(SA感受芯片)捕獲N端生物素化的CGRP肽或片段并測量越過芯片上的CGRP或片段滴定的抗體GlFab片段或變體的結(jié)合動力學(xué)來測定親和力。所有的Biacore測定在HBS-EP電泳緩沖液(10mMHEPESpH7.4、150mMNaCl、3mMEDTA、0.005%v/vpolysorbateP20)中進(jìn)行。通過將N生物素化的CGRP在HBS-EP緩沖液中稀釋為少于0.001mg/ml的濃度并使用多種接觸時間將越過SA感受芯片注射來制備CGRP表面。對應(yīng)于<50個響應(yīng)單位(RU)捕獲水平的低容量表面用于高分辨率動力學(xué)研究，而高容量表面(約800個RU的捕獲的CGRP)用于濃度研究、篩選和溶液親和力測定。通過將抗體GlFab連續(xù)地稀釋兩倍或三倍增量至跨越luM-0.1nM(針對0.1-10x估計的KD)的濃度獲得動力學(xué)數(shù)據(jù)。典型地，將樣品以100/^L/分鐘注射1分鐘并允許至少10分鐘的解離時間。每個結(jié)合循環(huán)后，用25%v/v乙醇中25mMNaOH再生表面，所述表面可耐受數(shù)百個循環(huán)。通過使用BIAevaluation程序?qū)⒄麄€滴定系列(典型地一式兩份產(chǎn)生)與Langmuir結(jié)合模型整體擬合。這獲得了針對每個結(jié)合相互作用的一對獨(dú)特的結(jié)合和解離動力學(xué)速率常數(shù)(分別為U和k。ff)，其比例給出平衡解離常數(shù)(KD=k。ff/k。n)。以該方式測定的親和力(Ko值)列在表6和7中。對具有極端低解離速率(offrates)的結(jié)合相互作用的高分辨率分析。對于具有極端低解離速率的相互作用(特別是25。C下抗體GlFab與芯片上人a-CGRP的結(jié)合)而言，在兩部分實(shí)驗(yàn)中獲得親和力。使用具有以下修飾的上述方案。通過將跨越550nM-lnM的2-倍效價系列(一式兩份)以100uL/分鐘注射30秒和僅允許30秒的解離階段來測定結(jié)合速率常數(shù)(k。n)。通過將相同效價系列的三種濃度(高、中和低)一式兩份注射30秒并允許2小時的解離階段來測定解離速率常數(shù)(k。ff)。通過將兩種類型實(shí)驗(yàn)中獲得的和值組合獲得每種相互作用的親和力(KD)，如表5所示。通過Biacore測定溶液親和力。通過Biacore在37'C下測量抗體Gl對大鼠o;-CGRP禾nF37A(19-37)人D-CGRP的溶液親和力。使用高容量CGRP芯片表面(選擇高親和力人ce-CGRP用于檢測目的)并且HBS-EP76電泳緩沖液以5uL/分鐘流動。將恒定濃度5nM的抗體GlFab片段(要位于或低于基于溶液的相互作用的預(yù)期KD)與3-倍連續(xù)稀釋中終濃度跨越1nM到1的競爭肽預(yù)孵育，所述競爭肽為大鼠a-CGRP或F37A(19-37)人ce-CGRP。不存在或存在基于溶液的競爭肽時，將抗體GlFab溶液越過芯片上的CGRP注入，并監(jiān)控由溶液競爭導(dǎo)致的在芯片表面上檢測到的結(jié)合應(yīng)答缺失。使用校正曲線將這些結(jié)合應(yīng)答轉(zhuǎn)化為"游離Fab濃度"，所述曲線通過將抗體GlFab單獨(dú)(5、2.5、1.25、0.625、0.325禾口0nM)越過芯片上的CGRP滴定構(gòu)建。"游離Fab濃度"針對用于產(chǎn)生每個數(shù)據(jù)點(diǎn)的基于溶液的競爭性肽的濃度繪制，并使用BIAevaluation軟件與溶液親和力模型擬合。通過該途徑(直接)測定的溶液親和力在表5和7中顯示，并用于確認(rèn)在Fab穿過N生物素化的CGRR被直接注入SA芯片上時獲得的親和力。通過這兩種方法測定的親和力的密切一致證實(shí)了N生物素化形式的CGRP與芯片的結(jié)合不改變其天然溶液結(jié)合活性。下表5顯示了通過將Fab片段流過SA芯片上N生物素化的CGRP，通過Biacore測定的抗體Gl對人a-CGRP、人/3-CGRP、大鼠a-CGRP和大鼠/3-CGRP的親合力。為了更好地分析具有極低解離速率的結(jié)合相互作用的親和力，還在兩部分實(shí)驗(yàn)中測定親和力以補(bǔ)充該實(shí)驗(yàn)方向，還測定了大鼠ce-CGRP相互作用的溶液親和力(如上所述)。在兩個實(shí)驗(yàn)方向中測量的親和力的密切一致證實(shí)當(dāng)溶液中天然大鼠q:-CGRP被n生物素化并結(jié)合在SA芯片上時，其親合力未被改變。表5.穿過芯片上的CGRP滴定的抗體GlFab的親合力<table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>*在高分辨率兩部分實(shí)驗(yàn)中測定a-CGRP(大鼠和人)的親和力，其中解離相被監(jiān)測2小時(k。n、k。ff和KD的值表示n份重復(fù)的平均值，標(biāo)準(zhǔn)偏差以百分比方差表示)。對/3-CGRP(大鼠和人)的親和力使用僅20分鐘解離相通過總體分析測定，其不足夠準(zhǔn)確到定量它們的極端解離速率(它們的解離速率可能比此處闡述的更慢，從而它們的親和力可能甚至更高)?？贵wGlFab以下述解離速率從所有的CGRP(除a-大鼠CGRP外)上極端緩慢地解離，所述解離速率達(dá)到Bmcore實(shí)驗(yàn)的分辨率極限(特別是在25。C下)。"通過測量結(jié)合應(yīng)答的缺失測定的溶液親和力，所述結(jié)合應(yīng)答由用于抗體GlFab的芯片上的CGRP探測，所述芯片用基于溶液的大鼠a-CGRP競爭劑預(yù)孵育。下表6顯示了與抗體Gl相比具有氨基酸序列變化的抗體和它們對大鼠a-CGRP和人a-CGRP的親和力。表6中所示變體的所有氨基酸替換是相對于Gl的序列描述的。Fab片段的親合力通過將它們流經(jīng)SA芯片上的CGRP通過Biacore測定。表6.通過Biacore在37'C下測定的抗體Gl變體的氨基酸序列和親合力數(shù)據(jù)。<table>tableseeoriginaldocumentpage79</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>所有的CDR包括Kabat和ChothiaCDR。氨基酸殘基連續(xù)編號(見圖5)。所有的克隆具有與G1相同的L3+H1+H3序列。KD=k。ff/k。n。除了加下劃線的是通過Fab濃度系列的總體分析獲得的(Gl在高分辨率模式中分析)以外，所有的k。ff值在篩選模式中測定。因此，加下劃線的KD值通過測量k。n實(shí)驗(yàn)測定。其它的k。n值被評價為與M25相同。n.d.=未觀!|定為了測定被抗體Gl識別的人a-CGRP上的表位，使用上述的Biacore實(shí)驗(yàn)。購買N-生物素化版本的人a-CGRP，使得其能夠通過SA感受芯片高親和力捕獲。測定不存在或存在VGRP肽時GlFab片段與芯片上的人a-CGRP的結(jié)合。典型地，將2000:1mol的肽/Fab溶液(例如50nMGlFab中的10uM肽)越過人ce-CGRP注射在芯片上。圖6顯示被競爭肽封閉的結(jié)合百分比。圖6中顯示的數(shù)據(jù)指出封閉100%的GlFab對人o;-CGRP結(jié)合的肽是人a-CGRP的1-37(WT)、8-37、26-37、P29A(19-37)、K35A(19-37)、K35E(19-37)和K35M(19-37);/3-CGRP(WT)的1-37;大鼠a-CGRP(WT)的l-37;和大鼠0-CGRP(WT)的1-37。所有這些肽在C末端被酰胺化。人Q!-CGRP的肽F37A(19-37)和19-37(后者在C末端未被酰胺化)也封閉了GlFab對人a-CGRP結(jié)合的約80%到90%。人a-CGRP的肽1-36(C末端未酰胺化)封閉了GlFab對人a-CGRP結(jié)合的約40%。人a-CGRP的肽片段19-36(C末端被酰胺化)；人Qf-CGRP的肽片段1-13和1-19(其C末端均未被酰胺化)；和人淀粉不溶素、降鈣素和腎上腺髓質(zhì)素(均在C末端被酰胺化)不與GlFab競爭結(jié)合芯片上的人a-CGRP。這些數(shù)據(jù)證明Gl耙向CGRP的C末端表位，最末端殘基(F37)的識別及其酰胺化對于結(jié)合均是重要的。還測定了G1Fab對人"-CGRP變體的結(jié)合(37。C下)。表7顯示了通過將GlFab越過芯片上的N生物素化的人a-CGRP和變體滴定直接測量的親和力。表7中的數(shù)據(jù)表明抗體Gl結(jié)合C末端的表位，F(xiàn)37和G33是最重要的殘基。當(dāng)在C末端(其被酰胺化)添加額外的氨基酸殘基(丙氨酸)時，G1不結(jié)合CGRP。表7.37。C下測量的GlFab對人a-CGRP和變體(它們的氨基酸序列參見表4)的親合力<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>上述數(shù)據(jù)指出抗體Gl結(jié)合的表位位于人o;-CGRP的C末端上，且人a-CGRP上的氨基酸33和37對于抗體Gl的結(jié)合是重要的。殘基F37的酰胺化對于結(jié)合也是重要的。實(shí)施例5:抗CGRP拮抗劑抗體Gl對大鼠隱神經(jīng)刺激誘導(dǎo)的皮膚血.管擴(kuò)張的作用為了測試抗CGRP抗體Gl的拮抗劑活性，使用實(shí)施例3中所述大鼠模型測試抗體對大鼠隱神經(jīng)刺激引起的皮膚血管擴(kuò)征的作用。簡言之，用2%的異氟垸將大鼠維持麻醉。在實(shí)驗(yàn)開始時給予溴芐銨(30mg/kg，靜脈施用)以最小化隱神經(jīng)的交感神經(jīng)纖維伴隨剌激引起的血管收縮。通過使用與溫度受控的加熱毯連接的直腸探頭將體溫維持在37°C。手術(shù)暴露右后肢的隱神經(jīng)，最接近地切割并用塑料膜覆蓋以防干燥。將激光多普勒探頭置于后爪皮膚的背中部上，其為隱神經(jīng)支配的區(qū)域。用激光多普勒流量計監(jiān)測皮膚血流(測量為血細(xì)胞通量)。在注射溴芐銨后三十到四十五分鐘測定注射兩小時內(nèi)抗體作用的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)穩(wěn)定的基線通量(少于5%的變化)被建立至少5分鐘時，將神經(jīng)置于鉑雙極電極上并用電刺激(2Hz,10V,1ms,持續(xù)30秒)，20分鐘后再次刺激。使用應(yīng)答這兩次刺激的血流通量的平均值建立對電剌激的基線應(yīng)答(時間0)。然后靜脈(i.v.)施用抗體Gl(1mg/kg或10mg/kg)或媒介(與10mg/kgGl等體積的含0.01%吐溫20的PBS)。隨后，在抗體施用后30分鐘、60分鐘、90分鐘和120分鐘刺激(2Hz,IOV，1ms,持續(xù)30秒)神經(jīng)。在大約三小時的時間段中保持動物麻醉。對于應(yīng)答電脈沖刺激的每個通量而言，通過通量-時間曲線下的面積(AUC，其等于通量的改變乘以時間的改變)評價皮膚血流的累積變化。如圖7所示，當(dāng)在抗體施用后90分鐘電刺激隱神經(jīng)時，與運(yùn)載體相比，通過在隱神經(jīng)上應(yīng)用電脈沖刺激的血流增加被1mg/kg的抗體Gl(靜脈施用)的存在顯著抑制。當(dāng)在抗體施用后90分鐘和120分鐘電刺激隱神經(jīng)時，與運(yùn)載體相比，通過在隱神經(jīng)上應(yīng)用電脈沖刺激的血流增加被10mg/kg的抗體Gl(靜脈施用)的存在顯著抑制。在隱靜脈實(shí)驗(yàn)中更長的時間點(diǎn)測定抗體作用的實(shí)驗(yàn)中，在制備用于上述隱神經(jīng)刺激的動物前24小時或7天，對大鼠靜脈注射指定劑量的抗體。在這些實(shí)驗(yàn)中，可能在給藥前在個體大鼠中建立對電脈沖剌激的基線應(yīng)答，從而將處理組與在24小時或7天用媒介(PBS,0.01%吐溫20)給藥的動物進(jìn)行比較。如圖8A和8B中所示，與刺激前24小時或7天用媒介給藥的組相比，在相同時間點(diǎn)，在用10mg/kg或3mg/kgGl給藥的動物組中，后爪中背部皮膚中由隱神經(jīng)刺激激發(fā)的血流增加被顯著抑制。圖8C示出了對圖8A和8B中所示劑量應(yīng)答數(shù)據(jù)進(jìn)行的曲線擬合分析，以確定50X最大作用(EC50)所需的劑量。24小時的EC50為1.3mg/kg，而7天的EC50略低(0.8mg/kg)。實(shí)施例6:硬脊膜動脈(封閉式顱窗)實(shí)驗(yàn)中抗CGRP拮抗劑抗體G1的急性作用封閉式顱窗模型該實(shí)驗(yàn)的目的在于測定抗CGRP拮抗劑抗體的急性作用，并將其與CGRP受體拮抗劑BIBN4096BS的急性作用比較。如前所述(Williamsonetal.,Cephalalgia17(4):518-24(1997))用以下修飾進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用70mg/kg腹腔內(nèi)的戊巴比妥麻醉SpragueDawley大鼠G00-400g)。用20mg/kg/hr的靜脈戊巴比妥維持麻醉。通過頸靜脈對大鼠插管用于遞送所有藥物。用通過股動脈旋入腹主動脈中的探頭(mikro-tip導(dǎo)管，MillarInstruments)監(jiān)測血壓。將大鼠氣管切開并將呼吸速率維持在每分鐘75次3.5mL體積的呼吸。將頭固定在定向器具上并去除頭皮，通過用牙鉆弄薄骨頭在矢狀縫的側(cè)面左壁區(qū)域制造一個2x6mm的窗口。施用顯微操作器將鉑雙極電極降低至表面上并用重礦物油覆蓋。在電極窗口的側(cè)面創(chuàng)建5x6mm的另一窗口并用重礦物油填充，通過該窗口用CCD照相機(jī)和視頻尺寸分析器(LivingSystems)持續(xù)監(jiān)測腦膜中動脈(MMA)分支的直徑。制備后讓大鼠休息不少于45分鐘。建立對電刺激的基線應(yīng)答(15V,10hz,0.5ms脈沖，持續(xù)30秒)，然后用實(shí)驗(yàn)化合物(10mg/kgmu7E9、300/xg/kgBIBN4096BS或PBS0.01%吐溫20)對大鼠靜脈給藥。在給藥后5(BIBN4096BS)、30、60、90和120分鐘進(jìn)行其它電刺激。使用制圖軟件(ADInstruments)記錄所有的數(shù)據(jù)。如圖9所示，10mg/kg的mu7E9在給藥后60分鐘內(nèi)顯著地封閉了電場刺激激發(fā)的MMA擴(kuò)張并在實(shí)驗(yàn)的持續(xù)時間(120分鐘)中維持了該作用。比較而言，BIBN4096BS在給藥的5分鐘內(nèi)封閉MMA擴(kuò)張，但是該作用在90分鐘時完全消失。封閉的強(qiáng)度在BIBN4096BS和mu7E9之間是相當(dāng)?shù)摹?shí)施例7:抗CGRP拮抗劑抗體G1在腦脊膜動脈(封閉式顱窗)實(shí)驗(yàn)中的慢性作用該實(shí)驗(yàn)的目的在于測定給藥后7天抗CGRP抗體是否仍然能夠封閉電刺激的MMA擴(kuò)張。大鼠的制備與上述急性實(shí)驗(yàn)(實(shí)施例6)相同，但是有以下例外。在創(chuàng)建封閉式顱窗制劑和剌激之前7天對大鼠靜脈注射(10mg/kg、3mg/kg或lmg/kgGl)。不可能像急性實(shí)驗(yàn)中那樣在給藥前建立對電刺激的基線擴(kuò)張應(yīng)答，所以將抗體組與媒介(PBS,0.01%吐溫20)給藥的對照組中的MMA擴(kuò)張進(jìn)行比較。大鼠被允許休息不少于45分鐘后，以30分鐘的間隔對硬腦膜進(jìn)行電剌激。刺激處于2.5V、5V、IOV、15V和20V，均在10hz、0.5ms脈沖下持續(xù)30秒。如圖10中所示，10mg/kg和3mg/kg的Gl顯著地封閉了10到20伏特范圍內(nèi)電刺激激發(fā)的MMA擴(kuò)張。該數(shù)據(jù)證明Gl能夠最多在給藥后7天封閉電刺激的MMA擴(kuò)張。嗎啡停藥大鼠模型是用于絕經(jīng)期熱潮紅機(jī)制的確定的嚙齒動物模型(Sipeetal"BrainRes.1028(2):191-202(2004);Merchenthaleretal,，Maturitas30:307-316(1998);Katovichetal.，BrainRes.494:85-94(1989);Simpkinsetal.,LifeSciences32:1957-1966(1983))?；旧贤ㄟ^在皮下植入嗎啡小球使大鼠對嗎啡上癮。上癮后用納洛酮(阿片拮抗劑)注射動'物，這使得它們立刻被停藥。該停藥伴隨著皮膚溫度上升、核心體溫下降、心率提高和血清黃體生成素提高。這些在強(qiáng)度和時間上均與發(fā)生在人熱潮紅中的相似(Simpkinsetal.,LifeSciences32:1957-1966(1983))。另外，如果在誘導(dǎo)停藥前用雌二醇治療大鼠，則熱潮紅的癥狀被減少(Merchenthaleretal.,Maturitas30:307-316(1998))。這是嗎啡停藥模型被認(rèn)為模擬臨床熱潮紅的原因。卵巢切除的大鼠從CharlesRiverLaboratories定制。卵巢切除后不少于7天時通過皮下植入嗎啡小球(75mg嗎啡堿)創(chuàng)建嗎啡依賴性。兩天后再植入兩個小球。下一天對大鼠靜脈注射10mg/kg4901[m]或媒介(PBS,0.01%吐溫)。第二次植入小球后兩天，用氯胺酮(90mg/kg)麻醉并輕微抑制實(shí)施例8:嗎啡停藥熱潮紅模型大鼠。將表面溫度熱電偶粘在尾巴底部并使用直腸熱電偶測量核心溫度。使用Chart軟件(ADInstruments)記錄數(shù)據(jù)。將穩(wěn)定基線溫度記錄15分鐘后，皮下注射納洛酮(lmg/kg)。在接下來的60分鐘內(nèi)連續(xù)記錄溫度。結(jié)果顯示在圖IIA和IIB中。應(yīng)理解本文所述的實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于闡述的目的，由其啟發(fā)的多種修飾和改變應(yīng)被提示給本領(lǐng)域技術(shù)人員，并且包括在本申請的內(nèi)容和范圍內(nèi)。本文所述的所有出版物、專利和專利申請通過參考整體并入本文用于所有目的，就如同每個個體出版物、專利或?qū)＠暾埍惶貏e地和單獨(dú)地指明通過參考被并入一樣。生物材料的保藏以下的材料已經(jīng)保藏于AmericanTypeCultureCollection,10801UniversityBoulevard,Manassas,Virginia20110-2209，USA(ATCC):<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>載體pEb.CGRP.hKGI是編碼Gl輕鏈可變區(qū)和輕鏈k恒定區(qū)的多核苷酸；載體pDb.CGRP.hFcGI是編碼Gl重鏈可變區(qū)和重鏈IgG2恒定區(qū)的多核苷酸，其含有以下突變A330P331到S330S331(氨基酸編碼參考野生型IgG2序列；參閱Eur.J.Immunol.(1999)29:2613-2624)。這些保藏尊需國際承認(rèn)用于專利程序的微生物保存布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)及其規(guī)章的規(guī)定進(jìn)行。這確保保藏的存活培養(yǎng)物從保藏日起被維持30年。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，保藏物可以從ATCC獲得，并且遵循RinatNeuroscienceCorp.與ATCC之間的anl協(xié)議，所述協(xié)議確保相關(guān)U.S.專利公布或任何U.S.或外國專利申請公開后(先公開為準(zhǔn))，保藏的培養(yǎng)物后代永久和無限制地能夠被公眾獲得，并根據(jù)35USCSection122及其Commissioner's規(guī)則(包括37CFRSection1.14，尤其是指886OG638)確保U.S.CommissionerofPatentsandTrademarks授權(quán)的人能夠獲得所述后代。本專利申請的受讓人已經(jīng)同意，如果保存材料的培養(yǎng)物在合適的條件下培養(yǎng)時將要死亡或丟失或損壞，將在通知后迅速用另一相同材料替換。保藏材料的可獲得性不應(yīng)被解釋為可以違背任何政府當(dāng)局根據(jù)其專利法授予的權(quán)利來實(shí)施本發(fā)明的許可?？贵w序列Gl重鏈可變區(qū)氨基酸序列(SEOIDNO:l)VYYCLAYFDYGLAIQNYWGQGTLVTVSSGl輕鏈可變區(qū)氨基酸序列rSEOIDNO:2)FGQGTKLEIKGlCDRHI(擴(kuò)展的CDR)(SEOIDNO:3)GFTFSNYWISGlCDRH2(擴(kuò)展的CDR)(SEOIDNO:4)EIRSESDASATHYAEAVKGGlCDRH3(SEOIDNO:5)YFDYGLAIQNYGlCDRLI(SEOIDNO:6)KASKRVTTYVSGlCDRL2(SEOIDNO:7)GASNRYLGlCDRL3(SEOIDNO:8)SQSYNYPYTGl重鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEOIDNO.9)89CTGGGGTCAGGGTACCCTGGTTACCGTTTCCTCCGl輕鏈可變區(qū)核苷酸序列(SEOIDNO:10)ACACCTTCGGTCAGGGTACCAAACTGGAAATCAAAGl重鏈全抗體氨基酸序列(包括本文所述的經(jīng)修飾的IgG2)(SEOIDNO:ll)KSLSLSPGKGl輕鏈全抗體氨基酸序列(SEOIDNO:12)GLSSPVTKSFNRGECGl重鏈全抗體核苷酸序列(包括本文所述的經(jīng)修飾的IgG2)(SEOIDNO:13)CCACCTTCAGAGTGGTGAGCGTGCTGACCGTGGTGGl輕鏈全抗體核苷酸序列(SEOIDNO:14):GTCACAAAGAGCTTCAACCGCGGTGAGTGCTAA人和大鼠CGRP的氨基酸序列比較(人a-CGRP(SEQIDNO:15)、人/3-CGRP(SEQIDNO:43)、大鼠a-CGRP(SEQIDNO:41);和大鼠/3-CGRP(SEQIDNO:44)):NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2(人o;-CGRP)NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2(人/5-CGRP)NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2(大鼠a-CGRP)NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2(大鼠/3-CGRP)權(quán)利要求1.對人α-CGRP具有50nM或更小親合力(KD)的抗體，所述親合力通過表面等離子共振在37℃下測量。2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其包含在氨基酸序列上與SEQIDNO:1至少90%相同的VH結(jié)構(gòu)域。3.根據(jù)權(quán)利要求2的抗體，其中SEQIDNO:1位置99上的氨基酸殘基為L或被替換為A、N、S、T、V或R，且其中SEQIDNO:1第100位的氨基酸殘基為A或被替換為L、R、S、V、Y、C、G、T、K或P。4.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其包含在氨基酸序列上與SEQIDNO:2至少90%相同的V:^結(jié)構(gòu)域。5.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其包含選自以下的至少一個CDR:a.SEQIDNO:3示出的CDRHI;b.SEQIDNO:4示出的CDRH2;c.SEQIDNO:5示出的CDRH3;d.SEQIDNO:6示出的CDRL1;e.SEQIDNO:7示出的CDRL2;f.SEQIDNO:8示出的CDRL3;g.表6中顯示的Ll、L2禾卩H2的變體。6.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，其包含a.SEQIDNO:5示出的VHCDR3，或由于1或2個保守的氨基酸替換而與SEQIDNO:5不同的序列；和b.SEQIDNO:8示出的V^CDR3，或由于1或2個保守的氨基酸替換而與SEQIDNO:8不同的序列。7.—種抗體，其包含在氨基酸序列上與SEQIDNO:1至少90%相同的VH結(jié)構(gòu)域和在氨基酸序列上與SEQIDNO:2至少90%相同的V^結(jié)構(gòu)域。8.權(quán)利要求7的抗體，其中所述抗體為IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子，或從其衍生而來。9.根據(jù)權(quán)利要求7的抗體，其包含由ATCC編號No.PTA-6867的表達(dá)載體生產(chǎn)的重鏈。10.根據(jù)權(quán)利要求7的抗體，其包含由ATCC編號No.PTA-6866的表達(dá)載體生產(chǎn)的輕鏈。11.藥物組合物，其包含根據(jù)權(quán)利要求1的抗體和可藥用的賦形劑。12.在個體中預(yù)防或治療至少一種血管運(yùn)動癥狀的方法，所述方法包括對個體施用有效量的抗CGRP拮抗劑抗體。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述血管運(yùn)動癥狀為有先兆或無先兆的偏頭痛、偏癱性偏頭痛、叢集性頭痛、偏頭痛性神經(jīng)痛、久頭痛或緊張性頭痛。14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述血管運(yùn)動癥狀為熱潮紅。15.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗CGRP拮抗劑抗體是權(quán)利要求1到10中任一項(xiàng)所述的任何抗體。16.權(quán)利要求12的方法，其中所述抗CGRP拮抗劑抗體是由ATCC編號Nos.PTA-6867和PTA-6866的表達(dá)載體生產(chǎn)的抗體。全文摘要本發(fā)明描述了通過施用抗CGRP拮抗劑抗體來預(yù)防或治療CGRP相關(guān)病癥如血管運(yùn)動癥狀的方法，所述病癥包括頭痛(例如偏頭痛、叢集性頭痛和緊張性頭痛)和熱潮紅。也描述了針對CGRP的拮抗劑抗體G1和來自G1的抗體。文檔編號A61P5/24GK101309704SQ200680042443公開日2008年11月19日申請日期2006年11月2日優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日發(fā)明者喬格·澤勒,克里斯頓·托德·波爾森,安儂·露森達(dá)爾,堯姆·龐斯,西爾若·瓊斯·庫利爾,雅斯米納·杜比亞·阿迪石申請人:禮納特神經(jīng)系統(tǒng)科學(xué)公司