專利名稱：一種可水解鞣質(zhì)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)。
技術(shù)背景鞣質(zhì)，又稱為植物單寧，是一類廣泛存在于植物體內(nèi)的復(fù)雜多元酚類化合物，其中可水 解鞣質(zhì)是酚酸與多元醇形成的酯或苷。Zhi-hong Jiang禾口 Yoko Hirose等人于2001年在蛇菰(免/""0;7/20ra/a; ow'ca Makino)中發(fā)現(xiàn)了多種含有咖啡?；蜎]食子?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)，如1-0-化>咖啡?；?3-0-沒食子酰基-P-D-吡喃葡萄糖，該化合物是一種黃色無定形粉末，[a]D15-48.9° (c=0.8， MeOH)， 在鞣酸酶的作用下可水解為沒食子酸和1-0-⑧-咖啡酰基-(3-0-吡喃葡萄糖；3-(9-問-咖啡酰 基-4-0-沒食子?；?D-吡喃葡萄糖，該化合物是一種黃色無定形粉末，[oc]D15-144.2° (c-0.7， MeOH)，在鞣酸酶的作用下可水解為沒食子酸和3-0-⑧-咖啡酰基-D-吡喃葡萄糖[Caffeoyl， Coumaroyl， Galloyl， and Hexahydxydiphenoyl Glucoses from Sfl/"朋/ /zora _/'o/>ora'ca. Zhi-hong Jiang, Yoko Hirose et. Chem. Pharm. Bull. 49(7)887-892(2001)]。但上述文中沒有公開這類化合 物的用途，也未見其他報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種新的含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)。 本發(fā)明的另一目的在于提供該新的含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)在制藥中的 應(yīng)用。本發(fā)明新的含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)是 一種可水解鞣質(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)為OH(I )。該化合物從蛇菰(免/""印/wra>po"/Cfl Makino，主要分布于我國南部和日本)中分離出來 的一種可水解鞣質(zhì)，為褐色無定型粉末，分子式C28H24017,比旋光度[a]D"-219.3。 (c=0.6, MeOH),是一種可水解鞣質(zhì)，將其甲基化后在堿溶液中可水解為化合物d和化合物e，水解 反應(yīng)過程如(II)所示。OH本發(fā)明化合物可以通過下述方法從蛇菰中提取獲得(1) 取蛇菰，切碎，在室溫下用70%甲醇或乙醇浸泡24小時，過濾，濾液減壓除醇， 得總提取物；(2) 總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3) 將水溶性部分經(jīng)MCI-gel CHP20P柱層析，先用水洗去糖類化合物，然后用10% 40%甲醇梯度洗脫，收集甲醇洗脫物；(4) 步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS,以水洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收 集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；再上MCI-gel CHP20P,以水 洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶 解；然后上Sephadex LH-20層析，以水洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集40-80%甲醇洗脫 物，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；最后經(jīng)TSK gel Toyopearl HW-40F柱層析，以水 洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集30~50%甲醇洗脫物中TLC上對FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點(diǎn) 的流分，合并含單一斑點(diǎn)的柱層析的洗脫流分，揮盡溶劑，即可。本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性，能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，可以用于制備治療腫瘤的藥物， 該藥物由本發(fā)明化合物和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成，其中本發(fā)明化合物的含量為5 20% (W/W)。下面將通過體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)來證明本發(fā)明化合物具有抗腫瘤活性。
一、采用人肝癌細(xì)胞株HepG2為模型進(jìn)行本發(fā)明化合物的抗腫瘤活性檢測。1、 實(shí)驗(yàn)方法1) HepG2細(xì)胞培養(yǎng)生長至指數(shù)生長期時，即以0，25%胰蛋白酶消化，1000Xg離心3min， 細(xì)胞沉淀以10%FBS的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整至6X 104個/1111, 96孔培養(yǎng)板每孔接種190y 1, 置于37'C、 5%<:02及飽和濕度條件下培養(yǎng)24小時。2) 每組設(shè)5個復(fù)孔，每孔中加入10ul本發(fā)明化合物，上述條件下繼續(xù)培養(yǎng)48小時。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3) 細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，每孔加入10 u 1的CCK-8 (cell counting kit 8)試劑，37°C， 5。/。C02及飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)1. 5小時。4) 用酶標(biāo)儀測定在波長為450nni處的吸光度值(0D)， 650nm作為參考波長，細(xì)胞生長抑 制率按公式抑制率=(對照孔0D值-實(shí)驗(yàn)孔0D值)/對照孔0D值)X 100%計(jì)算，并用co即usyn 軟件計(jì)算各組分的IC5。。2、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表1本發(fā)明化合物對HepG2細(xì)胞增殖的影響抑制率乂度終濃度(ug/ml)ic50 (ug/ml)502512.56.253.125本發(fā)明化合物43.43 ±2.3442,09 ±2.9130.3 ±9.6821.73 ±5.0018.99±6.3430.6正常培養(yǎng)HepG2細(xì)胞呈單層生長，細(xì)胞密度均勻分布，細(xì)胞呈梭形生長良好。在培養(yǎng)細(xì) 胞中加入蛇菰組分48小時后，細(xì)胞出現(xiàn)回縮、變圓，漂浮，隨著時間延長，漂浮的細(xì)胞增加。 各劑量的本發(fā)明化合物對HepG2細(xì)胞生長的抑制率如表1所示，本發(fā)明化合物對HepG2細(xì)胞 增殖的抑制程度與劑量的遞增成正相關(guān)，可見本發(fā)明能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，具有抗腫瘤活 性。二、本發(fā)明化合物對荷S180小鼠腫瘤大小的影響1、 將S180瘤源小鼠于傳代接種后IO天在無菌條件下從腹腔抽出瘤液，用無菌生理鹽水 調(diào)整瘤細(xì)胞數(shù)至5X 1()6個/ml。2、 取21只小鼠(18-22g/只)，分別接種步驟1所得的瘤液0.2ml于右大腿皮下后被隨機(jī) 分為以下5組(1) 本發(fā)明化合物低劑量組給予本發(fā)明化合物治療，5.0mg/kg;(2) 本發(fā)明化合物中劑量組給予本發(fā)明化合物治療，10.0mg/kg;
(3) 本發(fā)明化合物高劑量組組給予本發(fā)明化合物治療，20.0mg/kg;(4) 陽性對照組給予表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)治 療，20mg/kg;(5) 空白對照組生理鹽水灌胃。接種次日同時灌胃給藥，給藥量0.2ml，每日給藥一次，連續(xù)10天，停藥次閂稱重，解 剖后剝離皮下瘤體，稱瘤重。按下式計(jì)算抑瘤率(％)=(對照組平均瘤重-給藥組平均瘤重) /對照組平均瘤重X 100%。表2本發(fā)明化合物對荷S180小鼠腫瘤大小的影響組別劑量瘤質(zhì)量(g)抑瘤率(％)空白對照組01.28±0. 11陽性對照組20.0mg/kg0.70±0. 3345.31本發(fā)明化合物低劑量組5.0tng/kg1.21 ±0. 145.47本發(fā)明化合物中劑量組10.0mg/kg1.01±0.2221.09本發(fā)明化合物高劑量組20.0mg/kg0.69±0. 1246.09結(jié)果如表2所示，本發(fā)明化合物對荷S180小鼠腫瘤的抑制作用隨劑量增加而增大，其效 果與EGCG相當(dāng)。
具體實(shí)施方式
制備例1、本發(fā)明化合物的獲得(1) 取蛇菰，切碎，在室溫下用70%甲醇或乙醇浸泡24小時，過濾，濾液減壓除醇， 得總提取物；(2) 總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3) 將水溶性部分經(jīng)MCI-gel CHP20P柱層析，先用水洗去糖類化合物，然后用10% 40%甲醇梯度洗脫，收集甲醇洗脫物；(4) 步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS,以水洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收 集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；再上MCI-gel CHP20P，以水 洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶 解；然后上S印hadex LH-20層析，以水洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集40-80%甲醇洗脫 物，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；最后經(jīng)TSKgelToyopearlHW-40F柱層析，以水 洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集30 50%甲醇洗脫物中TLC上對FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點(diǎn)
的流分，合并含單一斑點(diǎn)的柱層析的洗脫流分，揮盡溶劑，即得本發(fā)明化合物，其純度大于 95%。2、該化合物的的鑒定分析1) 方法(1) 旋光度由JASCO DIP-370 digital polarimeter測定；(2) 'H和13C-NMR由Varian Unity plus 500和Varian Gemini 300 spectrometers測定； 耦合常數(shù)(力用Hz表示，化學(xué)位移用S(ppm)表示，四甲基硅垸為內(nèi)標(biāo)，高分辨ESI質(zhì)譜由Q-TOF mass spectrometer (Bruker Daltonics, MA, USA)測定，EI和FAB質(zhì)譜由JEOL JMS DX-303 spectrometer測定，甘油為FAB質(zhì)譜的基質(zhì)。(3) 薄層層析用Kiesdgel 60 F254預(yù)鋪板(0.2 mm thick, Merck)，斑點(diǎn)由紫外燈和2% FeCl3和10%硫酸噴霧顯色。(4) 水解反應(yīng)提取物54 mg在無水a(chǎn)cetone 15 ml、 dimethylsulfate 1.5 ml和K2C03 2 g 的混合溶液中回流1.5 h。過濾后濃縮并硅膠柱層析(2-20 % MeOH in CHCl3)純化，在純化產(chǎn) 物中加入2。/。NaOMe的甲醇溶液中(2ml)攪拌2hr，用HC1中和，水層用乙醚提取得到甲 基化產(chǎn)物化合物。柱層析填料由硅膠Kieselgel 60 (70-230 mesh, Merck)， Sephadex LH-20 (25-100 mm， Pharmacia Fine Chemical Co. Ltd.), MCI-gel CHP 20P (75-150 mm, Mitsubishi Chemical Co. Ltd.), TSK gel Toyopearl HW-40F (Tosoh), Chromatorex ODS (100-200 mesh, Fuji Silysia Chemical), Bondapak CI8 (125 um, Waters).(5) PGME Amide的合成提取物10.2 mg， (S)-PGME 10 mg， PyBop 18 mg， HOBT 9 mg 和methylmorphorine 20 ul在DMF (1 mg)的溶液中在室溫?cái)嚢? hr。加水15 ml并用15 ml n-butanol提取.有機(jī)層用無水Na2S04干燥并濃縮，最后用硅膠柱純化CHCl3-MeOH-H20 (8:2:0.2)。2) 結(jié)果[ot]D16-219.30 (c=0.6， MeOH).Calcd for C28H24017 5/4 H20: C， 51.34; H， 4.08. Found: C, 51.39; H， 4.22. Negative FAB-MS m/z: 631 [M-H]-. Negative HR-ESI-MS w/z: 631,0970 [M-H]' (calcd. for C28H230i7: 631.0935)」H-NMR (500 MHz， CD3OD): S 7.07 (IH, d， 《/=2 Hz, caf-2),6.78 (1H， d, /=8 Hz， caf-5),6.97 (IH, dd, 7=2, 8 Hz, caf-6),7.67 (IH, d， J=16 Hz, caf-7)，6.31 (1H， d, 7=16 Hz, caf-8)，5.70 (1H， d， 7=8 Hz, glc-l)， 3.64 (IH, t, J=8 Hz, glc-2)，3.90 (1H， t, /=9 Hz， glc-3)，4.93 (IH, t， ,9 Hz， glc-4)，4.05 (IH, m， glc-5)，4.16 (IH, t, J=ll Hz， glc-6a)，4.08 (IH, dd， 7=3, 11 Hz， glc-6b)，7.24 (IH, s, 4, 6-acyl-3')， 4.70 (IH, d， 《/=2 Hz， 4， 6-acyl-2),3.66 (1H， ddd, ^2,3， 11 Hz， 4, 6-acyl-3)，2.18 (1H， dd, /=11, 17 Hz， 4, 6-acyl-4a),1.81 (1H， dd, J=3， 17 Hz， 4 6-acyl-4b). 13C-NMR data見表2。表2 本化合物的13C- NMR (125 MHz) Spectral DataNO.13C- NMR (125 MHz) Soectral Datacaffeoyl-1127.5caffeoyl-2115.3caffeoyl-3146.8caffeoyl-4149.9caffeoyl-5116.5caffeoyl-6123.3caffeoyl-7148.7caffeoyl-8113.9caffeoyl-9167.5glucose-195.6glucose-274.1glucose-374.7glucose-476.9glucose-571.1glucose-667.24， 6-acyl-l176.94， 6-acyl-244.54， 6-acyl-348.34, 6-acyl-431.24， 6-acyl-5174.14, 6-acyl-6173,54， 6-3cyl-7-4， 6-acyl-l'118.14,6-acyl-2，117.44, 6-acyl-3，114.84， 6-acyl-4'148.34, 6-acyl-5'136.54, 6-acyl-6,143.34, 6-acyl-7，165.7高分辨ESI質(zhì)譜確定該化合物分子式為C2sH240n H-NMR顯示有一個咖啡?；鶊F(tuán)， 一個1，4，6三?；咸烟腔鶊F(tuán)。13C-NMR中除了葡萄糖和咖啡酰基團(tuán)的信號外，還發(fā)現(xiàn)有兩 個酯羰基、 一個內(nèi)酯羰基、 一個羧酸羰基、兩個次甲基(CH)， 一個亞甲基(CH2)和五取代的苯 環(huán)的信號。根據(jù)^和13C-NMR的數(shù)據(jù)推測該化合物中的4,6位的?；Y(jié)構(gòu)片斷與euphormisin M^的一致。對該化合物進(jìn)行甲基化和堿水解得到衍生物3d證實(shí)了以上推斷。HMBC中端
基質(zhì)子與羰基碳的相關(guān)信號(式ni)確定咖啡酰基的位置連在葡萄糖的端基，另外的酰基酯鏈連在葡萄糖的C-4，6位的羥基上。最后，對化合物3采用PGME法分析(見式IV)，確定 連在糖C-4,6位的?；Y(jié)構(gòu)片斷中C-3構(gòu)型為S。綜上所述，可確定該化合物的分子結(jié)構(gòu)為式 (I)所示的結(jié)構(gòu)。OH△5 (PPm) = 5[(化PGME amide-8[(fl)-PGME amide] PGME=phenylglycine methyl ester (IV )應(yīng)用例 例一制劑處方可水解鞣質(zhì)20 g 微晶纖維素48 g 可溶性淀粉30 g 滑石粉 2g共制1000片，每片含該化合物lOOmg。制備方法稱取該化合物20g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95%乙 醇制軟材，過篩制粒，低溫50。C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g),質(zhì)檢、
包裝，即得。用法用量每次3片，每日3次。適用人群適用各種腫瘤患者。例二:制劑處方可水解鞣質(zhì)10 g 微晶纖維素48 g 可溶性淀粉40 g 滑石粉 2g共制1000片，每片含該化合物100 mg。制備方法稱取該化合物10g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95%乙 醇制軟材，過篩制粒，低溫50。C干燥，整粒，加入滑石粉2g，混勻，壓片(每0.1g),質(zhì)檢、 包裝，即得。用法用量
每次3片，每日3次。適用人群
適用各種腫瘤患者。例三制劑處方可水解鞣質(zhì)5g 微晶纖維素48 g 可溶性淀粉30 g 滑石粉 2g共制1000片，每片含該化合物100mg。制備方法
稱取該化合物5g，加可溶性淀粉稀釋成50g，混勻，再稱取微晶纖維素48g，用95%乙 醇制軟材，過篩制粒，低溫50。C千燥，整粒，加入滑石粉2g,混勻，壓片(每0.1g)，質(zhì)檢、 包裝，即得。用法用量
每次3片，每日3次。適用人群
適用各種腫瘤患者。
權(quán)利要求
1、 一種可水解鞣質(zhì)，其分子結(jié)構(gòu)為<formula>formula see original document page 2</formula>
2、 權(quán)利要求1所述的可水解鞣質(zhì)的制備方法，該方法由以下步驟組成(1) 取蛇菰，切碎，在室溫下用70°/。甲醇或乙醇浸泡24小時，過濾，濾液減壓除醇， 得總提取物；(2) 總提取物用適量水稀釋，然后依次用乙醚、乙酸乙酯萃取，取水溶部分；(3) 將水溶性部分經(jīng)MCI-gel CHP20P柱層析，先用水洗去糖類化合物，然后用10% 40%甲醇梯度洗脫，收集甲醇洗脫物；(4) 步驟(3)所得的洗脫物經(jīng)ChromatorexODS,以水洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收 集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；再上MCI-gel CHP20P，以水 洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集40 80%甲醇洗脫液，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶 解；然后上Sephadex LH-20層析，以水洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集40-80%甲醇洗脫 物，減壓回收甲醇，殘?jiān)由僭S甲醇溶解；最后經(jīng)TSKgelToyopearlHW-40F柱層析，以水 洗脫后以10 80%甲醇洗脫，收集30 50%甲醇洗脫物中TLC上對FeCl3溶液顯深藍(lán)色斑點(diǎn) 的流分，合并含單一斑點(diǎn)的柱層析的洗脫流分，揮盡溶劑，即可。
3、 權(quán)利要求1所述的可水解鞣質(zhì)在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
4、 權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其中所述藥物由權(quán)利要求l所述的可水解鞣質(zhì)化合物(I ) 和醫(yī)學(xué)上可接受的輔料組成。
5、 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的藥物中化合物(I )的質(zhì)量百分比含量 為5 20%。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的含有咖啡?；倪拎咸烟穷惪伤怊焚|(zhì)，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如式(I)所示。本發(fā)明所述的化合物能抑制腫瘤的增殖，具有較好的抗腫瘤活性，可用于制備抗腫瘤的藥物。
文檔編號A61K31/7042GK101121739SQ20071003011
公開日2008年2月13日 申請日期2007年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2007年9月6日
發(fā)明者劉中秋, 吳少瑜, 吳曙光, 姜志宏, 巖田弘美, 廣瀨小野, 文曉蕓, 河野高畑勛, 田中山中崇 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)