專利名稱：：含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗腫瘤藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及抗腫瘤藥物，具體是關(guān)于一種含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗腫瘤藥物。
背景技術(shù)：
：枸骨，是為常綠灌木或小喬木，生于山坡、谷地、溪邊雜木林及灌叢中，分布于長江中下游。學名llexcomutaLindl，英文名HornyHolly;ChineseHolyLeaf,科名:冬青科Aquifoliaceae，別名鳥不宿，功勞葉、苦丁茶、八角刺，貓兒刺，枸骨刺，八角茶，老鼠剌，老虎刺，狗青窮，羊角刺。從枸骨中分離得到的化合物分別為枸骨甙l(fā)(坡摸酸3-P-O-a-L-吡喃阿拉伯糖甙)，枸骨甙2(3-P-O-D-吡喃葡萄糖基坡摸酸-3-28-0-D-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙3(3-0-O-(P-D-吡喃葡萄糖基)-a-L-吡喃葡萄糖基坡摸酸-3-28-0-D-吡喃葡萄糖酯的類似物)，枸骨甙4(3-6-0-(卜0-吡喃葡萄糖基)-(1-L-吡喃葡萄糖基坡摸酸-0-28-0。-吡喃葡萄糖酯)，枸骨甙5(坡摸酸3-P-O-a-L-2'-乙酰氧基吡喃阿拉伯糖基-28-0-卩-0-吡喃葡萄糖酯),枸骨甙6(3-p_0_(p-D-吡喃葡萄糖基)-a-L-4-乙酰氧基吡喃阿拉伯糖基坡摸酸-P-28-O-D-吡喃葡萄糖酯)；枸骨甙7(3-P-O-a丄-卩比喃阿拉伯糖基-28-0-P-D-吡喃葡萄糖酯)，胡蘿卜甙，4-二羥基苯甲酸，4-二羥基桂皮酸，長鏈脂肪酸或醇5個,羽扇豆醇，ll-酮基-a-香樹脂醇棕櫚酸酯,a-香樹脂醇棕櫚酸酯，3，28-烏索酸二醇，熊果酸，30-醛基羽扇豆醇，30-酮基降羽扇豆醇，鏈狀倍半萜，甾醇0-谷甾醇，正二十二垸酸，正二十六烷酸，七葉內(nèi)酯，槲皮氣異鼠李素，金絲桃苷，3-0-a丄-阿拉伯吡喃糖-28-0-6'-0-甲基葡萄糖坡摸醇酸苷,23-羥基烏索酸_3-0-a丄-阿拉伯吡喃糖(1—2)P-0-葡萄糖醛酸-28-0-3-D-葡萄糖苷，6、7-二甲氧基香豆素，咖啡堿，皂甙，鞣質(zhì)和苦味質(zhì)(李維林等，植物資源與環(huán)境學報，2003年02期，45-57;吳鼓等，中國藥學雜志，2005年，19期，67-72)。文獻報道整個枸骨植物是墮胎藥、驅(qū)風劑，避孕藥、退熱藥和補藥；能治療關(guān)節(jié)炎，肺結(jié)核，淋巴結(jié)核和腰痛；葉能補肝腎，養(yǎng)氣血，祛風濕，用于肺癆咳嗽、勞傷失血、腰膝痿弱、風濕痹痛、跌打損傷,肺結(jié)核潮熱和咯血;枸骨莖是滋補藥;果實常用于白帶過多和慢性腹瀉;根常用治風濕痛和黃疽肝炎(閻玉凝等，中國藥學雜志，2000年zl期，25-38;王亞娜等，中草藥，1997，28(Suppl.):H7;李維林等，中藥材，2003，26(8):595-598);枸骨葉脂溶性化學成分具有抗動脈粥樣硬化作用(吳撥等，中國藥學雜志，2005年，19期，67-72)。枸骨的水及醇浸液或其他有關(guān)制劑給小鼠灌胃，皆可使之減少懷孕，抑孕率為80100%;陰道涂片法證明，枸骨能使小鼠正常性周期發(fā)生改變，主要是使休息期延長，其次是超越或縮短動情期；枸骨葉的醇提物(綠色粉狀物，有甙的反應(yīng))有避孕作用，組織切片未發(fā)現(xiàn)子宮及卵巢的病理變化，故認為是生理性避孕(魏成武，中藥通報，1988,13(5):48)。枸骨葉的醇提物I、乙酸乙酯萃取物II、正丁醇萃取物III具有明顯抑制ConA刺激T淋巴細胞增殖反應(yīng)的作用；枸骨葉醇提物I與乙酸乙酯萃取物II能明顯抑制ConA刺激T淋巴細胞CD69分子的表達；枸骨葉水提物無免疫抑制作用；結(jié)論是枸骨葉脂溶性萃取物具有較強抑制T淋巴細胞活化、增殖的化學成分(林晨等，暨南大學學報；自然科學版，2006Vol.27No.2P.199-203)。枸骨葉不同溶劑提取物的體外抑菌活性結(jié)果表明枸骨葉中的3種溶劑組分均顯示一定的抑菌效果，其乙酸乙酯萃取物對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌效果最為顯著；醇提取物和正丁醇萃取物對金黃色葡萄球菌也顯示較好的抑菌效果；枸骨葉脂溶劑萃取物成分對病原性念珠菌的生長有一定的抑菌活性(邢瑩瑩等，暨南大學學報自然科學版，2004，25(1):119-121;張晶等，中國病理生理雜志，2003,19(11);1562;林晨等，中國人獸共患病雜志，2005年09期，186)。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，枸骨水提取物或枸骨醇提取物具有抗腫瘤的活性，能開發(fā)成新的抗腫瘤藥物。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種含有枸骨水提取物或枸骨醇提取物的抗腫瘤藥物，它是以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作為有效成分的抗腫瘤藥物?？鼓[瘤藥物中含有抗腫瘤有效量的枸骨水提取物或枸骨醇提取物及可藥用載體和/或賦形劑?？伤幱幂d體和/或賦形劑可以是PBS、生理鹽水、玉米油、5-30。/。Captisol等。本發(fā)明人通過試驗證明枸骨水提取物或枸骨醇提取物能廣泛抑制多種類型的人腫瘤細胞系生長，并進一步誘導腫瘤細胞凋亡。在人腫瘤異種移植模型研究中，枸骨水提取物或醇提取物被證明是一種有效的抗腫瘤劑，能強烈抑制人子宮肉瘤，前列腺癌，肺癌和結(jié)腸癌細胞在體內(nèi)生長。枸骨水提取物或枸骨醇提取物具有被開發(fā)成為新的廣譜抗腫瘤藥物的巨大潛力。枸骨水提取物或枸骨醇提取物的制備方法(參見秦文娟等，中草藥，1988，19(10):2)。藥物原材料采集枸骨全株植物，包括有枸骨葉，枸骨莖和枸骨根。將枸骨全株植物洗凈，曬干，切片和粉碎，粉碎后達100-500目。然后取粉碎的枸骨全株植物500克，分別采用水提和醇提方法對所述枸骨生藥進行加工處理枸骨水提取物的制備用水提法，將粉碎的枸骨生藥500克，在(5-20升)蒸餾水中浸泡過夜，第二天將該浸泡的枸骨液煮沸提取5小時，然后用多層(4-12層)紗布過濾水提液，并將水提液加熱濃縮到50-200毫升體積后，離心(10000g)去渣，上清液通過0.2微米孔徑的濾膜過濾，然后將濾液經(jīng)低溫干燥(-14(TC)或熱噴霧(15(TC-19(rC)干燥，即得水提取物。枸骨水提取物為綠色粉末，在水中溶解度為500mg/ml。枸骨醇提取物的制備用醇提法，同樣取上述粉碎好的枸骨生藥500克浸泡在5升(2-10升)95%醫(yī)用乙醇(酒精)中，浸泡(3小時-5天)后，將乙醇浸泡液用多層(4-12層)紗布過濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，當乙醇提取物濃縮到100-200毫升體積后，離心(10000g)，上清液通過0.2微米孔徑濾膜過濾，然后將濾液低溫干燥(-14(TC)即得醇提取物。枸骨醇提取物為深綠色粉末，在乙醇中溶解度為80mg/ml。枸骨水提取物或枸骨醇提取物的藥理試驗1.體外試驗(1)使用人腫瘤細胞系進行細胞毒性試驗在含有不同濃度枸骨水提取物或枸骨醇提取物的正常培養(yǎng)基中培養(yǎng)29種腫瘤細胞株，3天后應(yīng)用MTT法測定細胞存活情況。結(jié)果(表1)顯示大多數(shù)人體腫瘤細胞對枸骨水提取物或枸骨醇提取物敏感。有些腫瘤細胞對枸骨水提取物或枸骨醇提取物的EC50低于0.1mg/ml。但是，正常人乳腺上皮細胞(MCF10a)對枸骨水提取物或枸骨醇提取物不敏感，即便枸骨水提取物或枸骨醇提取物的濃度高達10mg/ml,這些細胞仍然生長良好。體外試驗證明枸骨水提取物或枸骨醇提取物能廣泛抑制人體腫瘤細胞生長，但對正常細胞株沒有作用。表1枸骨水提取物或枸骨醇提取物體外抑制人腫瘤細胞生長<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>(2)枸骨水提取物抑制腫瘤細胞生長周期試驗為了研究枸骨水提取物是否具有抑制腫瘤生長周期作用，對枸骨水提取物抑制人肺癌細胞A549生長周期作用進行試驗。分別加入濃度為0mg/ml，0.033mg/ml或O.lmg/ml枸骨水提取物。試驗結(jié)果如圖1-圖3所示，枸骨水提取物能抑制腫瘤細胞生長，并將腫瘤細胞生長停留在G1期。(3)枸骨水提取物誘導腫瘤細胞凋亡試驗為了研究枸骨水提取物是否具有誘導腫瘤細胞凋亡的作用，采用AnnexinV(AV)和7-ADD聯(lián)合染色法檢測枸骨水提取物處理后腫瘤細胞出現(xiàn)的細胞凋亡現(xiàn)象，AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期的細胞的胞膜結(jié)合，因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。本發(fā)明對枸骨水提取物誘導人肺癌細胞A459細胞凋亡進行試驗，分別加入濃度為0毫克/毫升，0.033毫克/毫升，0.1毫克/毫升枸骨水提取物樣品，經(jīng)培養(yǎng)，消化，反應(yīng)后，在細胞流動儀(FACS)上分析。對照組為未經(jīng)處理的細胞對照,排除自發(fā)凋亡;不加染色劑的對照；只加AV的對照；只加7—ADD的對照。結(jié)果判斷正常細胞AnnexinV和7—AAD均低染，凋亡細胞AnnexinV高染，7—AAD低染，壞死細胞AnnexinV和7—AAD均高染。實驗結(jié)果(圖4)顯示枸骨水提取物具有極強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力。(4)枸骨水提取物含有抗癌活性成分的分析試驗取枸骨水提取物樣品上柱葡聚糖凝膠SephadexLH-20色譜分離柱，共收集16個分離組份(這16個分離組分都是含有不同化合物的混合物)，減壓濃縮干燥后，各自用1毫升生理鹽水溶解并進行檢測是否含有抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的活性成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離組份3，分離組份7，分離組份9，分離組份11和分離組份13都具有抑制腫瘤細胞的作用，而且還發(fā)現(xiàn)這些組份混合在一起具有強大的協(xié)同作用。這一結(jié)果說明枸骨水提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個至少由5種以上的有機化合物所組成的混合物。(5)枸骨醇提取物含有抗癌活性成分的分析試驗取枸骨醇提取物樣品減壓濃縮成膠狀物，然后逐次用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇和乙醇進行抽提，各有機溶劑抽提液(這些抽提液樣本也都是含有多種化合物的混合物)減壓，濃縮和干燥，并各自用0.5毫升二甲基亞砜溶解，然后檢測是否含有抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的活性成分，結(jié)果石油醚和乙酸乙酯抽提物都含有抗腫瘤的有效成份，這一結(jié)果說明枸骨醇提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個至少由2種以上的有機化合物所組成的混合物。2.應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠模型進行枸骨水提取物的抗腫瘤有效性試驗在枸骨水提取物有效抑制多種腫瘤細胞體外增殖的基礎(chǔ)上，應(yīng)用人腫瘤移植裸鼠(皮下接種)評價枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液的抗腫瘤作用，受試的腫瘤細胞包括人前列腺癌細胞LnCAP，人肺癌細胞NCI-H23，人結(jié)腸癌細胞HCT-116和人子宮肉瘤細胞MES-SA。結(jié)果(圖5-圖8)顯示，枸骨水提取物注射液強烈抑制這四種腫瘤生長，其TGI值分別為25.8%,37%，40.8%，和19.8%。同樣也發(fā)現(xiàn)枸骨水提取物口服液能非常有效地抑制這四種腫瘤生長，其TGI值分別為33.8%，48.4%，48.7%,和24.2%。同時未發(fā)現(xiàn)枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液具有明顯的副作用，包括體重的變化。這些數(shù)據(jù)明顯提示，枸骨水提取物和枸骨醇提取物是開發(fā)新的抗腫瘤藥物很好的候選物。3.枸骨水提取物給藥后對小鼠的急性毒性試驗受試小鼠處死后，進行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量15g/Kg或多次劑量3g/kg(QDX15)灌胃給予枸骨水提取物口服液，或以單次劑量1.5g/kg或多次劑量0.3g/kg(QDX15)尾靜脈注射給予枸骨水提取物注射液，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。4.枸骨醇提取物給藥后對小鼠的急性毒性試驗受試小鼠處死后進行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量1.5g/kg或多次劑量0.3g/kg(QDX15)給予枸骨醇提取物口服液或枸骨醇提取物注射液，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。由以上藥理試驗的效果證明，枸骨水提取物或枸骨醇提取物對29種腫瘤細胞株的細胞毒性試驗結(jié)果顯示有廣譜的抗腫瘤作用；枸骨水提取物能抑制腫瘤細胞生長，并將腫瘤細胞生長停留在Gl期；枸骨水提取物具有極強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力；在人腫瘤移植裸鼠模型試驗中，枸骨水提取物顯示出對人前列腺癌細胞LnCAP、人肺癌細胞NCI-H23、人結(jié)腸癌細胞HCT-116和人子宮內(nèi)瘤細胞MES-SA有強烈的抑制腫瘤生長的作用，同時未有明顯的副作用；對小鼠的急性毒理試驗也顯示未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。因此枸骨水提取物或枸骨醇提取物是具有很大開發(fā)前景的廣譜抗腫瘤新藥，枸骨水提取物或枸骨醇提取物可作為抗腫瘤藥物的原料藥，優(yōu)先作為抗惡性實體瘤藥物的原料藥，枸骨水提取物或枸骨醇提取物也可與可藥用載體和/或賦形劑制成抗腫瘤藥物。所述可藥用載體和/或賦形劑例如PBS，生理鹽水，玉米油，5-30。/。Captisol等。枸骨水提取物或枸骨醇提取物在應(yīng)用時，可采用常規(guī)方法，分別制成口服液或注射液枸骨水提取物口服液制備取制得的枸骨水提取物樣品，溶解于蒸餾水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過濾，濃縮成每毫升含300毫克干重枸骨根水提取物，滅菌，即為口服液。枸骨水提取物注射液制備取制得的枸骨水提取物樣品，經(jīng)多次反復90%酒精沉淀(酒精沉淀的目的是沉淀掉植物粘多糖化合物，植物多肽或植物蛋白，這些物質(zhì)在配制注射液時都會造成受試動物發(fā)生變態(tài)反應(yīng))，其上清液經(jīng)減壓濃縮回收酒精，最后冷凍(-14(TC斤燥，將干燥物溶解在生理鹽水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過濾，濃縮成每毫升含30毫克干重枸骨水提取物，滅菌，即為注射液。枸骨醇提取物口服液制備取制得的枸骨醇提取物樣品，用精制玉米油溶解，配制成每毫升精制玉米油含30毫克干重枸骨醇提取物，最后經(jīng)高溫(IO(TC)消毒30分鐘后，即得枸骨醇提取物的口服液。枸骨醇提取物注射液制備取制得的枸骨醇提取物樣品，溶解于15%Captisol中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過濾，濃縮成每毫升15%Captisol含30毫克干重枸骨醇提取物，再滅菌消毒，即得枸骨醇提取物的注射液。枸骨水提取物口服液有效劑量為每天15g干重枸骨水提取物/體表面積m2,連續(xù)三周，休息一周為一療程。枸骨水提取物注射液一般靜脈滴注有效劑量為每天1.5g干重枸骨水提取物/體表面積m2,連續(xù)三周，休息一周為一療程。枸骨水提取物口服液或枸骨水提取物注射液每天總劑量一次于早餐后半小時服用或注射用，具體病例可由醫(yī)師根據(jù)病情調(diào)整。圖1是枸骨水提取物抑制人肺癌細胞A549生長并將腫瘤細胞生長停留在G1期(16小時)的示圖。圖2是枸骨水提取物抑制人肺癌細胞A549生長并將腫瘤細胞生長停留在G1期(24小時)的示圖。圖3是枸骨水提取物抑制人肺癌細胞A549生長并將腫瘤細胞生長停留在G1期(36小時)的示圖。圖4是枸骨水提取物誘導人肺癌細胞A549細胞凋亡(18小時)的示圖，圖中R2代表活細胞染色R3代理凋亡細胞染色。圖5枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人前列腺癌(LnCAP)腫瘤細胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖6是枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人肺癌(NCI-H23)腫瘤細胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖7是枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人結(jié)腸癌(HCT-116)腫瘤細胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。圖8是枸骨水提取物口服液組，枸骨水提取物注射液組或?qū)φ战M治療皮下接種的人子宮內(nèi)瘤(MES-SA)腫瘤細胞的腫瘤體積一移植后天數(shù)曲線圖。具體實施例方式實施例1枸骨水提取物的制備(參見秦文娟等，中草藥，1988，19(10):2)藥物原材料采集生長在廣東省英德縣的枸骨全株植物，包括有枸骨葉，枸骨莖和枸骨根。將枸骨全株植物洗凈、曬干，切片和粉碎，粉碎后達300目。然后取粉碎的枸骨全株植物500克，浸泡在10升蒸餾水中過夜，第二天將該浸泡的枸骨液煮沸提取5小時，然后用IO層紗布過濾水提液，并將水提液加熱濃縮到100ml體積后，經(jīng)10000g離心速度離心去渣。上清液通過0.2微米孔徑的濾膜過濾，然后將濾液經(jīng)低溫干燥(-140°C)12小時或熱噴霧法170'C干燥，即得綠色粉末枸骨水提取物15克。實施例2枸骨醇提取物的制備(參見秦文娟等，中草藥，1988，19(10):2)藥材原材料的采集，洗凈，曬干，切片和粉碎同實施例l，取粉碎的枸骨全株植物500克，浸泡在5升95%醫(yī)用乙醇(酒精)中，浸泡2天后將乙醇浸泡液用IO層紗布過濾，濾液經(jīng)減壓蒸餾回收乙醇，當乙醇提取物濃縮到150毫升體積后，10000g離心，上清液通過0.2微米孔徑濾膜過濾，然后將濾液低溫干燥(-14(TC)，即得深綠色粉末的枸骨醇提取物2克。實施例3枸骨水提取物口服液的制備取實施例1制得的枸骨水提取物樣品60克，溶解于300ml蒸餾水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過濾，濃縮成每毫升含300mg干重的枸骨水提取物，滅菌，共得200毫升的口服液，分裝入瓶。實施例4枸骨水提取物注射液的制備取實施例1制得的枸骨水提取物樣品60克，經(jīng)3次(每次1000ml)90%酒精沉淀，其上清液合并，經(jīng)減壓濃縮回收酒精，最后冷凍(-140°C)干燥，將干燥物溶解在30ml生理鹽水中，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過濾，濃縮成每毫升生理鹽水含30毫克干重枸骨水提取物，滅菌，共得20毫升注射液，分裝入安瓿瓶。實施例5枸骨醇提取物口服液的制備取實施例2制得的枸骨醇提取物樣品30克，用950毫升精制玉米油溶解，配制成每毫升精制玉米油含30毫克干重物枸骨醇提取物，經(jīng)高溫10(TC消毒30分鐘后，共得1000毫升的口服液，分裝入瓶。實施例6枸骨醇提取物注射液的制備取實施例2制得的枸骨醇提取物樣品30克，用950毫升15%Captisol溶解，經(jīng)0.2微米孔徑濾膜過濾，濃縮成每毫升15%Captisol含30毫克干重枸骨醇提取物，滅菌消毒，共得1000毫升注射液，分裝入安瓿瓶。實施例7細胞毒性試驗(參見CarmichaelJetal.，CancerResearch,1987,47:943-946)使用人腫瘤細胞系進行細胞毒性分析。人腫瘤細胞系購自ATCC(美國細胞菌種庫)和NCI(美國國立癌癥研究所)，用含10%FBS(胎牛血清)的DMEM培養(yǎng)液，在含5%(:02的37"C孵箱中培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化匯合的細胞，經(jīng)培養(yǎng)液洗滌后計數(shù)。向96孔培養(yǎng)板的每孔中加入30006000個細胞，孵育16小時或24小時。然后向孔內(nèi)加入不同濃度的枸骨水提取物或枸骨醇提取物。繼續(xù)培養(yǎng)72小時后，對藥物處理組細胞和對照組細胞進行MTT試驗，結(jié)果見表l。實施例8枸骨水提取物抑制腫瘤細胞生長周期試驗(參見BasuS，etal.,GlycoconjJ.2004;20(9):563-77)首先在6孔細胞培養(yǎng)板每孔種植2乂105人體肺癌細胞A549，24小時后，分別加入Omg/ml，0.033mg/ml或0.1mg/ml枸骨水提取物樣品，并繼續(xù)在37t;，5。/。C02條件下培養(yǎng)16小時，24小時或36小時，在終止每組培養(yǎng)前4小時，加入BrdU，BrdU最終濃度為20uM，當細胞終止培養(yǎng)后，及時將細胞用磷酸緩沖液(PBS)洗滌2次，然后經(jīng)胰酶消化收集細胞，再次用PBS洗滌一次，之后用冷卻的70%乙醇固定細胞一個小時。固定好的細胞離心收集并懸浮在2N鹽酸，在室溫溫育30分鐘，過后這些細胞用PBS洗滌3次，處理好的細胞與1微克抗BrdU抗體反應(yīng)30分鐘(美國腫瘤基因公司購買)，然后用PBS洗滌這些細胞2次，再與2微克異硫氰酸熒光標記的山羊抗小鼠免疫球蛋白抗體(購買于美國腫瘤基因公司)在室溫反應(yīng)30分鐘，二抗反應(yīng)后用PBS洗滌細胞2次，過后這些細胞與4微克核苷核酸酶A(購買美羅斯應(yīng)用科技公司)在室溫溫育30分鐘，最后每管樣品加入碘化丙啶，最終濃度為每毫升含20微克碘化丙啶，并在室溫條件下反應(yīng)30分鐘，這些處理好的細胞馬上用美國BectonDickinson生產(chǎn)的FACscan細胞流動分析儀進行測定分析，其結(jié)果量化分析采用美國多功能軟件大廈生產(chǎn)的WINLIST軟件程序。結(jié)果見圖1-圖3。實施例9枸骨水提取物誘導腫瘤細胞凋亡試驗(參見WickW，etal.，JPharmacolExpTher.1999Jun;289(3):1306-12)采用AnnexinV(AV)和7—ADD聯(lián)合染色法檢測枸骨水提取物處理后腫瘤細胞出現(xiàn)的細胞凋亡現(xiàn)象，AnnexinV是一種磷脂結(jié)合蛋白與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期的細胞的胞膜結(jié)合，因此AnnexinV被作為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。在進行凋亡實驗時，首先在100厘米直徑的培養(yǎng)皿中種植1X10S人體肺癌A549細胞，24小時后分別加入濃度為0毫克/毫升，0.033毫克/毫升，0.1毫克/毫升枸骨水提取物樣品，并繼續(xù)在37'C，5XC02條件下培養(yǎng)18小時，然后終止細胞培養(yǎng)，并用PBS洗滌細胞2次，經(jīng)胰酶消化，離心收集細胞，用冷卻的PBS再次洗滌細胞之后用4"C的結(jié)合緩沖液(含14mMNaCl和25mMCaCl2的O.OlmM，PH7.0，Hepe/NaOH緩沖液)將細胞配制成lX106/ml。取0.1ml細胞懸液置5ml培養(yǎng)管中，加入5微升的AV-FITC，再加5微升7—AAD。稍稍混懸細胞置暗處，室溫(20'C—25'C)反應(yīng)15分鐘，加上0.4ml結(jié)合緩沖液，終止反應(yīng)。立即在細胞流動儀(FACS)上分析。結(jié)果見圖4。對照組為未經(jīng)處理的細胞對照,排除自發(fā)凋亡;不加染色劑的對照;只加AV的對照;只加7—ADD的對照。實施例10枸骨水提取物含有抗癌活性成分的分析試驗(參見李維林等，植物資源與環(huán)境學報，2003年02期，45-57)采用葡聚糖凝膠Sephadex-LH-20對枸骨水提取物根據(jù)各化合物分子量的大小進行分離純化，然后對各分離組分進行抗腫瘤作用試驗，本試驗取l毫升枸骨水提取物(含有干重300毫克)上柱葡聚糖凝膠Sephadex-LH20色譜分離柱，上樣后用甲醇洗脫共收集16個分離組份(這16個分離組份都是含有不同化合物的混合物)，減壓濃縮干燥這些分離組份后，各分離組分用1毫升生理鹽水溶解并進行前述抗腫瘤作用分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離組份3，分離組份7，分離組份9，分離組份11和分離組份13都具有抑制腫瘤細胞的作用，而且還發(fā)現(xiàn)這些組份混合在一起具有強大的協(xié)同作用。這一結(jié)果說明枸骨水提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個至少由5種以上的有機化合物所組成的混合物。實施例ll枸骨醇提取物含有抗癌活性成分的分析試驗(參見吳鎪等，中國藥學雜志，2005年19期，67-72)取l毫升枸骨醇提取物樣品(每毫升含15毫克干重枸骨醇提取物)減壓濃縮成膠狀物，然后逐次用4毫升石油醚，4毫升乙酸乙酯，4毫升正丁醇和4毫升乙醇進行抽提，各有機溶劑抽提液減壓，濃縮和干燥，最后各自用0.5毫升二甲基亞砜溶解，然后進行腫瘤細胞毒性實驗檢測各有機溶劑抽提組分是否含有抑制腫瘤細胞生長和誘導腫瘤細胞凋亡的活性成分。結(jié)果石油醚和乙酸乙酯抽提物都含有抗腫瘤的有效成份，這一結(jié)果說明枸骨醇提取物含有抗腫瘤活性成分，是一個至少由2種以上的有機化合物所組成的混合物。實施例12枸骨水提取物給藥后對小鼠的急性毒性試驗(參見GoldbergLE,etal.,AntibioticMedBiotekhnol.32(12):910-5)枸骨水提取物口服液采用灌胃給藥,而枸骨水提取物注射液采用尾靜脈注射給藥。取兩組8周齡的BlabC小鼠，每組10只(5只雄性和5只雌性)，分別以單次劑量15g/kg或多次劑量3g/kg(QDX15)灌胃給予枸骨水提取物口服液，或分別以單次劑量1.5g/kg或多次劑量0.3g/kg(QDX15)尾靜脈注射給予枸骨水提取物注射液(用無菌生理鹽水配制)，然后分別觀察1周和4周。每兩天稱體重。試驗結(jié)束后，將受試小鼠處死，進行病理分析。結(jié)果顯示，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好,無一死亡。實施例13枸骨醇提取物給藥后對小鼠的急性毒性試驗(參見GoldergLE,etal.，AntibioticMedBiotekhnol32(12):910-5)枸骨醇提取物口服液采用灌胃給藥，而枸骨醇提取物注射液采用尾靜脈注射給藥。取兩組8周齡的BlabC小鼠，每組10只(5只雄性和5只雌性)，分別以單次劑量1.5g/kg和多次劑量0.3g/kg(QDX15)灌胃給予枸骨醇提取物口服液(精制玉米油配制)或分別以單次劑量1.5g/kg和多次劑量0.3g/kg(QDX15)尾靜脈注射給予枸骨醇提取物注射液(15%Captisol配制)，然后分別觀察1周和4周。每兩天稱體重。試驗結(jié)束后，將受試小鼠處死，進行病理分析。結(jié)果顯示，以單次劑量1.5g/kg和多次劑量0.3g/kg(QDX15)給予枸骨醇提取物口服液或枸骨醇提取物注射液，均未觀察到毒性，所有受試小鼠生長良好，無一死亡。實施例14應(yīng)用人腫瘤異種移植模型進行枸骨水提取物的抗腫瘤有效性試驗(1)建立人腫瘤移植裸鼠模型(參見HarrisonSDJretal.，JNatlCancerInst，1991,83(20):1509T細胞缺陷裸小鼠(nu/nu)，雄性，6周齡，購自CharlesRiver實驗室，按照大學動物飼養(yǎng)和使用委員會指南飼養(yǎng)于無病原體環(huán)境。將5X106個LnCAP、NCI-H23、HCT-116,MES-SA細胞分別懸浮于0.2mlHBSS(Hanvs，平衡鹽溶液)或基質(zhì)膠(50:50,v/v)中，皮下接種到小鼠的側(cè)腹部區(qū)域。當腫瘤平均直徑達78mm時，選出腫瘤大小為100200mm3的小鼠，分為給予生理鹽水配制的枸骨水提取物口服液,枸骨水提取物注射液的處理組和只給予載體(生理鹽水)的對照組。為保證枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液處理組和對照組在處理開始時腫瘤體積分布大致相等，將小鼠分成三類腫瘤體積小(長度〈4mm)，腫瘤體積中等(48mm)，腫瘤體積大(>8mm)。對照組，枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液處理組中來自相同類別的小鼠數(shù)目大致相等。(2)裸小鼠腫瘤移植模型的給藥(枸骨水提取物口服液和枸骨水提取物注射液)在口服給藥和尾靜脈注射給藥試驗中，用生理鹽水配制枸骨水提取物口服液按3g/kg和枸骨水提取物注射液按0.3g/kg給藥。每日給予單次劑量200ml藥液(含30mg枸骨水提取物口服液和含3mg枸水提取物注射液)，每周5次，持續(xù)3周；對照組按同樣方法給予載體(生理鹽水)。小鼠單獨飼養(yǎng)，允許自由采食。(3)抗腫瘤效應(yīng)評價每34天沿兩個垂直方向?qū)δ[瘤進行測量。腫瘤體積根據(jù)以下公式計算V=(a2Xb)/2其中a是腫瘤寬度(較小直徑)，b是長度(較大直徑)。每個腫瘤的相對腫瘤體積(RTV)定義為給定時間點的腫瘤體積與處理開始時腫瘤體積的比值。每個處理組均計算平均值。根據(jù)以下公式計算腫瘤生長抑制值(TGI)，判斷抗腫瘤活性TGI(%)=T/CX100其中T是處理組試驗終點(4周)RTV的平均值，C是對照組試驗終點RTV的平均值。采用美國國立癌癥研究所的最小抗腫瘤活性標準(T/C《42%)。試驗結(jié)束時，將腫瘤切除并在甲醛中固定，進行組織學觀察。試驗結(jié)果見圖5-圖8。權(quán)利要求1.一種抗腫瘤藥物，其特征在于它是以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作為有效成分的抗腫瘤藥物。2.如權(quán)利要求1所述抗腫瘤藥物，其特征在于所述抗腫瘤藥物中含有抗腫瘤有效量的枸骨水提取物或枸骨醇提取物及可藥用載體和/或賦形劑。3.如權(quán)利要求1或2所述的抗腫瘤藥物，其特征在于所述抗腫瘤藥物制成枸骨水提取物口服液或注射液,或枸骨醇提取物口服液或注射液。全文摘要一種以枸骨水提取物或枸骨醇提取物作為有效成分的抗腫瘤藥物，可制成口服液及注射液。藥理試驗效果證明枸骨水提取物或枸骨醇提取物對29種腫瘤細胞株的細胞毒性試驗結(jié)果顯示有廣譜的抗腫瘤作用；枸骨水提取物能抑制腫瘤細胞生長停留在G1期，并具有極強的誘導腫瘤細胞凋亡的能力；在人腫瘤移植裸鼠模型試驗中，枸骨水提取物顯示出對人前列腺癌LnCAP、人肺癌細胞NCI-H23、人結(jié)腸癌細胞HCT-116和人子宮內(nèi)瘤細胞MES-SA有強烈的抑制腫瘤生長的作用，同時未有明顯的副作用；對小鼠的急性毒理試驗也顯示無毒性。因此枸骨水提取物或枸骨醇提取物是具有很大開發(fā)前景的廣譜抗腫瘤新藥。文檔編號A61K125/00GK101095706SQ20071004399公開日2008年1月2日申請日期2007年7月19日優(yōu)先權(quán)日2007年7月19日發(fā)明者南張,邱日輝申請人:邱日輝;張南