專利名稱：一種海洋動物的抗腫瘤有效組分的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗腫瘤有效組分的制備方法，特指一種海洋動物的抗腫瘤有效組分的制備方法。
背景技術(shù)：
腫瘤現(xiàn)已成為嚴(yán)重威脅人類生命健康且較廣泛的疾病，全世界每年有新發(fā)惡性腫瘤900萬人，而死于該病的達(dá)700萬人。中國有13億人口，每年大約有160萬新發(fā)惡性腫瘤患者，每年大約有130萬人死于癌癥，因此癌癥正超過心腦血管疾病而成為第一死亡原因。腫瘤的防治已成為世界范圍內(nèi)廣泛重視的課題，世界各國每年投入了大量人力、物力進(jìn)行研究，但迄今為止，對其病因及發(fā)病機(jī)理仍不十分清楚，治療方法尚無重大突破，不少人已經(jīng)開始把目光轉(zhuǎn)向廣闊的海洋。海洋生物有著不同于陸地生物的特殊生存環(huán)境，其中蘊(yùn)藏著大量結(jié)構(gòu)新穎、化學(xué)性質(zhì)特殊、生物活性極其強(qiáng)烈的物質(zhì)，在抗腫瘤方面顯示了巨大的潛力。目前研究主要集中在軟體動物(蔣慶鋒，周有駿，王金政.海洋抗腫瘤藥物研究進(jìn)展.[J]中國海洋藥物，2004，(06).)以及海藻類(專利CN1690076A)，抗腫瘤機(jī)理和作用效果各不相同。
石蜐Pollicipes mitella(Linnaeus，1758)又稱龜足，屬節(jié)肢動物門(Arthropoda)甲殼綱(Crustacea)蔓足亞綱(Cirripedia)。在《本草綱目》、《綱目拾遺》、《海南解語》中均有記載。其性平、味甘，無毒，具有補(bǔ)益、利尿、消積等作用，對抗腫瘤方面的研究還未展開。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目是找到一種海洋動物具有抗腫瘤作用的有效組分的制備方法。
所述制備方法為以石蜐為原料，經(jīng)藥材前處理、浸膏提取、有效成分的分離等處理過程。具體為(1)藥材前處理取石蜐解凍、洗凈，逐一取肉，用組織搗碎勻漿機(jī)處理5-8min，濾去上清液，得前處理藥材；(2)浸膏提取將前處理藥材加30％-60％乙醇溶液，攪拌數(shù)分鐘，超聲提取30-60min，過濾，提取液備用。濾質(zhì)再加30％-60％乙醇溶液，超聲提取30-60min，冷浸10-12h，濾出提取液，并用30％-60％乙醇溶液洗滌殘?jiān)?-3次，合并兩次提取液及洗滌液，用離心機(jī)離心3-5min，取上清液回收乙醇溶液，濃縮，得浸膏。
(3)有效成分的分離將浸膏用水稀釋(7-10倍水量)后，上大孔樹脂柱洗脫，上樣后保留樣品1-2h。依次用純水、30％乙醇溶液、70％乙醇溶液進(jìn)行洗脫，待洗脫液清澈、無氣味后換用下一種洗脫液，分別收集合并各組洗脫液，濃縮，即可。
本發(fā)明優(yōu)勢在于1、找到了一種具有抗腫瘤作用的海洋動物目前腫瘤疾病逐漸成為對人類健康的威脅最大的疾病之一，而其尚未找到很好治療這一疾病的方法，并在不斷尋求新的物種、新的化合物來抵抗腫瘤。本發(fā)明找到了一種具有抗腫瘤作用的海洋動物——石蜐。
2、找到了這種海洋動物抗腫瘤的有效成分的制備方法經(jīng)過抗腫瘤生物活性篩選試驗(yàn)，找到了石蜐提取物抗腫瘤活性成分的制備方法。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一取石蜐解凍、洗凈，逐一取肉，用組織搗碎勻漿機(jī)處理5min，濾去上清液，得前處理藥材。取200g前處理藥材加30％乙醇溶液300ml，攪拌1min，超聲提取30min，過濾，提取液備用。濾質(zhì)再加30％乙醇溶液200ml，超聲提取30min，冷浸10h，濾出提取液，并用30％乙醇溶液洗滌殘?jiān)?次，合并兩次提取液及洗滌液，用離心機(jī)離心3min(2500轉(zhuǎn)/min)，取上清液，回收乙醇溶液，濃縮，得浸膏5g。
將5g浸膏用50ml水稀釋后，上大孔樹脂柱洗脫，上樣后保留樣品1h。先用純水洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共400ml，濃縮至10ml，得樣品A1。再用30％乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共280ml，濃縮至10ml，得樣品B1。再用70％乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共250ml，濃縮至10ml，得樣品C1。最后用無水乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共250ml，濃縮至10ml，濃縮液純清，經(jīng)薄層層析點(diǎn)樣證明無溶質(zhì)故舍棄。
實(shí)施例二取石蜐解凍、洗凈，逐一取肉，用組織搗碎勻漿機(jī)處理6min，濾去上清液，得前處理藥材。取200g前處理藥材加40％乙醇溶液300ml，攪拌1min，超聲提取40min，過濾，提取液備用。濾質(zhì)再加40％乙醇溶液200ml，超聲提取40min，冷浸12h，濾出提取液，并用40％乙醇溶液洗滌殘?jiān)?次，合并兩次提取液及洗滌液，用離心機(jī)離心5min(2500轉(zhuǎn)/min)，取上清液，回收乙醇溶液，濃縮，得浸膏8g。
將8g浸膏用60ml水稀釋后，上大孔樹脂柱洗脫，上樣后保留樣品1h。先用純水洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共450ml，濃縮至10ml，得樣品A2。再用30％乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共300ml，濃縮至10ml，得樣品B2。再用70％乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共300ml，濃縮至10ml，得樣品C2。最后用無水乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共300ml，濃縮至10ml，濃縮液純清，經(jīng)薄層層析點(diǎn)樣證明無溶質(zhì)故舍棄。
實(shí)施例三取石蜐解凍、洗凈，逐一取肉，用組織搗碎勻漿機(jī)處理8min，濾去上清液，得前處理藥材。取200g前處理藥材加60％乙醇溶液300ml，攪拌1min，超聲提取60min，過濾，提取液備用。濾質(zhì)再加60％乙醇溶液200ml，超聲提取60min，冷浸12h，濾出提取液，并用40％乙醇溶液洗滌殘?jiān)?次，合并兩次提取液及洗滌液，用離心機(jī)離心5min(2500轉(zhuǎn)/min)，取上清液，回收乙醇溶液，濃縮，得浸膏6g。
將6g浸膏用60ml水稀釋后，上大孔樹脂柱洗脫，上樣后保留樣品1h。先用純水洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共450ml，濃縮至10ml，得樣品A3。再用30％乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共300ml，濃縮至10ml，得樣品B3。再用70％乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共300ml，濃縮至10ml，得樣品C3。最后用無水乙醇溶液洗脫，洗脫至洗脫液清澈、無氣味，收集洗脫液共300ml，濃縮至10ml，濃縮液純清，經(jīng)薄層層析點(diǎn)樣證明無溶質(zhì)故舍棄。
實(shí)施例四抗腫瘤生物活性篩選試驗(yàn)1、篩選方法四氮唑鹽(microculture tetrozolium，MTT)還原法2、操作步驟(1)96孔板每孔加入單細(xì)胞懸液90μl?？瞻捉M只加完全培養(yǎng)基，不含細(xì)胞懸液。細(xì)胞接種后，于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。
(2)將陽性藥物(甲氨喋呤)與待測化合物各配成5個濃度梯度(5倍稀釋)，每孔加10μl，每個濃度設(shè)四個平行；陰性對照組加生理鹽水。連續(xù)培養(yǎng)48h。然后每孔加入20μl的5mg/ml MTT溶液(Sigma，生理鹽水配制)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。
(3)每孔加入50μl的三聯(lián)液(10％SDS-5％異丁醇-0.1％HCl)，37℃培養(yǎng)箱中過夜。
(4)于570nm處用酶標(biāo)儀測定OD值。
(5)按照下式計(jì)算抑制率，求IC50。

3、樣品與細(xì)胞株試藥甲氨喋呤，樣品A1、A2、A3(純水洗脫得到的樣品)、樣品B1、B2、B3(30％醇洗脫得到的樣品)、樣品C1、C2、C3(70％醇洗脫得到的樣品)。
細(xì)胞株人白血病細(xì)胞株CCRF-CEM，肺癌細(xì)胞株A549。
4、試驗(yàn)結(jié)果

對照品甲氨喋呤對人白血病細(xì)胞株CCRF-CEM和肺癌細(xì)胞株A549的IC50分別為0.41μg/ml和0.29μg/ml5、結(jié)論在三種實(shí)施例中，石蜐提取物C1、C2、C3組分的IC50都分別優(yōu)于A和B組分，且實(shí)施例二所得到的浸膏最多，C2組分對人白血病細(xì)胞株CCRF-CEM和人肺癌細(xì)胞株A549的生長抑制活性也最高。
權(quán)利要求
1.一種海洋動物的抗腫瘤有效組分的制備方法，其特征是以石蚴為原料，經(jīng)藥材前處理、浸膏提取、有效成分的分離的處理過程而制備得到抗腫瘤有效組分。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種海洋動物的抗腫瘤有效組分的制備方法，其特征是(1)藥材前處理取石蚴解凍、洗凈，逐一取肉，用組織搗碎勻漿機(jī)處理5-8min，濾去上清液，得前處理藥材；(2)浸膏提取將前處理藥材加30％-60％乙醇溶液，攪拌，超聲提取30-60min，過濾，提取液備用；過濾后得到的物質(zhì)再加30％-60％乙醇溶液，超聲提取30-60min，冷浸10-12h，濾出提取液，并用30％-60％乙醇溶液洗滌殘?jiān)?-3次，合并兩次提取液及洗滌液，用離心機(jī)離心3-5min，取上清液回收乙醇溶液，濃縮，得浸膏；(3)有效成分的分離將浸膏用水稀釋7-10倍后，上大孔樹脂柱洗脫，上樣后保留樣品1-2h；依次用純水、30％乙醇溶液、70％乙醇溶液進(jìn)行洗脫，待洗脫液清澈、無氣味后換用下一種洗脫液，分別收集合并各組洗脫液，濃縮，即可。
全文摘要
本發(fā)明為一種海洋動物的抗腫瘤有效組分的制備方法。其以石蚴為原料，經(jīng)藥材前處理、浸膏提取、有效成分的分離等過程制備而成。其將前處理藥材加30％－60％乙醇溶液，攪拌數(shù)分鐘，超聲提取30－60min，過濾，濾質(zhì)再加30％－60％乙醇溶液，超聲提取30－60min，冷浸10－12h，濾出提取液，并用30％－60％乙醇溶液洗滌殘?jiān)?－3次，合并兩次提取液及洗滌液，用離心機(jī)離心3－5min，取上清液回收乙醇溶液，濃縮，得浸膏。再將浸膏用水稀釋，上大孔樹脂柱洗脫，上樣后保留樣品1－2h，進(jìn)行洗脫濃縮。本發(fā)明經(jīng)過抗腫瘤生物活性篩選試驗(yàn)，證明其對抗腫瘤具有明顯療效。
文檔編號A61P35/00GK101062062SQ200710022469
公開日2007年10月31日 申請日期2007年5月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月21日
發(fā)明者張朝暉, 唐清泉, 李曉波 申請人:江蘇大學(xué)