專利名稱：藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藤黃酸的新用途，具體涉及藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
血管生成(angiogenesis)是指源于已經(jīng)存在的毛細(xì)血管和毛細(xì)血管后靜脈的新生毛細(xì)血管生成。血管是輸送氧、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的重要途徑，沒有血管支持的組織或器官難以生存，因此與機(jī)體內(nèi)器官和組織形成過程相伴隨會(huì)發(fā)生血管形成。由于組織或器官對(duì)氧與營養(yǎng)物質(zhì)的需要及對(duì)代謝產(chǎn)物清除的依賴，心臟和血管系統(tǒng)是胚胎發(fā)育過程中最早形成的器官。生理性的血管生成只存在于生殖系統(tǒng)和傷口愈合的過程，是短暫并且受到嚴(yán)格控制的。
血管生成是一復(fù)雜過程，主要由連續(xù)的10個(gè)步驟組成1、對(duì)缺氧做出反應(yīng)，損傷或疾病組織合成釋放血管生成因子；2、血管生成因子與內(nèi)皮細(xì)胞上各自的受體結(jié)合；3、受體結(jié)合使內(nèi)皮細(xì)胞激活；4、蛋白酶釋放，溶解基質(zhì)膜；5、內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、增值；6、黏附分子幫助出芽的血管向前延伸；7、產(chǎn)生基質(zhì)金屬水解蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)來溶解細(xì)胞外基質(zhì)；8、血管生成素與Tie-2相互作用調(diào)節(jié)小管生成；9、EphB-ephrinB系統(tǒng)調(diào)節(jié)管狀結(jié)構(gòu)連接成環(huán)；10、周細(xì)胞參與新生血管的穩(wěn)定性調(diào)節(jié)。
血管生成是一個(gè)及其復(fù)雜的過程，不僅有內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌纖維等許多成分參加其中，它還涉及到多種起重要作用的酶和蛋白質(zhì)。
腫瘤血管生成，是腫瘤研究中一個(gè)較新的領(lǐng)域。一百多年前人們就已發(fā)現(xiàn)腫瘤組織較正常組織富含血管。1945年，Algire首先提出了“腫瘤血管生成”的概念。1971年，F(xiàn)olkman最早提出腫瘤生長是血管依賴性的，但當(dāng)時(shí)這種觀點(diǎn)并未為人所接受，而在這8年后毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的建立，11年后第一個(gè)血管生成抑制劑的發(fā)現(xiàn)，13年后第一個(gè)血管生成活性蛋白的純化等一系列工作的完成，則使這一觀點(diǎn)為越來越多的證據(jù)所支持，并使這一領(lǐng)域成為腫瘤研究的熱點(diǎn)及腫瘤治療的新策略。
腫瘤的生長有兩個(gè)明顯不同的階段，即從無血管的緩慢生長階段轉(zhuǎn)變成有血管的快速增殖階段，血管生成使腫瘤能夠獲得足夠的營養(yǎng)物質(zhì)，是促成上述轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。如果沒有血管生成，原發(fā)腫瘤的生長不會(huì)超過1-2mm3。
關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、視網(wǎng)膜病(如糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早熟性視網(wǎng)膜病)、血管瘤、銀屑病等疾病均需要對(duì)病變組織血管生成進(jìn)行控制。
藤黃酸(gambogic acid，GA，C38H44O8)是中藥藤黃中有效成分之一。藤黃是藤黃科植物藤黃所分泌的干燥樹脂。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明藤黃酸可以抑制動(dòng)物移植瘤的腫瘤生長，在體外可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。目前沒有藤黃酸作為抑制血管生成藥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，尤其是藤黃酸在制備抑制腫瘤、關(guān)節(jié)炎(如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)、視網(wǎng)膜病(如糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞、早熟性視網(wǎng)膜病)、血管瘤、銀屑病等疾病的血管生成藥物中的應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明可以將治療有效量的藤黃酸和藥學(xué)上允許的任意一種輔料制成藥物組合物，也可以添加其他與藤黃酸沒有拮抗作用的其他抗血管生成的藥物。其制劑可以是藥學(xué)上允許的任意一種劑型，包括但不限于片劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、口服液、注射劑、脂質(zhì)體等。藤黃酸的用量可根據(jù)用藥途徑、患者年齡、體重、體表面積、所治療的疾病類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以在1～5mg/Kg體重范圍，可以一次或多次施用。
本發(fā)明的有益結(jié)果本發(fā)明公開了藤黃酸新的用途，即藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)表明，藤黃酸對(duì)雞胚尿囊膜血管生成、大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、血管內(nèi)皮細(xì)胞小管生成、腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子等均有顯著的抑制作用，可用于制備抑制血管生成的藥物。


圖1藤黃酸抑制雞胚尿囊膜血管生成照片。其中A，對(duì)照；B，0.9ng GA；C，4.5ngGA；D，22.5ng GA。
圖2藤黃酸抑制大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成的顯微鏡圖。其中A，對(duì)照；B，10-6mol/LGA；C，5×10-6mol/L GA；D，2.5×10-5mol/L GA。
圖3藤黃酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移的顯微鏡圖。其中A，對(duì)照；B，0.5×10-6mol/L GA；C，1×10-6mol/L GA；D，2×10-5mol/L GA。
圖4藤黃酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管生成的相差顯微鏡圖。其中A，對(duì)照；B，0.5×10-6mol/L GA；C，1×10-6mol/L GA；D，2×10-5mol/L GA。
圖5藤黃酸抑制肺癌細(xì)胞A549分泌VEGF的ELISA檢測結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式
以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的闡述。
實(shí)施例1藤黃酸抑制雞胚尿囊膜血管生成。
目的和原理在雞胚絨毛尿囊膜的血管生成早期，機(jī)體免疫系統(tǒng)尚未完全建立，對(duì)各種異物幾乎不發(fā)生排斥反應(yīng)，將含藥物載體置于其表面，可觀察到藥物對(duì)血管生成的影響。由于其對(duì)抗血管生成藥物敏感，目前仍被認(rèn)為是一種較理想的藥物篩選模型。
方法受精雞胚置于孵化箱中孵化9天(氣室端向上)。然后將雞胚用酒精擦拭后靜置15分鐘，在雞胚的上方劃一個(gè)2×2cm大小的開窗位置，用剪刀磨切開窗，吹去蛋殼上磨切的粉塵，揭去開窗處的蛋殼，再用虹膜剪刀剪破殼膜，暴露出絨毛尿囊膜。按分組將不同量的藤黃酸(A對(duì)照組，不加藤黃酸；B藤黃酸低劑量組，0.9ng GA；C藤黃酸中劑量組，4.5ng GA；D藤黃酸高劑量組，22.5ng GA)加在經(jīng)高壓滅過菌的0.5×0.5cm大小的Whatman濾紙上，然后將濾紙放在絨毛尿囊膜兩條大血管間的無血管部位，用滅菌透明膠帶封窗。
結(jié)果與評(píng)價(jià)雞胚放入孵化箱中孵化兩天，揭去封窗的透明膠帶，拍照，結(jié)果見圖1。與對(duì)照組比較，給予藤黃酸后，血管生成受到抑制，大的血管較少，說明藤黃酸可以抑制雞胚尿囊膜血管生成，并呈劑量依賴性。
實(shí)施例2藤黃酸抑制體外培養(yǎng)的大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成。
目的和原理將大鼠主動(dòng)脈環(huán)包埋于凝膠基質(zhì)中，觀察內(nèi)皮細(xì)胞從血管內(nèi)膜出芽并形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。
方法體重100～120g的雄性Wistar大鼠一只，脫臼法處死，取胸主動(dòng)脈，去除外圍結(jié)締組織和脂肪組織，剪成長約1mm的動(dòng)脈環(huán)，用M199無血清培養(yǎng)液漂洗。將大鼠主動(dòng)脈段包埋于24孔板中的纖維蛋白膠中，用M199培養(yǎng)液(對(duì)照組，不含藤黃酸)及含有不同濃度的藤黃酸的培養(yǎng)液進(jìn)行體外培養(yǎng)，每2至3天換液1次。
結(jié)果與評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞從動(dòng)脈段切口處向外生長，形成具有分枝的微血管樣結(jié)構(gòu)。7天后于倒置顯微鏡下觀察動(dòng)脈環(huán)附近內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管的生成情況并拍照。結(jié)果見圖2(其中A為對(duì)照組；B為10-6mol/L GA組；C為5×10-6mol/L GA組；D為2.5×10-5mol/LGA組)。與對(duì)照組比較，給予藤黃酸后，動(dòng)脈環(huán)的毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)生成減少，說明藤黃酸抑制大鼠動(dòng)脈環(huán)血管生成，并呈劑量依賴性。
實(shí)施例3藤黃酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞遷移。
目的和原理內(nèi)皮細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)采用transwell細(xì)胞培養(yǎng)小室進(jìn)行?？讖綖?μm的多聚碳酸鹽濾膜將小室分隔成上下兩層。在生長因子刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞通過阿米巴運(yùn)動(dòng)穿過8μm的濾孔，附著在濾膜的背面。利用該模型可評(píng)價(jià)藥物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響。
方法將內(nèi)皮細(xì)胞給予含有不同濃度藤黃酸的1640培養(yǎng)基作用30分鐘，然后將2.5×105個(gè)/ml HUVEC的細(xì)胞懸液400μl，加入到上室，下室加入600μl含刺激因子及不同濃度的1640培養(yǎng)液，于5％CO2孵箱37℃中培養(yǎng)4小時(shí)。
結(jié)果與評(píng)價(jià)取出濾膜，刮去膜上未遷移細(xì)胞，用100％甲醇固定濾膜，并以蘇木精—伊紅染色，甘油封片，最后利用顯微鏡觀察并拍照，結(jié)果見圖3(其中A為對(duì)照組；B為0.5×10-6mol/L GA組；C為1×10-6mol/L GA組；D為2×10-5mol/L GA組)。與對(duì)照組相比，給予藤黃酸后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力受到抑制，說明藤黃酸可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，并呈劑量依賴性。
實(shí)施例4藤黃酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管生成。
目的和原理matrigel為大鼠ESH肉瘤細(xì)胞外基質(zhì)提取物，富含IV型膠原，其成分與基底膜十分相似，可代替天然基底膜?？衫脙?nèi)皮細(xì)胞在matrigel上爬行、融合形成小管來觀察研究藥物對(duì)血管生成的影響。
方法將matrigel鋪到96孔板上，80μl/孔，37℃，放置30min使其凝固。將內(nèi)皮細(xì)胞分別給予含有不同濃度藤黃酸的培養(yǎng)基作用30分鐘，然后每孔加入1×105個(gè)/ml內(nèi)皮細(xì)胞懸液100μl。于5％CO2孵箱37℃培養(yǎng)8小時(shí)后在相差顯微鏡(×400)下觀察小管生成情況并拍照，每孔選擇五個(gè)不同部位，計(jì)數(shù)小管生成量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果與評(píng)價(jià)內(nèi)皮細(xì)胞在matrigel中生長8小時(shí)后，細(xì)胞會(huì)由原來的多角形變成長梭形，并向凝膠基質(zhì)中延伸生長，呈線形排列而形成管狀結(jié)構(gòu)，多個(gè)小管相互連接形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。結(jié)果見圖4(其中A為對(duì)照組；B為0.5×10-6mol/L GA組；C為1×10-6mol/LGA組；D為2×10-5mol/L GA組)。與對(duì)照組相比，給予藤黃酸后內(nèi)皮細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)受到破壞，說明藤黃酸可以抑制內(nèi)皮細(xì)胞小管生成，并呈劑量依賴性。
實(shí)施例5藤黃酸抑制腫瘤細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)。
目的和原理通過酶聯(lián)免疫原理，檢測藥物對(duì)細(xì)胞分泌VEGF的影響。
方法肺癌細(xì)胞A549(3×105/孔)接到六孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，給予不同濃度藤黃酸(分別為0，0.5μM，1μM，2μM)，12h后收集細(xì)胞上清，使用ELISA試劑盒，測定VEGF蛋白的含量。
結(jié)果與評(píng)價(jià)將測得的VEGF的濃度/細(xì)胞數(shù)作為評(píng)價(jià)藥物對(duì)VEGF分泌影響的指標(biāo)，結(jié)果見圖5。與對(duì)照組(即GA為0)相比，藤黃酸可以抑制腫瘤細(xì)胞分泌VEGF，并呈劑量依賴性。
權(quán)利要求
1.藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制腫瘤血管生成的藥物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制關(guān)節(jié)炎病變組織的血管生成的藥物。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于關(guān)節(jié)炎是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制視網(wǎng)膜病病變組織的血管生成的藥物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于視網(wǎng)膜病是糖尿病性視網(wǎng)膜病、視網(wǎng)膜靜脈閉塞或者早熟性視網(wǎng)膜病。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制血管瘤病變組織的血管生成的藥物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于抑制血管生成藥物為抑制銀屑病病變組織的血管生成的藥物。
全文摘要
本發(fā)明公開了藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了藤黃酸在制備抑制血管生成藥物中的應(yīng)用，特別是在制備抑制腫瘤、關(guān)節(jié)炎、視網(wǎng)膜病、血管瘤、銀屑病等疾病的病變組織血管生成的藥物中的應(yīng)用。根據(jù)本發(fā)明提供的應(yīng)用，可將藤黃酸制備成抑制血管生成的藥物，擴(kuò)大了藤黃酸的應(yīng)用領(lǐng)域。
文檔編號(hào)A61P17/00GK101049327SQ200710022230
公開日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月10日
發(fā)明者郭青龍, 楊嵐, 尤啟冬, 盧娜, 顧紅燕, 齊琦 申請(qǐng)人:中國藥科大學(xué)