專利名稱：干細(xì)胞因子純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的干細(xì)胞因子純化方法。
背景技術(shù)：
干細(xì)胞因子SCF(Stem Cell Factor)是1990年分別由William，DW，Zsebo，KM，Huang，EW為首的三個不同實(shí)驗(yàn)小組幾乎同時發(fā)現(xiàn)的[1-3]，([1]Williams DE，Eisenman J，Baird A et al.Identification of a ligand for the c-kit proto-oncogene.Cell，1990；63(2)167-174.[2]Zsebo KM，Wypych J，McNiece IK et al.Identification，purification，and biological characterization of hematopoietic stem cell factorfrom buffalo rat liver-conditioned medium.Cell，1990；63(2)195-201.[3]Huang E，Nocka K，Beier DR et al.The hematopoietic growth factor KL is encoded by the S1 locus and isthe ligand of the c-kit receptor，the gene product of the W locus.Cell 1990；63(2)225-233.)它是原癌基因c-kit產(chǎn)物的一個胞外配體。根據(jù)其刺激細(xì)胞生長、結(jié)合受體特性又被稱為肥大細(xì)胞生長因子(Mast Cell Growth Factor)、Steel因子(Steel factor)、kit配體(KitLigand)等。
SCF在體內(nèi)是一種糖蛋白，含N-連，O-連糖基，由于糖基化程度不同，分子量呈多形性。來源于E.coli的非糖基化的重組SCF具有生物活性，這說明糖基化對生物活性影響不大。SCF是一種對造血細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、原始生殖細(xì)胞、腸上皮干細(xì)胞等都有重要作用的因子，其中它對造血細(xì)胞的作用最為明顯。它主要作用于早期多能干細(xì)胞、祖細(xì)胞，同時對晚期成熟血細(xì)胞也有作用。它與IL-1β、IL-3、IL-6、IL-11、G-CSF、GM-CSF及EPO等聯(lián)合應(yīng)用具有明顯的協(xié)同作用，能刺激來源于骨髓、外周血、臍血的CD34+祖細(xì)胞的擴(kuò)增。SCF在抗放射、腫瘤放療化療的輔助治療、造血前體細(xì)胞移植，貧血和其它血液病的治療上具有良好的應(yīng)用前景。
人SCF已在原核表達(dá)系統(tǒng)中克隆表達(dá)，原核表達(dá)的人SCF以包涵體形式存在。要得到活性形式的SCF，必需先將包涵體變性和復(fù)性，然后從復(fù)性液中純化SCF。但復(fù)性液中除含低濃度構(gòu)型正確的SCF外，還含有宿主蛋白、核酸、SCF異構(gòu)體和變性劑等，其中SCF異構(gòu)體包括未形成正確的分子內(nèi)二硫鍵的SCF。而作為藥用或研究用，非常希望SCF是一種基本去除宿主蛋白、核酸、SCF異構(gòu)體和變性劑等雜質(zhì)的高純狀態(tài)。因此需要一種完成這一目標(biāo)的純化SCF的方法。同時，為了適應(yīng)生產(chǎn)的需要，還要求該方法個有以下特點(diǎn)中的一個或多個(1)回收率較高；(2)成本較低；(3)工藝穩(wěn)定。
發(fā)明概要本發(fā)明通過提供一種純化溶液中人干細(xì)胞因子(SCF)的方法來填補(bǔ)這一需要。該方法包括(a)將含人干細(xì)胞因子的溶液進(jìn)行陰離子交換，由此得含SCF的級份；(b)將含SCF級份進(jìn)行疏水色譜分離，由此得純化的SCF的級份。該方法可用于原核表達(dá)體系表達(dá)的SCF。
本發(fā)明還提供一種用陰離子交換色譜從含變性劑的人干細(xì)胞因子(SCF)稀溶液中快速濃縮，分離SCF的方法，其中變性劑可以為0.2-8mol/L的尿素，或0.1-10％非離子型表面活性劑，如吐溫、曲拉通等。
本發(fā)明還提供一種用疏水色譜從含SCF異構(gòu)體的溶液中分離具有天然構(gòu)型SCF的方法。
附圖詳述

圖1是色譜圖，SCF稀溶液，經(jīng)陰離子交換色譜吸附后，用含氯化鈉的緩沖液洗脫，用紫外檢測器280nm波長檢測洗脫液，獲得的色譜圖，第一峰為經(jīng)濃縮和初純化的SCF。圖2是色譜圖，經(jīng)陰離子交換色譜濃縮和純化SCF級分，經(jīng)Phenyle-Sepharose HighPerformance柱疏水色譜純化，用紫外檢測器280nm波長檢測洗脫液，獲得的色譜圖，保留時間64-95min的吸收峰對應(yīng)的級分為純化的SCF。圖3是色譜圖，經(jīng)陰離子交換色譜濃縮和純化SCF級分，經(jīng)Superdx200柱凝膠過濾色譜純化，用紫外檢測器280nm波長檢測洗脫液，獲得的色譜圖，保留時間225-260min的吸收峰對應(yīng)的級分為純化的SCF。圖4是曲線圖，表明不同濃度的SCF對TF-1細(xì)胞的刺激活性，A為英國國立生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所(NIBSC)提供的SCF國際參考品；B為用本方法純化的SCF。圖5是色譜圖，顯示純化的SCF的純度，純化的SCF用C8反相高壓液相色譜(RP-HPLC)分析，280nm紫外檢測器檢測獲得的色譜圖。
發(fā)明描述本文中引述的參考文獻(xiàn)合并于此作為參考。
如本文中所用的“干細(xì)胞因子”或“SCF”可以是人SCF(hSCF)或鼠SCF。人SCF定義為這樣的一種蛋白，它(a)具有已知成熟(即沒有前導(dǎo)序列)可溶型(相對于膜型而言)hSCF基本相同的氨基酸序列，如歐洲專利，EP0423980中所公開的，和(b)具有與天然hSCF相同或相似的生物活性。
SCF可以通過編碼SCF多肽的核酸的重組技術(shù)獲得。通常的分子生物學(xué)方法描述于，例如，Sambrook，et al.Molecular Cloning，A Laboratory Manual.Cold Spring HarborPublish.，Cold Spring Harbor，New York，2nded.1989。適合的序列可以從基因組庫或cDNA庫得到?？梢圆捎镁酆厦告?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)。參見，例如，PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，1990，Innis et al.(Ed.)，Academic Press，New York。如EP0423980A1公開的從肝癌細(xì)胞株HepG2(ATCC HB8065)采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)建立的cDNA得到。EP0423980A1公開了該cDNA序列?？梢愿鶕?jù)該序列合成寡核苷酸探針，用于從上述cDNA庫中篩選SCF的cDNA。也可用基因合成的方法合成編碼SCF多肽的基因。
多種表達(dá)載體可用于表達(dá)編碼SCF多肽的基因，優(yōu)選的載體包括pBV220。宿主細(xì)胞可用多種大腸桿菌，優(yōu)選的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌DH5α。在上述基礎(chǔ)上構(gòu)建表達(dá)SCF的工程菌是本領(lǐng)域已熟知的。許多表達(dá)載體和宿主細(xì)胞可從市場或ATCC得到。
本發(fā)明的方法包括順序使用陰離子交換色譜、疏水色譜純化溶液中人干細(xì)胞因子(SCF)。本發(fā)明的方法還包括一種用陰離子交換色譜從含變性劑的人干細(xì)胞因子(SCF)稀溶液中快速濃縮，分離SCF的方法，和一種用疏水色譜從含SCF異構(gòu)體的溶液中分離天然構(gòu)型SCF的方法。為獲取高產(chǎn)率，每一步都在pH、緩沖組合物、流速等方面進(jìn)行了優(yōu)化。為了進(jìn)一步提高純度，可選的使用凝膠色譜。凝膠色譜步驟可以在陰離子交換色譜之后，也可以在疏水色譜之后，優(yōu)選的為在陰離子交換色譜之后，原因是由于此處的陰離子交換色譜是用于濃縮和初純化SCF的，因而獲得的SCF級分濃度高，體積小，有利于凝膠色譜分離。
再則，為有效和有利于大規(guī)模操作，以及考慮產(chǎn)品純度和產(chǎn)率，對色譜步驟的次序作了優(yōu)化。此包括1.第一步驟(陰離子交換色譜)期間產(chǎn)品濃縮以減小體積，有利于下一步凝膠色譜，并除去大部分核酸和一些雜蛋白，尤其是堿性蛋白等。2.第二步驟(凝膠色譜)期間除去部分雜蛋白和一些SCF異構(gòu)體。3.第三步驟(疏水色譜)期間除去大部分SCF異構(gòu)體和少量的雜蛋白，從而獲得高純度的SCF。
首先采用陰離子交換步驟是由于SCF復(fù)性液體積較大，蛋白濃度較低，肯含有較多雜蛋白、核酸和尿素，需要對其先進(jìn)行濃縮和初純化。用陰離子柱直接吸附復(fù)性液中的SCF，而不需要先進(jìn)行透析或超濾來去除復(fù)性液中的尿素和更換緩沖組合物，簡化了操作，更重要的是避免了透析或超濾中蛋白堵膜引起的回收率下降，操作費(fèi)用增加等問題?？梢圆捎萌我环N陰離子交換基如季銨鹽(Quaternary ammonium)交換基、乙基季銨鹽(Quaternaryaminoethyl)交換基、二乙氨乙基(Diethylaminoethyl)交換基。陰離子交換基可以固定在任何固相載體上，包括但不限于瓊脂、纖維素、葡聚糖、聚苯乙烯。優(yōu)選的陰離子交換基為固定在瓊脂載體底物上的二乙氨乙基，如DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR(瑞士Pharmacia公司產(chǎn)品)。為在SCF上產(chǎn)生足夠的負(fù)電荷，平衡緩沖液的pH應(yīng)高于5.6，對DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR優(yōu)選pH為6.0-9.0，更優(yōu)選pH為8.4。
如果從原核表達(dá)體系包涵體中純化SCF，該SCF變性而后復(fù)性后，將含復(fù)性SCF的溶液用如上所述的陰離子交換介質(zhì)，使SCF結(jié)合在介質(zhì)上，將要裝載的蛋白量可參考廠家提供的信息，經(jīng)實(shí)驗(yàn)測定。采用一個1.6×15cm的DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR柱，可以3cm/min的流速加入大約5mg蛋白/ml填充體積。裝載后，將柱用分段洗脫或線性梯度鹽溶液洗脫，對DEAE-SEPHAROSE Fast FlowR優(yōu)選200mmol/L的NaCl溶液洗脫，收集含SCF的級分，優(yōu)選條件可使SCF的濃度從復(fù)性后溶液中的0.05-0.3mg/ml，濃縮到5-10mg/ml。
將含SCF的級分進(jìn)行疏水色譜分離?？梢苑蛛x去除大部分雜蛋白和SCF異構(gòu)體，這些異構(gòu)體包括未能形成正確分子內(nèi)二硫鍵的SCF，從而得到純化的SCF?？梢圆捎萌我环N疏水交換基如苯基(Phenyl)交換基、叔丁基(Butyl)交換基。疏水交換基可以固定在任何固相載體上，包括但不限于瓊脂、纖維素、葡聚糖、聚苯乙烯。優(yōu)選的疏水交換基為固定在瓊脂載體底物上的苯基，如Phenyl-SEPHAROSE High Performancer(瑞士Pharmacia公司產(chǎn)品)。為了實(shí)現(xiàn)上述分離，試驗(yàn)了并優(yōu)化了許多條件，包括所用的鹽的種類、洗脫梯度、pH等。
為了提高SCF的純度，可將來自陰離子交換色譜的含SCF的級分先進(jìn)行凝膠色譜分離，去除部分雜蛋白和SCF異構(gòu)體，然后再進(jìn)行疏水色譜分離。凝膠可用在約1KD至600KD的蛋白質(zhì)級份范圍的凝膠。其中優(yōu)選的為Superdex200R、Superdex75R、SEPHACRYL S-200R、SEPHACRYL S-100R(均為瑞士Pharmacia公司產(chǎn)品)。其中更優(yōu)選的是SEPHACRYL S-200R。
下列實(shí)例用來說明但不限定本發(fā)明。
實(shí)例1用陰離子交換色譜從復(fù)性液中濃縮、分離SCF工程菌培養(yǎng)將大腸桿菌(E.Coli)用含有編碼和表達(dá)人干細(xì)胞因子(rhSCF)基因的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化，該質(zhì)粒載有轉(zhuǎn)錄rhSCF的PLPR啟動子，載有抗氨芐青霉素基因，rhSCF以不溶的包涵體形式在轉(zhuǎn)化菌內(nèi)生產(chǎn)，轉(zhuǎn)化菌種在含酵母抽提物5g/L，胰蛋白胨10g/L，Nacl 10g/L，氨芐青霉素100mg/L，的種子培養(yǎng)基中，搖床30℃ 150r/min活化培養(yǎng)12h，按0.2％(v/v)接種量將上述活化菌種接6個含100ml上述種子培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，搖床30℃150r/min活化培養(yǎng)10-12h，合并6個三角瓶中的培養(yǎng)物接種裝有20L培養(yǎng)基的30L發(fā)酵罐(UD30型德國B.Brun Biotech International CO.)，培養(yǎng)基組成為酵母抽提物5g/L，胰蛋白胨10g/L，磷酸鹽緩沖液50mmol/L，硫酸鎂4mmol/L，用前加50％葡萄糖8ml/L。罐內(nèi)溶氧由溶氧電極在線(on line)檢測，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速和通氣流量，控制溶氧始終大于30％飽和氧濃度。pH也由pH電級在線檢測，通過蠕動泵補(bǔ)入5N氨水控制pH值不低于6.2。接種后30±1℃培養(yǎng)6-8h后補(bǔ)加50％葡萄糖200ml升溫至42±1℃誘導(dǎo)5-6h，收獲培養(yǎng)物，用JA-2型離心機(jī)(Backman公司產(chǎn)品，JA-10離心轉(zhuǎn)頭)8000r/min離心分離，收到大約300-400g菌體沉淀物。
取15g菌體沉淀物用135ml緩沖液A(10mmol/L Tris-HCl，pH7.0)懸浮，超聲破菌儀(Sonicprep150，三洋公司)超聲破菌40次(30秒/次，間隔30秒)，破菌液10000r/min，4℃離心30min(Backman JA-2型離心機(jī)，JA-14離心轉(zhuǎn)頭)，收集沉淀即為粗制包涵體，粗制包涵體用含1％TritonX-100的緩沖液A150ml攪拌洗滌1h，10000r/min離心30min(Backman JA-2型離心機(jī)，JA-14離心轉(zhuǎn)頭)，收集沉淀，用150ml不含Triton的緩沖液A重懸后10000r/min離心，收集沉淀為SCF包涵體。
包涵體的溶解和SCF復(fù)性上述制備的包涵體加150ml變性液B(含尿素8mol/L、Tris-HCl10mmol/L，pH8.4)攪拌溶解3h，加入到3L復(fù)性緩沖液(含尿素1.6mol/L、Tris-HCl50mmol/L，pH8.4、氧化型谷胱甘肽0.1mmol/L，還原型谷胱甘肽0.9mmol/L EDTA，0.1mmol/L)，攪拌混合后4-10℃復(fù)性12-24h。
陰離子交換色譜將上述復(fù)性液以6-8ml/min的流速加到DEAE-SepharoseFF柱(1.6×15cm，層析介質(zhì)為Pharmacia公司產(chǎn)品)上，該柱已預(yù)先用300ml平衡緩沖液G(2mol/L尿素，10mmol/LTris-HCl，PH8.4)以6-8ml/min的流速預(yù)平衡過。然后，用含2mol/L尿素，10mmol/LTris-HCl，pH8.4的緩沖液以0.5ml/min沖洗柱2h，再用100ml洗脫液H(含2mol/L尿素，NaCl 0.2mol/L，Tris-HCl 10mmol/L，pH8.4)，以0.5ml/min的流速洗脫。紫外檢測器，波長280nm，檢測洗脫液，含SCF的級分在第一主峰(圖1)，收集SCF的級分濃度達(dá)到6.3mg/ml，純度達(dá)80％。
實(shí)例2用疏水色譜從含SCF異構(gòu)體的溶液中分離天然構(gòu)型SCF經(jīng)陰離子交換色譜濃縮和純化的級分中SCF純度大于80％，除雜蛋白外，溶液中還含有少量，未正確復(fù)性的SCF，本方法建立了一種通過疏水色譜從含SCF異構(gòu)體的溶液中分離天然構(gòu)型SCF的方法。在Waters650中壓層析儀(Waters公司產(chǎn)品)上，將經(jīng)陰離子交換色譜濃縮和純化SCF級分，加入硫酸鈉至濃度為1mol/L后以流速為6ml/min加到Phenyle-Sepharose High Performance柱(2.6×12cm)上，該柱已預(yù)先用平衡液J(1mol/L Na2SO4，10mmol/L Tris-HCl，pH9.0)預(yù)平衡，然后用平衡液J以同一流速洗柱30min，然后Na2SO4在10min內(nèi)從1mol/L降到0.6mol/L，100min從0.6mol/L降到0.4mol/L進(jìn)行梯度洗脫，以8ml/管收集洗脫液，純化的SCF級分在Na2SO4濃度為0.55-0.45mol/L時洗脫(圖2，保留時間64-95min)。純化的SCF級分純度大于90％，除去了溶液中的，大部分雜質(zhì)和異構(gòu)體。
實(shí)例3含凝膠過濾色譜的SCF純化工程菌培養(yǎng)、包涵體分離、SCF復(fù)性及用陰離子交換色譜濃縮和初純化SCF的方法同實(shí)例1。
在Waters650中壓層析儀(waters公司產(chǎn)品)上，將陰離子交換色譜濃縮和初純化后的SCF溶液用Superdex200柱(5.0×120cm，層析介質(zhì)為Pharmacia公司產(chǎn)品)層析，流速6ml/min，該柱已預(yù)先用平衡緩沖液I(含Tris-HCl 10mmol/L，pH7.0)以6ml/min的流速預(yù)平衡過。紫外檢測器波長280nm檢測洗脫液，20ml/管收集洗脫液(圖3)，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)；分析各收集管溶液，合并SCF純度較高的級分(保留時間225-260min)用于下一步疏水色譜分離。疏水色譜分離方法同實(shí)例2。高純度的SCF級分在Na2SO4濃度為0.5-0.45mol/L時洗脫。收集該級分可選的，經(jīng)凝膠層析或透析換溶劑后可用于制藥或其它應(yīng)用。
表1 rhSCF純化步聚體積rhSCF濃度 純度總rhSCF 回收率(ml)(mg/ml)(％)(mg) (％)菌體縣液 150 2.535 375 100包涵體溶解液 75 4.160 307 82復(fù)性液1500ND ND NDND陰離子層析34 6.380 214 57凝膠過濾 360 0.590 180 48疏水層析 68 2.399 156 42ND未測經(jīng)各步純化，最終制品純度可達(dá)98％以上，收率40％左右。制品濃度在2mg/mL左右。
純化的rhSCF活性測定SCF樣品用無血清培養(yǎng)基在96孔板上作倍比稀釋，每孔加樣100μl，TF-1細(xì)胞培養(yǎng)在含10％新生牛血清和2ng/mlGM-CSF的1640培養(yǎng)基中，使用前，先用不含血清和GM-CSF的1640培養(yǎng)基洗細(xì)胞四次，用無血清培養(yǎng)基稀釋至濃度為4×104/ml，吸取100μl細(xì)胞加入上述96孔板，于37℃、5％ CO2條件下培養(yǎng)65h左右，每孔加20μl MTT，再培養(yǎng)5h后，加入20％ SDS 80μl，溶液后在酶聯(lián)儀上測A570。結(jié)果表明在無血清培養(yǎng)基中，制備的人SCF對TF-1細(xì)胞的生長有明顯的維持作用(圖4)，其半數(shù)有效劑量為6-7ng/ml，以英國國立生物標(biāo)準(zhǔn)與控制研究所(NIBSC)提供的國際參考品為參考，比活達(dá)1×106U/mg。
純化的rhSCF純度分析反相高壓液相色譜分析HP1050高效液相色譜儀(惠普公司)，C84.0×250mm色譜柱(中國科學(xué)院大連化學(xué)物理所)，UV檢測器，波長280nm，流動相A0.1％TFA+超純水B0.1％TFA+乙腈。洗脫程序?yàn)?→50min，A 100％→10％，B 0％→90％。RhSCF 20μl上樣分析，純度大于98％。(圖5)
權(quán)利要求
1.一種純化溶液中人干細(xì)胞因子(SCF)的方法，包括(a)將含人干細(xì)胞因子的溶液進(jìn)行陰離子交換，由此得含SCF的級份；(b)將來含SCF級份進(jìn)行疏水色譜分離，由此得高度純化的SCF的級份。
2.權(quán)利要求的1的方法，進(jìn)一步包括將含SCF的級份進(jìn)行凝膠色譜分離，由此得含SCF純度較高的級份。
3.權(quán)利要求1的方法，更進(jìn)一步包括(a)將含人干細(xì)胞因子的溶液進(jìn)行陰離子交換，由此得含SCF的級份；(b)將來源于(a)的含SCF級份進(jìn)行凝膠色譜分離，由此得含SCF級份。(c)將來源于(b)的含SCF級份進(jìn)行疏水色譜分離，由此得高度純化的SCF的級份。
4.權(quán)利要求1、2、3的方法，其中SCF由原核表達(dá)體系生產(chǎn)，并由包涵體蛋白變性和復(fù)性獲得。
5.一種用陰離子交換色譜從含變性劑的人干細(xì)胞因子(SCF)稀溶液中快速濃縮，分離SCF的方法，其中變性劑可以為0.2-8mol/L的尿素。
6.權(quán)利要求11的方法其中變性劑為0.5-3mol/L的尿素。
7.一種從含SCF異構(gòu)體的溶液中分離天然構(gòu)型SCF的方法，包括將含不同SCF異構(gòu)體的溶液，進(jìn)行疏水色譜分離，得到天然構(gòu)型SCF的級份。
8.權(quán)利要求1、2、3、5的方法，其中的陰離子交換色譜由固定在載體底物上的二乙氨乙基(Diethylaminoethyl)交換基構(gòu)成。
9.權(quán)利要求2、3的方法，其中的凝膠色譜具有1至600KD的極份范圍。
10.權(quán)利要求2、3的方法其中的凝膠色譜介質(zhì)為交聯(lián)葡聚糖。
11.權(quán)利要求1、2、3、7的方法，其中的疏水色譜由固定在載體底物上的苯基(phenyl)交換基構(gòu)成。
12.權(quán)利要求8、11的方法，其中載體底物為交聯(lián)瓊脂糖。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的干細(xì)胞因子純化方法,該方法包括:(a)將含人干細(xì)胞因子的溶液進(jìn)行陰離子交換,由此得含SCF的級份;(b)將含SCF級份進(jìn)行疏水色譜分離,由此得純化的SCF的級份。還提供一種用陰離子交換色譜從含變性劑的人干細(xì)胞因子(SCF)稀溶液中快速濃縮,分離SCF的方法,用疏水色譜從含SCF異構(gòu)體的溶液中分離具有天然構(gòu)型SCF的方法。并對方法進(jìn)行了優(yōu)化。
文檔編號C07K14/435GK1368507SQ01102478
公開日2002年9月11日 申請日期2001年2月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年2月7日
發(fā)明者吳軍, 馬清鈞 申請人:深圳科興生物工程股份有限公司, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所