專利名稱：：包含獲得自肋軟骨的軟骨細胞的人工軟骨及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種包含獲得自肋軟骨的軟骨細胞的Ax軟骨及其制備方法。
背景技術(shù)：
：關(guān)節(jié)軟骨損傷是一種非常常見的影響數(shù)百萬人關(guān)節(jié)的問題。由于在這些組織中沒有血管和缺少干細胞，成熟軟骨的再生能力受到了限制。雖然擴大到軟骨下骨的缺損^"激發(fā)纖維或纖維軟骨組織的形成，其還是將經(jīng)受早期退化，因為該修Ji且織在生物化學(xué)和生物力學(xué)方面不同于透明軟骨。已經(jīng)開發(fā)了^ft用于修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的臨^l:理，但成就有限。骨寸激方法(精細關(guān)節(jié)整形外^鉆孔關(guān)節(jié)整形外科)穿透軟骨下骨，并刺激骨髓內(nèi)的多能干細^te^損修J^為纖維組織或纖^t骨。然而，這些方法具有如下缺點修復(fù)的纖維軟骨缺乏如同正常透明軟骨具有的生物化學(xué)和生物力學(xué)性質(zhì)。更進一步，對大面積缺損、骨關(guān)節(jié)炎和年老的病人，它們的作用W更有被證明。對于小尺寸的缺損，骨軟骨/軟骨的移植是簡單和有效的，但是如^i且織是從低重量部位向高重量部位移動，由于移植部位的非生#重，將引起有害的壓縮。骨膜和軟骨膜移植具有引起新細胞集結(jié)的潛在益處，所述新細胞集結(jié)能夠構(gòu)造軟骨，但也具有缺點透明樣修復(fù)組織有通過軟骨骨發(fā)生而鉀化的趨勢。此外，已經(jīng)t艮了幾個基于細胞的利用軟骨細胞、間充質(zhì)干細胞(MSC)、骨膜細l&^軟骨膜細胞的工藝。a骨祖細胞例如間充質(zhì)干細胞、骨膜細#軟骨膜細胞作為修復(fù)骨軟骨缺損的潛在細胞源變^MfeU亍。然而，所^f且細麵造關(guān)節(jié)軟骨細胞的能力是受限的，而且病人的^與臨絲果直接相關(guān)。更進一步，據(jù)^ii該修復(fù)透明樣組織有鉤化的趨勢。自體關(guān)節(jié)軟骨細I^多植(ACT)已經(jīng)被臨床應(yīng)用于關(guān)節(jié)軟骨的小缺損，但僅有限的成#招皮才&1:。雖然關(guān)節(jié)軟骨細胞可以被輕易員過酶消^yv成熟關(guān)節(jié)軟骨中分離，但A^集和移才鏈兩步需^^A關(guān)節(jié)，并且是相當(dāng)昂貴的。因此自體關(guān)節(jié)軟骨細l^多植不淑皮應(yīng)用到超過兩個的小損傷、尺寸大于10cm2的損傷、人。j^卜，僅關(guān)節(jié)軟骨^K的百分之一到二是軟骨細胞，其中對于培養(yǎng)物，大約2000細胞/mg人關(guān)節(jié)軟骨可以凈紛離用于培養(yǎng)。對于自體關(guān)節(jié)軟骨細l^多植步驟，如果以勤以于正常AI^關(guān)節(jié)發(fā)現(xiàn)的細胞密度^LA,平均3cm2的缺損需要9xl(/細胞。事實上，由于26。/。的年齡小于40的有IVM^骨軟化損傷的病人具有多處損傷，自體關(guān)節(jié)軟骨細1&#植需要更多的細胞。因此，為以類似于正常人關(guān)節(jié)軟骨所示細胞密^充^t真充缺損的體積，需要大量的軟骨細胞。在用于細胞擴充的連續(xù)單層培養(yǎng)期間，軟骨細M于停ih4^骨特M白多津#11型^^,并轉(zhuǎn)到表達產(chǎn)生少量蛋白多糖的I型^f、。這種去分化是P艮制體外細I^廣#自體關(guān)節(jié)軟骨細^f多做用的主要問題。更進一步，肋軟骨是哺乳動物體內(nèi)最大的永久透明軟骨，其已經(jīng)^ut議作為關(guān)節(jié)軟骨、外耳和氣管的重構(gòu)中用于自體移植的可能的^^供給源。肋軟骨已經(jīng)凈M于修復(fù)d、關(guān)節(jié)，例如拇指指節(jié)間關(guān)節(jié)和顳下頜關(guān)節(jié)中骨軟骨的缺損。肋軟骨作為供^^且織看^與關(guān)節(jié)軟骨相t沐幾個優(yōu)點。甚至在80歲或更老的病人中凌^:則到了活動的增殖軟骨細胞，而且小于60歲的病A^大量的肋軟骨可用。另夕卜，肋軟骨^X的，而且其容易的夕卜科可及性允許對^^M立較小的損害。因此，如果肋軟骨具有與關(guān)節(jié)軟骨的透明軟骨相同的表現(xiàn)型，它可以被認(rèn)為是用于治療M關(guān)節(jié)軟骨紊亂病最有益的來源，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)軟骨缺損。然而，迄今為止，^ii行了移^J力軟骨本身到關(guān)節(jié)軟骨部分的自體組織移植，氾更有嘗^M力軟骨分離軟骨細艦i^且織工程方法來再生關(guān)節(jié)軟骨。是有限的。為iA與外科步剩目關(guān)的困難和找到^^軟骨細胞于缺損^M立不在關(guān)節(jié)腔內(nèi)外流的方法，已經(jīng)研究了新的作為支架的不同生物材,體方法，細!^皮接種到所述支架上。理想的支架將AA物相容的、生物可吸收的或可塑的，并且提^ii新組織生長的骨架。它們還應(yīng)該顯示與關(guān)節(jié)軟骨功f^目容的材料和才^M戎性能。各種生物材料，自然產(chǎn)生的例如基于膠原的生物材料；I和II型膠原^原/葡萄糖胺(GAG)復(fù)^和合成的例如聚乙醇酸(PGA)和聚乳酸(PLLA)，或它們的復(fù)合〉'^^物，PLGA(聚D，L-乳酸-乙醇酸共聚物)，已經(jīng)被引入作為軟骨修復(fù)的潛在的細胞載純質(zhì)。它們在體外和體內(nèi)實驗中都顯示了，軟骨特異的細*卜基質(zhì)(ECM)組分例如II型膠原和GAG在調(diào)節(jié)軟骨細^J(L型的表ii^支持軟骨形成中^'J了關(guān)鍵的作用。殼^t^丁質(zhì)的減性去乙ib^產(chǎn)品，是去乙^bf呈度和襯量不同的聚-D-葡糖胺單元的族。許多研究者建議殼麟可淑皮考慮作為用于結(jié)締組織修復(fù)的結(jié)構(gòu)生物材料，因為其結(jié)構(gòu)類似于在細血卜基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的GAG。殼和某些它的降解產(chǎn)品可以用于關(guān)節(jié)液體組分的合成，例如軟骨素、硫酸軟骨素、疏質(zhì)素、石皿角質(zhì)素和透明質(zhì)酸(HA)。這些物質(zhì)是軟骨營養(yǎng)所必需的。事實上，殼雑錄陽離子的，其結(jié)構(gòu)類似于透明質(zhì)酸，所iiif明質(zhì)齡關(guān)節(jié)軟骨細^tM的重^^S對軟骨組織工程具有特別的重要性。最近已經(jīng)教了基于殼彩瞎的間質(zhì)在i明軟骨的組織X^呈中的用途。Lahijietal，(2000)才^t了，在殼聚糖薄MJi培養(yǎng)的軟骨細胞保持了分^4現(xiàn)型并表a骨特異的細參卜M蛋白質(zhì)例如n型^f、和石jfL^蛋白多糖。殼,用于強化新軟骨形成的研究已經(jīng)揭示了，當(dāng)生絲殼総薄iiJi時，殼雑具有^ii軟骨細^^1型維^^軟骨特異細^fM組分生物合成的能力(Lahijietal.2000)。殼^te^^見為強化骨祖細胞分"^Mp強骨形成。透明質(zhì)酸在許多生物進程中起重務(wù)ft用，例如組織7JC合作用、在細^f基質(zhì)中的蛋白多糖(PG)才;M匕和細胞分化。它還是<綠關(guān)節(jié)軟骨的組成部分。Pattietal.(2001)才pUi了透明質(zhì)酸在體外改善基質(zhì)粘附能力和Alt骨細胞的增生活性。透明質(zhì)酸還在關(guān)節(jié)炎早期改善臨床功能(Pattietal.，2001)。更進一步，對于結(jié)締組織細胞和間充質(zhì)干細胞，成纖維細胞生長因子(FGF)是強促細胞分裂劑(J.CellBiol.100，477-485，1985)。在細l^廣充期間，成纖維細M長因子抑制F肌動蛋白結(jié)構(gòu)的形成，以維持關(guān)節(jié)軟骨細胞的軟骨形成潛力。(Exp.CellRes.253，681-688，1999)。并且，成纖維細敲長因子已知在許多有絲分裂中維持間充質(zhì)干細胞的多族分化(multifamilydifferentiation)。發(fā)明扭嫂首先，本發(fā)明的發(fā)明人已經(jīng)研究了獲得自肋軟骨的軟骨細胞是否可以用作組織X^l/vi軟骨的細胞源。并且，他們已經(jīng)研究了解決問題的方法，所述問題為由于在傳代期間的去分化,軟骨細M于失去軟骨細I^L型。更進一步，似門還繼續(xù)評價了接種肋軟骨細胞的基于殼聚糖的支架是否可以被用于關(guān)節(jié)軟骨再生。結(jié)果，似門發(fā)^得自肋軟骨的軟骨細胞與獲得自關(guān)節(jié)軟骨的軟骨細頗目比，更適合作為軟骨修復(fù)的，細胞源。并且，通ii^E分化可^秀導(dǎo)培養(yǎng)基中將它們再分化成為期望的細^M門發(fā)^L^傳代期間去分化的軟骨細胞顯示間^"干細胞化資，以證實它們用作細胞治療劑以;^v工軟骨的能力。另夕卜，本發(fā)明人證實加M骨細胞的基于殼聚糖的支架，當(dāng)被移植到關(guān)節(jié)缺損時，顯示了有效的關(guān)節(jié)再生，以實規(guī)4^發(fā)明。因此，本發(fā)明的目地是提^-"種包含間M干細l^f^分化細胞的人工軟骨及其制備方法，所述去分化細艦過傳徹力軟骨細麟得。圖i顯示關(guān)節(jié)軟骨細胞(AC)和肋軟骨細胞(cc)體外細胞擴充能力的比較。型M^、的表達。圖4顯示在P7的肋軟骨細胞形態(tài)學(xué)，圖5和6顯示I、II型膠原和平滑Wl動蛋白(SMA)脅的表達。圖7顯示在達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基-胎牛血清(DMEM-FBS)、間質(zhì)干細MM養(yǎng)基(MSCGM)和間質(zhì)干細M^^養(yǎng)基-成纖維細胞生長因子(MSCGM一FGF)中的細l^廣充率。圖8和9分別顯示在DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中培養(yǎng)的細胞的I型^f、、II型^f、和平滑WL動蛋白;^^表達。圖10顯示番|1#-0對葡萄糖胺，染色的結(jié)果，以確i^DMEM-FBS、MSCGM和MSCGM-FGF中細1姊#^分化為軟骨細胞的情況。圖11顯示P7肋軟骨細絲軟骨分4膽?zhàn)B基中以團塊形式，#^化為軟骨的結(jié)果。圖12顯示番細清-0對葡萄糖胺聚糖染色的結(jié)果，以證實分化為軟骨細胞。圖13顯示作為成骨分^^刀始才射彌的細胞中的堿汰磷*的表達,所述細^^皮誘導(dǎo)以分化為成骨細胞，圖14顯示作為成骨細胞刺^斜己物的茜紅染色的結(jié)果。圖15顯示油紅0對細胞中脂類小滴染色的結(jié)果,所述細l^皮誘導(dǎo)分化為脂肪細胞。圖16顯示通i^力軟骨細艇口栽的基于殼^f唐的支架來修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法。圖17為通過MTT分析顯示在M^-葡萄糖胺麟海綿(COL-GAG)、殼聚糖海綿(CS)和透明質(zhì)酸包被的殼雑海綿(CS-HA)中軟骨細胞生長率的比較。圖18顯示前膠原I型C-肽(PIP)和GAG的測量結(jié)果。圖19顯示蘇木^H尹紅(H&E)染色后的細胞形態(tài)。圖20顯示通過番紐晴-O染色和固綠染色顯示葡萄糖胺彩瞎的累積量。圖21和22分別顯示對I型膠原和II型膠原免疫染色的結(jié)果。圖23顯示關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)組織的總體外觀。圖24到26顯示光學(xué)顯微鏡下關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)組織。圖27顯示對在關(guān)節(jié)軟骨缺損的修H且織中葡萄糖胺^t分布，用番紅蜻-O染色的結(jié)果。圖28顯示對關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)組織中的I型和II型膠原，用免疫染色的結(jié)果。圖29是AX軟骨的目視圖片，所iiAX^骨來自于在軟骨形躲養(yǎng)基中加載于基于殼彩瞎的支裝二的間充質(zhì)干細^#^分化的細胞。圖30顯示對在軟骨形^養(yǎng)基中#^化的軟骨細胞內(nèi)的葡萄糖胺，用番細睛-O染色的結(jié)果。圖31是兔關(guān)節(jié)軟骨缺損在移植間充質(zhì)干細IW^分化的加載于基于殼聚糖的支象Ji的細胞6周后的目一見圖片。
發(fā)明內(nèi)容第一，本發(fā)明涉及一種包含間充質(zhì)干細胞片tt分化細胞的人工軟骨，所述去分化細l&t過傳^^軟骨細l^^得。優(yōu)選，肋軟骨細胞在MSCGM中傳代，特別是，包含成纖維細觸長因子(FGF)的MSCGM更有利于細^T^A分化為軟備賞。第二、本發(fā)明涉及一種包含^vR^骨細胞的人工軟骨，所述^^fU^骨體方案中，間充質(zhì)干:1^";化細^1在軟骨形，養(yǎng)基中聚:培養(yǎng)的。、第三，本發(fā)明涉及一種人工軟骨，其中軟骨細^fc^栽到基于殼l^唐的支架上。所tt于殼聚瞎的支架^i^自殼海綿；包含轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-p)的殼，海綿；透明質(zhì)酸(HA)包衣的殼,海綿；硫酸軟骨素包衣的殼海綿和殼聚瞎-膠原復(fù)合海綿。更m，基于殼聚糖的支架是透明質(zhì)酸包衣的殼，海綿或透明質(zhì)酸包衣的殼，-M^、復(fù)合海綿。第四，本發(fā)明涉及一種制備人工軟骨的方法，包括傳^RJ力軟骨細胞以獲得間充質(zhì)干細^#^分化細胞的步驟。在一個*方案中，將肋軟骨細胞在MSCGM或包含成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳代。在另一個M方案中，通過傳代肋軟骨細^^得的間充質(zhì)干細^#*分化細^#軟骨形^養(yǎng)基中培養(yǎng)來#^化，^1#軟骨形^養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)。在另一個M方案中，該方法包括加載間充質(zhì)干細月^f^分化細fe)j基于殼彩瞎的支架的步驟。第五，本發(fā)明涉及一種包含間充質(zhì)干細^#^分化細胞的細胞治療劑，所述去分化細艦過傳^i力軟骨細^:得。在一個M方案中，該細胞治療劑包含再分^^骨細胞，所述再分^^骨細月&tit^軟骨形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)間^干細IW"^分化細^^得。在另一個M方案中，該細胞治療劑包舍成骨細胞，所骨細自#成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)間充質(zhì)干細^#*分化細1得。在另一個M方案中，該細胞治療劑包含脂肪細胞，所i^旨肪細m過在脂肪形成培養(yǎng)基中培養(yǎng)間干細^#*分化細:得。下面，本發(fā)明^l^詳細的解釋。在自體關(guān)節(jié)軟骨細l^多植中對于關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)的主^^支術(shù)P艮制是不在g節(jié)承受重量的^^骨具有低的細M長量，和按照在體外細^T充期間的軟骨細M分化，難以獲#^適數(shù)量的軟骨細胞用于;1^軟骨缺損。另外，自體關(guān)節(jié)軟骨細1&#植應(yīng)用的成功受到患者^H^H^1M立有限的P艮制。因此，在本發(fā)明中，首次評估肋軟骨是否可以用作自體關(guān)節(jié)軟骨細l^多植的M細胞源，所，軟骨在其存在期間##較長的生長量而_@1*體內(nèi)有較大的#^組織。首先，基于原始細胞產(chǎn)量、細蔣充率和去分化，"Wh分離自肋軟骨的軟骨細^i否可以用作組織x^呈關(guān)節(jié)軟骨的潛在細胞源。特別的，在本發(fā)明中，將獲得自肋軟骨的軟骨細胞的原始細胞產(chǎn)量和在單層培養(yǎng)中的細J^廣充率與從關(guān)節(jié)軟骨獲得的軟骨細^i行t嫩。另外，通過細胞形態(tài)和n型膠原的表ii^"if估體外細l魄自間的去分化率。結(jié)果，肋軟骨的原始細胞產(chǎn)量是關(guān)節(jié)軟骨的2，6倍。在體外細麟絲間，肋軟骨細胞(CC)與關(guān)節(jié)軟骨細胞(AC)相比生長更快，而且細l^廣充至P4的速度大約是關(guān)節(jié)軟骨的3倍。在連續(xù)培養(yǎng)期間，關(guān)節(jié)軟骨細#肋軟骨細艇漸地失去它們的軟骨細;^JE見型，相反轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細1&#細胞，而且II型膠原的表逸咸少。肋軟骨細胞與關(guān)節(jié)軟骨細殿目比它們原始4m型丟失得更決。比較相同的傳^m,肋軟骨細胞與關(guān)節(jié)軟骨細^目比去分化更快。由來自相同兔的關(guān)節(jié)軟骨細l^肋軟骨細胞的比較代表的首次培養(yǎng)的結(jié)果顯示肋軟骨能用作骨關(guān)節(jié)炎修復(fù)的潛在細胞源，所述第一培養(yǎng)物的結(jié)果具有按照體外細1^廣^#代的去分4沐生長分布圖。在進一步研究中，本發(fā)明人證實通過傳^l力軟骨獲得的去分化細^^有間M干細胞的4生質(zhì)。間充質(zhì)干細^X軟骨形成扭細胞，意味著可以作為用于修復(fù)骨軟骨缺損的潛在細胞源。因此，在本發(fā)明中，首^A、開了獲得自肋軟骨細胞的間充質(zhì)干細1&#*分化細^|_軟骨形成祖細胞，所述軟骨形成祖細胞f^皮用于骨軟骨缺損的修復(fù)。才財居本發(fā)明的間充質(zhì)干細1&#*分化細胞能分化為成骨細|^脂肪細胞以及軟骨細胞。因此，在本發(fā)明中，術(shù)語"間干細1^#*分化細胞"指通過傳代去分化的和具有分化為軟骨細胞、成骨細胞、脂肪細胞等等的潛能的細胞，如間充質(zhì)干細胞。也f^i說，這個術(shù)語指多能細胞。在進一步的研究中，本發(fā)明人公開當(dāng)肋軟骨細,別是在包含成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳代時，細^T充率;I^的，向軟骨細胞的分化是優(yōu)秀的?？梢灶A(yù)料，如果向其中添加成纖維細g長因子，包含DMEM的正常細胞培養(yǎng)基可以具有相同的結(jié)果。itb^卜，在本發(fā)明中，作為用于加M骨細胞的支架，基于殼銜瞎的支架，特別是海綿形態(tài)的透明質(zhì)酸包衣的殼聚糖支架^^liSf^H^口載到透明質(zhì)酸包衣的殼,復(fù)合支架上的培養(yǎng)自體肋軟骨細胞，在修復(fù)動物模型中承受重量位置的全層關(guān)節(jié)軟骨缺損的作用。夷膝模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于軟骨修復(fù)的評估，4至6個月齡的兔髕骨凹槽中全層3mm直徑的軟骨缺損在6至8周之內(nèi)自然漆愈。因此，需要這個時鵬示表面上愈合軟骨的大多數(shù)退化贈。在如下的設(shè)計動物模型微中(4咖直徑骨軟骨的缺損)，可以表明，才財居本發(fā)明在基于殼歸的支架內(nèi)的自體肋軟骨細胞非常有效的修復(fù)了a受重量位點的全層關(guān)節(jié)軟骨缺損。以下，本發(fā)明將參考下述實施例^^詳細的描述，但4^發(fā)明的范圍將不會^^釋為借此以^^可方式限制。M實施方式實施例實施例1:^H^肋軟骨細I^I:否可以作為修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨的，細胞源材Wp方法軟骨細胞的分離從3至4個月大的新西蘭白兔中獲得關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨，然后稱重。為了采集肋軟骨，動物被通過靜脈注射甲苯漆溱鹽酸鹽(2mg/kg體重，Rompun，Bayer，Korea)和H^酮鹽離(6-10mg/kg體重，ketalar，YuhanCo.，Korea)的^/N勿麟。將胸部附近的Al^刮凈，用酒精清洗，并用聚維酮碘溶液備皮。打開右胸的背側(cè)，暴露第9和第10肋軟骨，^^多除軟的粘附組織^，稱重肋軟骨。這些軟^fi皮切碎為1-2mm3的塊，并在D-PBS(Dulbecco's磷離緩沖鹽水；JeilBiotechservicesInc.,Taegu，Korea)中漂洗3次。漂'3b^",#^刀碎的軟骨在多酶雞尾酒溶液37。C和5%C02糾下消化整夜，所述多酶雞尾酒i^液包"fe^f、酶D(2mg/ml，RocheDiagnosticGmbH,Germany),透明質(zhì)酸酶(1mg/ml，Roche),和!Jt!U^糖核酸酶(0.75mg/ml，Roche)。將所述溶艦過53jum的M網(wǎng)孑L，分離的細胞用補絲10y。胎牛血清(FBS;Hyclonetechnologies,U.S.A.)和1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B雞尾酒(Gibco)的醒M(Dulbecco'sModifiedEagleMedium;GibcoLifeTechnologies,GrandIsland,NY，U.S,A.)洗滌2次，活細^jk^計J^于錐蟲藍排除法計數(shù).。細胞以5xl()5細胞/100ram直徑平皿的細胞密度接種，每隔一天更換培養(yǎng)基，每次更換時添加新配制的50jug/ml的L-抗壞血酸(Sigma，St.Louis,MO,U.S.A.)。匯合的原生細^^R^"養(yǎng)直到P4。MTT分析將各自傳代的關(guān)節(jié)軟骨細^肋軟骨細胞以1x105細胞每孔的細胞密度種秘'J6孑L^養(yǎng)平^Ji培養(yǎng)5天。細胞的生長才財居MTT分析測定(MosmanT.Rapidcolormetricassayforcellulargrowthandsurvival,applicationtoproliferationandcytotoxicityassays,J.Immunol.Methods1983;65:55—63)。為了以光密度(0.D.)校準(zhǔn)細戯目，在1到8x105細胞范圍內(nèi)辦寸標(biāo)準(zhǔn)曲線，將光密度被轉(zhuǎn)化為細胞數(shù)目。II型膠原的免疫焚光染色對于免疫熒光染色，將各自傳代的軟骨細^l甫絲蓋玻片上，培養(yǎng)2天，用3.7%福爾馬輔縫緩沖鹽水固定10^^中，并用0.2%TritonX-100磷,緩沖鹽水透化。用20%正常山羊血清培養(yǎng)透化細胞以阻斷非特異性反應(yīng)并以單克隆抗II型膠原抗體(monoclonalanti-mouseantibody;ChemiconinternationalInc.,Temecula，CA，U.S.A.)作為初IU^。以才斜己了^^危氰酸熒光素(FITC)的山羊抗鼠IgG結(jié)合物(VectorLab.，Burlingame，CA，U.S.A.)作為笫JL^，蓋玻片用4'，6二脒基-2-苯p引哚(DAPI;1g/ml;SigmaChemicalCo.，St.Louis，M0，U.S.A.)培養(yǎng)5^i中用于核染色。細#焚ite微鏡下》膝(OlympusOpticalCo.,Japan)。統(tǒng)計用不酉樹t檢l^i^f^充計分析，以確定各中的變量是否具有^性差異(p<0.05)。結(jié)果分離自關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細胞的原始細胞產(chǎn)量和細^r充率的比較為了尋^體內(nèi)適合自微骨細1&#植的#^部位，對分離自關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細胞產(chǎn)量進行比較(表i)。表1:分離自關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細^^始細胞產(chǎn)量的》嫩<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>a:三個獨立的細齡離的平均值士標(biāo)準(zhǔn)差。按t檢驗(p<o,05)進e^充計分析。如表l所示，關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨的原始細胞產(chǎn)量分別為8800±3278細胞/mg和"900±"53細胞/mg，在肋軟骨中的細胞產(chǎn)f湘當(dāng)于關(guān)節(jié)軟骨中的約2.6倍。因此，依據(jù)原始細胞產(chǎn)量，肋軟骨與關(guān)節(jié)軟骨相比似乎;l^好的自^t骨細胞的娜锎立。然后，比較關(guān)節(jié)軟骨或肋軟骨的軟骨細胞的體外擴充性。將各自傳代的細胞分別以1x105細胞每孔的密度鋪餘6孑L盤上，在接種后的第5天進行MTT分析(圖1)。在整個細l^代中，肋軟骨細胞的總，曽長率高于關(guān)節(jié)軟骨細胞的總體增長率。在P0，肋軟骨細胞的生長率大約兩倍于關(guān)節(jié)軟骨細胞的那些。在P2，關(guān)節(jié)軟骨細胞的生長率類似于肋軟骨細胞的那些，但P3生長率比P2減少。為了^#分離自關(guān)節(jié)軟骨和肋軟骨的軟骨細胞的擴充性，比^L接種相同的細皿目后恕'j匯合的時間和每個細順代的細胞總數(shù)量(表2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>:來自三個獨立^平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。如上面表2所示，在體外細i&r充方面，肋軟骨細胞與關(guān)節(jié)軟骨細船目比似乎狄好的##^骨細胞。較在體外細l^廣綿間，軟骨細胞常常丟失它們在體內(nèi)的'f^t例如圓的形狀,II型膠原和葡萄糖胺聚糖的表達。在關(guān)節(jié)軟骨細^肋軟骨細胞的每^v(請調(diào)查形態(tài)變^^pII型l^f、的表達(圖2和3)。從P2，細胞的某些組開始丟失它們原始的圓形，而轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞的梭形(圖2)。在P4，多飾力軟骨細胞實際上改變它們的形態(tài)成為成纖維細^^L型。然而，關(guān)節(jié)軟骨細胞的這個形態(tài)變化比肋軟骨細^1￡慢得多。因此，關(guān)節(jié)軟骨細胞與肋軟骨細船目比在體外更緩匱的擴充，并更緩隻的改變它們的形態(tài)。為進一步證實成纖維細胞形態(tài)變化是否伴隨著II型^f、表達的丟失，用抗II型M^、^ii行免疫熒光染色(圖3)。在PO，99%獲得自肋軟骨或關(guān)節(jié)軟骨的原生軟骨細l^達II型膠原。在P2,表達II型膠原的軟骨細胞的數(shù)目快速的減少，在肋軟骨細胞中尤為明顯。在P4，大多IO力軟骨細胞不表達II型M>f、，而某些關(guān)節(jié)軟骨細胞維持表達II型膠原。DAPIP曰性軟骨細胞中表達II型^^的細^t量(表3)。表3:在不同細麟代，表達II型M^、的細艦?zāi)?％)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>a:平均值±標(biāo)準(zhǔn)差如上面表3所示，軟骨細絲體外擴充期間i^^丟失它們的原始^m型例如圓的細胞形態(tài)和II型^^、表達能力，肋軟骨細血bit程比關(guān)節(jié)軟骨細胞快得多。實施例2:證實完全去分化的肋軟骨細l^l否顯示間充質(zhì)干細胞'^t軟骨細胞的分離從4到5個月大的新西蘭白JMJ^得肋軟骨。將胸部附近的^l^刮凈，用酒糈清洗，并用聚維S^^溶液備皮。打開右胸的背側(cè)，暴露第9和第10肋軟骨。移除軟的粘附組織之后，稱重肋軟骨。這些軟f^皮切碎成1-2mm3的塊并在D-PBS(Dulbecco's磷^JL緩沖鹽水；JeilBiotechservicesInc.，Taegu,Korea)中漂洗3次。漂洗之后，將切碎的軟骨在多酶雞尾酒溶液37。C和5%C02下整夜消化，所述多酶雞尾酒溶液包括膠原酶D(2mg/ml,RocheDiagnosticGmbH，Germany)、透明質(zhì)酸酶(1mg/ml，Roche)和^IUt糖核酸酶(0.75mg/ml，Roche)。然后將溶M過53jum尼龍網(wǎng)眼，分離的細胞用補絲10%胎牛血清(FBS;Hyclonetechnologies,U.S.A.)和1%青霉素/鏈霉素/兩性霉素B雞尾酒(Gibco)的D薩(Dulbecco'sModifiedEagleMedium;GibcoLifeTechnologies,GrandIsland,NY，U.S.A.)清洗2次，并且活細^Uo^U十Ji^于錐蟲藍排除法計數(shù)。細胞以5x105細胞/100mm直徑平皿的細胞密度被涂敷，每隔一天更換細麟養(yǎng)基，每次培養(yǎng)基更換時添力一斤配制的50jag/ml的L-抗ifjk酸(Sigma，St.Louis,M0，U.S.A.)。匯合的原生細^vf慎養(yǎng)到P7。I、n型^^、和平滑Wl動蛋白(SMA)M的表達將P7的肋軟骨細月^甫絲蓋玻片上，培養(yǎng)2天，用3.7%福爾馬^械雖緩沖鹽水固定10分鐘，并用0.2%TritonX-100磷縫緩沖鹽7JC透化?？笽型膠原M(多克隆抗山羊抗體southern),抗II型^f、抗體(單克隆抗小鼠4^:ChemiconinternationalInc.,Temecular，U.S.A.)或抗平滑肌肌動蛋白^M單克隆抗小鼠M:DAK0)應(yīng)用到標(biāo)本，4'C過夜，用第^#^養(yǎng)，然后用抗生蛋白鏈菌素-itl^膽酶培養(yǎng)l小時，并用0.1%3，3'^i^四鹽縫(DAB;Chromogen,DAK0Corp.，CA，U.S.A.)磷醋緩沖鹽水顯影5^l中。用堅牢紅染料(VectorLab.，Burlingame，CA，U.S.A)復(fù)染色。結(jié)果證實肋軟骨細胞的去分^^'司M干細胞^t的表達如圖4所示，在P7的肋軟骨細I^失它們的原始圓的形狀，轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞的紡錘形。由此可見肋軟骨細胞完全的去分化了。圖5和6顯示了在去分化的軟骨細胞中I、II型^^和平滑Wi動蛋白M的^Ji。在每個細胞中，i型膠原仍被表達，而n型膠原完全;r^^達。間充質(zhì)干細胞的一個特征，平滑wi動蛋白的表錄許多細胞中凈力Ji^到(圖6)。如上所述，I型Myf和平實施例3:不同培^#^(DMEM+10%FBS，MSCGM或包含成纖維細M長因子的MSCGM)下對肋軟骨細胞的擴充和去分化為軟骨情況進^Sf^軟骨細胞的分離和培養(yǎng)軟骨細^^(口上所述的方法分離，活細^i^求計Ji^于雄蟲藍排除法計數(shù)。軟骨細胞以5x105細胞/1QOram直徑平皿的細胞密度被鋪板，并分別在D薩(DMEM—FBS)、MSCGM(CambrexBioscienceWalkersville，Inc.,MD，U.S.A.)、或添加了1ng/mlFGF(R&DSystemInc.,MN，U.S.A.)的MSCGM中培養(yǎng)。不同培養(yǎng)基的細月&廣充率當(dāng)細胞充滿培#^時，通ii^夷蛋白酶-EDTA(Gibco)移除細胞，活細蹤J&^求計Ji&于錐蟲藍排除法計數(shù)，以#細胞擴充率。然后，細胞以5x105細胞/100咖直徑平亞的細胞密度鋪板，并擬目同培養(yǎng)基中培養(yǎng)。I和II型M^和平滑WL動蛋白M的M將在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中培養(yǎng)的^^U力軟骨細胞分別涂覆在蓋玻片上，培養(yǎng)2天，用3.7%福爾馬麟雖緩沖鹽水固定10^4中，并用0.2%TritonX-IOO磷縫緩沖鹽水透化。透化細胞用20%正常山羊血、絲養(yǎng)以阻斷非特異性A^，抗平滑WL動蛋白M(單克隆抗小鼠M:DAKO)用做初始M并應(yīng)用到標(biāo)本4。C整夜。^i己了異硫氰酸熒光素(FITC)的山羊抗鼠IgG結(jié)^4勿作為第Jl^，將蓋玻片用4'，6二脒基-2-苯口引喇DAPI;1g/ml;SigmaChemicalCo.，St.Louis,M0，U.S.A.)培養(yǎng)5分鐘用于核染色。細餘焚i^^微鏡下XC^(OlympusOpticalCo.，Japan)。用磷,緩沖鹽7pf洗平皿底部2次后，在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中培養(yǎng)的各自傳代的肋軟骨細胞用細l&^解緩沖液(Biolabs;2謹(jǐn)Tris一HClpH7.4，15謹(jǐn)NaCl，lmMNa2EDTA，lnMEGTA，1%Triton,2.5mM焦磷酸鈉，lmMNa3V04,lmM卩-甘油磷酸酯，1|ig/ml亮肽素)練，添加2mM的苯甲基^氟化物(PMSF)用于抑制蛋白質(zhì)降解酶的活性，并離心取上清;W)于膠原分離。蛋白質(zhì)加載到10%SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，并用抗I型膠原M和抗11型^f、^/^(多克隆抗山羊^/^:southern)進行western免疫印跡法;f^測。分化誘導(dǎo)為軟骨細胞將在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中擴充至P7或P8的肋軟骨細胞制成團塊，并在軟骨形躲養(yǎng)基中誘導(dǎo)3周以分化為軟骨。番^1#-0染色評估分化為軟骨的程度。結(jié)果不同培^^基的細i&r充率當(dāng)細胞充滿培#^時，用胰蛋白酶-EDTA(Gibco)移除細胞，活細l&^jk球計媒于錐蟲藍排除法計數(shù)，"W^蔣充率。如圖7所示，為iiJ'jP7，需在MSCGM-FGF中培養(yǎng)約30天，其中細l^廣充約107倍，在MSCGM中需要約38天，其中細胞擴充約105倍。然而，在DMEM-FBS中，在大約l個月中，細胞幾乎不M4^勿線狀的擴充圖，在P7，細月&廣充僅約103倍。因此,在肋軟骨細胞的培養(yǎng)中，在MSCGM中的肋軟骨細I^廣充率肝在D醒+10%FBS中的。另外，當(dāng)在添加了FGF的MSCGM中培養(yǎng)時，肋軟骨細胞的擴充率M增高?？梢灶A(yù)期，如果肋軟骨細脈添加了FGF的DMEM中培養(yǎng)時，將獲得同樣的結(jié)果。I和II型^^和抗平滑Wl動蛋白M的表達測定分別在DMEM-FBS、MSCGM或MSCGM-FGF中培養(yǎng)的肋軟骨細胞其I和II型膠原和抗平滑肌肌動蛋白抗體的表i^呈度。如圖8所示，(5!^傳代的增加II型膠原的表達減少，肋軟骨細胞的II型M^表達減少,MSCGM-FGF、MSCGM和DM服-FBS的次序增高。在擴充于MSCGM和DMEM-FBS中的肋軟骨細胞內(nèi)，平滑WL動蛋白表達細胞約為90%，章)^>說，許多細I&^達平滑WL動蛋白。然而，在MSCGM-FGF中，M"傳代賄極少數(shù)的肋軟骨細^4ii平滑M^動蛋白。如圖9所示，在擴充于DMEM-FBS和MSCGM的肋^/f細胞內(nèi)，！5l^傳代的增加I型^f、的表ii^曾加，在P7,幾乎所有的細錄達I型^f、。相反，僅60至70%的擴充于MSCGM-FGF中的細#達I型膠原。葡萄糖胺的表達如圖IO所示，擴充于DMEM-FBS的肋軟骨細l&i要在團塊的外壁顯示葡萄糖胺，的表達，在高倍顯微圖象中大多數(shù)的外壁細M示軟骨細胞形態(tài)。擴充于MSCGM中的肋軟骨細胞在3周的軟骨分化后在某些團#面顯示了低的葡萄糖胺^t表達，和非常小數(shù)目的細胞顯示軟骨細胞的形態(tài)。相反，擴充于MSCGM-FGF中的細胞在周的軟骨分化后在大多數(shù)團塊中顯示了強的葡萄糖胺雑表達，并顯示軟骨細胞形態(tài)。從而，以添加1ng/mlFGF的MSCGM為擴^J力軟骨細胞的培養(yǎng)基時，當(dāng)細胞擴充約2x107倍后軟骨細胞分化能力被保持。實施例4:完全去分化的肋軟骨細胞的#^化材^p方法軟骨細胞的分離用實施例2中使用的方法，去分化細l^皮培養(yǎng)直至P7。完全去分化的肋軟骨細胞分化為軟骨細胞為了完全去分化的肋軟骨細^#^化為軟骨細胞，，細I&J^1x106細胞/15ml試管，并聚集培養(yǎng)。培養(yǎng)J^i^腦軟骨形麟養(yǎng)基(高葡萄糖DMEM，1%ITS+3(Sigma),100nMiiLE>M^(Sigma)，50ug/ml維生素C(Sigma)，40jig/ml果^4t(Sigma),10ng/mlTGFp3(R&Dsystem,Inc.，MN，U.S.A.》，對照組添加J^出培養(yǎng)基(DM服-HG,10%FBS)。一周更換2次培養(yǎng)基，并在2和3周觀察。為確證分化為軟骨細胞，在2和3周，用3.7%^爾馬緩沖液固定三維結(jié)構(gòu)，制備^5蠟標(biāo)本，^H刀為5罪厚度。薄片被去石參用番械-0和固綠(Sigma)染色，用于^膝葡萄糖胺^l分布。完全去分化的肋軟骨細^^化為成骨細胞為了#^化為成骨細胞，將P7的肋軟骨細胞以2x1(T細胞/cm2的細胞密度接種6孑L^24孑L，在成骨培養(yǎng)基(DMEM,10%FBS,100nM^E>fO^(Sigma)，l隨P-礴酸甘油(Sigma)，50yg/ml維生素C(Sigma))中培養(yǎng)。一周更換2次培養(yǎng)基，并在2和3周，膝。^f出培養(yǎng)基(DMEM，10%FBS)凈^f]于對照組。為確證分化為成骨細胞，細胞分4^刀始才射緣用堿性磷酸酶染色。用減性磷酸酶測量試劑盒(SIGMA-ALDRICH，St.Louis，MO，U.S.A."Jl^組織化學(xué)的表ii^呈度。并且，用茜素^t^鈉(SIGMA-ALDRICH)染色細胞，所述茜素^^t^鈉能夠染色成骨細胞成熟期間分泌的礦物成分，以觀^^化為成骨細胞的程度。完全去分化的肋軟骨細胞分化為脂肪細胞為了^^化為脂肪細胞，P7的肋lt骨細胞以2x1(T細胞/cm2的細胞密JL接種6孑L^24孑L，并在脂肪形躲養(yǎng)寂高葡萄糖DMEM(Gibco)，10%FBS，10mg/ml胰島素(Sigma)，100nM岫^SiM^(Sigma)，0.2raM消炎痛(WakoPureChemicalIndustries,Japan),500jum3—異丁基-1—甲基黃噪呤(Wako))中培養(yǎng)3天，并在脂肪形絲養(yǎng)基中(高葡萄糖DMEM,10%FBS)重復(fù)1天的培養(yǎng)?；A(chǔ)培養(yǎng)基(DMEM-HG，10%FBS)凈M于對照組，并在2和3周觀察。為確證分化為脂肪細胞，細胞用油紅0染色，所述油紅O特別適合染色脂類小滴。結(jié)果分化為軟骨細胞圖11顯示了P7肋軟骨細胞分化誘導(dǎo)3周成為軟骨細胞的目視圖。細to相形成團塊，軟骨誘導(dǎo)組中的團^A寸與對照組(勤出培養(yǎng)基DMEM，10%FBS)相比更大。圖12顯示對葡萄糖胺歸番,-0染色的結(jié)果。在分化誘導(dǎo)的3周，在團塊的外壁觀察葡萄糖胺彩瞎的表達。細lte示軟骨細胞形態(tài)。對照組不表達葡萄糖胺,，也不顯示軟骨細胞形態(tài)。分化為成骨細胞為確證分化為成骨細胞，X!^^生^^酶的活性。圖13顯示通艦性磷酸酶測量試劑盒(SIGMA-ALDRICH，St.Louis,MO，U.S.A.)測量堿性磷^H。堿f生磷麟的活性，作為成骨分化的初始才斜綠，在分化的2周強烈的表達，在3周趨于稍孩聰氐。培養(yǎng)于J^出培養(yǎng)基的對照組不表ii^性磷酸酶的活性。更進一步，圖14顯示用茜素紅染色劑進行礦物染色的結(jié)果。在分化2周時沒有XW到表達，但在3周的部分染色確證了成熟分化為成骨細胞。分化為脂肪細胞為確證分化為脂肪細胞，細胞用油紅0染色，所述油紅0適合染色脂類小滴。如圖15所示，在細胞內(nèi)顯現(xiàn)的許多油紅O染色的脂類小滴確證了分化為脂肪細胞。實施例5:基于殼支架內(nèi)的肋軟骨細fef關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)作用的評價實施例5的步驟與圖16圖#^見圖的相同。圖16顯示肋軟骨細lfe^^離，培養(yǎng)直到P2，去分化的細淑皮接種到基于殼聚糖的支^Ji,培養(yǎng)，然后將支架移"缺損的關(guān)節(jié)軟骨中以修復(fù)軟骨缺損。軟骨細胞的分離在^L如上述實施例1相同的步驟后，匯合的原代細l^^^養(yǎng)直到P2。海綿形式支架的制備C0L-GAG海綿多孑U^fvi^"(Integra,IntegraLifesciencesCo.，U.S.A.)由交聯(lián)的牛m原和葡萄糖胺聚糖(軟骨素-6-賄酸鹽)的纖維制成，所述牛艦原被制備具有一定孔隙和預(yù)定的降解速率。支架(COL-GAG)通過4咖活檢沖床(S.F.M，Germany)制^"和通蹄^H移除絲。CS海綿殼,(KoreachitosanCo.，Korea,1.5°/。w/v)溶于0.1。/。乙酸水液中。充分餅完全溶解后，溶M過0.4/am濾膜(MilliporeCo.，U.S.A.)并分商eJ'J模型中。成型在-80匸放置24小時，然后在冷凍干燥器中凍干24小時。支架用酒精和蒸餾水洗去殘酸，并添加乙酸酐以乙?；ＶЪ苡镁?蒸餾水洗去副產(chǎn)物酸，并凍干。殼雑支架(CS)的厚度約為2咖。殼支架的精細結(jié)構(gòu)和《W圣大小通過掃描電子顯微鏡法(掃描電鏡；圖8)獲得。通過4咖活檢沖床制備4咖直徑的支架。在細皿養(yǎng)實驗之前，支架(CS)暴露在紫外光下30^4中滅菌，并用培養(yǎng)勤旻泡10^4中。制備的支架應(yīng)立即〗^)。CS-HA海綿在制備4mm直徑的殼^l支絲，50%乙醇浸泡，再用0.1%透明質(zhì)酸(HA;Sigma,StLouis，M0，U.S.A.)磷啦緩沖鹽7J^旻泡。支絲-80。C放置24小時，冷凍干燥器中凍干24小時。在細g養(yǎng)實驗之前，支架(CS-HA)暴#紫外光下30^4申滅菌，并用培養(yǎng)勤曼泡10^^中。制備的支架應(yīng)立即使用。在支紅接種軟骨細胞并培養(yǎng)4f^有2x106J^^力軟骨細胞的培養(yǎng)基20iu1接種到C0L—GAG、CS和CS-HA(4咖直徑x2咖厚)上培養(yǎng)基中的，預(yù)ife^A^37。C的5%0)2的6-孑L盤中2小時。，向每個孔中添加6mL培養(yǎng)基，細艦養(yǎng)4周。每周更換培養(yǎng)j^在整個培養(yǎng)期間每72小時向培養(yǎng)jj^加新鮮的L-抗壞m6l酸。在第2、7、14和28A^得培，湯和細胞支架結(jié)構(gòu)，和結(jié)構(gòu)M第2^^得。MTT分析、Blyscan分析、細胞支架結(jié)構(gòu)的組織學(xué)的和免^i且織化學(xué)的染色以及前^f、I型C-肽(PIP)的ELISA分析MTT分析每個支架內(nèi)的細胞增殖率根據(jù)虹T分析(MosmanT.Rapidcolormetricassayforcellulargrowthandsurvival,applicationtoproliferationandcytotoxicityassays,J.Immunol.Methods1983;65:55-63)觀'J定。前M^、I型C-肽(PIP)的ELISA分析為了定量測定從新合^^、中#^文的前C-肽，<頓前l(fā)^f、I型C-肽(PIP)EIA試劑盒(TakaraBio.Inc.,Japan)。培養(yǎng)UU蒸鎦7jc^^^到1:100，其余的步驟按照制造商的說明書操怍。在450nm用酶標(biāo)儀(microplatereader)(BioRadLab.，Richimond，CA,U.S.A.)測f^JeJL在0—640ngPIP/mL范圍內(nèi)的以標(biāo)準(zhǔn)曲線^^交準(zhǔn)肽的#^丈量。Blyscan分析1，9-次甲基藍分析(Blyscan⑧GlycosaminoglycanAssay,Biocolor，U.L)定量測定葡萄糖胺,的^J:。等份300jul的培養(yǎng)基按照廠家的說明來分析，并用標(biāo)準(zhǔn)曲線來校準(zhǔn)，所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是通過O.1、0.2、0.3、0.5、l和2yg的鯊魚石Ji^軟骨素(SigmaChemicalCo.StLouis,U.S.A.)斜'j的。統(tǒng)計用不配對t檢驗^i^f^充計分析，確定Mr中各變量是否有顯著性差異(p<0.05)。動物的飼養(yǎng)l捐24只新西蘭白兔(初始重量2.2到2.5kg，約4到5月大)。動#^皮認(rèn)為是年輕成年的，因為在4個月大^通常不再MJjL骨骼的生長(Masoudetal.，1986)。在^r前1至2周獲取動物，#^〕養(yǎng)在固定溫度22±2。C和濕度50±7%和固定亮暗周期(上午7:00-下午7:OO，itM期)下。動物可以自由進^p^7JC(標(biāo)準(zhǔn)實驗室飲食(團塊類型，PurinaCo.Korea)),并允許在地上自由活動。4財居批準(zhǔn)的動物飼養(yǎng)國家指南喂養(yǎng)、管#處理動物。手術(shù)步驟JL^上述實施例1描述的方法麻醉。輔助^#是靜脈注射##嚷和氯胺酮的混合物。在手術(shù)前，動物肌內(nèi)注射應(yīng)用抗生素(頭孢哇啉(cefazoline),Jonggun-dang，韓國)一次。刮凈,附近的她，用酒精清洗，并用聚維^5典溶液備皮。手術(shù)方法類似于Shapiroetal.所描述的。在作出一個中央的膝蓋旁切口后，髕^fi皮橫向l3C/[立以暴露股骨的髕骨凹槽。^^H^i鉆在髕-股骨*點的承重區(qū)域制造直徑為4mm的缺損。在兔中的所述區(qū)域是間歇的承受重量，并與髕骨接觸。圓錐形的全^^損從關(guān)節(jié)軟骨的表面通過密質(zhì)軟骨下骨i^^股骨遠端的骨te中的+〉質(zhì)骨內(nèi)。缺損的^1大約為2.0到2.5咖。在鉆孑L^,用冷鹽水(NaCl0.9%w/v)大面積的沖洗傷口以移除脫落的碎片。在缺損處滴入一滴纖維蛋白津給系統(tǒng)(TisseelKit,BaxterAG,Austria)以將移齢構(gòu)固定到缺損，并且將支架立即插入缺損中。在寸照的缺損中，僅使用纖維蛋白密封劑(圖16)。髕骨M^立^cl^iL關(guān)節(jié)嚢與皮^^狀縫合。不佳JfH封可模具，兔子^A^復(fù)原之后，立即允許自由活動。肌肉注射5天頭孢哇啉，每天兩次。動物的膝蓋#紛為三個組(1)未治療缺損(對照)；(2)用CS-HA單獨治療；或(3)用加載了肋軟骨細胞的CS-HA治療。^tA的6和12周，兔子在^WJf下通過注射MgS(X安樂死。修^li且織的組織學(xué)*在動物處^后，檢查膝蓋^&形態(tài)學(xué)(顏色、完整性、輪廓和規(guī)度)、^:損的修"復(fù)和周圍^t骨的外》見。^區(qū)域的標(biāo)4^^剖、攝影和用10°/凝沖福爾馬林在室溫下固定一周。然后沖洗標(biāo)本以清除過量的固定劑，并用Calci-ClearRapid(NationalDiagnotics，U.S.A.)脫鉀一周。用梯度乙醇和二甲7jc，并用石蠟包埋。通過切片機切成6jum厚的片用于組織學(xué)研究。切片用蘇氺^^Wf^:(H&E)染色iM9f究形態(tài)細節(jié)，用番細晴-0和固綠染色來"^葡萄糖胺^t分布。軟骨缺損的緩按照Pineda等(1992)和Wakitani等(1994)的改良的組織等級評分法由研究者對切片進行盲法*。所述等級評分是^由5類纟誠,^(i^0(正常軟骨)到14(未修JJ且織)(表4)。表4:對于軟骨缺損的組織等級評分<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>a、修復(fù)軟骨的總平滑面積與軟骨缺損的總面積之比。b、修^復(fù)軟骨的平均厚度與周圍軟骨的平均厚;1之比。統(tǒng)計分析通過^fMt檢驗來^H^充計絲性。絲性水平是p〈0.05。結(jié)果培養(yǎng)在海綿支架中的肋軟骨細胞^^)MTT分析在培養(yǎng)的1、2和4周tb^^種不同支架！^f、-葡萄糖胺海綿(COL-GAG)、殼海綿(CS)和透明質(zhì)酸包被的殼麟海綿(CS-HA)中的肋軟骨細胞的增殖率(圖l7)。圖17中的值顯示了^it些支架內(nèi)的細胞增殖。CS和CS-HA的光學(xué)密度值隨培養(yǎng)時間延長而，增加，兩種支架之間沒有顯著的差異。在COL-GAG中發(fā)現(xiàn)了類似的趨勢，但初始水平較低。在培養(yǎng)28天時的光學(xué)密度值與培養(yǎng)第7天的相比，在COL-GAG、CS和CS-HA中分別增力。了大約1.30、1.43和1.40倍。為了評價接種了細胞的復(fù)合支架的新合皿原，通過ELISA分析(圖18)測量前l(fā)^f、I型C-肽(PIP)。在培養(yǎng)第7天，CS和CS-HA的^f、^^成大于COL-GAG中的合成，有絲的差異。然而，第14天，在CS中的^f、合成比在COL-GAG和CS-HA中的大的多(CS〉CS-HA>COL-GAG)。第14天的J^f、合成與在培養(yǎng)第7天的相比顯著的減少。在四周的培養(yǎng)期間，CS中向培養(yǎng)基的膠原分泌^f斤的減少，相M，在COL-GAG和CS-HA中，^^#^^第1和第2周之間顯著的減少，然后在第2和第4周之間有所增加。Blyscan分析顯示了接種了肋軟骨細胞的三種不同支架向培養(yǎng)上清液中持續(xù)一周#^文的GAG量。在培養(yǎng)的第1周，兩種殼彩瞎支架比COL-GAG#^嫂多的GAG。在第14天，三種支架中GAG#^文的量近似，錄培養(yǎng)的28天，在COL-GAG中釋放的GAG量與CS和CS-HA中的相比非常小。在兔肋軟骨細l^皮接種到COL-GAG、CS和CS-HA上并培養(yǎng)28天期間，在整個培養(yǎng)時間內(nèi)，CS和CS-HA的尺寸大于COL-GAG的。蘇木^H尹紅(H&E)染色的組織學(xué)檢查顯示了標(biāo)本的形態(tài)特征(圖19)。在圖19中，S^44面，(M議中心，刻度條^仏50um，黑色箭線^^纖銜且織，白色箭線^^亡細胞，黑色箭頭代表圓形細胞和白色箭頭代表梭形細胞。在軟骨細皿養(yǎng)2^,接種細^i要存在于兩種基于殼聚塘的支架和特別是COL-GAG的表面區(qū)域。圓形^^形細胞間雜,和在第2天軟骨陷窩中沒有細胞。在第2天的標(biāo)本中，在CS和CS-HA中心的細^I^:集的，而在COL-GAG中，中心的細脫稀少和綠的。在培養(yǎng)7M,在支架的周緣內(nèi)的細目的增力口^的，并且新的細胞周圍間質(zhì)包圍了大部分細胞。在CS和CS-M支架的中心和周緣，絕大多數(shù)的接種細艦維持它們的;形態(tài)，占據(jù)軟骨陷窩并合成狄的M。然而，在COL-GAG中，周緣的細M圓形的，但它們不占據(jù)陷窩，中心的細IS^^梭形的且不聚集。在培養(yǎng)的第14天，在兩種基于殼支架的中心和周緣的大多數(shù)細^￡維持它們的球形形態(tài)，占據(jù)陷窩并合成非常^X的細血卜M。棘COL-GAG中，周緣的細胞是球形形態(tài)，占據(jù)陷窩和合iUX的細l^卜絲，但中心的細^￡是梭形的，占據(jù)小的陷窩和合成少量的細^卜M。在試驗的末尾(28天)，兩種基于殼支架的表面被薄纖維組織覆蓋。在中心以及周緣的細胞變?yōu)樾〉?、仍占?jù)較大的陷窩。在COL-GAG中，周緣細胞減少了細胞構(gòu)成，具有非常小而圓的形態(tài)和不占據(jù)陷窩。中心內(nèi)的細胞與笫14天的類似。通過番fec4青-0固綠(S/0)對軟骨細船卜M的葡萄糖胺^tii行的組織學(xué)染色,在整個培絲間在CS和CS-HA支架中心銜則到葡萄糖胺親圖20)。在圖20中，白色箭頭f(^番,-O染色的結(jié)構(gòu)，黑色箭線f(^纖維組織、白色箭線代表固綠染色的細胞，刻度條^A100um。在兩種基于殼彩睹的支架中，2天培##本的中心的細|^皮3/0染色。然而，在COL-GAG中心內(nèi)的細胞不被S/0染色。在三種類型的支架中隨培養(yǎng)時間的增加，積累葡萄糖胺彩瞎的量也增加。在培養(yǎng)的28天，支架的周圍不^皮固綠染色。組織學(xué)檢測在沒有軟骨細胞的CS和CS-HA中沒有檢測到葡萄糖胺彩瞎，但COL-GAG的框架凈MS/0陽性著色，因為它們與石1^軟骨素相結(jié)合。I型和II型膠原的免疫染色在兩種基于殼麟的支架中，1和2周的標(biāo)本內(nèi)沒有檢測到I型I^^。相反，在兩種基于殼聚糖的支架中，在1至2周的培養(yǎng)期內(nèi)抗II型膠原^^是強陽性的。在第4周，在支g面和中心內(nèi)的部分細胞^^j"抗I型^f、M呈陽性。然而，在4周的標(biāo)本中，抗11型膠原^￡是陽性的，但變?nèi)趿?。在COL-GAG的1、2和4周的標(biāo)本內(nèi)^r測到了I型l^^。在第l周抗II型膠原抗體陽性^4面顯現(xiàn)，在第2周在周緣的間質(zhì)和中心的少許細胞內(nèi)顯陽性。在第4周的標(biāo)本內(nèi)，抗II型l^f^^顯非常弱的陽性(圖21和22)。在圖21中，黑色箭線^^纖維組織，黑色箭頭ft4l型^f、表達細胞，白色箭線^4C0L-GAG結(jié)構(gòu)，圖21和22中的刻度條^4100jum。由上iii且織學(xué)觀察的結(jié)果可知，當(dāng)去分^^骨細l^皮接種到三種類型的海綿形式支架(CS、CS-HA和C0L-GAG)上時，在兩種基于殼,支架中，接種的細#形態(tài)、葡萄糖胺^f唐合i^II型^^、表達中會#^化1至2周。然而，在COL-GAG中，內(nèi)部細l&^種效率不高，中心內(nèi)的細胞的^^ft^不好。直到第4周，細胞開始丟失合成細^卜基質(zhì)的活性(陷窩的尺寸變得更小)。體內(nèi)結(jié)果^f究將"W^養(yǎng)肋軟骨細胞-殼復(fù)，在修復(fù)承重動物模型內(nèi)全層關(guān)節(jié)軟骨缺損中的作用。將P2的肋軟骨細l^妾種到CS-HA支架上，培養(yǎng)2周。在兔股骨的髕骨凹槽上手術(shù)制作軟骨缺損。在第6和12周動桐皮安樂死，并獲關(guān)節(jié)。標(biāo)本作目視、組織學(xué)和免^B且織化學(xué)分析。臨床微所有動物中都沒有發(fā)生手術(shù)后并發(fā)癥。M究期間，沒有，￡#到關(guān)節(jié)脫臼或殘疾的癥狀。肉目,見依據(jù)肉目W膝，在《封可關(guān)節(jié)都沒有，Ji^到滑膜流出或滑膜炎。雖然沒有進行滑^i且織的組織學(xué)檢查，但無炎癥M跡象。肉目p膝，所有關(guān)節(jié)內(nèi)的滑液在量、粘性和顏色方面都是正常的。在圖23到圖26中，對照代表對照組，S代表CS-HA移植的缺損，和S-CELL4，力軟骨細l^^種的CS-HA移植的缺損?？瞻?對照)^^員^^多植后第6周，樹照組中，缺損可見規(guī)表面。缺損在修H且織和鄰近關(guān)節(jié)軟骨之間有縫隙或缺M續(xù)性。缺損的i^彖是可辨別的。修復(fù)組織與鄰^iE常軟骨相比更白和稍微不透明(圖23)。在移才i^12周，對照組中的修復(fù)組織可以容易的與正常鄰近軟骨區(qū)分，因為它們具有白色和不透明的夕卜觀。缺損中完全充滿了平滑的白色修復(fù)組織(圖23)。CS-HA移植的缺損在第6周肉目pj^，某些缺損沒有完全充滿修ii且織，在某些區(qū)^m骨下骨暴露。缺損中修Ji且織的表面與周圍正常組織相比更不細'J，修復(fù)組織的邊緣也不平滑。修Ji且織為白色至粉紅色的、半透明的(圖23)。在12周，CS-HA移植缺損的修Ji且織還是可辨別的，錄夕卜M^質(zhì)紅是透明的。缺損被填充至鄰^JE常軟骨的水平。它們某些的表面比6周標(biāo)本的更平滑。某些情況下(1/8)，修Ji且織由骨，而不是軟骨填充(圖23)。肋軟骨細^卩載的CS-HA移植的缺損在第6周，所有的缺損被充滿了修Ji且織，缺損的邊緣是可以從鄰iiJE常軟骨辨別出來的。修復(fù)組織的表面和ii^是WI^不規(guī)則的。修復(fù)組織在外^L^質(zhì)^Ji是透明的(圖23)。在第12周肉目W膝，所有的修復(fù)組織&ij了周圍正常軟骨的水平。修Ji且織的表面和ii^比6周標(biāo)本更平滑。修復(fù)組織還可以從周圍正常軟骨辨別出來。但與6周標(biāo);^目比修復(fù)軟骨的錄^口平滑的，與正常軟骨*更好(圖23)。兩者均是白L的和一定程度不細'J的。'通常:直至12周，對照缺損的表面與CS移植缺損的相比平滑的多，所述CS移植缺損的表面是突出和不細。的。對照缺損的表面是白色夕卜觀，^#植缺損的是粉紅外觀的。在細血口^f多植缺損中的修復(fù)組織的顏色和質(zhì)地類似于鄰ilJt常軟骨。形態(tài)學(xué)對照缺損^f多^6周，^f多植^l^^可見附加的類似纖,骨組織形成。缺損在修1^且織和鄰近關(guān)節(jié)軟骨之間的單側(cè)或雙順情縫隙或缺^il:續(xù)性。這個觀測表明周圍關(guān)節(jié)軟骨和修Ji且織之間^^度的下降。在修復(fù)軟骨和鄰^it常軟骨之間的界面偶爾顯示纖絲狀的連續(xù)性。修復(fù)組織的表面由3至5層扁平的細^i且成，并是纖絲化的。修復(fù)組織由纖維組織和多細胞纖^l^骨的混^組成。某些缺損在纖維和纖桑錄骨修復(fù)軟骨內(nèi)顯示裂縫缺口。修JilL織，的重新;tA了軟骨下骨(圖24至26)。在12周，某些軟骨缺損在修復(fù)組織和鄰近正常的軟骨之間有縫隙或缺^i4續(xù)性。修復(fù)組織的表面是平滑的且纖絲化較明顯。缺損充滿了軟骨細胞和間質(zhì)。然而，成纖維細^A^"^4面層，大部分表面由纖維M組成。修復(fù)組織具有類似纖維^^:骨的細密細參卜基質(zhì)和圓的、相對成熟的軟骨細^#細胞。因此，在12周的對照組的修復(fù)組織主要由纖維組織和纖,骨組織組成(圖24至26)。CS-HA支^f多植的缺損在第6周，修復(fù)組織與鄰^jt常軟骨^^良好。在顯微視圖下，修復(fù)組織是多細^i且分。用基于殼，海綿治療的骨軟骨缺損中，修Ji且織主要;O巴大軟骨細^扁平4^細胞。修^li且織的底部由梭形細i^M，所述梭形細i^r有不細'J細^KM和類似于不成熟的實質(zhì)細胞。修復(fù)組織是透明的纖維化的軟骨。缺損表面上的少許細J^是小且扁平的，細*卜基質(zhì)被H&E染色。在修Ji且織的表面可以發(fā)現(xiàn)幾乎所有的纖維組織。修復(fù)組織的中間層具有透明軟骨樣的組織，其包含圓而大的細皿、相對不成熟的軟骨細,細胞(圖24至26)。然而，修復(fù)軟骨偶爾可見垂直裂逸在第12周，修Ji且織與鄰i^E常軟骨齡脅。4#植12周后，用基于殼,海綿治療的骨軟骨缺損中的修復(fù)組織主要為不成熟的軟骨細胞和扁平表層細胞。長形的成纖維細胞與表面平行排列，和缺損充滿了高密度不成熟的軟骨細月沐透明樣間質(zhì)。修復(fù)軟骨的底部包括肥大軟骨細胞并;|的向軟骨下骨再生。某些情況下缺損由^1有薄纖維組織的骨組織M^，而不是由軟骨組織纟M(圖24至26)。肋軟骨細胞加載的CS-HA支架移植的缺損在6周的標(biāo)本中，修復(fù)組織內(nèi)的軟骨細胞與鄰iiit常軟骨內(nèi)的相比更多，呈柱狀排列。表面某些部分有纖絲化的證據(jù)。修復(fù)軟骨顯示了與周圍正常軟骨和骨部分的正常^。^f可缺損在修復(fù)軟骨內(nèi)顯示了裂縫缺口(圖24至26)。^^質(zhì)骨中可見骨小梁^f多植的深層區(qū)^^育，包含小殘留軟骨細胞。在12周，用培養(yǎng)細胞加載的CS-HA治療的缺損完全充滿了細^p基質(zhì)。修復(fù)組織與軟骨下骨和鄰^jt常軟骨正常的^^。4封可缺損在修復(fù)軟骨內(nèi)顯示了裂縫缺口。修復(fù)組織在單個陷窩內(nèi)包含單或多個軟骨細胞，修復(fù)組織由同源細^^賦并呈柱狀#^。修復(fù)組織具有議的細I^卜M和整齊排列的軟骨細胞，雖然還是可劃財1^面俾免有檢測到纖絲^4面。絲面內(nèi)2至4層的軟骨細胞是小而扁平形的，并包括陷窩。修1^且織底部內(nèi)的軟骨細胞是大而圓的細胞，并比表面的細翻巴大、數(shù)量多。修復(fù)軟骨主要是透明軟骨。在這些缺損中形成的透明軟骨的厚度與鄰^常軟骨的相比更薄(圖24至26)。葡萄糖胺(GAG)分布一番,-O染色對照缺損在第6周，對照缺損中，僅修復(fù)組織底部內(nèi)的某些區(qū)域被S/0染色。修復(fù)組織W皮s/o染色，修復(fù)組織的表面被固綠染色，相反的染色顏色。樹照缺損切片中異染性中度-嚴(yán)重丟失明顯緩解(圖27)。在12周，修Ji且織的表面仍被固綠染色。絲"-^中，修復(fù)組織被S/0染色，^^例對S/0是負(fù)性染色(圖27XCS-HA支斜多植的缺損在第6周，充滿肥大軟骨細胞的區(qū)械被S/0陽性染色，與周圍正常軟骨的連接是弱染色的。在缺損底部的肥大軟骨細胞區(qū)域內(nèi)番^1#-0和固綠染色是主要的(圖27)。第12周與第6周相比，修復(fù)組織的底部和與周圍正常軟骨的連^t被S/0更強的染色(圖27)。肋軟骨細胞加載的CS-HA支架移植的缺損在6周，所有的修彭且織被S/0染色，但與周圍正常軟骨相J^f肖孩域狄的斷氐，并且修！i且織的底部對S/0呈強陽性染色。與鄰i^iL常軟骨相比修復(fù)軟骨的染色強度稍樣談狄的I^f氐(圖27)。在第12周除了某些中心的區(qū)域，修復(fù)組織用S/0染色達到了周圍正常軟骨的水平。大部W參復(fù)軟骨是透明樣的，在半徑區(qū)域內(nèi)缺損顯示垂直的柱狀軟骨細胞。I型和II型膠原的免疫染色對照缺損^^多植后6周，修Ji且織的上部的一半?yún)^(qū)域和與正常軟骨的々財^bt抗I型l^f是陽性的。除了^f緣骨外的^^部分對抗II型M^是陽性的(圖28)。在12周，修復(fù)組織的所有細M抗I型膠原是陽性的(圖28)。CS-HA移植的缺損在6周，修復(fù)組織的邊^(qū)^上部對抗I型膠原是陽性的。肥大部分對抗I型^f、也是陽性的(圖28)。在12周，修H且織的表面對抗I型M^、是陽性的，其他部分對抗II型膠原呈P曰性(圖28)。肋軟骨細胞加載的CS-HA支架移植的缺損在6周，修復(fù)組織表面的某些部分對抗I型膠原是陽性的。與鄰i^E常軟骨相比修H且織抗II型膠原的表達降低了(圖28)。在12周，表面的小范圍內(nèi)，抗I型^f、呈弱陽寸錄達。修li且織對抗II型^^、的表達類似于正常軟骨水平(圖28)。組織學(xué)等級評分(平均分)的結(jié)果見表5。表5:組織學(xué)等級#的結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>實施例6:基于殼彩瞎支架內(nèi)的間充質(zhì)干細^#^分化細胞寸關(guān)節(jié)軟骨缺損的4務(wù)復(fù)作用的"W軟骨細胞的分離和培養(yǎng)如同實施例1，用斷^AM力分離助軟骨細胞，以5x105細胞/100mm直徑平皿的細胞密度鋪板，并在添加了1ng/ml成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳^^養(yǎng)直至P8，如實施例3，以獲得間充質(zhì)干細;5^怯分化細胞。在基于殼支架內(nèi)的間充質(zhì)千細^#*分化細胞的制備和培養(yǎng)如同實施例5,制備殼彩瞎海綿并包被透明質(zhì)酸。5mm直徑的CS-HA海綿被接種2x1()6的在P8的間^t干細^f^分化細胞，以獲得在支架內(nèi)的間^f干細^#*分化細胞，并在包含TGF-e的軟骨形，養(yǎng)基中培養(yǎng)2周以誘導(dǎo)產(chǎn)生軟骨分化。為了^H古分化為軟骨的程度，進行番^lt-O染色。對關(guān)節(jié)軟骨缺損的lf復(fù)作用如同實施例l，JM^醉，并在手術(shù)前給予抗生素。在兩個股骨的髕骨凹槽上制作缺損(5咖直徑、大約2.0至2.5咖深)，并在支架內(nèi)移植間干細IW^分化細胞(已經(jīng)分化為軟骨)，如實施例2。結(jié)果粉化為軟骨細胞圖29是包含-^Mt^骨細胞的AX軟骨的目視圖，所述#^(^1骨是通過將肋軟骨細胞的間充質(zhì)干細^W分化細胞加載到殼^l海綿上，并在軟骨形"養(yǎng)基中^1^得的。圖30顯示對在軟骨形^|#基中#^化的軟骨細胞內(nèi)的葡萄糖胺，用番細晴-0染色的結(jié)果。在2周的軟骨形成分化后，海綿內(nèi)的間充質(zhì)干細皿去分化細IW^化為軟骨細胞。關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)圖31將加載了間充質(zhì)干細月&f^分化細胞的基于殼彩瞎的支架移植到兔關(guān)節(jié)軟骨缺損6周后的目視圖片。修復(fù)組織與鄰:^￡常組織平滑地*，在外M^質(zhì)地可見為透明軟骨。工業(yè)實用性在本發(fā)明中，首先公開了肋軟骨與關(guān)節(jié)軟骨相比提供高細胞產(chǎn)量和細胞擴增率，因jt時軟骨修復(fù)來i^力軟骨與關(guān)節(jié)軟骨相比^X好的細胞源。在本發(fā)明之前，在JM技術(shù)中已知去分化率，也lt^說，在軟骨細l^,間的軟骨細^!^見型的損紋非常高的，其P艮制了自體關(guān)節(jié)軟骨細I^多植的應(yīng)用。然而，顯示了間充質(zhì)干細胞的性質(zhì)，因此，這種完4^分化的肋軟骨細胞可以初C^化為期望的分化細胞例如成骨細胞、脂肪細胞等等，以及當(dāng)在分化M下再培養(yǎng)時成為軟骨細胞。從而，本發(fā)明提^^種包含間緒干細1&#^分化細胞的人工軟骨和細胞治療劑，所述去分化細J&t過傳^^力軟骨細^^得。另夕卜，本發(fā)明顯示，自體肋軟骨細彪口載的基于殼，的支架，入軟骨缺損時，能非常有效的修復(fù)承重位點內(nèi)的全層關(guān)節(jié)軟骨缺損。權(quán)利要求1、一種人工軟骨，包含通過肋軟骨細胞傳代獲得的間充質(zhì)干細胞(MSC)樣去分化細胞。2、H又利要求1所述的AX軟骨，其中所述間干細^#*分化細胞是通過在MSCGM或包含成纖維細胞生長因子(FGF)的MSCGM中傳^^力軟骨細胞獲得的。3、.如權(quán)利要求1或2所述的AX軟骨，其包^iiii^軟骨形^養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間干細1&#*分化細^得的#^^^骨細胞。4、如權(quán)利要求3所述的人工軟骨，其中所述再分4t^t骨細艦錄軟骨形^W養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細^#*分化細^得。5、如權(quán)利要求3所述的人工軟骨，其中所述軟骨細^fc^口載到基于殼聚糖的支紅6、如權(quán)利要求5所述的人工軟骨，其中所i^于殼彩瞎的支婦&自殼M海綿；包含轉(zhuǎn)化生長因子-P(TGF-P)的殼海綿；透明質(zhì)酸(HA)包衣的殼聚糖海綿；^L^軟骨素包衣的殼^t海綿；和殼聚糖^f、復(fù)合海綿。7、一種用于制名vOi軟骨的方法，包4舌傳^J力軟骨細胞以I^得間充質(zhì)干細艦W分化細胞的步驟。8、如權(quán)利要求7所述的方法，其中將所^J力軟骨細月驢MSCGM或包含成纖維細胞生長因子的MSCGM中傳代。9、N又利要求7或8所述的方法，其包含在軟骨形，養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間干細^#^分化細胞以獲得#^骨細胞的步驟。10、W又利要求9所述的方法，其包含在軟骨形，養(yǎng)基中聚集培養(yǎng)所述間干細^#*分化細胞以獲得#^(*骨細胞的步驟。11、如4Wj要求7或8所述的方法，其包含加載所述間錯干細I^W分化細^J'J基于殼彩緣的支架上的步驟。12、一種細胞治療劑，包^1過傳^1力軟骨細^^得的間充質(zhì)干細1&#*分化細胞。13、如權(quán)利要求12所述的細胞治療劑，其包^itit^軟骨形M養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間M干細Mif^分化細^^得的^^f汰骨細胞。14、^K利要求12所述的細胞治療劑，其包輛錄成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細^M:分化細^^得的成骨細胞。15、^K利要求12所述的細胞治療劑，其包^iiity旨肪形，養(yǎng)基中培養(yǎng)所述間充質(zhì)干細^#*分化細胞荻得的脂肪細胞。全文摘要本發(fā)明涉及一種包含間充質(zhì)干細胞(MSC)樣去分化細胞的人工軟骨及其制備方法，所述去分化細胞通過傳代培養(yǎng)肋軟骨細胞獲得。文檔編號A61K35/00GK101589139SQ200680049510公開日2009年11月25日申請日期2006年10月31日優(yōu)先權(quán)日2005年10月31日發(fā)明者孫英淑,李定宣,李殷坰,李珍研申請人:株式會社現(xiàn)代組織工學(xué);韓國原子力醫(yī)學(xué)院;慶熙大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團