本發(fā)明屬于中藥領(lǐng)域，具體涉及一種代代花萼多酚及制備方法與在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

茶多酚又叫茶單寧,茶鞣質(zhì),是茶葉中酚類及其衍生物的總稱,約占茶葉干物質(zhì)總質(zhì)量的25％,主要是兒茶素類、黃酮類、花青素和酚酸四類物質(zhì),其中兒茶素類的含量占80％左右。兒茶素中的主要成分有四種:表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明,茶葉中的生理活性物質(zhì)主要為茶多酚,它具有優(yōu)異的抗氧化性能和顯著的清除自由基能力。

目前最有前途的替代經(jīng)典抗生素治療的抗炎方法之一是使用能增強(qiáng)宿主防御反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)劑?，F(xiàn)已知的多種免疫調(diào)節(jié)劑，包括哺乳動(dòng)物蛋白，如：γ-干擾素、粒細(xì)胞集落刺激因子和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及從微生物分離純化的物質(zhì)。對(duì)于免疫細(xì)菌多糖和人工合成的化合物來說，其不良反應(yīng)和副作用已引起人們廣泛注意。大多數(shù)植物多酚均為無不良反應(yīng)的物質(zhì)，不會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生較大的副作用。隨著人們對(duì)這一特性研究的不斷深入,茶多酚在醫(yī)療保健、食品、化工、油脂等行業(yè)具有廣泛的發(fā)展空間，尤其是在日本,美國(guó)。雖然我國(guó)茶葉資源豐富,但對(duì)于茶葉中茶多酚的提取技術(shù)及茶多酚在醫(yī)藥中的應(yīng)用還處于研究開發(fā)階段。

代代(Citrus aurantium L.var.amara Engl)是蕓香科柑橘屬植物酸橙的一個(gè)變種，代代花是其花蕾的干品，具有良好的藥理作用，常用于治療氣郁不舒、脘腹脹痛、積食不化、惡心嘔吐等。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)代代花的研究主要以其揮發(fā)油類化合物為主，而對(duì)代代花多酚抗炎的研究報(bào)道幾乎沒有。代代花作為藥食兩用價(jià)值的天然保健品，其多酚的提取純化和藥理活性等方面的研究還有待進(jìn)一步深入探討，全面加強(qiáng)代代花的生物利用，對(duì)于開發(fā)新藥、指導(dǎo)臨床用藥具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足和缺點(diǎn)，本發(fā)明的首要目的在于提供一種代代花萼多酚的制備方法。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述制備方法制備得到的代代花萼多酚。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述代代花萼多酚在制備抗炎藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn)：

一種代代花萼多酚的制備方法，包含如下步驟：

將代代花萼粗粉加入溶劑中，加熱提取，離心，取上清液，去除溶劑，得到代代花萼多酚；所述溶劑為水、乙醇水溶液或甲醇水溶液。

以蒸餾水做為溶劑提取到的代代花萼多酚記為CAVP-W，以乙醇做為溶劑提取到的代代花萼多酚記為CAVP-E，以甲醇做為溶劑提取到的代代花萼多酚記為CAVP-M。

所述乙醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為40～60％；優(yōu)選為50％。

所述甲醇水溶液的體積分?jǐn)?shù)為40～60％；優(yōu)選為50％。

所述溶劑與代代花萼粗粉的體積質(zhì)量比為(10～30)mL:1g；

所述溶劑與代代花萼粗粉的體積質(zhì)量比優(yōu)選為20:1；

所述加熱提取的溫度為80～100℃；優(yōu)選為90℃；所述加熱提取的時(shí)間為1～3h；優(yōu)選為1h。

所述離心的轉(zhuǎn)速為3000～5000r/min；優(yōu)選為4000r/min。

所述離心的時(shí)間為8～12min；優(yōu)選為10min。

所述去除溶劑的方式優(yōu)選為減壓濃縮和干燥；所述減壓濃縮的溫度為40～60℃，干燥的溫度為40～60℃，干燥的時(shí)間為18～24h。

所述代代花萼粗粉是將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)干燥，粉碎，過篩，得到。

所述干燥溫度為40～60℃；所述干燥時(shí)間為18～24h；所述粉碎過篩為50～60目篩。

一種代代花萼多酚(代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M))，通過上述制備方法制備得到。

所述代代花萼多酚(代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M))在制備抗炎藥物中的應(yīng)用；

所述的代代花萼多酚可作為新型的抗炎藥物，應(yīng)用于炎癥的治療。

一種抗炎藥物，含有上述代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M)中的至少一種。

本發(fā)明的原理：植物來源的多酚能通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的免疫功能體現(xiàn)出各種有益的藥理作用。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)和確證植物多酚具有顯著的抗炎活性，且植物多酚的使用劑量低，在同樣劑量下的毒副作用也較低。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

(1)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M)在體外能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的釋放。

(2)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M)在體外能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β、和COX-2mRNA的表達(dá)。

(3)本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M)在體外能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞p-ERK、p-JNK、p-p38、p-p65和COX-2蛋白的表達(dá)。

(4)代代花萼多酚(CAVP-W)，代代花萼多酚(CAVP-E)或代代花萼多酚(CAVP-M)的用藥劑量比較低，而且在有效用藥劑量范圍內(nèi)毒性較低。

附圖說明

圖1是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)、實(shí)施例4制備的代代花萼多酚(CAVP-E)和實(shí)施例7制備的代代花萼多酚(CAVP-M)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性作用圖；

圖2是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)、實(shí)施例4制備的代代花萼多酚(CAVP-E)和實(shí)施例7制備的代代花萼多酚(CAVP-M)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響圖；

圖3是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響圖；

圖4是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01；

圖5是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01。

圖6是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01；

圖7是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-1βmRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01；

圖8是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01；

圖9是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化ERK(p-ERK)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-ERK蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖10是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-JNK蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖11是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化P38(p-P38)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-P38蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-P38蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖12是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化P65(p-P65)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-P65蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-P65蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01；

圖13是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞COX-2蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為COX-2蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。

實(shí)施例中，小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7購自中科院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；代代花萼購自廣州清平藥材市場(chǎng)。

實(shí)施例1從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-W)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入100mL蒸餾水，充分震蕩搖勻，水浴鍋90℃加熱1h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)4000r/min下離心10min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮，50℃真空干燥至恒重即得代代花萼粗多酚(CAVP-W)。

實(shí)施例2從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-W)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中40℃干燥20h，用粉碎機(jī)粉碎后，過50目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入50mL蒸餾水，充分震蕩搖勻，水浴鍋80℃加熱2h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)3000r/min下離心8min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55℃下減壓濃縮，40℃真空干燥至恒重即得代代花萼粗多酚(CAVP-W)。

實(shí)施例3從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-W)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥18h，用粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入150mL蒸餾水，充分震蕩搖勻，水浴鍋100℃加熱3h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)5000r/min下離心12min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮，60℃真空干燥至恒重即得代代花萼粗多酚(CAVP-W)。

實(shí)施例4從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-E)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入100mL的50％乙醇溶液，充分震蕩搖勻，水浴鍋90℃加熱1h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)4000r/min下離心10min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮，45℃真空干燥至恒重，即得代代花萼粗多酚(CAVP-E)。

實(shí)施例5從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-E)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中40℃干燥20h，用粉碎機(jī)粉碎后，過50目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入50mL的40％乙醇溶液，充分震蕩搖勻，水浴鍋80℃加熱2h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)3000r/min下離心8min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55℃下減壓濃縮，50℃真空干燥至恒重即得代代花萼粗多酚(CAVP-E)。

實(shí)施例6從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-E)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥18h，用粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入150mL的60％乙醇溶液，充分震蕩搖勻，水浴鍋100℃加熱3h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)5000r/min下離心12min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮，60℃真空干燥至恒重即得代代花萼粗多酚(CAVP-E)。

實(shí)施例7從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-M)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中50℃干燥24h，用粉碎機(jī)粉碎后，過60目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入100mL的50％甲醇溶液，充分震蕩搖勻，水浴鍋90℃加熱1h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)4000r/min下離心10min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50℃下減壓濃縮，45℃真空干燥至恒重即得代代花萼粗多酚(CAVP-M)。

實(shí)施例8從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-M)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中40℃干燥20h，用粉碎機(jī)粉碎后，過50目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入50mL的40％甲醇溶液，充分震蕩搖勻，水浴鍋80℃加熱2h。加熱結(jié)束后，離心機(jī)3000r/min下離心8min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在55℃下減壓濃縮，50℃真空干燥至恒重，即得代代花萼粗多酚(CAVP-M)。

實(shí)施例9從代代花萼中制備得到代代花萼多酚(CAVP-M)

(1)將代代花萼(Citrus aurantium L.var.amara Engl)置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中60℃干燥18h，用粉碎機(jī)粉碎后，過40目篩，得代代花萼粗粉備用；

(2)稱量代代花萼粗粉5.0g于錐形瓶中，加入150mL的60％甲醇溶液，充分震蕩搖勻，水浴鍋100℃加熱3h；加熱結(jié)束后，離心機(jī)5000r/min下離心12min，取上層澄清液，將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60℃下減壓濃縮，55℃真空干燥至恒重，即得代代花萼粗多酚(CAVP-M)。

實(shí)施例10 MTT法檢測(cè)代代花萼多酚(CAVP-W)、代代花萼多酚(CAVP-E)和代代花萼多酚(CAVP-M)對(duì)RAW264.7細(xì)胞毒性的影響

分別取生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，1000rpm離心5min，棄去上清液，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)為3×10⁵/mL，100μL接種于96孔培養(yǎng)板中，置于5％CO₂培養(yǎng)箱中，37℃培養(yǎng)24h后，棄去上清液，各組分別加入含有CAVP-W(實(shí)施例1制得)、CAVP-E(實(shí)施例4制得)、CAVO-M(實(shí)施例7制得)的DMEM培養(yǎng)基(CAVO-W、CAVO-E和CAVO-M的終濃度分別為31.25μg/mL、62.5μg/mL、125μg/mL、250和500μg/mL)。在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，棄去上清液，PBS清洗兩次，每孔加入200μL不含血清的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基和20μL噻唑藍(lán)(MTT)，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，棄上清液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)，避光放置于微量振蕩器均勻震蕩10min，用酶標(biāo)儀測(cè)量在490nm波長(zhǎng)下的OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。圖1是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)、實(shí)施例4制備的代代花萼多酚(CAVP-E)和實(shí)施例7制備的代代花萼多酚(CAVP-M)對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的毒性作用圖。

在CAVO-W、CAVO-E和CAVO-M濃度為31.25～500μg/mL范圍內(nèi)，三種代代花萼多酚作用于RAW264.7細(xì)胞24h，對(duì)RAW264.7細(xì)胞的生長(zhǎng)均沒有毒性作用(圖1)。因此后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，CAVO-W、CAVO-E和CAVO-M的濃度設(shè)定為500、250、125、62.5、31.25和16.13μg/mL。

實(shí)施例11 Griess法檢測(cè)CAVO-W、CAVO-E和CAVO-M對(duì)RAW264.7細(xì)胞釋放NO的影響

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，1000rpm，離心5min去上清，培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度，按20萬個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+CAVP-W(實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚，終濃度為16.13、31.25、62.5、125、250和500μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+CAVO-E(實(shí)施例4制備得到的代代花萼多酚，終濃度為16.13、31.25、62.5、125、250和500μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+CAVO-M(實(shí)施例7制備得到的代代花萼多酚，終濃度為16.13、31.25、62.5、125、250和500μg/mL)組，對(duì)照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。分別取各孔細(xì)胞上清100μL，相應(yīng)加入另一新的96孔板中。每孔加50μL Griess試劑A，置于37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)10min，每孔再加50μL Griess試劑B，置于37℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)10min，立即置板于多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀上，在550nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值。圖2是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)、實(shí)施例4制備的代代花萼多酚(CAVP-E)和實(shí)施例7制備的代代花萼多酚(CAVP-M)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的影響圖。

CAVO-W、CAVO-E和CAVO-M能夠抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的釋放(圖2)。當(dāng)濃度為500μg/mL時(shí)，CAVO-W對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞NO的抑制率顯著高于CAVO-E和CAVO-M(P<0.01)，因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇CAVO-W進(jìn)行深入研究。

實(shí)施例12代代花萼多酚CAVO-W對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞影響的電子顯微鏡觀察

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RAW264.7細(xì)胞，吹打細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，顯微鏡下用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，1000rpm，離心5min去上清，培養(yǎng)基重懸并調(diào)整細(xì)胞濃度，按20萬個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于24孔培養(yǎng)板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)，貼壁24h，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔：Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+CAVP-W(實(shí)施例1制備得到的CAVP-W，終濃度為62.5、125、250和500μg/mL)組，對(duì)照組添加同體積的DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)24h。然后取出細(xì)胞在電子顯微鏡下拍照。圖3是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響圖。

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，隨著作用時(shí)間的改變，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，control組細(xì)胞呈圓形，邊界清晰，貼壁良好，給予LPS誘導(dǎo)后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，RAW264.7細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變逐漸明顯，出現(xiàn)體積變大，呈不規(guī)則圓形、橢圓形、伸出偽足，邊界不規(guī)則，部分細(xì)胞內(nèi)呈明顯泡沫化(圖3)。經(jīng)不同濃度的代代花萼多酚CAVP-W治療后，細(xì)胞形態(tài)改變緩慢，趨于正常(圖3)。

實(shí)施例13代代花萼多酚CAVO-W對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞iNOS、IL-6、TNF-α、IL-1β和COX-2mRNA表達(dá)的影響

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)生長(zhǎng)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，按100萬/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+CAVP-W(實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚CAVP-W，終濃度為62.5、125、250和500μg/mL)組，對(duì)照組添加同體積的培養(yǎng)基。給藥后，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)12h。作用12h后，吸棄細(xì)胞上清，PBS洗2次。每孔加入Trizol 1mL，靜置5min，吸管吹打至液體無粘稠物，吸取細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)入EP管，每管加入0.2mL氯仿，蓋上EP管蓋，手持用力上下震蕩10s，室溫靜置5min，4℃以12,000rpm離心15min，離心后轉(zhuǎn)移上層水相至另一EP管中，加入0.5mL異丙醇，室溫靜置10min，4℃離心機(jī)以12,000rpm離心10min，小心吸棄去上清，用冷體積分?jǐn)?shù)75％的乙醇1mL清洗2次，分別4℃條件下以7,500rpm離心5min，小心吸棄上清，空氣吹干，約15min，加入0～50μL RNase-free純水，60℃加熱10min溶解沉淀。測(cè)定mRNA的純度和濃度。并用RevertAid First Strand cnthesis Kit(Thermo公司)反轉(zhuǎn)錄試劑盒，20μL反應(yīng)體系，對(duì)RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用DyNAmo Flash SYRB Green qPCR Kit(Thermo公司)試劑盒，ABI實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Rrism 7500，Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA,USA)對(duì)mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后用ABI PRISM7500SDS軟件中Relative Quantification(ddCt)Study法進(jìn)行自動(dòng)分析以獲得目的基因的相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)基因mRNA引物序列為iNOS(forward,5′-CGG CAA ACA TGA CTT CAG GC-3′,reverse,5′-GCA CAT CAA AGC GGC CAT AG-3′)，IL-6(forward,5′-GTA CTC CAG AAG ACC AGA GG-3′,reverse,5′-TGC TGG TGA CAA CCA CGG CC-3′)，TNF-α(forward,5′-GGG GAT TAT GGC TCA GGG TC-3′,reverse,5′-CGA GGC TCC AGT GAA TTC GG-3′)，IL-1β(forward,5′-CCA TGG AAT CCG TGT CTT CCT-3′,reverse,5′-GTC TTG GCC GAG GAC TAA GG-3′)，COX-2(forward,5′-CAG CAA ATC CTT GCT GTT CC-3′,reverse,5′-TGG GCA AAG AAT GCA AAC ATC-3′)和GAPDH(forward,5′-CAC TCA CGG CAA ATT CAA CGG CAC-3′,reverse,5′-GAC TCC ACG ACA TAC TCA GCA-3′)。

圖4是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞iNOS mRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01。圖5是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-6mRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01。圖6是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01。圖7是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞IL-1βmRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01。圖8是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞COX-2mRNA表達(dá)的影響圖；其中，##：與control組比較，P<0.01；**：與LPS組比較，P<0.01。

與control組相比，LPS組分泌的iNOS、IL-6、IL-1β和COX-2顯著增加(P＜0.01)，表明LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞釋放NO的炎癥模型成立。代代花萼多酚CAVP-W可以抑制iNOS mRNA(圖4)、IL-6mRNA(圖5)、TNF-αmRNA(圖6)、IL-1βmRNA(圖7)和COX-2mRNA(圖8)的分泌(P＜0.05)。

實(shí)施例14代代花萼多酚CAVO-W對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞相關(guān)蛋白水平的影響

常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞，取對(duì)生長(zhǎng)數(shù)期的RAW264.7細(xì)胞，按100萬/孔細(xì)胞數(shù)接種于6孔板，孵育24h后，吸棄上清，按如下分組要求給藥，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。Control組，脂多糖(LPS，終濃度為1μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+地塞米松(DXM，終濃度為50μg/mL)組，LPS(終濃度為1μg/mL)+CAVP-W(實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚CAVP-W，終濃度為125、250和500μg/mL)組，對(duì)照組添加同體積的培養(yǎng)基。其中，LPS+CAVP-W組采用CAVO-II預(yù)先刺激2h后，再加脂多糖(LPS+地塞米松組同樣處理)，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱，繼續(xù)培養(yǎng)12h。作用2h后，吸棄細(xì)胞上清，并且用預(yù)冷的PBS清洗兩次，收集細(xì)胞至1.5mL離心管中，加入60μL的PIPA裂解液(含磷酸酶抑制劑(PhosSTOP，Roche)和蛋白酶抑制劑(cOmplete ULTRA Tablets，Mini，EDTA-free，EASYpack，Roche))，用1mL的注射器吸取裂解液反復(fù)吹打細(xì)胞至充分混勻，于冰上放置30min，每隔10min于渦旋振蕩器上振蕩30s。以12000rpm離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mLEP管，置于冰上待測(cè)定蛋白濃度。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度(按照BCA Protein Assay Kit說明書進(jìn)行)：先將濃度為2mg/mL的BSA溶液予超純?nèi)ルx子水稀釋為系列質(zhì)量濃度(0μg/mL、25μg/mL、125μg/mL、250μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL)的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，再根據(jù)需要配置一定量的工作液(BCA Solution:4％(體積分?jǐn)?shù))Cupric Sulfate＝200:4)。取一塊無底物的96孔板，每孔分別加入已稀釋好的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液25μL，以及需要檢測(cè)的蛋白溶液25μL(已稀釋5倍)，每組均設(shè)置復(fù)孔。同時(shí)加入200μL/孔工作液，輕輕震蕩混勻，置于37℃孵育30min后，取出，于多標(biāo)記微孔板檢測(cè)儀570nm處檢測(cè)OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液所測(cè)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出待測(cè)蛋白溶液濃度。根據(jù)BCA法測(cè)得的蛋白濃度，計(jì)算出40μg總蛋白所需蛋白體積，同時(shí)加5μL 5×SDS-PAGE上樣緩沖液，再補(bǔ)充相應(yīng)體積的超純?nèi)ルx子水至總體積為25μL，混勻，充分離心，使液體聚集在底部，100℃加熱變性10min，離心，置于冰上備用。選擇10％(體積分?jǐn)?shù))分離膠和5％(體積分?jǐn)?shù))濃縮膠，將已變性好的蛋白樣品依次加入各泳道，樣品兩側(cè)的泳道分別加入5μL Marker。電泳槽中加入足夠量的TGS緩沖液，電泳條件為：100V，約150min，直至溴酚藍(lán)指示劑跑至距膠下緣約0.5cm時(shí)，停止電泳。然后在冰浴中以100V的電壓轉(zhuǎn)膜100min。用含5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST封閉，緩慢搖蕩1h。一抗抗體分別為：GAPDH(14c10)Rabbit mAb、p-ERK、p-JNK、p-P38、p-P65和COX-2(均購自CST公司)，二抗抗體為山羊抗兔(HRP標(biāo)記)，購自聚研生物科技有限公司。按照說明書推薦的稀釋比例(1:1000)，配制一抗，室溫下輕搖孵育4h或4℃靜置過夜。一抗孵育結(jié)束后，更換二抗，HRP標(biāo)記的二抗按相應(yīng)比例稀釋(1:2000)，室溫輕搖1h。二抗結(jié)束后，加入發(fā)光液(購自BioFuture公司)并利用凝膠成像儀蛋白條帶顯影。

圖9是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化ERK(p-ERK)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-ERK蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-ERK蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖10是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化JNK(p-JNK)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-JNK蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-JNK蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖11是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化P38(p-P38)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-P38蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-P38蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖12是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞磷酸化P65(p-P65)蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為p-P65蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為p-P65蛋白相對(duì)表達(dá)量；其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。圖13是實(shí)施例1制備得到的代代花萼多酚(CAVP-W)對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞COX-2蛋白水平影響的結(jié)果分析圖，其中圖A為COX-2蛋白表達(dá)曝光圖，圖B為COX-2蛋白相對(duì)表達(dá)量。其中，##：與control組比較，P<0.01，**：與LPS組比較，P<0.01。

正常組RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)磷酸化的ERK、JNK、P38、P65和COX-2蛋白表達(dá)較低，當(dāng)1μg/mL的LPS作用細(xì)胞12h，細(xì)胞內(nèi)磷酸化的ERK、JNK、P38、P65和COX-2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，從而激活MAPK和NF-κB信號(hào)通路(圖9～12)。代代花萼多酚(CAVP-W)可以顯著下調(diào)p-ERK(圖9)p-JNK(圖10)、p-P38(圖11)、p-P65(圖12)和COX-2(圖13)蛋白表達(dá)。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南理工大學(xué)

<120> 一種代代花萼多酚及制備方法與在制備抗炎藥物中的應(yīng)用

<130> 1

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的forward

<400> 1

cggcaaacat gacttcaggc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> iNOS的reverse

<400> 2

gcacatcaaa gcggccatag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的forward

<400> 3

gtactccaga agaccagagg 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-6的reverse

<400> 4

tgctggtgac aaccacggcc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α的forward

<400> 5

ggggattatg gctcagggtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-α的 reverse

<400> 6

cgaggctcca gtgaattcgg 20

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的forward

<400> 7

ccatggaatc cgtgtcttcc t 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1β的reverse

<400> 8

gtcttggccg aggactaagg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-2的forward

<400> 9

cagcaaatcc ttgctgttcc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> COX-2的reverse

<400> 10

tgggcaaaga atgcaaacat c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的forward

<400> 11

cactcacggc aaattcaacg gcac 24

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> GAPDH的reverse

<400> 12

gactccacga catactcagc a 21