專利名稱：：知母皂苷bⅲ的制備方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物提取物的制備方法和用途，更具體地說涉及從中藥知母中提取分離有效成分知母皂苷Bin的方法，以及知母皂苷Bin在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：糖尿病是由于人體內(nèi)胰島素絕對或相對缺乏而引起的一種臨床常見病，血中葡萄糖濃度升高，進(jìn)而糖大量從尿中排出，并出現(xiàn)多飲、多尿、多食、消瘦、頭暈、乏力等癥狀。進(jìn)一步發(fā)展則引起全身各種嚴(yán)重的急、慢性并發(fā)癥，威脅身體健康。其中i型糖尿病患者完全失去產(chǎn)生胰島素的功能，依賴胰島素治療切需終身使用；n型糖尿病患者體內(nèi)胰島素處于相對缺乏狀態(tài)，不必完全依賴胰島素而可以用其它藥物治療。在糖尿病患者中，n型糖尿病占了大多數(shù)。糖尿病是現(xiàn)代社會中的常見病、高發(fā)病，嚴(yán)重威脅人類的健康和生命。目前，西醫(yī)治療糖尿病的主要方法為胰島素治療和口服磺脲類、雙胍類等降血糖藥物，但胰島素治療價格昂貴，而其它類型藥物或療效有限，或毒副作用明顯。近年來，大量研究表明，中藥在n型糖尿病的臨床治療中顯示出很大優(yōu)勢，但現(xiàn)有中成藥大多有效成分不清，作用機(jī)理不明，劑型落后，急待開發(fā)出有效成分和作用機(jī)理清楚、質(zhì)量穩(wěn)定可控、劑型先進(jìn)、服用攜帶方便的中藥制劑。ct-葡萄糖苷酶又叫(X-D-葡萄糖苷水解酶，它是小腸內(nèi)麥芽糖、蔗糖的水解酶。飲食中的碳水化合物在a-葡萄糖苷酶的作用下，釋放葡萄糖并經(jīng)小腸吸收進(jìn)入血液，是餐后血糖升高的主要原因，而餐后高血糖可引起胰島素敏感性降低從而加重病情并導(dǎo)致一系列并發(fā)癥，因此找到合適的酶抑制劑，對防治糖尿病及其并發(fā)癥將有重要的意義。抑制a-葡萄糖苷酶活性，可減緩葡萄糖的生成和吸收，降低血糖水平。中藥知母清熱瀉火，生津潤燥，主要具有抗菌、抗病毒、解熱、降血糖等作用。到目前為止，已有了知母總苷、知母皂苷AIII和芒果苷抗糖尿病方面的活性，對知母皂苷BIII的活性報道較少，HiroyukiKodama在其文章(Effectofsixsteroidalsaponinsisolatedfromanemarrhenaerhizomaonplateletaggregationandhemolysisinhumanblood,C"w/caC7n'm/caJcto,1999289:79-88)中報道了它對人體血小板聚合以及溶血方面的影響。但還未見知母皂苷BIII((3卩,5卩,25S)-26-0-卩-0-吡喃葡萄糖基-呋甾-20(22)-烯-3,26-二醇-3-0-卩-D-吡喃葡萄糖基(1—2)-0-|3-0-吡喃半乳糖苷)治療糖尿病方面的報道。對于知母皂苷BI^的提取分離方法己有如下報道馬百平報道了知母皂苷B的提取工藝("知母中呋甾皂苷的研究"，藥學(xué)學(xué)報，1996，31(4):271-277)，該方法先以溶劑提取，再以硅膠柱層析，所得的混合物需要用制備型hplc反復(fù)分離、純化，得知母皂苷B(該化合物即知母皂苷BIII)。HiroyukiKodama也報道了該化合物的分離方法(Effectofsixsteroidalsaponinsisolatedfromanemarrhenaerhizomaonplateletaggregationandhemolysisinhumanblood,CV/wz'caC7n7m.caJcto,1999,289:79—88)，該方法也是先以溶劑提取，再分別用大孔樹脂柱、硅膠柱層析，所得產(chǎn)品再用hplc分離，即得知母皂苷BIII。以上兩種方法均采用了溶劑提取、柱層析分離以及hplc分離制備的方法。但hplc分離方法只適用于實驗室，不能滿足于工業(yè)上的應(yīng)用。本發(fā)明制備方法相對簡單，用結(jié)晶等工藝操作代替了HPLC制備，向工業(yè)化生產(chǎn)更邁進(jìn)了一步。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種知母皂苷Bin的制備方法，該方法采用化學(xué)途徑從中藥知母中分離出有效成分一一知母皂苷Bin。本發(fā)明的另一目的在于提供上述知母皂苷BIII的醫(yī)藥用途，經(jīng)體內(nèi)、外藥理試驗，提供該化合物在制備治療糖尿病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所涉及的知母皂苷biii結(jié)構(gòu)如下，該化合物分子式為c45h74o18，分子量為902，化學(xué)名為(3p，5f3,25S)J6-0-(3-D-吡喃葡萄糖基-呋甾-20(22)-烯-3,26-二醇-3-0-P-D-口比喃葡萄糖基(1—2)-O-p-D-吡喃半乳糖苷。為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案本發(fā)明公開的知母皂苷BIII的制備方法，其步驟如下1)取知母藥材，用C6C3o的脂肪烴溶劑滲漉脫脂，干燥；2)對上述脫脂后產(chǎn)物用dCs醇回流提取，過濾，合并濾液，減壓蒸餾除去溶劑，得知母浸膏；3)將步驟2)中所得的浸膏以水混懸，并用水飽和的C4Q的醇萃取，除去溶劑，干燥-，4)將上述步驟3)中所得的產(chǎn)物用硅膠柱層析，先以氯仿洗脫，然后用氯仿-正丁醇洗脫，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑至干''5)將步驟4)中所得樣品又一次通過硅膠層析柱進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇為洗脫劑洗脫，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑，得知母皂苷BIII粉末；6)將上述干燥粉末用dCs的醇進(jìn)行重結(jié)晶，得知母皂苷BIII。上述制備方法步驟2)中，原料與dCs醇的重量比為l:520;步驟3)中，原料與水的重量比為1:0.53.5，原料與C4C8的醇的重量比為1:0.53.5;步驟4)中，氯仿-正丁醇的體積比為20:11:1;步驟5)中，氯仿-甲醇的體積比為10:11:1。上述制備方法中，步驟l)中所述的脫脂溶劑優(yōu)選汽油或石油醚；步驟2)中所述的提取溶劑優(yōu)選5090%乙醇；步驟3)中所述的萃取溶劑優(yōu)選正丁醇；步驟6)中所述的dCs的醇優(yōu)選甲醇或乙醇。本發(fā)明采用上述方法提取得到的知母皂苷BIII首先進(jìn)行常規(guī)的體內(nèi)、體外藥效試驗。1.體外a-葡萄糖苷酶抑制實驗。本實驗主要是通過體外觀察該化合物對Ct-葡萄糖苷酶抑制率來得出其抑制效果。結(jié)果表明，本發(fā)明藥物在體外抑制a-葡萄糖苷酶的活性與陽性對照藥拜糖平相近，可在制備a-葡萄糖苷酶抑制劑中應(yīng)用。2.體內(nèi)葡萄糖耐量試驗葡萄糖耐量是衡量糖代謝的主要指標(biāo)之一，進(jìn)食后一定時間內(nèi)血糖可以恢復(fù)到基礎(chǔ)值，而患病鼠在相同時間內(nèi)血糖不能恢復(fù)到基礎(chǔ)值。本實驗以小鼠為模型，通過測定給糖前和給糖后的血糖值來進(jìn)行測試。以正常的禁食不禁水的小鼠為空白對照組，以經(jīng)口給予蒸餾水和蔗糖的小鼠為模型對照組，對模型對照組的小鼠分別給藥，所用藥物為知母皂苷BIII，通過測定幾組不同時間小鼠的血糖值來進(jìn)行體內(nèi)實驗。結(jié)果表明，本發(fā)明藥物可顯著降低ICR小鼠給糖前和給糖后的血糖值，明顯改善其糖負(fù)荷，可在制備治療糖尿病藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果該發(fā)明中知母皂苷BIII的制備方法相對簡單，用一些結(jié)晶等工藝操作代替了HPLC制備，向工業(yè)化生產(chǎn)更邁進(jìn)了一步。同時，糖尿病是影響人類健康的非常嚴(yán)重的疾病，但目前還沒有治療II型糖尿病的特效藥物，該化合物在體內(nèi)外表現(xiàn)出了很好的抗糖尿病活性，并且為首次發(fā)現(xiàn)，不僅開拓了其應(yīng)用領(lǐng)域，也有可能成為未來治療糖尿病的有效藥物。具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但不限制本發(fā)明。實施例l:知母皂苷BIII的提取分離方法一取知母藥材5.0千克，汽油滲漉脫脂，干燥。以25升85%乙醇回流提取三次，每次回流2小時，過濾，合并濾液。減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，將浸膏以6升水混懸，用水飽和過的4升正丁醇萃取四次。將正丁醇層回收、干燥，得浸膏135克。用甲醇拌樣進(jìn)行硅膠柱(2700克，160-200目)層析。先以氯仿洗脫，至色淡為止；然后用氯仿-正丁醇(1:1)洗脫。TLC檢測，展開劑為正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)上層。以10%磷鉬酸乙醇110oC為顯色劑，合并含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑至干,得浸膏23克。將該浸膏繼續(xù)通過硅膠層析柱進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇(5:3)為洗脫劑洗脫，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑，得粉末3克。將上述干燥粉末用甲醇溶解、結(jié)晶，得白色顆粒狀固體。繼續(xù)用甲醇重結(jié)晶，得知母皂苷BIII。經(jīng)HPLC面積歸一法測定該化合物的純度為90%。其波譜數(shù)據(jù)如下知母皂苷Bill白色無定型粉末。Liebermann-Burchard反應(yīng)和Molish反應(yīng)均呈陽性。HRESIMS(positivemode)w/z:925.4766[M+Na]+(calcd.925.4773);^NMR(400MHz，吡啶-^):55.37(1H，d，《/=7.8Hz，H-l"),4.87(1H，d,/=7.6Hz,H-l，)，4.77(1H,d,J=7.6Hz，H畫l"，)，1.62(3H,s,H-21),0.94(3H,d,/=6.8Hz,H-27)，0.91(3H，s,H-19),0.67(3H,s,H-18);13CNMR(100MHz,吡啶-A):S152.2(C-22),106.0(C-l")，105.1(C-l，")，103.5(C-20),102.5(C畫l，)，84.5(C-16),81.7(C-2，)，78.4(C-5，，)，78.4(C-3"),78.4(C-5"),77.9(C陽3"),76.9(C-3，)，76.5(C畫5')，75.5(C-2，，)，75.1(C-2"，)，75.1(C-3),75.1(C-26),71.6(C-4")，71.6(C-4,"),69.7(C-4，)，64.5(C-17),62.6(C-6"),62.6(C-6"，)，62.1(C-6,),54.6(C-14),43.7(C-13)，41.0(C-9)，40.9(C-12),36.8(C-5),35.1(C-8),35.1(C-10),34.3(C-23),33.6(C畫25)，31.3(C-15),30.8(C-l):30.8(C-4),26.7(C-2),26.7(C-6)，26.7(C-7),23.9(C-19),23.5(C-24),21.2(C-ll)，17.1(C-27),14.3(C-18),11.8(C-21).實施例2:知母皂苷BIII的提取分離方法二取知母藥材5.0千克，石油醚滲漉脫脂，干燥。以40升甲醇回流提取三次，每次回流2小時，過濾，合并濾液。減壓回收溶劑，濃縮至無醇味，得知母浸膏1.2千克。將浸膏以IO升水混懸，用水飽和過的IO升正戊醇萃取四次。將正戊醇層回收、干燥，得浸膏150克。用甲醇拌樣進(jìn)行硅膠柱(2700克，160-200目)層析。先以氯仿洗脫，至色淡為止；然后用氯仿-正丁醇(5:1)洗脫。TLC檢觀U，展開劑為正丁醇-乙酸乙酯-水(4:1:5)上層。以10%磷鉬酸乙醇為顯色劑，合并含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑至干,得浸膏24克。將該浸膏繼續(xù)通過硅膠層析柱進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇(6:1)為洗脫劑洗脫，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑，得粉末3.1克將上述干燥粉末用乙醇溶解、結(jié)晶，得白色顆粒狀固體。繼續(xù)用甲醇重結(jié)晶，得知母皂苷BIII。經(jīng)HPLC面積歸一法測定該化合物的純度為87%。實施例3:體外抑制a-葡萄糖苷酶活性試驗a)試劑與儀器a-葡萄糖苷酶(EC232-604-7)，購于美國Sigma公司，pNPG(4硝基苯-a-D-吡喃葡萄糖苷)(EC223-189-3)，購于Sigma公司無水碳酸鈉、磷酸鹽等，均為分析純。酶標(biāo)儀BIO-TECKInstruments,美國產(chǎn)。b)試劑配制磷酸緩沖液(67mM，PH6.8):稱量適量的K2HP043H20溶液，用磷酸調(diào)至pH6.8，4。C保存待用。酶液稱取適量的a-葡萄糖苷酶凍干粉用67mM，PH6.8磷酸緩沖液稀釋，濃度0.5mg/ml，0.5ml—管分裝，-20°0凍存。底物PNPG:用磷酸緩沖液(67mM，PH6.8)配成29mMa-PNPG，，分裝，-2(TC保存。反應(yīng)終止液用蒸餾水配制lMNa2C03，4"C保存。c)操作步驟中藥抑制活性的測定反應(yīng)系統(tǒng)為67mM磷酸鹽緩沖液(PH=6.8)145ul，0.5mg/mla-葡萄糖苷酶5ul，適當(dāng)濃度的藥物稀釋液20ul，37。C孵育10min，加入0.029MpNPG10ul，37。C孵育10min，加入100ullMNa2C03，405nm檢測在酶的作用下釋放出硝基苯酚的量?？瞻卓拙彌_液+酶液+底物+終止液?？瞻讓φ湛拙彌_液+終止液。反應(yīng)孔緩沖液+酶液+藥物+底物+終止液。反應(yīng)對照孔緩沖液+酶液+藥物+終止液。讀數(shù)96孔板用酶標(biāo)儀測405nm處的OD值。d)數(shù)據(jù)處理'a:空白孔；b:空白對照孔；C:反應(yīng)孔；d:反應(yīng)對照孔。抑制率(％)=[1-(c-d)/(a-b)]x100%知母皂苷BIII對a-葡萄糖苷酶的抑制活性如表1所示。表l:知母皂苷BlII對a-葡萄糖苷酶的抑制活性<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>結(jié)果表明知母皂苷BlII在體外a-葡萄糖苷酶的抑制活性與陽性對照藥拜糖平相近。實施例4:體內(nèi)對正常ICR小鼠糖耐量的影響試驗a)實驗材料實驗動物清潔級ICR小鼠160只，體重23士2g，雄性，由中科院上海實驗動物中心供應(yīng)，動物質(zhì)量合格證SCXK(滬)2003-0003號。強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖儀，強(qiáng)生穩(wěn)豪型血糖試紙，LIFESCAN公司生產(chǎn)。蔗糖，分析純AR，中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司生產(chǎn)。b)試驗條件SPF級ICR小鼠實驗詞養(yǎng)室，溫度23±1°C，濕度50-70%，噪音<50dB，光照150-200Lx，12小時明暗交替(早6:00-晚18:00)，自由飲食。c)試驗劑量、途徑與體積100mg/Kg，灌胃給試劑體積為0.3ml，蔗糖0.2ml，陽性藥物O.lml。d)試驗方法正常ICR小鼠禁食不禁水15小時，分成四組。其中一組小鼠禁食不禁水，作為空白對照組；其余三組小鼠經(jīng)口給予蒸餾水和蔗糖蔗糖2.5g/kg，作為模型對照組。對模型對照組的小鼠分別灌胃給藥，一組所用藥物為知母皂苷BIII，另外一組所用藥物為拜糖平，余下一組作為對照。分別測定給葡萄糖后O、30、60、120min的血糖值，觀察各組給葡萄糖后各時間點血糖曲線下面積的變化情況。知母皂苷BIII在體內(nèi)對正常ICR小鼠糖耐量的影響如表2所示。表2:知母皂苷BIII對正常ICR小鼠糖耐量的影響(5±s)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>注與模型對照組比較**P<0.01血糖曲線下面積^/4x(0min血糖值+2x30min血糖值+3x60min血糖值+1201^11血糖值)。結(jié)果顯示知母皂苷BIII可顯著降低ICR小鼠給糖前和給糖后的血糖值，明顯改善其糖負(fù)荷。見表2。權(quán)利要求1.一種具有如下結(jié)構(gòu)的知母皂苷BIII的制備方法，其步驟包括1)取知母藥材，用C6～C30的脂肪烴溶劑滲漉脫脂，干燥；2)對上述脫脂后產(chǎn)物用C1～C5醇回流提取，過濾，合并濾液，減壓蒸餾除去溶劑，得知母浸膏；3)將步驟2)中所得的浸膏以水混懸，并用水飽和的C4～C8的醇萃取，除去溶劑，干燥；4)將上述步驟3)中所得的產(chǎn)物用硅膠柱層析，先以氯仿洗脫，然后用氯仿-正丁醇洗脫，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑至干；5)將步驟4)中所得樣品又一次通過硅膠層析柱進(jìn)行分離，以氯仿-甲醇為洗脫劑洗脫，收集含知母皂苷BIII的流分，回收溶劑，得知母皂苷BIII粉末；6)將上述干燥粉末用C1～C5的醇進(jìn)行重結(jié)晶，得知母皂苷BIII。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷BIII的制備方法，其特征在于，步驟2)中，原料與C,Cs醇的重量比為1:520。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷BIII的制備方法，其特征在于，步驟3)中，原料與水的重量比為l:0.53.5;原料與C4Q的醇的重量比為1:0.53.5。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷BIII的制備方法，其特征在于，步驟4)中，氯仿-正丁醇的體積比為20:11:1。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷BIII的制備方法，其特征在于，步驟5)中，氯仿-甲醇的體積比為10:11:1。6.根據(jù)權(quán)利要求15所述的知母皂苷BIII的制備方法，其特征在于，步驟l)中所述的脫脂溶劑為汽油或石油醚；步驟2)中所述的提取溶劑為5090%乙醇；步驟3)中所述的萃取^劑為正丁醇。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的知母皂苷BIII的制備方法，其特征在于，步驟6)中所述的C,C5的醇為甲醇或乙醇。8.如權(quán)利要求1所述的制備方法得到的知母皂苷BIII，其特征在于，在制備治療糖尿病的藥物中應(yīng)用。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的知母皂苷BIII的用途，其特征在于，在制備(X-葡萄糖苷酶抑制劑中應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及知母皂苷BIII的制備方法，該方法采用化學(xué)途徑從中藥知母中分離出有效成分——知母皂苷BIII。同時經(jīng)體內(nèi)、外藥理試驗證明，該化合物對α-葡萄糖苷酶具有顯著抑制活性，并可有效降低動物血糖，可在制備α-葡萄糖苷酶抑制劑和治療糖尿病的藥物中應(yīng)用。本發(fā)明的知母皂苷BIII的制備方法操作簡單，用結(jié)晶等工藝代替了HPLC制備，更有利于工業(yè)化生產(chǎn)。同時，該化合物在體內(nèi)外表現(xiàn)出了很好的抗糖尿病活性，不僅開拓了其應(yīng)用領(lǐng)域，也有可能成為未來治療糖尿病的有效藥物。文檔編號A61K31/7042GK101307090SQ200710040730公開日2008年11月19日申請日期2007年5月16日優(yōu)先權(quán)日2007年5月16日發(fā)明者唐意紅,孫兆林,松施,朱海燕,李志雄,范明松,趙維民,馬春輝,黃成鋼申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所