專利名稱：用于組織損傷的干細(xì)胞生長因子療法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
0002本發(fā)明涉及用于缺血性組織損傷治療的人干細(xì)胞生長因子(Stem CdlFactor(SCF))的應(yīng)用。本法明還涉及用于體內(nèi)表達(dá)SCF多肽的載體和 輸送方法。
背景技術(shù)：
0003下面對(duì)本發(fā)明背景的論述僅僅提供用于幫助讀者理解本發(fā)明以 及并沒有承認(rèn)描述或構(gòu)成本發(fā)明的現(xiàn)有技術(shù)。
0004在證明了干細(xì)胞在新血管形成中發(fā)揮作用，以及在心肌梗塞后 心臟功能改善中可能發(fā)揮作用之后，干細(xì)胞治療在心臟病學(xué)中已經(jīng)成為 研究的活躍領(lǐng)域。干細(xì)胞還顯示了在治療缺血性綜合癥例如冠狀動(dòng)脈疾 病、充血性心力衰竭和外周動(dòng)脈疾病的臨床前和臨床研究中具有潛力。 參見Perin等Circulation 2003 107: r75-r83; Haide等J. Mol, Cell. Cardiol. 2005 38(2): 225; Deschaseaux等，Cardiovascular Res. 2005 65(2): 305; Thompaon等，J. Heart Ling transplant. 2005 24(2): 2501;美國專利申請(qǐng)公 布第20060008450號(hào)。已經(jīng)描述了在培養(yǎng)中有效擴(kuò)增干細(xì)胞的方法。參見， Feugier等，J. Hematotherapy and Stem Cell Res. 2002 U: 127-138。
0005在這些疾病模型中，已經(jīng)假設(shè)了干細(xì)胞衍生的治療效果的幾種 作用機(jī)理；1)在骨髓干細(xì)胞制備物中存在的內(nèi)皮前體誘發(fā)缺血性組織中 的新血管形成并且這種新血管形成增強(qiáng)了血流，其能阻止損傷細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)組織修復(fù)。參見，Itescu, J. Mol. Med. 2003 8K5):288: Orlic, Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 2001 ^:10344; 2)骨髓衍生的干細(xì)胞誘發(fā)內(nèi)源性心 肌細(xì)胞生成。參見，Yoon等，J.Clin. Invest. 2005115: 326; 3)已經(jīng)顯 示哺乳動(dòng)物細(xì)胞能夠在干細(xì)胞和心肌細(xì)胞之間建立納米管狀的"高速通 道"，并且細(xì)胞質(zhì)的細(xì)胞器和流體被傳送到心肌細(xì)胞中。參見，Koyanagi, 等，CirculationRes。 2005， 1039-1041;和4)由骨髓衍生的細(xì)胞分泌 的旁分泌(體液的)因子促進(jìn)心肌細(xì)胞存活。參見，Gnecchi，等，Nat. Med.2005 U:367陽368.
0006已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在缺血性疾病例如心肌梗塞后中直接注入CD34+骨髓 干細(xì)胞或自體同源成肌細(xì)胞提高臨床效果。但是，細(xì)胞的先體外后體內(nèi)
(離體)處理提出了重大的技術(shù)挑戰(zhàn)，例如缺乏足夠的高效傳輸方式。 參見，Takagi等，Biosci Bioengineer. 2005 22:189-196。另外，細(xì)胞產(chǎn)物的 制造具有復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，包括維持足夠的無菌狀態(tài)，低溫鏈傳輸(cold chain transport)，質(zhì)量控制測試后勤管理，等等(Bosse等，AnnHematol 2005 2^:469-476)。最后，在心臟中注入非心臟細(xì)胞可能產(chǎn)生具有生命危 險(xiǎn)的心律不齊。參見，MenascM等J. Am. Coll. Cardiol. 2003 ii (7): 1078-1083。
0007已經(jīng)顯示在急性的心肌梗塞后施用特定的細(xì)胞因子例如SCF和 G-GSF增強(qiáng)心臟功能的恢復(fù)。參見，Orlic等，Proc.Natl.Acad.Sci (USA)2001 98 (18) : 10344-10349; Takano等，Current Pharmaceutical Design 2003 2:1121-1127; Ohtsuka等，TheFASEB J.2004 18(7):851-3。施用編碼 VEGF165， VEGF189， ANG-1或SDF-1的腺病毒載體，已經(jīng)被用于增加 造血干細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞的血漿水平。Rafii等，Gene Therapy 2002 2:631-641。
0008干細(xì)胞生長因子("SCF")為已知為c-kit的酪氨酸激酶受體的配 體。參見，Zsebo,Cell 1990， 63(1) 213-24:美國專利第6，218,148號(hào)。SCF 誘發(fā)原始CD34+骨髓祖細(xì)胞的增殖。在小鼠，狗和人類的許多研究中顯 示SCF/c-kit通路(SCF/c-kitpathway)參與缺血性損傷后的正常修復(fù)過程。 在C-kit信號(hào)傳導(dǎo)中具有遺傳缺陷的小鼠顯示，心肌梗塞后的恢復(fù)依靠心
6臟中SCF誘導(dǎo)的c-kit+細(xì)胞增殖。參見，F(xiàn)azel等，"Stem cell factor receptor and cardiac regeneration after myocardial infarction" Am. Heart Assoc. Scientific Sessions 2004, Circulation 2004， 10月26日；110(17增刊)摘要第 2181號(hào)；Ayach,等，"c國Kit十BM cells are essential for reducing deteriorating myocardial and heart function post-myocardial infarction"Am. Heart Assoc. Scientific Sessions 2004， Circulation 2004， 10月26日；110 (17增刊)摘要 第317號(hào)。SCF在心肌梗塞后在犬心臟組織中被誘導(dǎo)。參見，F(xiàn)rangogiannis 等，Circulation 1998巡:687。 SCFmRNA在心肌梗塞后72小時(shí)的再輸注期 間內(nèi)被誘導(dǎo)。參見，F(xiàn)rangogiannis等1998。從梗塞的心肌產(chǎn)生的SCF在 其中存在的巨噬細(xì)胞亞群中被發(fā)現(xiàn)，并且增加了在缺血部位c-kit+肥大細(xì) 胞的密度。肥大細(xì)胞可以分泌血管因子例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)， 其促進(jìn)血管再形成過程。參見，Heissig等，J.Exp. Med .2005 202(6):739-50。 SCF表達(dá)被發(fā)現(xiàn)在心肌梗塞后的心臟中降低。參見，Wolbaek等， ActaPhysiol Scand 2002 12^:173-181。體外研究顯示，SCF基因表達(dá)可以 被包括TNF-a在內(nèi)的促炎細(xì)胞因子抑制。參見，Andreews等，1992 Blood 祉365A; Langley ， Blood , 1993 M: 656-660。0009美國專利第6，723，561號(hào)描述了編碼SCF的反轉(zhuǎn)錄病毒載體和表 達(dá)SCF的反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞系，和它們?cè)谳斔屯鈦砗怂岬綄?duì)象的干細(xì)胞 中的應(yīng)用。
發(fā)明概述
0010描述了用于治療對(duì)象損傷的方法。該方法包括輸送編碼SCF的核 酸到對(duì)象損傷的部位，其中該核酸被由核酸表達(dá)SCF的細(xì)胞所吸收。由核 酸編碼的SCF的形式可能是膜結(jié)合形式，可分泌形式或二者都是。在施用 并被損傷部位的細(xì)胞吸收后，表達(dá)的SCF可以在體內(nèi)將c-kit表達(dá)干細(xì)胞和 /或肥大細(xì)胞募集到損傷部位以使得損害組織修復(fù)。
0011應(yīng)該理解，核酸可以作為可溶的分子被輸送——單獨(dú)的或與蛋 白質(zhì)、脂類和其它物質(zhì)一起，作為病毒的一部分，或包封在人造顆粒例 如脂質(zhì)體內(nèi)。但是，核酸不在細(xì)胞中輸送。但是，應(yīng)該理解，細(xì)胞可以 被單獨(dú)施用并且與核酸的施用分開。這樣施用的細(xì)胞可以包括干細(xì)胞。但是，該方法不必需施用任何這樣的細(xì)胞。
0012適于該治療方法的損傷包括缺血性損傷。本文所使用，"缺血 性損傷"指供給組織的血液不足所導(dǎo)致的組織損傷，例如由動(dòng)脈狹窄或封 閉引起的。嚴(yán)重的缺血可能導(dǎo)致組織壞死。本文中所使用的缺血性組織 的治療指降低由缺血侵害引起的組織損傷的嚴(yán)重性。
0013優(yōu)選地，缺血性損傷與心血管系統(tǒng)相關(guān)。能夠用本文公開方法 治療的牽涉心血管系統(tǒng)的缺血性損傷包括心肌梗塞、缺血性中風(fēng)、冠狀 動(dòng)脈疾病、外周血管疾病(例如。外周動(dòng)脈疾病)，和充血性心力衰竭。 能治療的其它損傷包括周圍神經(jīng)病，重建外科手術(shù)和傷口愈合，和以作 為損傷過程一部分的降低的SCF水平為特征的其它疾病。本發(fā)明的損傷不 包括對(duì)象中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)損傷。
0014由施用的核酸編碼的SCF優(yōu)選地是人SCF。編碼的SCF可以是可 分泌形式的SCF。優(yōu)選的分泌形式的SCF包含

圖1的氨基酸26-165。編碼 的SCF還可以是膜結(jié)合形式的SCF。優(yōu)選的膜結(jié)合形式的SCF包含圖1的氨 基酸25-245。還包括施用編碼膜結(jié)合形式的SCF和分泌形式的SCF的核 酸。如本領(lǐng)域熟知，編碼每種形式的核酸可以以單一核酸存在或以不同 的核酸存在。
0015編碼SCF的核酸可以是表達(dá)載體的形式，其可以是病毒載體或非 病毒載體。優(yōu)選的病毒載體包括那些從腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹 病毒、牛乳頭瘤病毒，腺相關(guān)病毒、慢病毒載體、牛痘病毒或多瘤病毒 衍生的病毒載體。
0016通過使用在損傷組織中存在的配體的受體，施用的核酸可以被 輸送到損傷的部位。使用導(dǎo)向部分進(jìn)行的病毒載體-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)已經(jīng)被描 述用于許多病毒載體系統(tǒng)，包括慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān) 病毒和HSV-1擴(kuò)增子。參見，例如，Takada等，Rev. Med. Virol. 2003 13: 387-398?？蛇x地，或另外，在設(shè)備例如可操控導(dǎo)管的幫助下，核酸可以 被施用到損傷的部位。在一個(gè)實(shí)施方式中，導(dǎo)管被用于輸送核酸到缺血 性心臟組織。在另一個(gè)實(shí)施方式中，通過植入心壁中的裝置，核酸可以 被輸送到缺血性心臟組織。在又一實(shí)施方式中，核酸被輸送到冠狀動(dòng)脈
8循環(huán)中，其隨后將核酸與缺血性心臟組織接觸。
0017治療的方法還包括將干細(xì)胞施用到對(duì)象。施用的干細(xì)胞優(yōu)選為 造血干細(xì)胞或間質(zhì)干細(xì)胞。干細(xì)胞可以是外源干細(xì)胞或內(nèi)源干細(xì)胞，內(nèi) 源干細(xì)胞由對(duì)象的細(xì)胞源離體產(chǎn)生，并且隨后返回到對(duì)象中。
0018治療的方法還包括向?qū)ο笫┯靡环N或多種細(xì)胞因子或趨化因子。 細(xì)胞因子或趨化因子可以與干細(xì)胞聯(lián)合被施用。
附圖簡述
0019圖1為人全長SCF的天然氨基酸序列。
0020圖2顯示了編碼人全長SCF的的核酸序列。在核苷酸位置41 開始的蛋氨酸起始密碼子被加強(qiáng)顯示，在核苷酸860位置開始的終止密 碼子TAA被加強(qiáng)顯示。
優(yōu)選實(shí)施方式的詳述
0021本文提供治療遭受損傷，例如缺血性損傷的對(duì)象的方法，包括 向?qū)ο笫┯镁幋aSCF的核酸，其中核酸被輸送到損傷的部位并被吸收入表 達(dá)SCF的細(xì)胞中。正如所討論的，該治療方法不需要向?qū)ο笫┯眉?xì)胞?？?以相信，依照本發(fā)明方法在損傷部位所產(chǎn)生的SCF動(dòng)員來自體內(nèi)部位，例 如骨髓，表達(dá)c-kit的干細(xì)胞和/或肥大細(xì)胞，其隨后回到損傷的部位。細(xì) 胞可以回到損傷的部位并粘附在其中的基質(zhì)細(xì)胞上，這通過已知被表達(dá) 在干細(xì)胞和基質(zhì)上的各種受體/配體對(duì)中的任意一種進(jìn)行。這樣的受體/ 配體對(duì)可以包括SCF/ckit, SDF-1/CXCR4，和VCAM-l/VLA-4。參見， Cottler-Fox,等，Am. Soc. Hematol. Educ. Program Book 2003 San diego calif, 第419頁。
0022如本文所描述SCF向損傷部位的靶向輸送還可以增強(qiáng)從骨髓動(dòng) 員的在血液中循環(huán)的c-kit表達(dá)細(xì)胞的數(shù)目，并且?guī)椭@樣的細(xì)胞靶向缺血 性組織。本文所描述的SCF向損傷部位的靶向輸送還可以增加移植細(xì)胞的 增殖。在將SCF核酸靶向損傷部位后，任意或所有的這些結(jié)果可能發(fā)生。
0023本文所使用的向"損傷部位"的輸送指編碼SCF的核酸被輸送到在損傷組織中出現(xiàn)的細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，向損傷部位的輸送不需要所有施用的核酸被輸送到損傷組織部位，或沒有施用的核酸沒有被輸送到損傷部位外的細(xì)胞。施用的核酸可以被吸收并且被體內(nèi)損傷組織外
的細(xì)胞所表達(dá)，只要被損傷組織中的細(xì)胞所表達(dá)的SCF數(shù)量足以募集干細(xì)胞到損傷部位并且提供治療改進(jìn)。應(yīng)該理解，本文中對(duì)于施用編碼SCF核酸的引用不限定于施用裸核酸，而是包括與蛋白質(zhì)、脂類和其它物質(zhì)一同施用核酸。因此，施用的核酸可以是病毒載體，其可以被包裝在病毒顆粒中，與脂質(zhì)體結(jié)合的核酸和類似物。
0024本文所描述的SCF療法可以是單獨(dú)的治療，可以與標(biāo)準(zhǔn)的醫(yī)學(xué)處理結(jié)合，或與其它專用療法，如施用細(xì)胞因子、趨化因子和/或干細(xì)胞相
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0025在優(yōu)選的方法中，損傷為與心血管系統(tǒng)相關(guān)的缺血性損傷。本文所使用的術(shù)語"心血管疾病"指心臟和脈管系統(tǒng)的異常。該術(shù)語旨在包括但不限于，腎血管性高血壓、充血性心力衰竭、主動(dòng)脈瘤、髂動(dòng)脈瘤或股動(dòng)脈瘤、肺栓塞、心肌梗塞、急性冠狀動(dòng)脈綜合癥、心絞痛，原發(fā)性高血壓、心房纖顫、收縮障礙、舒張障礙、心肌炎、動(dòng)脈硬化癥、房性心動(dòng)過速、心室纖顫、心內(nèi)膜炎和外周血管疾病。由缺血導(dǎo)致的心血管疾病例如冠狀動(dòng)脈疾病、充血性心力衰竭和外周動(dòng)脈疾病特別地適合使用本發(fā)明的方法治療。依照本文的方法，心血管系統(tǒng)損傷——例如包括心臟或外周部位例如腿的損傷——的治療可以通過將編碼SCF的核酸輸送到損傷部位的方法而完成。
0026如本文所用，"干細(xì)胞生長因子"或"SCF，或"SCF多肽"指天然存在的SCF (例如天然人SCF)以及非天然存在的(即不同于天然存在的)多肽，其具有與天然存在的干細(xì)胞生長因子足夠相同的氨基酸序列和糖基化作用，以便保留天然存在的干細(xì)胞生長因子的至少一種生物活性。SCF的生物活性包括刺激早期造血祖細(xì)胞的生長，其能成熟為紅細(xì)胞類、巨核細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。在施用SCF后，SCF還具有增加動(dòng)物體內(nèi)髓系和淋巴系造血細(xì)胞數(shù)目的功能。干細(xì)胞的特色性特征之一為它們分化成骨髓的和淋巴細(xì)胞二者的能力。參見，Spangrude等，Science 1988 241:58-62。
0027SCF多肽可以是全長天然多肽或該序列的變體。參見，例如Martin,FH. Cell, 1990, 63,203-211;美國專利第6,218,148號(hào)。SCF多肽還可以包括SCF多肽的截短的或分泌的形式，(例如，包含細(xì)外結(jié)構(gòu)域序列的可溶性形式)，變體形式(例如，可選地剪接形式)和SCF多肽的等位基因變體。
0028全長天然SCF多肽作為273個(gè)氨基酸的前體被產(chǎn)生，其包括作為信號(hào)序列的殘基1-25，作為胞外結(jié)構(gòu)域的殘基26-214位，作為潛在的跨膜的結(jié)構(gòu)域的殘基215-237和作為潛在的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的殘基238-273。參見，Swiss-Prot登錄號(hào)P21583或圖l。編碼全長天然人SCF的核苷酸序列在圖2中被顯示為nt位置41-862(還可以參見，GenBank登記號(hào)BC074725)。編碼SCF的剪接變體的核酸序列在GenBank中在登記號(hào)NM 000899和NM003994.2下發(fā)現(xiàn)。因此，人天然SCF表示為從Swiss-Prot登錄號(hào)P21583或圖l的位置26-273的248個(gè)氨基酸。較短形式的人天然SCF包括表示為Swiss-Prot登錄號(hào)P21583或圖l的位置26-245的膜結(jié)合形式，以及可溶性形式表現(xiàn)為Swiss-Prot登錄號(hào)P21583或圖l的位置26-165。
0029如本文所使用的，"可溶性的SCF，或"可分泌的SCF"指具有關(guān)于c-kit的生物活性但缺少功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的SCF形式。缺少功能性跨膜結(jié)構(gòu)域的分泌形式的SCF缺少Swiss-Prot登錄號(hào)P21583或圖1的序列238-273的全部或幾乎全部。"功能性跨膜結(jié)構(gòu)域"為這樣的結(jié)構(gòu)域，其當(dāng)被包含在蛋白質(zhì)中時(shí)，保留在產(chǎn)生蛋白質(zhì)的細(xì)胞的質(zhì)膜中的蛋白質(zhì)。可溶性或可分泌SCF可以被保持在未添加去污劑的水溶液中。
0030本文所使用的SCF包括SCF多肽的變體("變體SCF多肽")，其指代"活性"的SCF多肽，其中活性如本文所定義，以及與天然人SCF多肽序列具有至少大約95%氨基酸序列同一性。這樣的SCF多肽變體包括，例如，其中在N-或C-未端或在序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被加入、置換或剔除的SCF多肽。通常地，變體SCF多肽將與所描述的天然氨基酸序列具有至少約95%的氨基酸序列同一性，更優(yōu)選地具有至少約95%的序列同一性，％%、 97%、 98%、 99%或大于99%的序列同一性，含有
ii或不含有信號(hào)肽。在美國專利6，759，215或6,207,417中也描述了天然和非天然的SCF多肽。
0031SCF多肽還包括前蛋白(pre-protein)或原蛋白(pro-protein)或
成熟蛋白，包括能夠被導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)、分泌囊泡、細(xì)胞區(qū)室、或胞外空間的多肽或蛋白質(zhì)，這典型的例如是信號(hào)序列導(dǎo)致的，但是，還包括不需要具有信號(hào)序列而被釋放進(jìn)入胞外空間的蛋白質(zhì)。 一般地，多肽進(jìn)行下列加工，例如信號(hào)序列的切割、修飾、折疊等，導(dǎo)致產(chǎn)生成熟的形式(參見，例如Alberts等(1994) ， Molecular Biology of The Cell, GarlandPublishing, New York, NY，第557-592頁)。如果SCF多肽被釋放到胞外空間中，它能進(jìn)行胞外加工以產(chǎn)生"成熟"的蛋白質(zhì)。釋放進(jìn)入胞外空間可以通過多種機(jī)理，包括例如胞吐作用和蛋白水解切割而發(fā)生。0032SCF多肽還可以被"改變"，導(dǎo)致"變異"，以及可以包含氮基酸殘基的剔除、插入或置換，其產(chǎn)生沉默變化并且產(chǎn)生功能相等的蛋白質(zhì)?？紤]周全的氨基酸置換可以根據(jù)殘基的極性、電荷、溶解度、疏水性、親水性和/或兩親性性質(zhì)的相似性作出，只要SCF多肽的生物活性或免疫活性被保留。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸可能包括天冬氨酸和谷氨酸，以及帶正電荷的氨基酸可能包括賴氨酸和精氨酸。具有相似親水性值的、擁有不帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸可能包括天冬酰胺和谷氨酰胺；以及絲氨酸和蘇氨酸。具有相似親水性值的、擁有不帶電荷側(cè)鏈的氨基酸可能包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸；甘氨酸和丙氨酸；以及苯丙氨酸和酪氨酸。
0033可以用本領(lǐng)域已知的任意方法制備SCF多肽。例如，天然存在的SCF多肽可以被分離、重組產(chǎn)生、合成產(chǎn)生，或用這些方法的任意組合產(chǎn)生。例如，重組產(chǎn)生的SCF多肽形式——包括分泌的多肽，可以使用本文中所描述的技術(shù)或在本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)純化。參見，Martin FH
;Primary structure and functional expression of rat and human stem cell
factor DNAs. Cell 63:203， 1990。 SCF多肽還可以從天然的、合成的或重組來源純化，或本領(lǐng)域已知的其它方式純化，如諸如使用針對(duì)SCF或與SCF融合的肽序列產(chǎn)生的抗體而。參見，例如美國專利6,759,215或6,207,417。0034本文所描述的SCF多肽和變體由核酸所編碼。編碼SCF的多核苷酸序列，通常是SCF多核苷酸變體將與天然SCF核酸序列具有至少大約75%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約80%的核酸序列同一性，還更優(yōu)選地至少大約81%的核酸序列同一性，又更優(yōu)選地至少大約82%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約83%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約84%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約85%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約86%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約87%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約88%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約89%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約90%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約91%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約92%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約93%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約94%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約95%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約96%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約97%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約98%的核酸序列同一性，更優(yōu)選地至少大約99%的核酸序列同一性。優(yōu)選地，變體將與天然多核苷酸序列具有至少大約95%，更優(yōu)選地至少96%、 97%、 98%、 99%或大于99%的序列同一'性。參見，Martin FH， FH. Primary Structure AndFunctional Expression Of Rat And Human Stem-Cell Factor DNAS Cell,1990, ^!，203-211。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，作為遺傳密碼子簡并性的結(jié)果，可以產(chǎn)生大批編碼SCF多肽的多核苷酸序列，其中一些與任何已知和天然存在的基因的多核苷酸序列具有最小同源性。因此，編碼SCF的核酸考慮多核苷酸序列的每種和全部可能的變異，其可以根據(jù)可能的密碼子選擇通過選擇各種組合而產(chǎn)生。這些組合根據(jù)運(yùn)用到天然存在的SCF的多核苷酸序列的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)遺傳密碼子而產(chǎn)生，并且所有這樣的變異被認(rèn)為被具體公開。編碼天然的和非天然的SCF多肽的DNA序列在美國專利6,759,215或6,207,417中被描述。
0035編碼多核苷酸可以通過合成化學(xué)方法被制備。產(chǎn)生之后，合成的序列可以被單獨(dú)使用或被插入許多可利用的表達(dá)載體和細(xì)胞系統(tǒng)的任意之中，這通過使用本領(lǐng)域熟知的試劑進(jìn)行。而且，合成化學(xué)方法可以被用于將突變引入編碼SCF的序列。
0036編碼SCF的多核苷酸可以由多核糖核苷酸或多脫氧核糖核苷酸組成，其可能是未修飾的RNA或DNA或修飾的RNA或DNA。例如，SCF多核苷酸可以由以下組成單鏈和雙鏈DNA，為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的DNA，單鏈和雙鏈RNA，為單鏈和雙鏈區(qū)域混合物的RNA，包含DNA和RNA的雜合分子，其可以是單鏈的，或更典型地，是雙鏈的或單鏈和雙鏈區(qū)域的混合物。此外，編碼SCF的多核苷酸可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA兩者的三鏈區(qū)域組成。SCF多核苷酸還可能包含一個(gè)或多個(gè)修飾的堿基或出于穩(wěn)定性或其它原因而修飾的DNA或RNA骨架。"修飾的"堿基包括，例如三甲基化堿基和非常見堿基例如次黃苷。對(duì)DNA和RNA可以進(jìn)行多種修飾；因此，"多核苷酸"包括化學(xué)修飾的，酶法修飾的或代謝修飾的形式。
0037本文所使用的術(shù)語"相似的"或"相似性"描述了不同的核酸或氨基酸序列之間的關(guān)系，其中，序列因序列內(nèi)一個(gè)或多個(gè)區(qū)段或區(qū)域上部分序列同一性或序列相似性而關(guān)聯(lián)。這樣的相似氨基酸殘基可以在不同的氨基酸序列之間相同，或代表不同序列間的保守氨基酸置換。因此，術(shù)語"同一性"描述了氨基酸殘基，其在不同氨基酸序列間是相同的。對(duì)于本文所鑒定的每個(gè)SCF氨基酸序列，氨基酸序列相似性或同一性被定義為在序列比對(duì)之后或，如果需要，引入缺口以獲得最大的序列相似性或同一性百分比之后，與SCF多肽序列中的氨基酸殘基相似或相同的候選序列中的氨基酸殘基百分比。對(duì)于本文所鑒定的SCF氨基酸序列，"氨基酸序列同一性百分比(％)"被定義為在序列比對(duì)之后或，如果需要，引入缺口以獲得最大的序列同一性百分比之后，與SCF多肽序列中的氨基酸殘基相同的候選序列中的氨基酸殘基百分比，并不考慮任何保守置換作為序列同一性的一部分。類似地，對(duì)于本文所鑒定的SCF多核苷酸序歹lj，"核酸序列同一性百分比(％)"被定義為在序列比對(duì)之后或，如果需要，引入缺口以獲得最大的序列同一性百分比之后，與SCF多核苷酸序列中的多核苷酸相同的候選序列中的多核苷酸百分比。用于確定氨基酸序列同一性百分比的比對(duì)可以通過本領(lǐng)技術(shù)內(nèi)的多種方法完成，例如，使用公共可利用的計(jì)算機(jī)軟件例如ALIGN、 ALIGN-2 、 Megalign (DNASTAR)或BLAST(例如，Blast、 Blast-2、 WU-Blast-2)軟件和使用用 于缺口罰分(gap penalty)等的默認(rèn)設(shè)置。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以決定用于 測量序列比對(duì)的合適參數(shù)，包括在被比較的全長序列上取得最大比對(duì)所 需要的任何算法。例如，本文所使用的同一性百分比數(shù)值通過使用 WU隱BLAST-2[Altschul.等，Methods in Enzymology 266:460-80 (1996)]而 產(chǎn)生。大多數(shù)WU-BLAST-2搜索參數(shù)被設(shè)置為默認(rèn)值。那些沒有被設(shè)置 為默認(rèn)值的參數(shù)，即可調(diào)整的參數(shù)，被設(shè)為下列值重疊范圍(overlap span)=l;重疊分?jǐn)?shù)(overlapfraction^0.125;字閾值(word threshold) (T) =11;以及得分矩陣(scoring matrix) =BLOSUM62。對(duì)于本文的目的， 氨基酸序列同一性百分?jǐn)?shù)的數(shù)值可以通過以下確定(a)通過 WU-BLAST-2確定的，在感興趣SCF多肽氨基酸序列和感興趣的比較氨 基酸序列(即，感興趣的SCF多肽與之比較的序列)之間匹配的相同氨 基酸殘基的數(shù)目分別除以(b)感興趣的SCF多肽的氨基酸殘基的總數(shù)目。
0038二條核酸序列基本上相同表示為由第一條核酸序列編碼的多肽 與由第二條核酸序列編碼的多肽發(fā)生免疫交叉反應(yīng)，如下面描述。因此， 多肽典型地基本上與第二多肽相同，例如，其中兩個(gè)肽僅僅因保守置換 而不同。二條核酸序列基本上相同的其它指示為二個(gè)分子在本領(lǐng)域熟知 的嚴(yán)格條件下相互雜交。代表性的高嚴(yán)格條件包括低的鹽濃度(例如， <4xSSC緩沖液和/或〈2xSSC緩沖液)，非離子去污劑的存在(例如 0.1%SDS)，和/或相對(duì)高的溫度(例如，〉55。C和/或〉70。C)。
0039在另一個(gè)實(shí)施方式中，SCF變體多肽由這樣的核苷酸分子編碼， 其能夠與編碼全長SCF天然多肽的核苷酸序列雜交，優(yōu)選地在嚴(yán)格的雜 交和洗滌的條件下進(jìn)行。本文所使用的術(shù)語"成熟蛋白質(zhì)"或"成熟多肽" 指在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的形式(一種或多種)。通常 假設(shè)， 一旦成長中的蛋白質(zhì)鏈通過粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)開始時(shí)，由哺乳動(dòng) 物細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)具有信號(hào)肽(SP)序列，其從完整的多肽切割下來 以產(chǎn)生蛋白質(zhì)的"成熟的"形式。對(duì)分泌蛋白質(zhì)的切割不常常是一致的， 并且可能產(chǎn)生一種以上的成熟蛋白質(zhì)。分泌的蛋白質(zhì)的切割部位由全蛋白的一級(jí)氨基酸序列決定。
0040本文所使用的術(shù)語"載體"指包含完整復(fù)制子的非染色體核酸， 這樣，當(dāng)例如通過轉(zhuǎn)化過程被置于細(xì)胞中時(shí)，載體可以被復(fù)制。病毒載 體包括反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、乳多空病毒或其它修飾的天然 存在的病毒。載體還指核酸與允許被細(xì)胞吸收的化學(xué)品或物質(zhì)的配制物。 在近幾年中生物化學(xué)和分子生物學(xué)的進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致構(gòu)建重組載體，其中
例如，反轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒和質(zhì)粒被制成分別包含外源RNA或DNA。 在具體的例子中，重組載體可以包括異源RNA或DNA。0041輸送核酸的載體可以是病毒載體，非病毒載體或物理載體。參 見，例如，Rosenberg等，Science, 242:1575-1578 (1988)，和Wolff等， Natl. Acad. Sci. USA86: 901 l掘4 (1989)。討論用于基因治療的方法 和組合物的最近的綜述文獻(xiàn)包括Eck等，c& Gz7/^wS 777e 尸/wr附"co/og7.c"/ 5ay/s r/zm^wZ/cj, 第九版，Hardman 等編輯， McGray-Hill，紐約，(1996)，第5章，第77-101頁；附/so" C"". /ww""o/. 107 (增干U 1): 31-32 (1997); Wivel等，//emWo/ogv/(9"co/ogy C7/w'" o/ JVoW/z Jwm'ca， T7z簡"，S. L. Eck， ed， 12(3) : 483-501
(1998); Romano等，&emCe^， 18: 19-39 (2000)，以及其中所引用的 參考文獻(xiàn)。美國專利6,080,728也提供了大量的基因輸送方法和組合物的 討論。輸送的途徑包括例如系統(tǒng)性施用和原位施用。熟知的病毒輸送技 術(shù)包括使用腺病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、泡沫病毒、單純皰疹病毒和 腺相關(guān)病毒載體。
0042用于輸送核酸的代表性非病毒載體包括裸DNA;與陽離子脂類 復(fù)合的DNA，單獨(dú)或與陽離子聚合物組合；陰離子和陽離子脂質(zhì)體;DNA-
蛋白質(zhì)復(fù)合體和顆粒，包括與陽離子聚合物例如異源多賴氨酸，限定長 度的寡肽和聚乙烯亞胺縮合的DNA，在一些情況下包含在脂質(zhì)體中；以 及包含病毒和多賴氨酸-DNA的三重復(fù)合體的使用。廣泛地研究了體內(nèi) DNA-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移到多種不同的靶位置。裸DNA可以提供在肌肉中 長期的表達(dá)。參見，Wolff,等Human Mol. Genet, 1992 h 363-369; Wolff， 等，Science, 1990 247， 1465-1468。 DNA-介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移也在肝臟、心臟、肺、大腦和內(nèi)皮細(xì)胞中被表征。參見，Zhu等，Science, 1993巡 209-211; Nabel等，Science, 19892M: 1342-1344。用于基因轉(zhuǎn)移的DNA 還可以與多種陽離子脂類、多聚陽離子和其它結(jié)合物質(zhì)一起聯(lián)合使用。 參見，Przybylska等，J. Gene Med .2004《85-92; Svahn等J. Gene Med， 2004 g: S36-S44。
0043當(dāng)核酸被置于與另一核酸序列的功能關(guān)系中時(shí)，該核酸被"可操 縱地連接"。例如，前序列或分泌前導(dǎo)序列的DNA可操縱地與多肽的DNA 連接，如果它被表達(dá)為參與多肽分泌的前蛋白話；啟動(dòng)子或增強(qiáng)子可操 縱地與編碼序列連接，如果它影響序列轉(zhuǎn)錄的話；或核糖體結(jié)合位點(diǎn)可 操縱地與編碼序列連接，如果它被放置在幫助翻譯的位置。 一般地，"可 操縱地連接"指DNA序列被功能性地連接并且在一些情況是相鄰的例如 分泌前導(dǎo)序列，其在閱讀框中也是相鄰的。但是增強(qiáng)子并不必須是相鄰 的。在便利的限制性位點(diǎn)通過連接作用完成連接。如果這樣的位點(diǎn)不存 在，依照傳統(tǒng)的實(shí)踐使用合成的寡核苷酸連接物或接頭。
0044用于引入核酸到細(xì)胞中的技術(shù)隨核酸是被體外轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)的細(xì) 胞還是被體內(nèi)轉(zhuǎn)移到目的宿主的細(xì)胞中而變化。適用于將核酸體外轉(zhuǎn)移 到哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的技術(shù)，包括使用脂質(zhì)體、電穿孔、顯微注射、細(xì)胞 融合、DEAE-葡聚糖、磷酸鈣沉淀方法和類似方法。優(yōu)選的體內(nèi)基因轉(zhuǎn) 移技術(shù)包括用病毒(典型地，反轉(zhuǎn)錄病毒或腺病毒)載體進(jìn)行的轉(zhuǎn)染和 病毒包衣蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Dzau等，7Ve"A 所ofec/wo/ogy 11(5):205-10(1993))。合適的載體可以通過本領(lǐng)域熟知的任何方法構(gòu)建。 參見，例如Sambrook等，Afo/ecw/ar C7o"/wg， 丄a6orato^ Afa"wa/，第二 版，Cold Spring Harbor Press (1989)和Ausubel等編輯，CWre^ /Votoco/s ,'" Mo/ecw/w Bz'ofogy, John Wiley & Sons,紐約(1987和更新資料)；Moore 等，Ann N Y Acad Sci. 2001 ， 36-45-47。陽離子脂質(zhì)體，例如 CD-Chol/DOPE脂質(zhì)體的使用已經(jīng)被廣泛地記載，作為適當(dāng)?shù)妮d體，用于 通過靜脈內(nèi)注射DNA/陽離子脂質(zhì)復(fù)合體將DNA輸送到廣大范圍的組織 中。參見，Caplen等，A^w"Me/.， 1:39-46(1995); Zhu等，Science, 261: 209-211 (1993)。脂質(zhì)體通過與質(zhì)膜融合轉(zhuǎn)移基因到靶細(xì)胞。成功應(yīng)用脂質(zhì)體復(fù)合體的例子包括Lesso-Wood等，/fi/m^ Ge"e77^ra/ ;;， 6:395-405 (1995)，禾口 Xu等，Mo/ec由G匿"cs aw/Me勵(lì)ofe附，63: 103-109 (1998)。
0045核酸可以通過本領(lǐng)域熟知的多種方法中的任意方法被輸送到對(duì) 象的損傷部位。向部位的輸送可以通過受體/配體介導(dǎo)的方法來完成，如 對(duì)細(xì)胞表面膜蛋白質(zhì)或耙細(xì)胞具有特異性的抗體，耙細(xì)胞上的受體的配 體，和類似物。當(dāng)脂質(zhì)體被使用時(shí)，結(jié)合與胞吞作用相關(guān)的細(xì)胞表面膜 蛋白的蛋白可以被用于靶向和/或促進(jìn)吸收，例如，對(duì)特定的細(xì)胞類型有 營養(yǎng)作用的衣殼蛋白質(zhì)或其片段，在循環(huán)中經(jīng)歷了內(nèi)在化的蛋白質(zhì)的抗 體，靶向胞內(nèi)定位和增強(qiáng)胞內(nèi)半衰期的蛋白質(zhì)。受體-介導(dǎo)的胞吞作用的 技術(shù)被描述在，例如Wu等， /腺.C7z綴262(10):4429-32 (1987);禾口 Wagner等，iVoc.〗Vw/. 5W. USA 87(9):3410-4(1990)。對(duì)于基因標(biāo)記 和基因治療方案的綜述文獻(xiàn)，參見，Anderson, ^^wce 256 (5058): 808-13(1992)。
0046核酸可以在機(jī)械裝置例如導(dǎo)管的幫助下被輸送到對(duì)象的損傷部 位。例如，當(dāng)心臟被損壞時(shí)，核酸可以被輸送到心肌的間質(zhì)區(qū)，如Altaian 等，美國專利公布第20020010462號(hào)中所描述。實(shí)質(zhì)上，可操縱導(dǎo)管被 推進(jìn)到心腔室中的位置并且被放置在心壁附近。藥物輸送導(dǎo)管被推進(jìn)以 穿透心壁和期望體積的具體輸送漿或懸浮液(0.05ml到2.0ml)被注入。 穿透結(jié)構(gòu)將被脫離，并且藥物輸送導(dǎo)管在輸送導(dǎo)管中被拉回一小段距離。 可操縱導(dǎo)管隨后被重置，該過程被重復(fù)希望的次數(shù)。在這個(gè)方法中，輸 送通過導(dǎo)管系統(tǒng)進(jìn)行，其輸送包含用于表達(dá)SCF多肽的載體的穩(wěn)定脂質(zhì) 體制劑。這種方法還被用于靶向編碼SCF的核酸到心血管系統(tǒng)的其它區(qū) 域。
0047Struijker-Boudier等在美國專利公布第20030009145號(hào)中所描述
的以微型泵形式和/或以儲(chǔ)存物和植入物形式的持續(xù)釋放輸送技術(shù)可以被 用于輸送編碼SCF的核酸到心臟和或心血管系統(tǒng)的其它區(qū)域。依照本方 法， 一般地泵被皮下植入在例如胸壁中或臂下，并且與導(dǎo)管相連以輸送 載體，其中導(dǎo)管的遠(yuǎn)端被植入到心肌組織中并且在通過縫線固定適當(dāng)?shù)奈恢?。此外，非聚合?chǔ)存物可以被注入到組織中以局部地影響載體的持 續(xù)釋放，產(chǎn)生高效的載體局部濃度而無全身性藥物輸送的不利副作用。 非聚合儲(chǔ)存物在釋放載體一段希望的時(shí)間后，被機(jī)體緩慢降解，從而不 需要去除輸送裝置。
0048編碼SCF的核酸可以在冠狀動(dòng)脈循環(huán)中通過直接的心外膜的灌 輸被輸送到損傷的心臟組織。該工作被描述在2006年7月25日提交的 名稱為"用于基因治療的腺相關(guān)病毒的持久前向性心外膜冠狀動(dòng)脈灌輸
(Extended antegrade epicardial coronary infiision of adeno-associated viral for gene therapy)"的美國臨時(shí)申請(qǐng)序列第60/833,324中。簡而言之，核 酸，例如，如本文中更詳細(xì)描述的多核苷酸/病毒載體，通過體內(nèi)灌輸入 搏動(dòng)心臟的冠狀動(dòng)脈循環(huán)的血管中而被施用到對(duì)象，在具體的血管中進(jìn) 行至少大約三分鐘的時(shí)間。提供氧合的血到心臟以分布在整個(gè)心臟組織 的四個(gè)主要的冠狀動(dòng)脈(即左冠狀動(dòng)脈主支和右冠狀動(dòng)脈主支，左前降 支動(dòng)脈(left anterior descending artery)和左旋支動(dòng)脈)中的一個(gè)或多個(gè)可以 被注入核酸，例如注入左冠狀動(dòng)脈和右冠狀動(dòng)脈。輸注時(shí)間可以是8分 鐘、10分鐘或甚至更長。優(yōu)選地，對(duì)左冠狀動(dòng)脈主支和右冠狀主動(dòng)脈主 支使用前向性心外膜注輸注。而且還考慮冠狀動(dòng)脈的逆行性輸注，或一 種或多種前向性和逆行性冠狀動(dòng)脈或靜脈輸注的組合。輸注流速可以從 大約0.1 mL/min到10 mL/min之間變化。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，輸注流 速在大約0.2 mL/min到大約6.0 mL/min之間變化，更優(yōu)選地在大約0.2 mL/min到大約2.5 mL/min之間，更優(yōu)選地在大約0.2 mL/min到大約2.0 mL/min之間。使用標(biāo)準(zhǔn)的導(dǎo)絲、導(dǎo)管和輸注泵進(jìn)行冠狀血管的輸注。在 優(yōu)選的實(shí)施方式中，輸注管經(jīng)由股動(dòng)脈在熒光透視的指導(dǎo)下被直接植入 冠狀動(dòng)脈中。如本文所用，"冠狀循環(huán)的血管"、"冠狀血管"或"心臟的血 管"包括冠狀血管上的移植物，例如那些通過旁路手術(shù)產(chǎn)生的移植物。如 本文所使用，"心外膜的"指位于心臟外部的血管，例如，左或右冠狀動(dòng) 脈。值得注意的是，這種方法不需要將冠狀循環(huán)與體循環(huán)隔離或者另外 重新循環(huán)核酸，或人工限制冠狀靜脈循環(huán)，以便增加冠狀循環(huán)中的壓力 或增加核酸的駐留時(shí)間。0049編碼SCF的核酸可以通過使用V-焦點(diǎn)心臟循環(huán)裝置將冠狀靜 脈，即冠狀靜脈循環(huán)基本上或完全地與體循環(huán)隔離而被輸送到心臟組織， 所述V-焦點(diǎn)心臟循環(huán)裝置包括特殊的導(dǎo)管、充氧器和輸注泵。該工作和 相關(guān)的工作被描述在2004年2月26提交的名稱為"輸送治療劑到心臟組 織的方法(Methods for delivering therapeutic agents to heart tissue)"的美國 臨時(shí)申請(qǐng)60/548,038; 2004年9月24日提交的名稱為"隔離心臟循環(huán) (Isolating cardiac circulation)"的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/612,846; 2005年5月31 日提交的名稱為"輸送到心臟組織中的多核苷酸(Polynucleotide delivery to cardiac tissue)"的美國臨時(shí)申請(qǐng)60/685,913; 2005年8月25日提交的 PCT/AU2005/000237中。根據(jù)這些方法，引入冠狀動(dòng)脈循環(huán)中的多核苷 酸因此被選擇性地輸送到心臟組織。多核苷酸可能或可能不從冠狀靜脈 循環(huán)再循環(huán)到冠狀動(dòng)脈循環(huán)中。優(yōu)選地，多核苷酸被再循環(huán)。有利地， 冠狀靜脈循環(huán)與體循環(huán)基本上隔離使得多核苷酸優(yōu)選輸送到心臟組織， 而最小化非心臟組織對(duì)多核苷酸的暴露。優(yōu)選地，通過閉塞冠狀竇和體 循環(huán)之間的流動(dòng)將冠狀靜脈循環(huán)與體循環(huán)隔離。離開冠狀靜脈循環(huán)的任 何多核苷酸因此被限制進(jìn)入體循環(huán)(例如，腔靜脈或右心房)運(yùn)送到身 體的其它部分。該方法可以包括在冠狀竇中使用靜脈收集裝置(venous collection device)以從心臟組織中排出多核苷酸。靜脈收集裝置可以包括 支撐物以在收集其中的流體期間保持冠狀竇的開放。在靜脈收集裝置和 一個(gè)或多個(gè)冠狀動(dòng)脈之間建立人工的流動(dòng)通道并且多核苷酸被加入到人 工流動(dòng)通道以輸送到心臟。優(yōu)選地，支撐結(jié)構(gòu)包括二維或三維框架，其 以壓縮的狀態(tài)下被輸送到冠狀竇。當(dāng)壓縮的結(jié)構(gòu)從輸送腔釋放時(shí)，該框 架可以擴(kuò)張以保持冠狀竇中的開放性。用于保持其中的流體收集期間冠
狀竇的開放性的支撐結(jié)構(gòu)優(yōu)選地是可經(jīng)皮輸送的。在另一個(gè)實(shí)施方式中， 支撐結(jié)構(gòu)可以包括二個(gè)連續(xù)的可膨脹區(qū)域。當(dāng)膨脹時(shí)，第一個(gè)可膨脹區(qū)
域被安置為鄰接冠狀竇口周圍的右心房壁的部分。當(dāng)膨脹時(shí)，第二個(gè)可 膨脹區(qū)域被安置為維持冠狀竇的開放性，而冠狀竇和右心房之間的流動(dòng) 被閉塞。這些球囊區(qū)域可以與或不與可壓縮的支撐結(jié)構(gòu)例如上面描述的 框架一同使用。V-焦點(diǎn)系統(tǒng)可以被用于輸送SCF多肽和多核苷酸以治療缺血性心臟疾病、非缺血性心肌病、外周血管疾病和衰老。
0050已經(jīng)開發(fā)用于輸送治療劑到心臟組織的各種其它方法和裝置可 以被用于輸送編碼SCF的核酸到對(duì)象的損傷部位。例如，美國專利 5,387,419; 5,931,810; 5，827，216; 5,900,433; 5,681,278和5,634,895和 PCT公開號(hào)WO97/16170描述了輸送藥劑到心臟的各種裝置和/或方法， 例如，經(jīng)心包輸送(transpericardial delivery)。美國專利5，387，419和 5,797,870也描述了輸送藥劑到心臟的方法，其通過將藥劑與幫助該藥劑 從裝置持續(xù)或可控釋放的材料混合，或通過將藥劑與保持長久的、高的 細(xì)胞外周藥劑濃度的增粘劑混合而進(jìn)行。
0051核酸定點(diǎn)輸送的方法還包括將核酸直接沉淀到動(dòng)脈壁中。例如， 美國專利6,251,418公開了將固體聚合物小丸(pdlet)植入心肌組織中的方 法，其中該小丸用藥物包被或包含藥物。美國專利6,258,119描述了用于 插入心壁以便心壁發(fā)生跨心肌血管再形成(transmyocardial revascularizatkm)(TMR)的心肌植入物。植入物提供了促進(jìn)新血管生成的 工具，并且具有柔性的伸長主體，其包含腔和從腔穿過柔性的伸長主體 的開口。為了將TMR植入物固定在心壁中，TMR植入物包括在一端以 整體形成的同軸錨定元件。
0052用于輸送編碼SCF的核酸的物理方法包括使用無針注射器，例 如"基因槍，，裝置，在高壓下使用液體以輸送到間質(zhì)空間的裝置，和通過 電穿孔。將編碼SCF的核酸施用到不同的組織包括肌肉注射和外周靜脈 內(nèi)的注射。
0053編碼SCF的核酸可以被制備并心肌內(nèi)施用，如對(duì)于輸送編碼音 猬蛋白(sonic hedgehog)的核酸所描述的，由Kusano等，Nat. Med. 2005 11(11): 1197-204報(bào)道。
0054也可以被用于輸送核酸到心血管組織損傷部位的熟知的藥物輸 送裝置包括機(jī)械輸注泵或電機(jī)輸注泵，例如在美國專利4,692,147; 4，360，019; 4,487,603; 4,360,019; 4，725，852，和類似專利中所描述的。滲 透驅(qū)動(dòng)泵(例如DUROST滲透泵)描述在美國專利3,760,984; 3,845,770; 3,916,899; 3，923，426; 3,987,790; 3，995，631 ; 3,916,899; 4,016,880;4，036，228; 4,111,202; 4,111,203; 4,203,440; 4,203,442; 4,210,139; 4,327,725; 4,627,850; 4,865,845; 5,057,318; 5,059,423; 5,112,614; 5,137,727; 5,234,692; 5,234,693; 5,728,396; 5，985，305; 5,728,396和 WO97/27840。
0055編碼SCF的核酸優(yōu)選地在缺血性損傷之后盡可能早地施用，以 最佳地增強(qiáng)血管再通。
0056對(duì)于預(yù)防或治療疾病，活性藥劑的合適劑量將取決于待治療疾 病的類型，如上面所定義，疾病的嚴(yán)重性和進(jìn)程，藥劑以預(yù)防目的還是 或治療目的施用，之前的治療，患者的臨床歷史和對(duì)藥劑的反應(yīng)，以及 主治醫(yī)師的判斷力。藥劑被適當(dāng)?shù)卦谝淮位蛞幌盗兄委熤惺┯媒o患者。 藥物組合物的劑量和希望的藥品濃度可以隨預(yù)想的具體用途而變化。合 適劑量或給藥途徑的確定在普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍之內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為 人類治療有效劑量的確定提供了可靠的指導(dǎo)。
0057本文所使用的術(shù)語"治療""處理"和"療法"指治愈性療法、預(yù)防 性療法和防御性療法。"防御性療法"的例子是預(yù)防或減輕目標(biāo)病理狀況 或疾病。需要治療的對(duì)象包括已經(jīng)患病的對(duì)象或易于患病的對(duì)象或疾病 待被預(yù)防的對(duì)象。"慢性(長期)"給藥指藥劑以持續(xù)的方式給予而不是急性 的方式，以便在長時(shí)間內(nèi)保持最初的治療效果(活性)。"間歇"給藥不 是不間斷的連續(xù)進(jìn)行，但在本質(zhì)上具有周期的治療。與一種或多種其它 治療劑"聯(lián)合"給藥包括以任何次序同時(shí)(共同)和連續(xù)給藥。
0058依照本方法，編碼SCF的核酸可以被施用一次并取得治療效果。 核酸的施用可以根據(jù)需要重復(fù)一次或多次。
0059如本文所使用的，"治療上有效的量"是賦予哺乳動(dòng)物治療效果 所必須的活性藥劑(例如SCF多肽(或編碼核酸))的最小數(shù)量。例如 對(duì)患病的哺乳動(dòng)物或易于患病的哺乳動(dòng)物或預(yù)防患病的哺乳動(dòng)物而言， "治療上有效的量"是這樣的量，其誘導(dǎo)、改善或引起與前述疾病有關(guān)的 病理癥狀、疾病進(jìn)程、生理狀況或?qū)记笆黾膊〉牡挚沟母纳啤?br> 0060如本文所使用，本文所使用的"載體"包括藥理學(xué)可接受的載體、 賦形劑或穩(wěn)定劑，它們?cè)谒褂玫膭┝亢蜐舛认聦?duì)被暴露的細(xì)胞或哺乳動(dòng)物是無毒的。通常，藥理學(xué)可接受的載體為含水的pH緩沖的溶液。藥
理學(xué)可接受載體的實(shí)例包括緩沖液，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其它有機(jī)
酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸；低分子量(少于大約10個(gè)殘基)多肽； 蛋白質(zhì)，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，例如聚 乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或 賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精； 螯合劑，例如EDTA;糖醇，例如甘露醇或山梨(糖)醇；形成鹽的抗衡離 子例如鈉；和/或非離子表面活性劑，例如TWEEN、聚乙二醇(PEG) 和PLURONIC。
0061在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方式中，提供了包含可用于治療上述疾 病的材料的制品。該制品包括容器和標(biāo)簽。適合的容器包括，例如，瓶、 小瓶、注射器和試管。容器可以由多種材料例如玻璃或塑料制成。容器 具有對(duì)于治療疾病有效的組合物并可以具有無菌入口 (例如，容器可以 是靜脈溶液袋或具有可被皮下注射針刺穿的塞子的小瓶)。組合物中的 活性劑典型的為SCF多肽(或編碼核酸)。在容器上或與容器相連的標(biāo) 簽指明，組合物用于治療選擇的疾病。制品可以進(jìn)一步包括第二容器， 其包括藥理學(xué)可接受的緩沖液，例如磷酸鹽緩沖鹽水、Ringer's溶液和葡 萄糖溶液。它可以進(jìn)一步包括從商業(yè)和使用者的立場希望的其它材料， 包括其它緩沖液、稀釋劑、過濾器、針、注射器和帶有使用說明的包裝 說明書。
0062通過施用編碼SCF的核酸治療本文所描述的缺血性疾病的方法 還可以與施用細(xì)胞例如干細(xì)胞結(jié)合。細(xì)胞可以在施用核酸之前或期間或 之后給予。優(yōu)選地，細(xì)胞在施用核酸后二周之內(nèi)被施用。
0063施用的細(xì)胞對(duì)于對(duì)象來說可以是外源的并且在體外產(chǎn)生。在另 一種方法中，細(xì)胞可以由取自對(duì)象的組織離體產(chǎn)生，并且隨后在治療期 間返回到對(duì)象。離體產(chǎn)生干細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域熟知并且包括美國專利 第6，326,198; 6,261,549; 6,093,531; 5,935,565; 5,670,351; 5,670,147; 5,646,043; 5,437,994。這些方法特別地適用于產(chǎn)生造血干細(xì)胞。干細(xì)胞 可以用特定的細(xì)胞因子和趨化因子與遺傳修飾的細(xì)胞一起培養(yǎng)和增殖，如Feugier等，J. Hematotherapy and Stem Cell Res.2002 11:127-138所描述。0064本文所描述的用編碼SCF的核酸對(duì)缺血性損傷的治療還包括施 用間充質(zhì)干細(xì)胞。這樣的干細(xì)胞可以被遺傳修飾以表達(dá)細(xì)胞因子例如 SCF，如Faizel等，J Thorac Cardiovasc Surg. 2005 130(5): 1310所描述的。0065本文所描述的用編碼SCF的核酸對(duì)缺血性損傷的治療還包括施 用一種或多種細(xì)胞因子或趨化因子。細(xì)胞因子或趨化因子可以作為純化 的蛋白質(zhì)或純化蛋白質(zhì)的藥物制劑被施用。細(xì)胞因子或趨化因子還可以 通過施用編碼細(xì)胞因子的表達(dá)(載體)被施用，因此其可以被對(duì)象的細(xì) 胞吸收并且細(xì)胞因子或趨化因子由之表達(dá)。蛋白質(zhì)和編碼核酸的組合也 可以被施用。二種或多種細(xì)胞因子或趨化因子可以被施用或細(xì)胞因子和 趨化因子二者的組合可以被施用。
0066如本文所使用的，"細(xì)胞因子"指幾種調(diào)節(jié)蛋白的任意一種，例 如白細(xì)胞介素和淋巴因子，它們由免疫系統(tǒng)的細(xì)胞釋放并且在免疫應(yīng)答 的產(chǎn)生中充當(dāng)細(xì)胞間的介質(zhì)。本文所使用的"趨化因子"指具有有效的白 細(xì)胞激活和/或趨化活性的結(jié)構(gòu)相關(guān)的糖蛋白家族。它們?cè)陂L度上為70 到90個(gè)氨基酸和分子量為大約8到10kDa 。它們的大部分被分入具有 四個(gè)半胱氨酸殘基的二個(gè)亞家族。這些亞家族基于是否二個(gè)氨基末端半 胱氨酸殘留緊密相鄰或被一個(gè)氨基酸分開。a趨化因子，也稱為CXC趨 化因子，在第一和第二半胱氨酸殘基之間含有單個(gè)氨基酸；(3或CC趨化 因子具有相鄰的半胱氨酸殘基。大多數(shù)CXC趨化因子對(duì)于嗜中性粒細(xì)胞 是化學(xué)引誘物，而CC趨化因子通常吸引單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞 和嗜曙紅(嗜酸)細(xì)胞。
0067本文所描述的治療方法中有用的細(xì)胞因子和趨化因子包括，例 如粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子
(GM-CSF)、 SCF、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子家族成員(VEGF-A到 VEGF-E)、成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)、促血管生成素-1 (AdAngl)、 基質(zhì)細(xì)胞衍生因子l (SDF1)。這些多種多樣的多肽可以如本領(lǐng)域熟知的 產(chǎn)生并施用，或可以作為編碼核酸被引入并在體內(nèi)表達(dá)。參見，Orlic等， Proc. Natl. Acad.Sci (USA) 2001 98 (18): 10344-10349; Takano等，CurrentPharmaceutical Design 2003 9:1121-1127; Ohtsuka等，The FASEB J. 2004 18(7):851-3; Rafii等，Gene Therapy 2002 9:631-641 。這些多肽因子的許 多還可以作為商業(yè)上批準(zhǔn)的藥物獲得(例如，G-CSF可以作為非格司亭 (filgrastim)或Neupogen (Amgen,Thousand Oaks,力卩禾lj福尼亞)、來格司 亭(lenograstim)或Granocyte (Chugai Pharmaceutical Company Ltd.)或聚 乙二醇化的非格司亭或Neulasta⑧(Amgen，Thousand Oaks,加利福尼亞) 購買得到。
0068對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說很明顯的是，對(duì)本文公開的發(fā)明可以 作各種替代和修改，而不脫離本發(fā)明的范圍和精神。在缺少本文中沒有 具體公開的任何元素(一種或多種)、限定(一種或多種)的情況下， 本文示例性描述的發(fā)明可以被適當(dāng)?shù)貙?shí)施。所使用的術(shù)語和表達(dá)作為描 述的術(shù)語而不是限定，在這些術(shù)語和表達(dá)的使用中并沒有想要排除所顯 示和描述的特征或其部分的任何等同物，而是應(yīng)該認(rèn)識(shí)到，各種修改可 以在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，應(yīng)該理解，盡管本發(fā)明已經(jīng)由具體的實(shí)施 方式和任選的特征描述，對(duì)本文中所公開的概念的修改和/或變化可以被 本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行，并且這樣的修改和/或變化被考慮在本發(fā)明的范圍 之內(nèi)。
0069此外，在本發(fā)明的特征或方面根據(jù)馬庫什組或其它可替代的組 描述時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明也因此根據(jù)馬庫什組或其它 組的任何單個(gè)成員或亞組的成員而描述。
0070而且，除非指明相反的情況，在各種數(shù)值提供用于實(shí)施方式時(shí)， 其它的實(shí)施方式可以通過采用作為范圍端點(diǎn)的任意二個(gè)不同的值而描 述。這樣的范圍還是在所描述的發(fā)明的范圍內(nèi)。
0071說明書中所引用的所有的文獻(xiàn)、專利和/或申請(qǐng)都以它們的整體 并入作為參考，包括任何表格和圖，其程度仿若每一篇文獻(xiàn)以其整體單 獨(dú)并入作為參考。
2權(quán)利要求
1.一種用于治療遭受缺血性損傷的對(duì)象的方法，該方法包括給所述對(duì)象施用編碼干細(xì)胞生長因子(SCF)的核酸，其中所述核酸被輸送到所述損傷的部位，在所述損傷的部位，所述核酸被細(xì)胞吸收并且SCF被表達(dá)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SCF是可分泌形式的SCF。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述SCF包括圖1中的氨基酸 26-165。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SCF是膜結(jié)合形式的SCF。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述SCF包括圖1中的氨基酸 25-245。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SCF包括膜結(jié)合形式和可 分泌形式二者。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述SCF是人SCF。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸是載體。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述載體是病毒載體。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述病毒載體被包裹在感染性 病毒顆粒中。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述病毒載體選自腺病毒、逆 轉(zhuǎn)錄病毒、單純皰疹病毒、牛乳頭瘤病毒，腺相關(guān)病毒、慢病毒載體、牛 痘病毒和多瘤病毒。
12. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述病毒載體是腺病毒載體或 與腺相關(guān)病毒載體。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述損傷與心血管系統(tǒng)有關(guān)。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述損傷與選自下面的疾病相 關(guān)心肌梗塞.缺血性中風(fēng)、外周血管疾病和心力衰竭。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸使用導(dǎo)管被輸送到所 述損傷的部位。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述輸送是輸送到缺血性心臟 組織。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述核酸被輸送到冠狀動(dòng)脈循 環(huán)中以便輸送到缺血性心臟組織。
18. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述核酸使用植入在所述心 臟壁中的裝置被輸送到缺血性心臟組織。
19. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在所述損傷部位的SCF表達(dá)將 細(xì)胞募集到所述部位以實(shí)現(xiàn)修復(fù)。
20. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一歩包括施用一種或多種細(xì)胞因 子或趨化因子的步驟。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述細(xì)胞因子選自G-CSF和 GM-CSF。
22. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述對(duì)象不被施用細(xì)胞。
23. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，進(jìn)一步包括施用細(xì)胞的步驟。
24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述細(xì)胞為干細(xì)胞。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述干細(xì)胞從取自所述對(duì)象的 組織中被離體產(chǎn)生。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用干細(xì)胞生長因子(SCF)來治療例如心血管疾病中的缺血性損傷組織。該方法包括施用編碼SCF的核酸，其中核酸被輸送到損傷的部位并且被整合到隨后表達(dá)SCF的細(xì)胞中。
文檔編號(hào)A61K38/19GK101563097SQ200680045846
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2006年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2005年11月14日
發(fā)明者K·M·熱伯 申請(qǐng)人:企業(yè)合伙人風(fēng)險(xiǎn)資本公司