專(zhuān)利名稱(chēng)：七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白(uncouplingprotein，UCP)分子克隆。
背景技術(shù)：
線粒體的主要功能是參與能量代謝。當(dāng)線粒體進(jìn)行呼吸時(shí)，呼吸鏈傳遞電子的同時(shí)，將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到膜間隙，形成線粒體跨膜電位。質(zhì)子通過(guò)驅(qū)動(dòng)ATP合成酶合成ATP，從而回到線粒體基質(zhì)，形成氧化與磷酸化的偶聯(lián)。定位于線粒體內(nèi)膜的UCP能使線粒體膜間隙的質(zhì)子回漏到基質(zhì)中，從而降低線粒體的膜電位，使氧化與磷酸化解偶聯(lián)。目前共發(fā)現(xiàn)5個(gè)UCP家族成員，由于UCP4和UCP5與其余3個(gè)成員同源性較遠(yuǎn)，是否為UCP家族成員仍有爭(zhēng)論。
氧化磷酸化解偶聯(lián)是恒溫動(dòng)物產(chǎn)熱以維持自身體溫的機(jī)理之一。UCP1參與恒溫動(dòng)物的非顫栗性產(chǎn)熱已得到公認(rèn)(Enerback S.et.al.Nature 38790-94，1997)。盡管有許多研究表明，UCP2和UCP3可能參與ATP的合成、調(diào)節(jié)活性氧(reactive oxygen spicies，ROS)的生成、參與脂肪酸的代謝等(Vidal-Puig AJ.et.al.J Biol Chem 27516258-16266，2000.ArsenijevicD.et.al.Nat Genet 26435-439，2000.Joseph JW.et.al.J Biol Chem 27951049-51056，2004.Jaburek M.et.al.J Biol Chem 27953097-53102，2004)。但是，目前它們的功能仍有爭(zhēng)論。如果我們能夠?qū)ふ业経CP進(jìn)化的祖先，明確其功能，然后沿動(dòng)物進(jìn)化路線，脊索動(dòng)物-圓口綱動(dòng)物-魚(yú)類(lèi)-兩棲類(lèi)-爬行類(lèi)-嚙齒類(lèi)-人，逐一闡明不同進(jìn)化層次動(dòng)物UCP的功能，對(duì)我們了解變溫動(dòng)物向恒溫動(dòng)物進(jìn)化過(guò)程中，UCP功能的變化，以及這種變化對(duì)變溫動(dòng)物向恒溫動(dòng)物進(jìn)化的影響，無(wú)疑是有益的。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤等(Zhang CY et al Cell 105745-755，2001.Murrav AJ et al Lancet3641786-1788，2004.Mills EM et al J Biol Chem 27727385-27392，2002)。了解七鰓鰻(圓口綱動(dòng)物)UCP的功能有助于我們更深刻理解哺乳類(lèi)和人的UCP的功能，因此，有助于我們以UCP作為靶點(diǎn)，制備治療這些疾病的藥物。
七鰓鰻屬于圓口綱動(dòng)物，在演化過(guò)程中占有重要地位。一些器官的起源與發(fā)育以及獲得性免疫的起源等，均出現(xiàn)于此進(jìn)化階段。因此，是研究這些課題的理想動(dòng)物。弄清七鰓鰻是否具有UCP，以及UCP在七鰓鰻代謝過(guò)程中的作用，將有助于我們理解七鰓鰻的代謝特點(diǎn)及生理習(xí)性。為進(jìn)一步研究在組織和器官的起源與發(fā)育以及獲得性免疫的起源打下基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克隆七鰓鰻的UCP基因并對(duì)其功能進(jìn)行研究。七鰓鰻UCP序列acgcggggac aggacgaagt cgtcaagcac tcccacactt cccactggca tctcgcttcttccaccacca ccatcacagc agcagcagca gctcgcatag gccgggctgg tctccaggcacaagcggcgc cctgctggag gaggacttct cgcccagcaa ctcgagtcgg gggagcggactggctgtgtt tcgcggactg caacaggatc gtattatgcg cttaaagagt cgcgtccccaccactcttat ggaagaagcc ctggtccaag aattctgcca aacggtccac tacagtgaaagggacgcgtt tcgggagtct tgatgagctg agaacccttt tcccatcaag atttcgggcagagtacacct acctgcatct tcatcacatc agtcccgcta ccgccaccac taccacctctaccaaccctc cgctcatttc gtgctataaa atacattcag aattaggctt ttttcacgtttgtggaaaaa aacgttttgg aaatatccgc cgcaagtcaa cataacacgc tcgcacagag
gggaaaatgg ttggtcttcg gcccacggat gttccgccga ctgcggctgt gaagttcatcggagccggca ccgcagcgtg cattgccgac ctcatcacgt tccctctgga cacggctaaagtccgcctgc aggtccaggg cgagtgccag cgcggtggag agggggcggc gcgctctgctggcgtacaat accgcggtgt gttcggcacc atcgcggcca tggtgcgcac ggagggcccgcgcagcctct acagcggcct cgtcgccggg ctgcagcggc agatgagctt cgcctcggtccgcatcggcc tctacgactc cgtcaagaac ttctacacca acggcgctga acacgcggggattgggtgcc gcctactggc cggctgcacc accggcgcga tggccgtgac ctttgcgcagcccaccgatg tggtgaaggt tcgattccag gcgcaggtga acatgctggg cacctccaagcgctacagcg gaaccatcaa tgcctacaag accatcgcac gggaggaggg cgtccgtggcctctggaaag gcactggccc caacatcacg cgcaacgcca tcgtgaactg cgcggagctcgtgacctatg acatcatcaa ggacaccatc ctcaagtaca aactgctgac tgacaacctgccctgccact tcgtgtccgc cttcggagcg ggcttctgca ccaccgttgt ggcgtctcctgtggatgtgg tgaagacgcg gtacatgaac tctgcccccg gccggtatcc cagtgccttcaactgtgcct acctcatgct gactaaagaa ggagccatgg ctttttacaa agggtttgtgccgtcgttcc tgcgcctggg ctcctggaac gtggtgatgt tcgtcacgta cgagcagctcaagcgcggca tcatgatggc caagcagtca tgggaggtgc ccttctagaa ggaggttgtgtgcggctccc caacggcccg tcgttccgtg cacgtgacca agcacgtgaa cggcggccaagtggtgcaag acgtgtcgtc ggacagaaca acattacgca cagcaaaatt ttgctcaataattattcttc ttcttcatag ggctcattgc tccagccgtt actgcccctg atctatgttttccccaaata ttaagttttt ttttgcctgt gttgctcgtc gatgtgaaac acttgctttgaaactcttta attctcgtaa gtggccaagt ttaagttgac ttgcggtgga aggaagaattcacgagttaa accccagacc aggtcagggt cctattccac caatgctctg cctttatcgtttacgccttt tgccgcatat tccaggatgt ttcgcaggca aaaataatta tttttcctattttttttttt tagtctgtac tttgagtttt tattattaaa ttgttgtgcc tttgatcgctggtcgaaatt tacttttttt ttattagtgg cagttgtaag tagtacaact gttctagtacattgattatt taaatgactt taggaggatg tcttctggtg atatttgcac agctgaggaatctttgtgct taaactttgg gcattaacca tacgaggatt ttaatttgcc ttttatcacatttgcagcag cttcaacctt tttaatgaac ttacaaccat gtgttgacca gcatttttccgggttttttt gaccttgcga cagcattgtt taactaaccg catcacttat gcacaattgtaagtagacca aaactgtaag attgctgaat ttcggacgct cggttaagtg agcaataattaatgtgtttt tcttaaggcg acagctgctg gtacaattag agtggtggac gtctttctcgaatggctgat ttatttgcgt gcgcgcgtgt ggggggtata cgactataat ttaacgtttacatttcaaac tagcgcgtgt tttctatgga tggttcacat taggccccac aaacgacagggttgaaggat atttgaattc cacattaata acttatcgtg gtggttctga atgctgatgtgttttatctc ctggtgcatg cctgagttgt gcttctctgt ggttcatttc tctgcgatggtacgtgaaaa ctaactgggt gctttgccac gtttttgaaa ctatgcaccc ccacgtgcgcgcccatcttc agtttcccaa cacagcttgc gggggcgttt tgaaaatgtt ggtttaattaaagaaacttg catgttttaa aatgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa本發(fā)明的技術(shù)解決方案七鰓鰻UCP的分子克隆提取七鰓鰻的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增UCP片段，測(cè)序，經(jīng)同源性、保守序列等分析，以證實(shí)克隆的片段為UCP。然后3’，5’-RACE克隆全長(zhǎng)序列，再次同源性、保守序列等分析，以證實(shí)克隆的為UCP。
本發(fā)明首次從七鰓鰻中克隆了UCP基因。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤等。了解七鰓鰻UCP的功能，將有助于我們更深刻理解哺乳類(lèi)和人類(lèi)UCP的功能。因此，有助于我們以UCP作為靶點(diǎn)，制備治療這些疾病的藥物。
具體實(shí)施例方式
提取七鰓鰻總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用簡(jiǎn)并引物從cDNA擴(kuò)增UCP片段，經(jīng)序列同源性比較后確定后，用3’，5’-RACE擴(kuò)增出UCP全長(zhǎng)序列。
材料與來(lái)源試劑，Trizol購(gòu)自Invitrogen公司；3’，5’-RACE試劑盒(SMARTTMRACEcDNA Amplification Kit)購(gòu)于Clontech公司；逆轉(zhuǎn)錄酶、Tag酶和pMD18-Tvector及應(yīng)用的酶類(lèi)和試劑盒，除特殊標(biāo)明外，均購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；引物合成及序列測(cè)定由上海英駿生物技術(shù)有限公司(InvitrogenBiotechnology Co.，Ltd)完成。
手術(shù)器械剪刀，彎頭小鑷等購(gòu)自江蘇思來(lái)科技有限公司。
材料及其它器材野生型七鰓鰻取自于黑龍江。Heidolph DIAX900勻漿器；BIO-RAD公司PCR儀。
實(shí)施例1、七鰓鰻組織取材實(shí)驗(yàn)用野生型七鰓鰻取自于黑龍江。用剪刀快速剪碎后放于適量的Trizol中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?br> 2、RNA的提取及逆轉(zhuǎn)錄將保存于Trizol中的七鰓鰻，用Heidolph DIAX900組織勻漿器將其充分勻漿(4檔100秒)，將勻漿液轉(zhuǎn)入潔凈的1.5ml離心管中，室溫放置5分鐘后，12000g，4℃離心5分鐘，取上清，加入200μl氯仿，強(qiáng)烈震蕩混勻，室溫放置5分鐘，12000g，4℃離心15分鐘，小心吸取上清至另一潔凈的1.5ml離心管中，加入等體積的異丙醇，混勻，室溫放置10分鐘，12000g，4℃離心10分鐘，棄上清，75％乙醇洗滌沉淀，室溫干燥，適量DEPC水溶解，紫外分光法定量。2μg RNA用于逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20μl，含2μg RNA，1mM dNTP，1U/μl RNA酶抑制劑，2.5pmol/μl Olig(dT)18引物，0.5U/μl AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，輕輕混勻，42℃ 1小時(shí)，冰上放置2分鐘，所得cDNA可用于PCR。
3、七鰓鰻UCP片段的克隆將人、小鼠、斑馬魚(yú)、鯉魚(yú)等UCP2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，尋找保守序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，上游引物為5’-GCMAAAGTSCGSCTHCAGRTCCA-3’，下游引物為5’-TAKCKBGTYTTYACYACATCCAC-3’，其中MA-C；SG-C；HA-T-C；RA-G；YC-T；KG-T；BG-T-C。
PCR為20μl反應(yīng)體系，含1μl cDNA，2mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.025U/μlTag酶，2pmol/μl上、下游引物。上游引物5’-GCMAAAGTSCGSCTHCAGRTCCA-3’，下游引物為5’-TAKCKBGTYTTYACYACATCCAC-3’，反應(yīng)條件95℃5分鐘后，95℃30秒-67℃2分鐘-72℃30秒(35個(gè)循環(huán))，72℃延伸10分鐘，電泳分析。
應(yīng)用寶生物工程(大連)有限公司提供的TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0試劑盒(按說(shuō)明書(shū)操作)切膠回收目的片段，然后與pMD18-T vector連接(應(yīng)用Takara DNA Ligation Kit)，反應(yīng)體系為pMD18-Tvector 1μl，上述PCR產(chǎn)物0.2pmol，加H2O至5μl后，加入等量(5μl)Ligation Mix，混勻，16℃反應(yīng)30分鐘，全量加入100μl Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42℃90秒后，冰上放置1分鐘，加入890μl LB培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取適量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說(shuō)明書(shū)操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對(duì)序列進(jìn)行測(cè)定。對(duì)序列進(jìn)行同源性和保守氨基酸等分析證明，我們克隆的片段屬于UCP家族成員。根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)引物，用于3’，5’-RACE，以得到UCP全長(zhǎng)序列。
4、3’，5’-RACE(SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit購(gòu)于clontech公司)第一鏈cDNA的合成對(duì)于5’-RACE-Ready cDNA的合成，在離心管中配制1μg總RNA，1μl 5’-CDS primer A，1μl SMART II A oligo，加水至體積為5μl；對(duì)于3’-RACE-Ready cDNA的合成，在離心管中配制1μg總RNA，1μl3’-CDS primer A，加水至體積為5μl；將上述2離心管混勻，70℃處理2分鐘后，冰上放置2分鐘。然后，向兩離心管中分別加入以下試劑，2μl 5×First-Strand Buffer，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μlPowerScript ReverseTranscriptase，總體積為10μl，混勻，42℃孵育1.5小時(shí)，分別加入100μl Tricine-EDTA Buffer，72℃處理7分鐘后，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> PCR41.5μlMaster Mix的配制5μl 10×Advantage 2 PCR Buffer，1μldNTP(10mM)，1μl 50×Advantage 2 Polymerase Mix，混勻備用。對(duì)于5’-RACE，在PCR管中配制2.5μl 5’-RACE-Ready cDNA，5μl UPM(10×)，1μlGSP(10μM)，序列為5’-CTGGAATCGAACCTTCACCACATC-3’，加入配好的41.5μlMaster Mix，總體積50μl，混勻。對(duì)于3’-RACE，在PCR管中配制2.5μl5’-RACE-Ready cDNA，5μl UPM(10×)，1μl GSP(10μM)，序列為5’-GTGGTGAAGGTTCGATTCCAGGC-3’，加入配好的41.5μlMaster Mix，總體積50μl，混勻。PCR反應(yīng)條件95℃5分鐘后，94℃30秒-72℃2分鐘5個(gè)循環(huán)，94℃30秒-70℃30秒-72℃2分鐘5個(gè)循環(huán)，94℃30秒-68℃30秒-72℃2分鐘25個(gè)循環(huán)，然后72℃10分鐘，電泳分析。
應(yīng)用Clontech公司提供的Nucleo Trap Gel Extraction Trial Kit(按說(shuō)明書(shū)操作)切膠回收目的片段，然后與pMD18-T vector連接(應(yīng)用TaKaRa DNALigation Kit)，反應(yīng)體系為pMD18-T vector 1μl，上述PCR產(chǎn)物0.2pmol，加H2O至5μl后，加入等量(5μl)Ligation Mix，混勻，16℃反應(yīng)30分鐘，全量加入100μl Top10大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，冰上放置30分鐘，42℃90秒后，冰上放置1分鐘，加入890μl LB培養(yǎng)基，37℃250rpm培養(yǎng)1小時(shí)，取適量菌液涂布含有X-gal，IPTG和氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。挑取白色菌斑，加入3ml含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中37℃，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。質(zhì)粒提取應(yīng)用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒，按使用說(shuō)明書(shū)操作。用Hand III和Bam HI雙酶切和PCR鑒定后，對(duì)序列進(jìn)行測(cè)定。對(duì)序列進(jìn)行同源性和保守氨基酸等分析證明，該基因?qū)儆赨CP家族成員。
七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)基因序列<110>南京大學(xué)<120>七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白基因及其應(yīng)用<160>1<210>1<211>2820<212>DNA<213>七鰓鰻(Lampetra japonica)<400>1acgcggggac aggacgaagt cgtcaagcac tcccacactt cccactggca tctcgcttct60tccaccacca ccatcacagc agcagcagca gctcgcatag gccgggctgg tctccaggca120caagcggcgc cctgctggag gaggacttct cgcccagcaa ctcgagtcgg gggagcggac180tggctgtgtt tcgcggactg caacaggatc gtattatgcg cttaaagagt cgcgtcccca240ccactcttat ggaagaagcc ctggtccaag aattctgcca aacggtccac tacagtgaaa300gggacgcgtt tcgggagtct tgatgagctg agaacccttt tcccatcaag atttcgggca360gagtacacct acctgcatct tcatcacatc agtcccgcta ccgccaccac taccacctct420accaaccctc cgctcatttc gtgctataaa atacattcag aattaggctt ttttcacgtt480tgtggaaaaa aacgttttgg aaatatccgc cgcaagtcaa cataacacgc tcgcacagag540gggaaaatgg ttggtcttcg gcccacggat gttccgccga ctgcggctgt gaagttcatc600ggagccggca ccgcagcgtg cattgccgac ctcatcacgt tccctctgga cacggctaaa660gtccgcctgc aggtccaggg cgagtgccag cgcggtggag agggggcggc gcgctctgct720ggcgtacaat accgcggtgt gttcggcacc atcgcggcca tggtgcgcac ggagggcccg780cgcagcctct acagcggcct cgtcgccggg ctgcagcggc agatgagctt cgcctcggtc840cgcatcggcc tctacgactc cgtcaagaac ttctacacca acggcgctga acacgcgggg900attgggtgcc gcctactggc cggctgcacc accggcgcga tggccgtgac ctttgcgcag960cccaccgatg tggtgaaggt tcgattccag gcgcaggtga acatgctggg cacctccaag1020cgctacagcg gaaccatcaa tgcctacaag accatcgcac gggaggaggg cgtccgtggc1080ctctggaaag gcactggccc caacatcacg cgcaacgcca tcgtgaactg cgcggagctc1140gtgacctatg acatcatcaa ggacaccatc ctcaagtaca aactgctgac tgacaacctg1200ccctgccact tcgtgtccgc cttcggagcg ggcttctgca ccaccgttgt ggcgtctcct1260gtggatgtgg tgaagacgcg gtacatgaac tctgcccccg gccggtatcc cagtgccttc1320aactgtgcct acctcatgct gactaaagaa ggagccatgg ctttttacaa agggtttgtg1380ccgtcgttcc tgcgcctggg ctcctggaac gtggtgatgt tcgtcacgta cgagcagctc1440aagcgcggca tcatgatggc caagcagtca tgggaggtgc ccttctagaa ggaggttgtg1500tgcggctccc caacggcccg tcgttccgtg cacgtgacca agcacgtgaa cggcggccaa1560gtggtgcaag acgtgtcgtc ggacagaaca acattacgca cagcaaaatt ttgctcaata1620attattcttc ttcttcatag ggctcattgc tccagccgtt actgcccctg atctatgttt1680tccccaaata ttaagttttt ttttgcctgt gttgctcgtc gatgtgaaac acttgctttg1740aaactcttta attctcgtaa gtggccaagt ttaagttgac ttgcggtgga aggaagaatt1800cacgagttaa accccagacc aggtcagggt cctattccac caatgctctg cctttatcgt1860ttacgccttt tgccgcatat tccaggatgt ttcgcaggca aaaataatta tttttcctat1920tttttttttt tagtctgtac tttgagtttt tattattaaa ttgttgtgcc tttgatcgct1980ggtcgaaatt tacttttttt ttattagtgg cagttgtaag tagtacaact gttctagtac2040attgattatt taaatgactt taggaggatg tcttctggtg atatttgcac agctgaggaa2100
tctttgtgct taaactttgg gcattaacca tacgaggatt ttaatttgcc ttttatcaca2160tttgcagcag cttcaacctt tttaatgaac ttacaaccat gtgttgacca gcatttttcc2220gggttttttt gaccttgcga cagcattgtt taactaaccg catcacttat gcacaattgt2280aagtagacca aaactgtaag attgctgaat ttcggacgct cggttaagtg agcaataatt2340aatgtgtttt tcttaaggcg acagctgctg gtacaattag agtggtggac gtctttctcg2400aatggctgat ttatttgcgt gcgcgcgtgt ggggggtata cgactataat ttaacgttta2460catttcaaac tagcgcgtgt tttctatgga tggttcacat taggccccac aaacgacagg2520gttgaaggat atttgaattc cacattaata acttatcgtg gtggttctga atgctgatgt2580gttttatctc ctggtgcatg cctgagttgt gcttctctgt ggttcatttc tctgcgatgg2640tacgtgaaaa ctaactgggt gctttgccac gtttttgaaa ctatgcaccc ccacgtgcgc2700gcccatcttc agtttcccaa cacagcttgc gggggcgttt tgaaaatgtt ggtttaatta2760aagaaacttg catgttttaa aatgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa2820
權(quán)利要求
1.一種七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白基因，其特征在于序列為acgcggggac aggacgaagtcgtcaagcac tcccacactt cccactggca tctcgcttct tccaccacca ccatcacagcagcagcagca gctcgcatag gccgggctgg tctccaggca caagcggcgc cctgctggaggaggacttct cgcccagcaa ctcgagtcgg gggagcggac tggctgtgtt tcgcggactgcaacaggatc gtattatgcg cttaaagagt cgcgtcccca ccactcttat ggaagaagccctggtccaag aattctgcca aacggtccac tacagtgaaa gggacgcgtt tcgggagtcttgatgagctg agaacccttt tcccatcaag atttcgggca gagtacacct acctgcatcttcatcacatc agtcccgcta ccgccaccac taccacctct accaaccctc cgctcatttcgtgctataaa atacattcag aattaggctt ttttcacgtt tgtggaaaaa aacgttttggaaatatccgc cgcaagtcaa cataacacgc tcgcacagag gggaaaatgg ttggtcttcggcccacggat gttccgccga ctgcggctgt gaagttcatc ggagccggca ccgcagcgtgcattgccgac ctcatcacgt tccctctgga cacggctaaa gtccgcctgc aggtccagggcgagtgccag cgcggtggag agggggcggc gcgctctgct ggcgtacaat accgcggtgtgttcggcacc atcgcggcca tggtgcgcac ggagggcccg cgcagcctct acagcggcctcgtcgccggg ctgcagcggc agatgagctt cgcctcggtc cgcatcggcc tctacgactccgtcaagaac ttctacacca acggcgctga acacgcgggg attgggtgcc gcctactggccggctgcacc accggcgcga tggccgtgac ctttgcgcag cccaccgatg tggtgaaggttcgattccag gcgcaggtga acatgctggg cacctccaag cgctacagcg gaaccatcaatgcctacaag accatcgcac gggaggaggg cgtccgtggc ctctggaaag gcactggccccaacatcacg cgcaacgcca tcgtgaactg cgcggagctc gtgacctatg acatcatcaaggacaccatc ctcaagtaca aactgctgac tgacaacctg ccctgccact tcgtgtccgccttcggagcg ggcttctgca ccaccgttgt ggcgtctcct gtggatgtgg tgaagacgcggtacatgaac tctgcccccg gccggtatcc cagtgccttc aactgtgcct acctcatgctgactaaagaa ggagccatgg ctttttacaa agggtttgtg ccgtcgttcc tgcgcctgggctcctggaac gtggtgatgt tcgtcacgta cgagcagctc aagcgcggca tcatgatggccaagcagtca tgggaggtgc ccttctagaa ggaggttgtg tgcggctccc caacggcccgtcgttccgtg cacgtgacca agcacgtgaa cggcggccaa gtggtgcaag acgtgtcgtcggacagaaca acattacgca cagcaaaatt ttgctcaata attattcttc ttcttcatagggctcattgc tccagccgtt actgcccctg atctatgttt tccccaaata ttaagtttttttttgcctgt gttgctcgtc gatgtgaaac acttgctttg aaactcttta attctcgtaagtggccaagt ttaagttgac ttgcggtgga aggaagaatt cacgagttaa accccagaccaggtcagggt cctattccac caatgctctg cctttatcgt ttacgccttt tgccgcatattccaggatgt ttcgcaggca aaaataatta tttttcctat tttttttttt tagtctgtactttgagtttt tattattaaa ttgttgtgcc tttgatcgct ggtcgaaatt tactttttttttattagtgg cagttgtaag tagtacaact gttctagtac attgattatt taaatgactttaggaggatg tcttctggtg atatttgcac agctgaggaa tctttgtgct taaactttgggcattaacca tacgaggatt ttaatttgcc ttttatcaca tttgcagcag cttcaacctttttaatgaac ttacaaccat gtgttgacca gcatttttcc gggttttttt gaccttgcgacagcattgtt taactaaccg catcacttat gcacaattgt aagtagacca aaactgtaagattgctgaat ttcggacgct cggttaagtg agcaataatt aatgtgtttt tcttaaggcgacagctgctg gtacaattag agtggtggac gtctttctcg aatggctgat ttatttgcgtgcgcgcgtgt ggggggtata cgactataat ttaacgttta catttcaaac tagcgcgtgttttctatgga tggttcacat taggccccac aaacgacagg gttgaaggat atttgaattccacattaata acttatcgtg gtggttctga atgctgatgt gttttatctc ctggtgcatgcctgagttgt gcttctctgt ggttcatttc tctgcgatgg tacgtgaaaa ctaactgggtgctttgccac gtttttgaaa ctatgcaccc ccacgtgcgc gcccatcttc agtttcccaacacagcttgc gggggcgttt tgaaaatgtt ggtttaatta aagaaacttg catgttttaaaatgtaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白基因的克隆方法，其特征在于提取整條七鰓鰻RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)已經(jīng)克隆的其它物種解偶聯(lián)蛋白基因的保守序列，設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，從cDNA擴(kuò)增解偶聯(lián)蛋白基因片段，經(jīng)序列同源性比較，確定其為解偶聯(lián)蛋白基因片段后，用3’，5’-RACE擴(kuò)增出解偶聯(lián)蛋白基因的全長(zhǎng)序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白基因在制備治療糖尿病、心血管疾病以及腫瘤疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及七鰓鰻解偶聯(lián)蛋白(uncoupling protein，UCP)分子克隆。本發(fā)明應(yīng)用簡(jiǎn)并引物和3′，5′－RACE首次從七鰓鰻中克隆了UCP基因。UCP與多種疾病相關(guān)。如，糖尿病、心血管疾病以及腫瘤。因此，以UCP作為靶點(diǎn)，可以制備治療這些疾病的藥物。
文檔編號(hào)A61P3/10GK101092621SQ200710022809
公開(kāi)日2007年12月26日 申請(qǐng)日期2007年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月22日
發(fā)明者孫國(guó)勛, 陳坤, 張辰宇, 項(xiàng)陽(yáng), 王修強(qiáng), 陳均遠(yuǎn), 張俊峰, 張紅杰, 徐威, 鄒季虹 申請(qǐng)人:南京大學(xué)