專利名稱：通過(guò)測(cè)定PPARδ激活作用篩選物質(zhì)的方法和藥劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)測(cè)定激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體5 (peroxisome proliferator activated receptor 5 ， PPAR 5 )的作用來(lái)篩選 具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，以及含有具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的化合 物的藥劑，該藥劑具有PPAR5激活作用。另外，本發(fā)明涉及一種能 專一性地增強(qiáng)線粒體功能中的解偶聯(lián)蛋白(UCP )導(dǎo)致的解偶聯(lián)呼吸 或在線粒體內(nèi)膜中質(zhì)子泄漏(以下一般稱之為質(zhì)子泄漏)的藥劑，線 粒體是使用脂肪酸和丙酮酸作為底物的能量代謝(呼吸)細(xì)胞內(nèi)的細(xì) 胞器。另外，本發(fā)明涉及抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、以及減少內(nèi)臟 積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑。
背景技術(shù)：
體內(nèi)的能量代謝調(diào)節(jié)系統(tǒng)，包括食物攝取調(diào)節(jié)系統(tǒng)和能量消耗 調(diào)節(jié)系統(tǒng)。能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)參與兩種類型的能量消耗，即用于基礎(chǔ) 代謝以便維持生命的能量消耗，和其他能量消耗。在后一種情況下的 主要能量消耗是非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱(nonshivering thermogenesis， nST),它 是產(chǎn)熱的，并且，它的功能意義是在出生之后即刻、在接觸寒冷期間 以及在冬眠結(jié)束時(shí)保持體溫等，以及通過(guò)消耗由于吃得過(guò)多而產(chǎn)生的 多余能量，從而抑制肥胖和糖脂代謝疾病等。特別是在恒溫的哺乳動(dòng) 物和烏類中，尤其是小型動(dòng)物中，nST對(duì)于保持體溫來(lái)說(shuō)是重要的。 在誘導(dǎo)nST的機(jī)制中，線粒體中的質(zhì)子泄漏，即細(xì)胞呼吸鏈的電子 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)和ATP合成的參與是重要的。在褐色脂肪組織(BAT)中，在線粒體膜中存在一種被稱為解 偶聯(lián)蛋白(UCP1)的特殊蛋白，其分子量為32kD，并且包括大約300 個(gè)氨基酸。該蛋白具有使ATP合成與褐色脂肪細(xì)胞(BA)的呼吸鏈的 電子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)解偶聯(lián)的作用。UCP1包括一種結(jié)構(gòu)域的三次重復(fù)的結(jié) 構(gòu)，該結(jié)構(gòu)域包括約100個(gè)氨基酸，并且每個(gè)結(jié)構(gòu)域具有兩個(gè)跨膜部位， 一共6個(gè)部位。所迷跨膜區(qū)構(gòu)成了線粒體膜上的通道。UCP1是轉(zhuǎn)運(yùn)質(zhì)子的栽體。由UCP1和其他成分構(gòu)成的質(zhì)子通道具 有按照電化學(xué)梯度使質(zhì)子自由穿透，以釋放熱量的功能。這就是nST. 就是說(shuō)，nST通過(guò)經(jīng)質(zhì)子通道的質(zhì)子滲透導(dǎo)致所述解偶聯(lián)，并且，所迷 解偶聯(lián)減弱了 ATP合成，激活了線粒體內(nèi)的呼吸，從而保持ATP與 ADP的比例恒定。結(jié)果，大量脂肪和糖被氧化以產(chǎn)生熱量.UCP1的生理學(xué)作用是在出生之后即刻、在接觸寒冷期間等情況下 保持體溫，并且，用轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的研究，業(yè)已證實(shí)了它參與肥胖 的抑制。在各種肥胖模型中，UCP1表達(dá)減弱這一亊實(shí)，表明了UCP1 與肥胖發(fā)生、發(fā)展和持續(xù)的相關(guān)性。例如，業(yè)已證實(shí)，在BAT減少的 轉(zhuǎn)基因小鼠中，在沒(méi)有過(guò)量進(jìn)食的情況下出現(xiàn)了肥胖(Lowell等，Nature, 366, 740-742(1993))。另外，在小鼠中觀察到了身體脂肪的減少，和 對(duì)由于高脂肪食物所導(dǎo)致的飲食誘導(dǎo)的肥胖的抗性，其中通過(guò)將UCP1 基因插入脂肪專一性基因aP2的啟動(dòng)子，強(qiáng)制所述小鼠表達(dá)大量的 UCP1 (Kopecky等，J. Clin Invest, 96, 2914-2923 ( 1995)),另夕卜， 在UCP1表達(dá)被抑制到1/3的小鼠體內(nèi)，觀察到了在暴露于寒冷的環(huán)境 時(shí)體溫保持功能的減弱、由于身體脂肪的增加而導(dǎo)致的肥胖和胰島素 抗性(Lowell B.B.等,Nature, 366, 740-742(1993))。另外，UCP1剔除 小鼠是不耐寒的(EnerbackS.等,Nature, 387, 90-94 ( 1997))。如 上文所述，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)業(yè)已了解到UCP1作為產(chǎn)熱分子在體溫調(diào)節(jié)和 能量消耗方面具有重要作用，并且與肥胖密切相關(guān)。UCP1表達(dá)的數(shù)量，主要是由核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的，而UCP1 基因表達(dá)隨cAMP濃度的提高而加強(qiáng)(齋藤等，最新醫(yī)學(xué)，52， 1095-1096 ( 1997))。大約20-40%的細(xì)胞內(nèi)能量消耗被認(rèn)為是通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的質(zhì) 子泄漏而產(chǎn)生的。另外，在具有很少BAT的成年人和其他動(dòng)物中，大 部分nST被認(rèn)為是在骨骼肌和白色脂肪組織(WAT)中產(chǎn)生的.基于 上述事實(shí)， 一直認(rèn)為UCP存在于除了 BAT以外的組織中.有兩個(gè)研究 小組在1997年連續(xù)報(bào)導(dǎo)了來(lái)自除了 BAT以外的組織的UCP2的cDNA 克隆(Fleury等，Nature Genet, 15， 269-272(1997); Gimeno等，Diabetes 46， 900-906 ( 1997))。4人UCP2表現(xiàn)出與人UCP1的59%的同源性，并且像UCP1那樣 形成了具有6個(gè)跨膜區(qū)的通道，并且它具有嘌呤核苷酸結(jié)合位點(diǎn)。UCP2 與UCP1的不同之處在于，它是在系統(tǒng)組織中廣泛表達(dá)的，在肺和胰腺 中是以特別高的濃度表達(dá)的，并且在心臟、肝臟、大腦、腎臟、睪丸、 WAT、 BAT和骨骼肌中也檢測(cè)到了表達(dá)。至于UCP2功能，在食用高脂肪飲食的小鼠體內(nèi)，觀察到在附睪 周圍的脂肪組織中UCP2基因表達(dá)的上調(diào)，不過(guò)，據(jù)報(bào)導(dǎo)，UCP2剔除 小鼠在寒冷條件下，在體溫保持功能方面是正常的(Arsenijevic D.等， NatureGenet, 26, 387-388 ( 2000))。另外，在上述UCP1剔除小鼠 中觀察到了褐色脂肪組織中UCP2的表達(dá)得到充分上調(diào)，這種現(xiàn)象被認(rèn) 為是代償作用，并且所述小鼠不耐寒(Enerback， F.等，Nature, 387, 90-94(1997))。另外，業(yè)已證實(shí)UCP2能通過(guò)改變胰腺P細(xì)胞中細(xì)胞內(nèi) A丁P濃度，抑制胰島素分泌(ZhangC-Y.等，Cell, 105, 745-755( 2001 ))。 對(duì)于糖尿病治療來(lái)說(shuō)，這是一種不利的特征.如上文所述，對(duì)于UCP2 來(lái)說(shuō)，到目前為止，與能量消耗/肥胖的關(guān)系尚未搞清楚，盡管業(yè)已證 實(shí)了其質(zhì)子通道的解偶聯(lián)功能.體內(nèi)的多余能量，最初主要是作為內(nèi)臟脂肪積累的(特別是作為 腸系膜脂肪)。與其他部位的脂肪(特別是皮下脂肪)相比，內(nèi)臟脂 肪容易受到脂肪動(dòng)員(adipokinetic)作用，快速地分解和消耗。內(nèi)臟脂肪 (肥胖)被認(rèn)為是導(dǎo)致與生活方式相關(guān)的疾病(成年人疾病)的多重 危險(xiǎn)因素。其原因是從WAT中的白色脂肪細(xì)胞(WA)中分泌的脂肪 酸通過(guò)門靜脈直接流入肝臟，促進(jìn)了胰島素耐受性和脂肪合成，其結(jié) 果是，誘導(dǎo)了糖耐受性異常、高血壓和高血脂，并且，這些疾病最終 并發(fā)導(dǎo)致動(dòng)脈硬化。因此，預(yù)計(jì)抑制內(nèi)臟脂肪的積累和減少內(nèi)臟脂肪 的積累，能有效預(yù)防與生活方式相關(guān)的疾病(如成年人的糖尿病)的 發(fā)生，并且治療所述疾病.過(guò)氣化物酶體增殖物激活的受體(PPAR)在它的結(jié)構(gòu)等方面被認(rèn) 為是核受體(核激素受體)超家族的一員.到目前為止，業(yè)已鑒定了 三種類型的PPAR亞型，這三種亞型是PPARot， PPAR5 (又稱為 NUC-1、 PPAR0或FAAR)和PPARy，并且業(yè)已克隆了它們的基因 (cDNA) (Lemberger等，Annu. Rev. Cell. Dev. Biol.， 12, 335-363(1996))。據(jù)報(bào)導(dǎo)，貝特(fibrate)藥劑對(duì)三種類型PPAR中的PPARoc具有 配體作用，在臨床上表現(xiàn)出對(duì)血清甘油三酯含量的很強(qiáng)的降低作用 (Forman等,Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 94， 4312-4317 ( 1997)),PPARv主要是在脂肪組織中表達(dá)的，并且據(jù)報(bào)導(dǎo)，PPARy是與 調(diào)控脂肪細(xì)胞分化密切相關(guān)的因子(Tontonoz等，Genes and Development, 8， 1224-1234( 1994);和Tontonoz等，Cell, 79, U47-1156 (1994))。各種類型的逸唑烷二酮衍生物，在非胰島素依賴型糖尿 病(NIDDM)的動(dòng)物模型中表現(xiàn)出降血糖作用，并且預(yù)期可以作為 NIDDM的新型治療劑，它具有胰島素抗性解除作用.最近的研究證實(shí) 了漆唑烷二酮衍生物還具有作為PPARy的配體的作用，并且能專一性 地激活PPAR y ( Lehman等，J. Biol. Chem.， 270， 12953-12956(簡(jiǎn)))。不過(guò)，尚未搞清楚PPAR5的生理學(xué)功能(Willson等，J. Med. Chem., 43 (4) ， 527-550 (2000) ) 。 W097/28149披露了一種具有 血液HDL提高作用的PPAR6配體，而WO99/04815披露了施用PPAR 5受體激活物質(zhì)能夠降低膽甾醇含量。不過(guò)，沒(méi)有說(shuō)明或暗示PPAR5 和產(chǎn)熱促進(jìn)作用與PPAR5和解偶聯(lián)蛋白之間的相關(guān)性.另外，已知諸如花生四烯酸、卡巴前列環(huán)素(carbaprostacyclin, cPGI) 、 L-165041 (4- (3- ( 2-丙基-3-羥基-4-乙酰-苯氣基)丙氧基)-苯氣基乙酸)的不飽和脂肪酸，能增強(qiáng)UCP2的表達(dá)(The Journal of Biological Chemistry, Vol.276, No.M， Issue of April 6, pp.10853-10860, 2001 )。不過(guò)，沒(méi)有有關(guān)UCP1和PPAR5之間的相關(guān)性的報(bào)導(dǎo)。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法， 以及含有所迷物質(zhì)作為有效成分的藥刑。本發(fā)明的進(jìn)一步的目的是提 供一種抗糖尿病藥劑，抗肥胖藥刑和用于減少內(nèi)臟脂肪積累或抑制內(nèi) 臟脂肪積累的藥劑。本發(fā)明的發(fā)明人關(guān)注的是由nST對(duì)體內(nèi)能量消耗調(diào)節(jié)系統(tǒng)的刺激 而產(chǎn)生的產(chǎn)熱促進(jìn)作用，他們?cè)噲D促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸，促進(jìn)BAT 線粒體中的質(zhì)子泄漏(相對(duì)nST組織而言是比較小的)，促進(jìn)WAT線粒體中的質(zhì)子泄漏，并且促進(jìn)UCP1 (解偶聯(lián)蛋白的同系物)的功能，由此提高它們的效率，本發(fā)明的發(fā)明人為了解決上迷問(wèn)題進(jìn)行了深入的研究，發(fā)現(xiàn)卡巴前列環(huán)素(cPGI: 6，9 0(-亞甲基-110(，155-二羥基^ )31汰-5￡，136-二烯-1-酸)和伊洛前列素(Iloprost， 5- ((E)-(lS，5S，6R,7R)-7-羥基-6-[(E). 。S，4RS);羥基-4-甲基-5-辛-6-烯]-雙環(huán)[3.3.0]-3-亞辛基)戊酸)(它們 是非專一性PPAR配體)，在骨骼肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞中具有UCP1表達(dá)促進(jìn)作用。這一新的發(fā)現(xiàn)與以下發(fā)現(xiàn)組合在一起貝特化合物和Wyl4643(它 們是PPARa的配體)，以及逸唑烷二酮化合物(它們是PPARy的配 體)，幾乎不表現(xiàn)UCP1表達(dá)促進(jìn)作用。根據(jù)這一組合發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人 推測(cè)PPAR 5主要參與UCP1表達(dá)促進(jìn)作用，并且他們還對(duì)具有PPAR 5激活作用的化合物做了進(jìn)一步的研究。結(jié)果，通過(guò)使用人類或嚙齒類動(dòng)物的骨骼肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞進(jìn)行 的實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)具有PPAR5激活作用的物質(zhì)表現(xiàn)出UCP1表達(dá)促進(jìn) 作用。另外，基于UCP基因的表達(dá)是由PPAR5調(diào)控這一事實(shí)，本發(fā)明 的發(fā)明人證實(shí)了可以通過(guò)測(cè)定PPAR 5激活作用，篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作 用的物質(zhì)，它能增強(qiáng)UCP1基因的表達(dá)并且促進(jìn)nST功能，因此，本發(fā)明包括以下主題(1 )篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè)定PPAR5激活作用。(2) 篩選具有促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸作用的物質(zhì)的方法，其特 征在于測(cè)定PPAR 5激活作用。(3) 篩選具有促進(jìn)線粒體內(nèi)膜質(zhì)子泄漏作用的物質(zhì)的方法，其特 征在于測(cè)定PPAR 5激活作用。(4) 篩選能增加UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的物質(zhì)的 方法，其特征在于測(cè)定PPAR5激活作用。(5) 篩選能促進(jìn)脂肪酸0氧化作用的物質(zhì)的方法，其特征在于測(cè) 定PPAR5激活作用。(6) 如上迷(1 ) - (5)中任一項(xiàng)的篩選物質(zhì)的方法，該方法利用了報(bào)導(dǎo)基因。(7) 如第(6)項(xiàng)中的篩選具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的物質(zhì)的方法，該 方法包括下面①-③的步驟① 讓具有PPAR5激活作用的物質(zhì)與能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞接 觸和/或?qū)胨黾?xì)胞，② 測(cè)定UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量，和③ 篩選能提高所述UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量的化合物。(8) 如第(7)項(xiàng)中的篩選方法，其中能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞 是脂肪細(xì)胞或骨駱肌細(xì)胞.(9) 如第(7)項(xiàng)中的篩選方法，其中能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞 是脂肪細(xì)胞。(10) 具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的藥劑，其含有具有PPAR5激活作用的 物質(zhì)作為有效成分。(11 )促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸的藥劑，其含有具有PPAR5激活 作用的物質(zhì)作為有效成分.(12) 促進(jìn)線粒體內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏的藥劑，其含有具有PPAR 5激活作用的物質(zhì)作為有效成分。(13) 提高UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的藥劑，其含 有具有PPAR 5激活作用的物質(zhì)作為有效成分。(14) 促進(jìn)脂肪酸P氧化的藥劑，其含有具有PPAR5激活作用的 物質(zhì)作為有效成分。(15) 如上述(10) - ( 14)中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPAR5 激活作用的物質(zhì)是非專一性PPAR配體或PPAR5配體.(16) 如上述(10) - ( 14)中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPAR5 激活作用的物質(zhì)是卡巴前列環(huán)素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙酰基-3-羥基 -2-丙基笨氧基)-丙氧基)笨乙酸。(17) 如(11 ) - ( 13)中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于骨骼 肌，白色脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中.(18) 如(11) - (13)中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于白色 脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中，(19) 抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有具有PPAR 5激活作用的物質(zhì)作為有效成分。(20)抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或 抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有如(10) - (18)中任一項(xiàng)的藥劑作為有效成分。附圖簡(jiǎn)述

圖1表示通過(guò)PPAR5配體之外的各種類型的測(cè)試化合物在人類脂 肪細(xì)胞中誘導(dǎo)的UCP1 mRNA表達(dá)量.圖2表示通過(guò)PPAR 5配體或各種類型的測(cè)試化合物在人類脂肪細(xì) 胞中誘導(dǎo)的UCP2 mRNA表達(dá)量。圖3表示通過(guò)PPAR 5配體或各種類型的測(cè)試化合物在人類脂肪細(xì) 胞中導(dǎo)致的游離脂肪酸&氧化作用的促進(jìn)程度。實(shí)施本發(fā)明的方式本發(fā)明的具有能專一性地增強(qiáng)nST組織的線粒體中質(zhì)子泄漏等作 用的藥劑，包括具有PPAR5激活作用的化合物或其衍生物作為有效成 分。本發(fā)明的所述藥劑可以是上迷有效成分本身或者是含有所述成分 的合適的配合物、組合物或混合物。另外，具有PPAR5激活作用的化 合物，表示能通過(guò)像"PPAR配體"那樣與PPAR結(jié)合，調(diào)控PPAR的 靶基因的轉(zhuǎn)錄激活功能的化合物.所迷化合物不局限于天然存在的化 合物，而且還包括人工合成的化合物。為了說(shuō)明上述有效成分的作用，通過(guò)向?qū)嵤├兴镜母鞣N類型的 骨骼肌細(xì)胞或脂肪細(xì)胞中添加各種類型的PPAR配體，測(cè)定UCP1的 mRNA的數(shù)量。結(jié)果，證實(shí)了與測(cè)定的PPARoc和PPARy配體相比， PPAR5配體表現(xiàn)出UCP1的mRNA的明顯更大數(shù)量的表達(dá)，PPAR5 配體的例子包括p-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基笨氣基)-丙氣基)笨乙酸 (YM-16638 )，該配體作為具有例如降血液膽甾醇活性作用的化合物 披露于WO9904815中?？梢允褂脠?bào)導(dǎo)基因，通過(guò)一種簡(jiǎn)單方法，以很高的靈敏度確定一種 物質(zhì)的PPAR結(jié)合程度和/或激活程度。例如，以下方法是已知的使用融合蛋白表達(dá)栽體的方法，該栽體是通過(guò)將酵母轉(zhuǎn)錄因子GAL4的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與PPAR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合而荻得的，以及使用 一種動(dòng)物細(xì)胞的方法，其中，業(yè)已轉(zhuǎn)導(dǎo)了含有與GAL4響應(yīng)序列(GAL4 結(jié)合元件)連接的報(bào)導(dǎo)基因的報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒(W096/33724;Lehmann等，J, Bio.Chem., 270， 12953-12956( 1995 );和Willson等，J. Med. Chem.， 39， 665-668 (W96))。使用報(bào)導(dǎo)基因的方法是按以下方式實(shí)施的 首先，當(dāng)測(cè)試化合物是諸如能結(jié)合或激活PPAR的物質(zhì)時(shí)，該測(cè)試化合 物與GAL4的PPAR的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合。于是，與PPAR的配體結(jié) 合結(jié)構(gòu)域融合的GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與報(bào)導(dǎo)質(zhì)粒的GAL4響應(yīng)因 子結(jié)合，以便啟動(dòng)所述報(bào)導(dǎo)基因的表達(dá).通過(guò)測(cè)定由所述報(bào)導(dǎo)基因表 達(dá)的蛋白的活性等，就是說(shuō)通過(guò)檢測(cè)所述報(bào)導(dǎo)物活性，可以確定所迷 測(cè)試化合物是PPAR結(jié)合化合物或PPAR激活化合物，或者不是。因此，在篩選能結(jié)合PPAR的未知配體時(shí)，或在確定一種測(cè)試化合 物是否是PPAR結(jié)合配體的檢驗(yàn)中，檢測(cè)和分離天然或人工合成的配體 是可行的。另外，報(bào)導(dǎo)物活性的檢測(cè)可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)，通過(guò)根 據(jù)報(bào)導(dǎo)基因的類型，從染色、焚光、細(xì)胞活性中選擇的指標(biāo)適當(dāng)?shù)赝?成。另外，在本發(fā)明的篩選方法中，在上迷系統(tǒng)中選擇性地增加以下步 驟，以便檢測(cè)報(bào)導(dǎo)物活性(a)讓一種測(cè)試樣品與UCP1基因表達(dá)細(xì) 胞接觸或?qū)朐摷?xì)胞，(b)測(cè)定UCP1基因在所述細(xì)胞中的表達(dá)量， 和(c)篩選能增加UCP1基因在所迷細(xì)胞中的表達(dá)量的化合物，被用于篩選的"UCP1基因表達(dá)細(xì)胞"沒(méi)有特別限制，優(yōu)選的是諸 如白色脂肪細(xì)胞或褐色脂肪細(xì)胞的脂肪細(xì)胞或骨骼肌細(xì)胞，所述細(xì)胞 可以是從動(dòng)物組織中分離的原代培養(yǎng)細(xì)胞，或通過(guò)細(xì)胞的癌化或不死 化制備的建立細(xì)胞系。作為脂肪細(xì)胞，例如，各種類型的脂肪細(xì)胞， 如披露于以下實(shí)施例中的人類白色脂肪細(xì)胞、大鼠褐色脂肪細(xì)胞、 3T3-L1 (小鼠脂肪細(xì)胞)可以優(yōu)選使用，而作為骨骼肌細(xì)胞，例如， 各種類型的骨骼肌細(xì)胞，如SkMC (人骨骼肌細(xì)胞)和C2C12 (小鼠骨 骼肌細(xì)胞)可以優(yōu)選使用。另外，UCP家族(解偶聯(lián)蛋白同系物)基 因的例子包括UCP1基因、UCP2基因、UCP3基因、UCP4基因.在本發(fā)明篩選方法的一個(gè)步驟中，讓測(cè)試樣品與能表達(dá)UCP1基因的細(xì)胞接觸和/或?qū)朐摷?xì)胞，并且測(cè)定UCP1基因的表達(dá)量。為了測(cè)定所述基因的表達(dá)量，可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種類型的方法。所迷基因表達(dá)的測(cè)定可以通過(guò)測(cè)定DNA、 RNA或蛋白的量實(shí)現(xiàn)， 例^口， 通過(guò)Northern印跡方法(Sambrook等，Molecular Cloning, 20N206, ( 1987), Cold Spring Harbor Laboratory )， RT-PCR方法(Shaffer 等，Anal. Biochem., 190, 292-296 ( 1990))等，當(dāng)通過(guò)所述測(cè)定檢測(cè)到UCP1基因表達(dá)的顯著增強(qiáng)時(shí)，所迷測(cè)試樣 品的化合物就被認(rèn)為具有促進(jìn)nST功能的作用。UCP1的表達(dá)是在nST 組織的細(xì)胞中的線粒體中燃燒脂肪或糖所必需的。不過(guò)，本發(fā)明的有 效成分，具有顯著提高UCP1在上述組織的細(xì)胞中的表達(dá)量的作用。通 過(guò)以上分子水平上的發(fā)現(xiàn)可以了解，本發(fā)明的藥劑能有效抑制內(nèi)臟脂 肪積累和減少內(nèi)臟脂肪積累.實(shí)際上，在實(shí)施例中，為了證實(shí)UCP(其表達(dá)是由PPAR5促進(jìn)的) 能夠發(fā)揮抑制或減少內(nèi)臟脂肪積累的作用，就是說(shuō)加速細(xì)胞內(nèi)死亡和 糖類的燃燒，將各種類型的PPAR配體添加到所述原代人脂肪細(xì)胞中， 并且測(cè)定脂肪酸P氧化作用(已知這種氧化作用是脂肪酸燃燒促進(jìn)作用 的指標(biāo))。正如在實(shí)施例中具體示出的，對(duì)脂肪酸P氣化作用的促進(jìn)， 與UCP表達(dá)量成正比。在PPAR5配體中，對(duì)脂肪酸P氧化作用的促 進(jìn)最強(qiáng)。本發(fā)明的藥劑具有提高內(nèi)膜穿透型蛋白UCP1在諸如骨骼肌和脂 肪的非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱組織細(xì)胞的線粒體中的表達(dá)量的作用，它與nST相關(guān)， 特別是與促進(jìn)上述細(xì)胞的線粒體中的解偶聯(lián)呼吸、質(zhì)子泄漏和產(chǎn)熱相為有效成分,;且它具有高度表達(dá)ucpi的作用，其中:，所述作用大大提高了 UCP1在諸如上述脂肪和骨骼肌的nST組織中的細(xì)胞表達(dá)量。 可以根據(jù)UCP1表達(dá)活性鑒定、分離和純化本發(fā)明的藥劑。通過(guò)作為有 效成分化合由此獲得的物質(zhì)，可以制備用于降低內(nèi)臟脂肪積累量或用 于抑制內(nèi)臟脂肪積累的、特別是對(duì)抗肥胖具有顯著作用的藥刑。本發(fā)明的藥劑可用于和治療肥胖，特別是治療哺乳動(dòng)物(例如人 類、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猴、貓、馬、兔子等)或禽類的肥胖， 因?yàn)樗艽龠M(jìn)能量代謝和脂肪代謝，并且降低血脂，另外，它還可用于預(yù)防或治療與肥胖并發(fā)的疾病(例如，成年人疾病，如糖尿病、高 血壓、高血脂、動(dòng)脈硬化或缺血性心臟病)等.作為所述降低藥劑或抑制藥劑的栽體，可以根據(jù)使用模式使用合適 的填充刑、結(jié)合劑、增量劑、崩解刑、表面活性劑、防濕劑、賦形刑、 稀釋劑等。藥劑的形狀可以根據(jù)使用目的適當(dāng)?shù)卮_定，并且沒(méi)有特殊 限制。所述藥劑的例子包括固體藥劑(如片劑、顆粒、粉末、丸劑和 膠囊)，液體藥劑，懸浮劑、乳劑等。通過(guò)這種方式獲得的抗糖尿病 藥劑，抗肥胖藥劑，減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積累脂肪的 藥劑，優(yōu)選是通過(guò)口服施用的。所迷刑量是根據(jù)要治療的患者的癥狀 等適當(dāng)確定的。因此，每天服用的劑量和次數(shù)等沒(méi)有特殊限制。實(shí)施例下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，不過(guò)，本發(fā)明并 不局限于這些實(shí)施例。在以下實(shí)施例中，每一種搮作都是按照披露于"Molecular Cloning"中的方法進(jìn)行的(Sambrook，丄，F(xiàn)ritsch， E.F, 和Maniatis, T， Cold Spring Harbor Laboratory Press )，除非另有說(shuō)明.[實(shí)施例1]藥劑對(duì)誘導(dǎo)UCP1和UCP2 mRNA在人類白色脂肪細(xì) 胞中表達(dá)的影響(1)人類白色脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)和RNA的制備人類脂肪細(xì)胞，來(lái)自皮下脂肪組織的未分化的冷凍原脂肪細(xì)胞 (Cat. No. SP-F， Lot. No. L011399)是從美國(guó)ZenBio公司購(gòu)買的。按 照生產(chǎn)商的說(shuō)明，在24孔平板上培養(yǎng)所述細(xì)胞，并且分化成脂肪細(xì)胞. 將所培養(yǎng)的細(xì)胞用作人類白色脂肪組織衍生的脂肪細(xì)胞。具體地講， 通過(guò)使用24孔平板在二氧化碳培養(yǎng)箱中，在37'C下在原脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 基中培養(yǎng)所述原脂肪細(xì)胞，直到達(dá)到鋪滿狀態(tài).然后，將所述培養(yǎng)基 更換成分化培養(yǎng)基，并且再繼續(xù)培養(yǎng)72小時(shí)，以便誘導(dǎo)分化。另外， 將所述培養(yǎng)基更換成脂肪細(xì)胞培養(yǎng)基，并且進(jìn)行14天培養(yǎng)，以便獲得 完全分化的白色脂肪細(xì)胞.在以下條件下，對(duì)所述培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一 步的培養(yǎng)。將各種類型的測(cè)試化合物分別添加到培養(yǎng)基中，使它的最終濃度為lOpM,并且將所述細(xì)胞培養(yǎng)6小時(shí)(n-3).所述測(cè)試化合物是PPAR (X配體必降脂(Bezafibrate)、 WY14643、 PPAR5配體YM-16638、 PPAR Y配體曲格列酮(Troglitazone)、羅格列酮(Rosiglitazone)、非專 一 性 PPAR配體cPGI、伊洛前列素、腎上腺素能受體激動(dòng)劑L755507. 通過(guò)添加DMSO制備對(duì)照，它是所述測(cè)試化合物的溶刑，使它的最終 濃度為0.5%,并且以與測(cè)試化合物相同的方式用它進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于每 一種測(cè)試化合物或?qū)φ諄?lái)說(shuō)，回收培養(yǎng)的細(xì)胞，將它們懸浮在150微升 的細(xì)胞裂解緩沖液(RLT溶液，由QIAGEN公司生產(chǎn))中，然后裂解 細(xì)胞，以便獲得細(xì)胞提取物。通過(guò)使用RNA制備試劑盒(商品名RNeasy 總RNA試劑盒，由QIAGEN公司生產(chǎn))按照該試劑盒所附帶的說(shuō)明書， 從所述細(xì)胞提取物中制備總RNA。(2 ) UCP1 mRNA表達(dá)量的測(cè)定通過(guò)使用上面所獲得的總RNA (大約0.1微克)作模板，按下文 所述方法進(jìn)行實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，以便測(cè)定UCPl mRNA表達(dá)量。作為人UCP1基因的PCR引物，使用了兩種類型的寡核苷酸 5'-AACCCACAGAGGTCGTGAAAG-3，(正向引物)和 5，-CGTGTAGCGAGGTTTGATTCC-3，(反向引物) 作為PCR探針，使 用了 5，-CAGACTTCAAGCATAGAGCCATCTCCA-3，，所述探針是用一 種熒光染料FAM標(biāo)記過(guò)的。另外，G3PDH mRNA的測(cè)定是按照PE Applied Biosystems推薦的方法進(jìn)行的，該測(cè)定是與2-Reporter Assay同 時(shí)進(jìn)行的。所述引物是由Amersham-Pharmacia Biotech公司化學(xué)合成 的，而所述探針是由PE Applied Biosystems公司化學(xué)合成的(包括用所 述熒光染料標(biāo)記)。通過(guò)使用待測(cè)定的制備的總RNA，上面所提到的引物和探針，以 及通過(guò)商業(yè)渠道獲得的實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR試劑盒(TaqMan EZ RT-PCR Core Reagent Kit (商品名),由PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))制備表1 所示的反應(yīng)溶液，表中所示出的用量相應(yīng)于一個(gè)反應(yīng)試管.[表l〗成分終濃度模板RNA5 x丁aqManEZ緩沖液A1 x10 mM dATP300pM10 mM dGTP300^M10 mM dCTP300pM10 mM dTTP300^M10岸UCP1正向引物200nM10pM UCP1反向引物200nM5pM UCP1探針lOOnMIO)liM G3PDH正向引物40nM10, G3PDH反向引物40nMl(VM G3PDH探針lOOnMr丁th DNA聚合酶(2.5U/nl)O.卿lAMP Erase UNG(,l)0.01，25mM Mn(OAc)23mM將25微升如上制備的反應(yīng)溶液》欠入PCR Perkin Elmer Microamp Optical Tuber (商品名，由PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))中，并且 用 一個(gè)蓋子密封所述試管。將該試管放在ABI PRISM 7700序列檢測(cè)系 統(tǒng)(商品名，由PE Applied Biosystems公司生產(chǎn))，并且在以下條件下進(jìn)行反應(yīng)。在50'C下用50分鐘時(shí)間由UNG分解DNA污染物，在60'C下進(jìn) 行逆轉(zhuǎn)錄處理10分鐘，并且在95'C下加熱2分鐘使UNG失活。在隨 后的PCR反應(yīng)中，在95'C下進(jìn)行15秒鐘的變性處理，并且在58'C下 進(jìn)行90秒鐘的退火處理(循環(huán)次數(shù)40循環(huán))。在該反應(yīng)開(kāi)始之后， 通過(guò)實(shí)時(shí)處理自動(dòng)確定熒光強(qiáng)度，以便測(cè)定UCP1 mRNA表達(dá)量。UCPl mRNA表達(dá)量是通過(guò)一種相對(duì)值表示的，該相對(duì)值是通過(guò)將被用作空 白對(duì)照的參考樣品中的量設(shè)定為100，并且通過(guò)G3PDHmRNA表達(dá)量 對(duì)所述值進(jìn)行校正而計(jì)算的.14結(jié)杲如圖1所示。PPAR5配體(具有激活PPAR5的作用的化合 物)YM-16638能夠?qū)CP1 mRNA表達(dá)量提高到對(duì)照表達(dá)量的大約12 倍 這表明，PPAR5配體能有效促進(jìn)所迷表達(dá)。由于該實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 PPAR 5配體能專一性地增強(qiáng)UCP1基因，很顯然，PPAR 5配體對(duì)WAT 的功能的促進(jìn)作用，是由于PPAR5配體對(duì)WAT的直接作用.UCP1 表達(dá)的顯著加強(qiáng)不僅出現(xiàn)在嚙齒類動(dòng)物，而且還出現(xiàn)在人類的白色脂 肪細(xì)胞中這一事實(shí)表明，PPAR5配體對(duì)于人類糖尿病和肥胖來(lái)說(shuō)是極其有效的。(3 ) UCP2 mRNA表達(dá)量的測(cè)定通過(guò)使用在上面的第(1)項(xiàng)獲得的總RNA(大約0.1微克)作模 板，通過(guò)與上述第(2)項(xiàng)相同的實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，測(cè)定UCP2 mRNA 表達(dá)量。作為人類UCP2基因的PCR引物，使用了兩種類型的寡核苷 酸5,-CGCCAAATGAGCTTTGCCT-3，(正向引物)和 5，-GCCCTTGGTGTAGAACTGTTTGA-3，(反向引物)。作為PCR探針， 使用了 5 ， -TGTCCGCATCGGCCTGTATGATTC-3 ，.所述探針用 一種焚 光染料FAM標(biāo)記。結(jié)果如圖2所示。PPAR5配體(具有激活PPAR5的作用的化合 物)YM-16638能夠?qū)CP2 mRNA表達(dá)量提高到對(duì)照表達(dá)量的大約2 倍。[實(shí)施例2]藥劑對(duì)人類白色脂肪細(xì)胞中游離脂肪酸P氧化的影響 按與實(shí)施例1相同的方法制備人類完全分化的白色脂肪細(xì)胞，然 后除去上清液，添加500微升培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是通過(guò)向脂肪細(xì)胞培養(yǎng) 基中添加適量的油酸和棕櫚酸，使它們的濃度分別為0.67mM和 0.33mM而制備的。將各種類型的測(cè)試化合物添加到所述培養(yǎng)基中，使 它們的最終濃度為10yM,然后向每一個(gè)孔中添加[9,10(n)JH]棕櫚酸 (由Amersham Phamacia公司生產(chǎn))，最終濃度為1 p Ci/毫升)，并且， 在37'C下培養(yǎng)所述細(xì)胞48小時(shí)。所述測(cè)試化合物是PPAR5配體的 YM-16638, PPARoc配體的WY14643， 腎上腺素能受體激動(dòng)刑的 L755507和PPAR y配體的Rosiglitazone.通過(guò)添加DMSO制備對(duì)照， DMSO是所述測(cè)試化合物的溶劑，使它的最終濃度為0.5%,并且以與測(cè)試化合物相同的方式培養(yǎng).為了防止在培養(yǎng)期間由于細(xì)胞對(duì)[W0(n)JH]棕櫚酸的p氧化所產(chǎn)生的3H20的蒸發(fā)，用由住友Bakelite 公司生產(chǎn)的微型培養(yǎng)濾膜(MS-30055 )對(duì)培養(yǎng)平板進(jìn)行密封.在培養(yǎng)"小時(shí)之后，將培養(yǎng)基的200微升上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5 毫升的Eppendorf管中，添加50微升50%的三氯乙酸，并且將該試管 放在冰上保持30分鐘，以便產(chǎn)生沉淀，并且以15000rpm的速度離心 該混合物IO分鐘。然后，將沒(méi)有蓋子的1.5毫升Eppendorf管放入亊先 在它里面放入了 500微升蒸餾水的20毫升的玻璃瓶中，將上面所荻得 的上清液的總量放入該Eppendorf管，并且用聚丙烯封裝蓋緊密密封所 述玻璃瓶。在5(tc下對(duì)所述玻璃瓶進(jìn)行加熱18小時(shí)，以便所述玻璃瓶 內(nèi)部被^20飽和，在4'c下對(duì)所迷玻璃瓶進(jìn)行冷卻之后，再進(jìn)行離心 (1000rpm， 1分鐘)。丟棄瓶中Eppendorf管中殘留的上清和Eppendorf 管。向留在所述玻璃瓶中的含有^20的蒸餾水中添加5毫升液體閃爍 混合物(Ultima Gold,由Packard公司生產(chǎn))，并且在充分混合之后測(cè) 定放射性。結(jié)果如圖3所示。10nM的PPAR5配體YM16638將所述細(xì)胞的 P氧化作用提高了 30°/。。另 一方面，10 m m的PPAR y配體Rosiglitazone 具有15%的增強(qiáng)作用，而10 )j M的PPARot配體WY14643和10 p M的 0 3腎上腺素能受體激動(dòng)劑L755507的P氧化，沒(méi)有表現(xiàn)出增強(qiáng)作用. 以上結(jié)果表現(xiàn)出與在實(shí)施例1中觀察到的各種類型的PPAR配體對(duì) ucp1 mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用的良好的相關(guān)性，就是說(shuō)，PPAR5配體 通過(guò)促進(jìn)ucp1基因表達(dá)提高了 ucp1蛋白的數(shù)量，以便增強(qiáng)用游離脂 肪酸作底物的e氧化。所述P氧化作用是ucp1的功能之一。這表明 ppar5配體能促進(jìn)能量代謝，并且抑制或減少內(nèi)臟脂肪積累.以上結(jié) 果表明PPAR5配體能有效抗人類糖尿病和肥胖.產(chǎn)業(yè)上利用的可能性本發(fā)明獲得了一種具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用等的物質(zhì)，并且荻得了諸如 抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或抑制內(nèi)臟積 累脂肪的藥劑的含有所述物質(zhì)的藥刑.序列表<110>TEIJIN LIMITED YAMAOKA Kazuyoshi TAKAGI Kenichiro KATAOKA Kenichiro YAMAMOTO Masanori CHIKANISHI Toshihiro<120>通過(guò)測(cè)定PPAR S激活作用篩選物質(zhì)的方法和藥劑<130> T-456<150> JP P2001-216502 <151> 2001-7-17<160>6<210> 1 <211>21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP1基因PCR的正向引物 <400> 1aacccacaga ggtcgtgaaa g 21<210> 2 <211> 21 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP1基因PCR的反向引物<400> 2cgtgtagcga ggtttgattc c 21<210> 3 <211> 27 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP1基因PCR的探針 <400> 3cagacttcaa gcatagagcc atctcca 27<210>4 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP2基因PCR的正向引物 <400> 4cgccaaatga gctttgcct 19<210> 5 <211> 23 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP2基因PCR的反向引物 <400> 5gcccttggtg tagaactgtt tga 23<210>6 <211> 24 <212> DNA <213>人工序列<220><223>人UCP2基因PCR的探針 <400> 6tgtccgcatc ggcctgtatg attc 2權(quán)利要求
1.具有產(chǎn)熱促進(jìn)作用的藥劑，其含有具有PPARδ激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
2. 促進(jìn)線粒體的解偶聯(lián)呼吸的藥劑，其含有具有PPAR5激活作 用的物質(zhì)作為有效成分。
3. 促進(jìn)線粒體內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏的藥劑，其含有具有PPAR5激 活作用的物質(zhì)作為有效成分。
4. 提高UCP1在含有線粒體的細(xì)胞中的表達(dá)量的藥劑，其含有具 有PPAR5激活作用的物質(zhì)作為有效成分。
5. 能促進(jìn)脂肪酸0氧化的藥劑，其含有具有PPAR5激活作用的 物質(zhì)作為有效成分。
6. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPAR5激活作用的 物質(zhì)是非專一性PPAR配體或PPAR5配體。
7. 權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的藥劑，其中具有PPAR5激活作用的 物質(zhì)是卡巴前列環(huán)素、伊洛前列素或p-(3-(4-乙?；?3-羥基-2-丙基苯 氧基)-丙氧基)苯乙酸。
8. 權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于骨骼肌、白 色脂肪組織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中。
9. 權(quán)利要求2-4中任一項(xiàng)的藥劑，其中線粒體存在于白色脂肪組 織或褐色脂肪組織的細(xì)胞中。
10. 抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或 抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有具有PPAR5激活作用的物質(zhì)作為 有效成分。
11. 抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑、減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑或 抑制內(nèi)臟積累脂肪的藥劑，其含有權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)的藥劑作為. 有效成分。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種篩選包含具有PPARδ激活作用的化合物的產(chǎn)熱促進(jìn)物質(zhì)；含有所述化合物的藥物；以及具有抗糖尿病、抗肥胖或減少內(nèi)臟積累脂肪作用的藥物。本發(fā)明提供一種藥劑，其包含具有激活過(guò)氧化物酶體增殖物激活的受體PPARδ的作用的化合物，并且具有促進(jìn)非戰(zhàn)栗產(chǎn)熱(nST)，特別是促進(jìn)在脂肪組織等的細(xì)胞中的線粒體解偶聯(lián)呼吸或線粒體內(nèi)膜中的質(zhì)子泄漏，和提高UCP1表達(dá)量的作用；本發(fā)明也提供含有上述化合物的抗糖尿病藥劑、抗肥胖藥劑和減少內(nèi)臟積累脂肪的藥劑。另外，本發(fā)明還提供了通過(guò)測(cè)定PPARδ激活作用篩選化合物的方法。
文檔編號(hào)G01N33/68GK101259276SQ200810090910
公開(kāi)日2008年9月10日 申請(qǐng)日期2002年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月17日
發(fā)明者山岡一良, 山本真則, 片岡健一郎, 近西俊洋, 高木健一郎 申請(qǐng)人:帝人株式會(huì)社