專(zhuān)利名稱(chēng)：L－絲氨酸在制備治療腦缺血的藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及L-絲氨酸的新醫(yī)藥用途。
背景技術(shù)：
腦血管病是由各種血管源性腦病變引起的腦功能障礙，腦卒中(又稱(chēng)中風(fēng))是急性腦循環(huán)障礙迅速導(dǎo)致局限性或彌漫性腦功能缺損的臨床事件。腦卒中包括缺血性和出血性卒中，前者占70％。其主要特征是病變血管支配區(qū)局灶性神經(jīng)功能缺損，如意識(shí)障礙、偏癱、偏盲、偏身感覺(jué)障礙及失語(yǔ)等。據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，我國(guó)腦卒中發(fā)病率為120～180/10萬(wàn)人，每年新發(fā)卒中大于150萬(wàn)人，腦卒中死亡率世界第二位(死亡率80～120/10萬(wàn)人)，由此，每年因腦卒中死亡人數(shù)約120萬(wàn)。如此高的腦卒中發(fā)病率、死亡率及其相當(dāng)驚人的醫(yī)療費(fèi)，給社會(huì)和家庭造成了沉重的負(fù)擔(dān)。針對(duì)缺血性腦卒中，目前除溶栓治療有肯定的療效外，神經(jīng)保護(hù)藥物一直未能顯示確定的臨床效果。因此，缺血性卒中防治方面的研究極需創(chuàng)新性研究思路與研究方法。
研究表明，腦缺血后，在缺血缺氧性腦損傷發(fā)生發(fā)展的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中，神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞大量釋放谷氨酸等興奮性氨基酸，而重?cái)z取減少，細(xì)胞外間隙谷氨酸堆積，興奮性氨基酸/抑制性氨基酸比例大大增加，激活興奮性氨基酸受體，引起興奮性神經(jīng)毒性被認(rèn)為是極其關(guān)鍵的機(jī)制，并且與其它機(jī)制如胞內(nèi)鈣超載、自由基及一氧化氮生成增加等相關(guān)聯(lián)，最后引起急性或遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，損傷腦組織。腦缺血后治療的成功與否，取決于能否及時(shí)建立再灌注和有效地保護(hù)神經(jīng)元免受缺血缺氧損傷，神經(jīng)保護(hù)劑和溶栓治療的聯(lián)合應(yīng)用，被認(rèn)為是一條較為合理的解決方法。神經(jīng)保護(hù)劑能提高神經(jīng)細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受性，延長(zhǎng)溶栓治療時(shí)間窗，為有效建立再灌注爭(zhēng)取時(shí)間，還能阻止或減輕溶栓治療帶來(lái)的再灌注損傷。即使對(duì)于喪失溶栓治療時(shí)機(jī)的病人，使用神經(jīng)保護(hù)劑，還可保護(hù)缺血半影區(qū)內(nèi)的神經(jīng)元，抑制遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。拮抗或抑制谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性以保護(hù)腦組織成為這方面治療的一個(gè)重要切入點(diǎn)。然而，目前興奮性氨基酸受體阻斷劑或釋放抑制劑對(duì)缺血腦損傷的治療效果并不理想，一是治療時(shí)間窗窄，二是潛在的神經(jīng)精神方面的副作用較大。我們從全新的角度入手，激動(dòng)腦內(nèi)抑制性氨基酸-甘氨酸受體，降低神經(jīng)元的興奮性，抑制谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性，從而起到保護(hù)大腦、抗缺血缺氧性腦損傷的作用，以治療缺血性中風(fēng)等引起缺血缺氧性腦損傷的一些疾病。有研究報(bào)道激動(dòng)γ-氨基丁酸(GABA)受體，在整體動(dòng)物模型上能抑制興奮性神經(jīng)毒性，并對(duì)缺血大腦有很好的保護(hù)作用。
中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存在γ-氨基丁酸能和甘氨酸(Gly)兩類(lèi)抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)。通常認(rèn)為GABA遞質(zhì)系統(tǒng)在腦內(nèi)發(fā)揮主要作用，而Gly能遞質(zhì)系統(tǒng)主要在脊髓內(nèi)發(fā)揮作用(徐天樂(lè)。中樞甘氨酸受體分子特性的研究。生理科學(xué)進(jìn)展，2000，31(4)373-380)。然而，近年來(lái)的研究表明，腦內(nèi)不僅存在一些Gly能神經(jīng)元，Gly受體的分布更是非常廣泛?，F(xiàn)有的研究資料顯示從腦干到大腦皮質(zhì)多處(如中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、下丘腦、海馬、紋狀體、伏核、杏仁核、大腦皮質(zhì))有功能性Gly受體的分布。因此，Gly能抑制性神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)、Gly受體及配體在腦內(nèi)的作用越來(lái)越受到人們的關(guān)注。研究表明，在腦內(nèi)成熟的神經(jīng)元，使用Gly可引起神經(jīng)元膜的超極化。這樣即會(huì)降低神經(jīng)元的興奮性，并且阻止NMDA受體通道中Mg2+的移出，抑制其通道的開(kāi)放，抑制谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的興奮作用。腦缺血時(shí)使用，可望抑制谷氨酸等興奮性氨基酸對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性，起到腦神經(jīng)保護(hù)作用。
根據(jù)這一設(shè)想，我們研究比較了甘氨酸(Glycine)、牛磺酸(Taurine)、β-丙氨酸(β-alanine)、L-絲氨酸(L-serine)、L-α-丙氨酸(L-α-alanine)等五種甘氨酸受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。在五種甘氨酸受體激動(dòng)劑中，L-serine的抗缺血腦損傷效果最佳；其對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用具有劑量依賴(lài)性；L-serine的作用可能與激活腦內(nèi)的甘氨酸受體，抑制缺血損傷后神經(jīng)元的興奮性毒性，阻止神經(jīng)元的凋亡及壞死有關(guān)。
在急性缺血性腦卒中的治療中，采用藥物或干預(yù)措施干擾缺血瀑布反應(yīng)的各個(gè)環(huán)節(jié)、延長(zhǎng)神經(jīng)元存活稱(chēng)為神經(jīng)保護(hù)。急性缺血導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，并導(dǎo)致一系列缺血瀑布反應(yīng)，包括神經(jīng)細(xì)胞膜去極化，興奮性氨基酸釋放增加，鈣離子通過(guò)NMDA/AMPA受體、代謝性谷氨酸受體和電壓依賴(lài)性鈣通道等大量進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，激活蛋白酶、脂酶、各種激酶、核酸酶和一氧化氮(NO)合酶，自由基生成增加，破壞細(xì)胞的正常結(jié)構(gòu)和功能。同時(shí)，再灌注伴隨的炎癥反應(yīng)、白細(xì)胞的粘附和浸入、細(xì)胞因子作用等將進(jìn)一步加劇缺血后的腦組織損害。上述過(guò)程不僅引起神經(jīng)元的急性變性壞死，還啟動(dòng)細(xì)胞凋亡過(guò)程，引起遲發(fā)性神經(jīng)元死亡。正因?yàn)槠洳±砩頇C(jī)制極為復(fù)雜，因此治療難度極大。迄今報(bào)道已有50多種神經(jīng)保護(hù)藥物在缺血性卒中患者中進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，但卻沒(méi)有一種藥物取得令人滿(mǎn)意的療效。神經(jīng)保護(hù)劑臨床試驗(yàn)失敗的原因眾多，目前認(rèn)為主要原因有不良反應(yīng)重；研究類(lèi)型、樣本大小和觀察指標(biāo)不恰當(dāng)；治療劑量和療程不合適；藥代動(dòng)力學(xué)和藥效動(dòng)力學(xué)不佳；治療時(shí)間窗狹窄等。
與大量的外源性藥物相比，近年來(lái)一些內(nèi)源性化合物如白蛋白、胞二磷膽堿，促紅細(xì)胞生成素等在預(yù)試驗(yàn)中取得了一定的效果，引起研究者廣泛關(guān)注和深層次的思考。一方面這些內(nèi)源性物質(zhì)，機(jī)體在正常情況下就可產(chǎn)生，外源性使用一般不至于產(chǎn)生嚴(yán)重的不良反應(yīng)；另一方面，在急性缺血損傷的情況下，這些物質(zhì)會(huì)反應(yīng)性釋放增加，這可能是機(jī)體缺血應(yīng)激狀態(tài)下被迫進(jìn)行的一種自我保護(hù)機(jī)制。
L-絲氨酸雖屬于非必需氨基酸，但具有許多重要的生理功能和作用，因此，在醫(yī)藥、食品、化妝品中均有較為廣泛的應(yīng)用。但迄今為止沒(méi)有在針對(duì)腦缺血方面應(yīng)用的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種L-絲氨酸的新醫(yī)藥用途，是L-絲氨酸在制備治療腦缺血的藥物中的應(yīng)用L-絲氨酸的制劑類(lèi)型包括特別注射劑或輸液制劑、包括緩釋或控釋藥物制劑，包括腸腔給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑。
我們進(jìn)行了后述有關(guān)L-絲氨酸抗腦缺血/再灌注損傷和神經(jīng)組織損傷的實(shí)驗(yàn)研究，證實(shí)了L-絲氨酸具有明確的抗腦缺血損傷和神經(jīng)組織損傷的作用，為其作為一種新型抗中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷藥物及其臨床應(yīng)用提供了較完整的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
對(duì)于L-絲氨酸抗腦缺血作用，通過(guò)大鼠局灶性腦缺血模型，得到以下結(jié)論I.五種甘氨酸受體激動(dòng)劑中，除牛磺酸外，L-絲氨酸可明顯改善大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)行為障礙，減少腦梗死體積。
II.MRI動(dòng)態(tài)觀察L-絲氨酸對(duì)缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響，表明L-絲氨酸可持續(xù)發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用。
III.L-絲氨酸降低缺血引起的腦組織水腫和血腦屏障(BBB)的破壞L-絲氨酸可明顯降低缺血半球的腦水含量，同時(shí)L-絲氨酸可明顯降低皮質(zhì)、皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)和半球的BBB的破壞。
IV.L-絲氨酸的作用隨劑量增加而增強(qiáng)，168mg.kg-1.12h-1時(shí)效果接近飽和。
V.L-絲氨酸可減少腦缺血再灌注后海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的變性壞死與丟失；免疫組化、Western-blot提示L-絲氨酸可抑制腦缺血損傷后凋亡相關(guān)基因(Caspase-3)的表達(dá)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，L-絲氨酸抗缺血腦損傷效果最佳；其對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用具有劑量依賴(lài)性；L-絲氨酸的作用可能與激活腦內(nèi)的甘氨酸受體，抑制缺血損傷后神經(jīng)元的興奮性毒性，阻止神經(jīng)元的凋亡及壞死有關(guān)。至此L-絲氨酸適用于制成藥物制劑，可制成緩釋或控釋藥物制劑；可制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；可制成注射制劑或輸液制劑；也可與其它藥物組成復(fù)方藥物制劑。以上藥物制劑有明確的神經(jīng)保護(hù)作用，可用于制成治療各種神經(jīng)退化或損傷性疾病的藥物制劑，例如用于中風(fēng)性腦損傷、老年癡呆和多種硬化癥等的治療。
根據(jù)這一設(shè)想，我們研究比較了甘氨酸(Glycine)、?；撬?Taurine)、β-丙氨酸(β-alanine)、L-絲氨酸(L-serine)、L-α-丙氨酸(L-α-alanine)等五種甘氨酸受體激動(dòng)劑對(duì)大鼠大腦中動(dòng)脈局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。在五種甘氨酸受體激動(dòng)劑中，L-serine的抗缺血腦損傷效果最佳；其對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用具有劑量依賴(lài)性；L-serine的作用可能與激活腦內(nèi)的甘氨酸受體，抑制缺血損傷后神經(jīng)元的興奮性毒性，阻止神經(jīng)元的凋亡及壞死有關(guān)。
研究證明，激動(dòng)甘氨酸受體的五種抑制性氨基酸具有不同程度的抗缺血腦損傷作用，其中以L-serine的作用最佳。局灶性腦缺血再灌注后，使用L-serine治療，可以明顯縮小大鼠的腦梗死體積，改善神經(jīng)行為學(xué)癥狀，抑制腦水腫的形成，阻止缺血損傷后神經(jīng)元的變性、壞死及神經(jīng)元凋亡。L-serine的這種神經(jīng)保護(hù)作用可被甘氨酸受體阻斷劑士的寧所抑制，說(shuō)明L-serine的作用確實(shí)是通過(guò)激動(dòng)腦內(nèi)甘氨酸受體而實(shí)現(xiàn)的。
L-serine抗腦缺血再灌注損傷的可能機(jī)制是提高腦內(nèi)抑制性氨基酸濃度，逆轉(zhuǎn)腦缺血時(shí)興奮性氨基酸/抑制性氨基酸比例失調(diào)，激動(dòng)甘氨酸受體，降低神經(jīng)元的興奮性，抑制谷氨酸對(duì)神經(jīng)元的興奮性毒性，減少缺血半暗區(qū)Caspase-3的表達(dá)，減少神經(jīng)元的急性壞死和遲發(fā)性死亡，從而減輕缺血再灌注帶來(lái)的損傷，保護(hù)腦組織。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1是驗(yàn)正本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)中缺血2h再灌注24h各組大鼠腦片TTC染色例圖。
注梗死區(qū)壞死組織呈蒼白色，而正常腦組織呈紅色，梗死區(qū)域與大腦中動(dòng)脈支配的腦區(qū)基本一致，主要位于皮質(zhì)及紋狀體區(qū)。L-絲氨酸組、牛磺酸組各層面腦片較其它處理組相比，梗死區(qū)域顯得較小。a假手術(shù)組；b?；撬峤M；cL-絲氨酸組；d甘氨酸組；eL-α-丙氨酸組；fβ-丙氨酸組；g腦缺血對(duì)照組。
圖2是缺血腦梗死典型MRI改變示圖注在MCAO(大腦中動(dòng)脈栓塞)后2小時(shí)，DWI(Diffusionweightedimaging，彌散加權(quán)像)上就可以反映出缺血部位高密度信號(hào)，此時(shí)L-絲氨酸組(L-ser)與對(duì)照組(Vehicle)的腦梗死體積并沒(méi)有明顯差別；但在MCAO后5小時(shí)，可觀測(cè)到L-絲氨酸組腦梗死體積較對(duì)照組相比明顯減少。在MCAO后2小時(shí)，T2WI(T2Weighted imaging，T2加權(quán)像)上并沒(méi)有明顯的信號(hào)改變；5小時(shí)，可見(jiàn)缺血部位的高密度信號(hào)，此時(shí)L-絲氨酸組腦梗死體積明顯較對(duì)照組縮小；在MCAO后24、48小時(shí)，對(duì)照組腦梗死體積持續(xù)增加，而L-絲氨酸組可持續(xù)發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用，腦梗死體積維持不變。
圖3是缺血2h再灌注24h各組大鼠尼氏染色圖注A對(duì)照組雙側(cè)海馬，圖片右側(cè)為缺血區(qū)；BL-絲氨酸組雙側(cè)區(qū)海馬，圖片右側(cè)為缺血區(qū)，；C假手術(shù)組(sham-operated)雙側(cè)區(qū)海馬；D對(duì)照組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)；EL-絲氨酸組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)；F假手術(shù)組缺血側(cè)海馬CA1區(qū)；G對(duì)照組缺血側(cè)皮質(zhì)；HL-絲氨酸組組缺血側(cè)皮質(zhì)；I假手術(shù)組缺血側(cè)皮質(zhì)。除假手術(shù)組外，尼氏染色顯示對(duì)照組、L-絲氨酸組大鼠缺血側(cè)大腦半球不同程度的著色變淡，紋狀體、海馬及大腦皮層部神經(jīng)元縮小變形，可見(jiàn)核溶解、核碎裂、核固縮，缺血周邊區(qū)受損神經(jīng)元呈現(xiàn)細(xì)胞腫脹，尼氏體消失等神經(jīng)元變性的特征(圖3)。對(duì)照組缺血側(cè)海馬組織有明顯損傷，主要表現(xiàn)在CA1、CA2區(qū)大量錐體細(xì)胞缺失，殘留的錐體細(xì)胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失(圖3A、D)；缺血側(cè)皮質(zhì)部著色明顯變淡，神經(jīng)元縮小變形，可見(jiàn)核溶解、核碎裂、核固縮，尼氏體消失等神經(jīng)元變性的特征(圖3G)。L-絲氨酸組缺血側(cè)海馬錐體細(xì)胞排列比較整齊致密，胞核飽滿(mǎn)，核仁較清晰，僅有少量散在的CA1區(qū)錐體細(xì)胞缺失或胞核固縮(圖3B、E)；缺血側(cè)皮質(zhì)部神經(jīng)元形態(tài)基本完整，胞核較飽滿(mǎn)，核仁清晰，尼氏小體豐富(圖3H)。假手術(shù)組海馬組織無(wú)明顯損傷，CA1區(qū)錐體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，可見(jiàn)淺染的突起，錐體細(xì)胞2-3層，排列整齊致密，形態(tài)完整，尼氏小體豐富(圖3C、F)；皮質(zhì)部神經(jīng)元形態(tài)無(wú)明顯異常，排列較緊密，胞核飽滿(mǎn)，核仁清晰(圖3I)。
圖4是大鼠Caspase-3免疫組化圖注A頂葉皮層缺血半暗帶區(qū)，方框區(qū)域?yàn)檫x擇計(jì)數(shù)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域；BL-絲氨酸組，有少量的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞位于正常神經(jīng)元之間；C對(duì)照組，可見(jiàn)大量的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞，有少量的正常神經(jīng)元；D假手術(shù)組，多見(jiàn)正常神經(jīng)元，偶見(jiàn)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。黑色箭頭所指為正常神經(jīng)元，紅色箭頭所指為Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞。
圖5是大鼠Caspase-3 Western-bolt分析圖注β-actin作為內(nèi)參，在各組中有較均一的表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)處理組Caspase-3條帶深淺不一，對(duì)照組中Caspase-3的表達(dá)明顯；L-絲氨酸組中則表達(dá)明顯下調(diào)；假手術(shù)組(sham)中，Caspase-3基本未見(jiàn)表達(dá)。
具體實(shí)施例方式一種L-絲氨酸在制備治療腦缺血的藥物中的應(yīng)用。
具體驗(yàn)正實(shí)驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)材料和方法1材料1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，清潔級(jí)，體重240-260g，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
1.2主要試劑與溶液牛磺酸(Taurine)粉劑購(gòu)自Sigma-Aldrich；甘氨酸國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-絲氨酸中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司；β-丙氨酸Sigma公司(美國(guó))；L-α-丙氨酸中國(guó)醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司；紅四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium，TTC)粉劑購(gòu)自上海靈錦精細(xì)化工有限公司；抗β-actin單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司；Cleaved Caspase-3(Asp175)兔抗鼠單克隆抗體購(gòu)自CellSignaling公司；二抗為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司SP免疫組化染色試劑盒。
2方法2.1模型制備參照Longa EZ方法并稍作改良的大腦中動(dòng)脈線栓法(middle cerebral artery occlusion，MCAO)制備大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。尼龍線插入深度平均為18.5±0.5mm(從ECA分叉處算起)。結(jié)扎固定尼龍線，縫合皮膚，栓線外留1cm線頭。2h后再灌注，勿需再次麻醉和切開(kāi)頸部，提拉栓線至有阻力時(shí)表明尼龍線頭端已達(dá)到ICA分叉切口處，血流再通。假手術(shù)組栓線只插入10cm，其余步驟同模型組。動(dòng)物蘇醒后出現(xiàn)血管栓塞的同側(cè)Hornor征和對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)障礙即為模型成功。
2.2神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分參考Zea Longa 6分制評(píng)分。評(píng)分標(biāo)淮0分無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分不能完全伸展對(duì)側(cè)前爪；2分向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分向?qū)?cè)傾倒；4分不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失；5分死亡。
2.3腦梗死灶測(cè)量大鼠迅速取腦，去除嗅腦、小腦和低位腦干，冰凍10min，從額極到枕極作2mm厚度的連續(xù)額狀切片，切片置0.5％TTC溶液中，于37℃避光孵育30分鐘，間隔5分鐘搖動(dòng)切片。再將切片置于4％多聚甲醛緩沖液中固定。24h后拍照并輸入計(jì)算機(jī)，用Image J&Scion Image圖像處理軟件計(jì)算梗死面積(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色區(qū)為梗死區(qū))，梗死面積＝非缺血側(cè)半球面積-缺血側(cè)半球未梗死區(qū)面積，各腦片梗死面積之和乘以厚度(2mm)為總的梗死體積，腦梗死灶體積與全腦體積比為腦梗死體積百分比。
2.4腦含水量測(cè)定缺血2h再灌注24h后，將大鼠迅速斷頭取腦，用干濕法測(cè)腦組織含水率，在冰塊上迅速取腦，將取出的腦組織放在一個(gè)內(nèi)有生理鹽水濕潤(rùn)的定性濾紙的培養(yǎng)皿中，以防水分蒸發(fā)，同時(shí)快速去掉腦皮質(zhì)表面的軟腦膜和凝血塊。用分析天秤準(zhǔn)確稱(chēng)取兩個(gè)半球的重量，然后置于100℃烤箱24小時(shí)后，再次稱(chēng)重，以〔(濕重-干重)/濕重〕×100％即為相對(duì)含水量。
2.5血腦屏障通透率缺血2h再灌注22h，經(jīng)大鼠尾靜脈注射2％伊文氏藍(lán)(evans blue，EB)生理鹽水液(3ml/Kg)，循環(huán)2h后，將大鼠過(guò)度麻醉后，經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水直至右心房流出的液體無(wú)色為止，迅速斷頭取腦。從額極到枕極作2mm厚度的連續(xù)橫斷面切片，并將腦組織分為損傷側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下和健側(cè)皮質(zhì)、皮質(zhì)下4部分，在分析天平上稱(chēng)重后置入50％三氯乙酸溶液中。勻漿和離心(10000r/min，20min)，取上清液按1∶2的比例用乙醇稀釋后，采用島津UV-2450型紫外分光光度儀在λ＝620nm處比色，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得出腦組織中EB的含量，以每克濕重腦組織內(nèi)所含EB的量(μg)表示。
2.6 MRI檢查采用美國(guó)GE Healthcare 3.0T核磁共振機(jī)和肩關(guān)節(jié)正交線圈行MRI檢查。大鼠麻醉后，俯臥位，頭置于線圈中央，自主呼吸。除假手術(shù)組外，各組隨機(jī)抽取4只大鼠連續(xù)測(cè)定缺血再灌注后2h、5h(DWI，T2WI)；24h、48h(T2WI)的缺血梗死灶的動(dòng)態(tài)變化。T2WI和DWI上的梗死體積測(cè)定方法參照采用Heiland等描述，使用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件，梗死體積＝梗死面積×(層厚+間距)。
2.7數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示(x±SE)，采用Stata 8.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。兩組間比較采用t檢驗(yàn)，組間差異采用成組設(shè)計(jì)的方差分析，兩兩比較用Scheffé法。
二、結(jié)果1五種甘氨酸受體激動(dòng)劑抗局灶性腦缺血再灌注損傷的療效評(píng)價(jià)(藥物篩選)1.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分假手術(shù)組(Sham)動(dòng)物無(wú)神經(jīng)功能缺損，其它各組均有不同程度的神經(jīng)功能缺損分值。缺血2h再灌注24h后，Taurine(牛磺酸)組(Tau)、L-serine組(L-ser)與對(duì)照組(Veh)神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分具有顯著性差異(p＜0.01)；Glycine組(Gly)與對(duì)照組差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；而L-α-alanine組(L-α-Ala)、β-alanine組(β-Ala)與對(duì)照組間無(wú)顯著性差異(p＞0.05)。說(shuō)明Taurine、L-serine和Glycine能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能，似以L-serine的作用最佳。而L-α-alanine、β-alanine不能改善大鼠神經(jīng)功能(參見(jiàn)表1)。
表1五種甘氨酸受體激動(dòng)劑對(duì)神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分的影響。

注與對(duì)照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
1.2腦梗死體積的測(cè)定缺血2h再灌注24h后，行TTC染色，梗死區(qū)內(nèi)壞死組織呈蒼白色，未壞死組織呈紅色。觀測(cè)發(fā)現(xiàn)梗死區(qū)域與MCA支配的腦區(qū)基本一致，與對(duì)照組相比，各藥物組腦梗死體積及梗死百分體積均有所縮小，以L-serine作用最顯著，其次為T(mén)aurine(p＜0.05)；其它治療組與對(duì)照組的差別無(wú)顯著性意義(p＞0.05，表2、圖1)。
表2 五種甘氨酸受體激動(dòng)劑對(duì)腦梗死體積的影響

注與對(duì)照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2對(duì)L-serine藥效與藥理作用的深入研究2.1對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水量的影響表3顯示，與對(duì)照組相比，L-serine治療組腦含水量明顯降低，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，表明L-serine能抑制腦缺血再灌注損傷后腦水腫的形成。
表3 L-serine對(duì)大鼠腦含水量的影響


注與對(duì)照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.2 L-serine對(duì)血腦屏障破壞的影響結(jié)果見(jiàn)表4。從結(jié)果看，缺血后應(yīng)用L-serine可降低缺血所引起的血腦屏障破壞，尤以減少皮質(zhì)區(qū)血腦屏障破壞為主(L-serine組皮質(zhì)區(qū)EB含量較缺血對(duì)照組相比明顯減少，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)；L-serine組皮質(zhì)下區(qū)EB含量雖也所減少，但與對(duì)照組相比，尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
表4 L-serine對(duì)缺血引起的血腦屏障破壞的影響

注與對(duì)照組比較，**p＜0.01；△p＞0.05。
2.3 MRI(核磁共振)動(dòng)態(tài)觀察L-serine對(duì)缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響在MCAO后2小時(shí)，DWI上就可以反映出缺血部位高密度信號(hào)，此時(shí)測(cè)得L-serine組與對(duì)照組的腦梗死體積并沒(méi)有明顯差別；但在MCAO后5小時(shí)，可觀測(cè)到L-serine組腦梗死體積較對(duì)照組相比明顯減少(p＜0.05)。在MCAO后2小時(shí)，T2WI上并沒(méi)有明顯的信號(hào)改變；5小時(shí)，可見(jiàn)缺血部位的高密度信號(hào)，此時(shí)L-serine組腦梗死體積較之前有所減少，較對(duì)照組相比，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)；在MCAO后24、48小時(shí)，對(duì)照組腦梗死體積持續(xù)增加，而L-serine組可持續(xù)發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用，與對(duì)照組相比差別均有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)(圖2，表5)。
表5 L-serine對(duì)缺血后腦梗死體積的影響

注與對(duì)照組比較，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.4 L-serine抗局灶性腦缺血再灌注損傷的有效劑量范圍2.4.1神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分缺血2h再灌注24h后，L-serine 56mg.kg-1.12h-1劑量組神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分較對(duì)照組有所降低，但無(wú)顯著性意義(p＞0.05)；168mg.kg-1.12h-1組、504mg.kg-1.12h-1組與對(duì)照組相比，神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分顯著降低，差別都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，但這兩個(gè)劑量組之間無(wú)明顯差異。說(shuō)明168、504mg.kg-1.12h-1劑量的L-serine能明顯改善大鼠的神經(jīng)功能，并且這種作用具有劑量依賴(lài)關(guān)系，即低于56mg將不產(chǎn)生明顯作用，而高于504mg則作用趨于飽和(參見(jiàn)表6)。
表6不同劑量L-ser對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能學(xué)評(píng)分影響。


注與對(duì)照組相比，*p＜0.05；**p＜0.01。
2.4.2腦梗死體積缺血2h再灌注24h后，56mg.kg-1.12h-1劑量組TTC法測(cè)得的腦梗死體積較對(duì)照組有所降低，但差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＞0.05)，這與神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果一致；168mg.kg-1.12h-1組、504mg.kg-1.12h-1組與對(duì)照組相比，腦梗死體積顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，但這兩個(gè)劑量組之間無(wú)明顯差異。說(shuō)明L-serine 168、504mg.kg-1.12h-1兩個(gè)劑量能明顯減少局灶性腦缺血再灌注大鼠的腦梗死體積，且效果相似；但劑量在56mg.kg-1.12h-1時(shí)，還未顯示出顯著減少腦梗死體積的能力。提示L-serine減少大鼠腦缺血后梗死體積形成的作用存在著劑量依賴(lài)關(guān)系，至504mg.kg-1.12h-1劑量時(shí)效應(yīng)已達(dá)飽和程度(參見(jiàn)表7)。
表7不同劑量L-ser對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積百分比的影響。

注與對(duì)照組相比，*p＜0.05。
2.5組織形態(tài)學(xué)觀察(尼氏染色)2.5.1對(duì)神經(jīng)元數(shù)目的影響對(duì)照組海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞稀疏，有片狀缺失，有的細(xì)胞旁有空染區(qū)，可見(jiàn)核固縮，胞質(zhì)濃染，胞體變小的細(xì)胞；細(xì)胞層次不清楚，神經(jīng)元密度明顯降低。L-serine組海馬組織學(xué)特征與假手術(shù)組相似，神經(jīng)元密度較對(duì)照組相比顯著增加，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)，表明L-serine組可部分阻止大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷造成的神經(jīng)元缺失(結(jié)果見(jiàn)表8，圖3)。
表8海馬CA1區(qū)錐體層細(xì)胞密度

注與其它兩組比較，**p＜0.012.5.2對(duì)神經(jīng)元形態(tài)的影響大鼠右側(cè)MCAO2h、再灌注24h后，行尼氏染色。除假手術(shù)組外，尼氏染色顯示對(duì)照組、?；撬嶂委熃M大鼠缺血側(cè)大腦半球不同程度的著色變淡，紋狀體、海馬及大腦皮層部神經(jīng)元縮小變形，可見(jiàn)核溶解、核碎裂、核固縮，缺血周邊區(qū)受損神經(jīng)元呈現(xiàn)細(xì)胞腫脹，尼氏體消失等神經(jīng)元變性的特征。對(duì)照組缺血側(cè)海馬組織有明顯損傷，主要表現(xiàn)在CA1、CA2區(qū)大量錐體細(xì)胞缺失，殘留的錐體細(xì)胞排列松散不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞胞核固縮，核仁欠清晰，尼氏小體減少或消失；缺血側(cè)皮質(zhì)部著色明顯變淡，神經(jīng)元縮小變形，可見(jiàn)核溶解、核碎裂、核固縮，尼氏體消失等神經(jīng)元變性的特征。L-serine組缺血側(cè)海馬錐體細(xì)胞排列比較整齊致密，胞核飽滿(mǎn)，核仁較清晰，僅有少量散在的CA1區(qū)錐體細(xì)胞缺失或胞核固縮；缺血側(cè)皮質(zhì)部神經(jīng)元形態(tài)基本完整，胞核較飽滿(mǎn)，核仁清晰，尼氏小體豐富。假手術(shù)組海馬組織無(wú)明顯損傷，CA1區(qū)錐體細(xì)胞核大而圓，核仁明顯，可見(jiàn)淺染的突起，錐體細(xì)胞2-3層，排列整齊致密，形態(tài)完整，尼氏小體豐富；皮質(zhì)部神經(jīng)元形態(tài)無(wú)明顯異常，排列較緊密，胞核飽滿(mǎn)，核仁清晰(如圖3所示)。
2.6凋亡相關(guān)基因Caspase-3(活化型)的表達(dá)2.6.1免疫組化檢測(cè)每例動(dòng)物取連續(xù)的6張切片，在10×40倍光鏡下記數(shù)頂葉皮層缺血半暗帶區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其平均值為每只的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。對(duì)照組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較多，僅有少量的正常神經(jīng)元；L-serine治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組明顯減少(p＜0.01，表9，圖4)，較少量的陽(yáng)性細(xì)胞位于正常神經(jīng)元之間。本實(shí)驗(yàn)提示L-serine可使凋亡相關(guān)基因Caspase-3表達(dá)明顯下調(diào)，說(shuō)明L-serine可以部分抑制腦缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡，減少神經(jīng)元遲發(fā)性死亡，從而發(fā)揮腦缺血保護(hù)作用。
表9高倍鏡下皮層缺血半暗帶區(qū)Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)

注與其它兩組比較，**p＜0.012.6.2 Western-blot分析β-actin作為內(nèi)參，在各組中有較均一的表達(dá)。各實(shí)驗(yàn)處理組Caspase-3條帶深淺不一，對(duì)照組中Caspase-3的表達(dá)明顯；L-serine組中則表達(dá)明顯下調(diào)；假手術(shù)組中，Caspase-3(半胱氨酸天冬氨酸酶)基本未見(jiàn)表達(dá)。經(jīng)凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描，用四星圖像處理系統(tǒng)測(cè)定各組Caspase-3表達(dá)量與內(nèi)參表達(dá)量(β-actin)的比值，數(shù)據(jù)以x±SE表示。L-serine組與對(duì)照組相比，差別具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01，表10，圖5)。進(jìn)一步說(shuō)明L-serine可抑制大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷所誘導(dǎo)的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的表達(dá)。
表10Caspase-3表達(dá)量化圖

注與對(duì)照組比較，**p＜0.0權(quán)利要求
1.一種L-絲氨酸在制備治療腦缺血的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種L－絲氨酸在制備治療腦缺血的藥物中的應(yīng)用。L－絲氨酸治療腦缺血效果佳，適用于制成藥物制劑，可制成緩釋或控釋藥物制劑；可制成腔腸給藥、噴霧給藥、透皮吸收或口服的藥物制劑；可制成注射制劑或輸液制劑；也可與其它藥物組成復(fù)方藥物制劑。
文檔編號(hào)A61P9/10GK101049295SQ20071002205
公開(kāi)日2007年10月10日 申請(qǐng)日期2007年4月28日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月28日
發(fā)明者姜正林, 王國(guó)華 申請(qǐng)人:南通大學(xué)