專利名稱：建立出血性腦梗死大鼠模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種建立出血性腦梗死動(dòng)物模型的方法，用于模擬、研究和防治人類的出血性腦梗死等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
腦血管病是一種高發(fā)病率、高病死率和高致殘率的疾病，嚴(yán)重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量。在我國(guó)國(guó)民的死亡原因統(tǒng)計(jì)中腦血管病居第二位，約占14.85％，每年死于腦血管病病人約150萬(wàn)，存活者約2/3留下殘疾。腦血管病中70％左右為缺血性腦卒中，而出血性腦梗死是急性缺血性腦卒中的常見(jiàn)并發(fā)癥，出血性腦梗死的發(fā)生率國(guó)內(nèi)外報(bào)道約為3％～43％，其中大面積腦梗死后出血發(fā)生率更高，約為30％～76.1％。自從1951年Fisher和Adams首先提出出血性腦梗死這一臨床病理術(shù)語(yǔ)至今，出血性腦梗死的確切病理生理機(jī)制尚不清楚，一些學(xué)說(shuō)仍有爭(zhēng)議，亦無(wú)確定有效的治療方法。因而，深入開(kāi)展出血性腦梗死病理生理機(jī)制的研究，可為預(yù)測(cè)出血性腦梗死的疾病衍變和預(yù)后、以及為開(kāi)辟新的藥物或基因治療途徑提供理論依據(jù)。
局灶性腦缺血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究早在1975年就開(kāi)始應(yīng)用，因大腦中動(dòng)脈(Middle Cerebral Artery MCA)是腦梗死發(fā)生最常見(jiàn)的部位，故大鼠急性大腦中動(dòng)脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion MCAO)模型在研究中的應(yīng)用最為廣泛。目前常用的實(shí)驗(yàn)性局灶性腦缺血模型有開(kāi)顱法、線栓法、光化學(xué)法。①開(kāi)顱法制作腦梗死模型是最為經(jīng)典的方法，實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)恒定，制作成功可靠，但是創(chuàng)傷性大，無(wú)法實(shí)現(xiàn)再灌注，且開(kāi)顱手術(shù)本身可伴有顱內(nèi)壓增高、血腦屏障破壞和腦溫變化的影響腦梗死的不利因素，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性。②線栓法制作MCAO模型的關(guān)鍵是尼龍線粗細(xì)和硬度要選擇恰當(dāng)，手法要輕柔，防止用力太大捅破血管引起蛛網(wǎng)膜下隙出血。該方法無(wú)須開(kāi)顱，屬相對(duì)非侵入性方法，可輕易實(shí)現(xiàn)缺血后再灌注，更接近臨床腦梗死發(fā)生時(shí)情況。③光化學(xué)法制作MCAO模型是使動(dòng)脈永久性閉塞，無(wú)法實(shí)現(xiàn)再灌注，存在一定的局限性，同時(shí)妨礙了擴(kuò)血管治療藥物的療效觀察。
腦出血的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究始于20世紀(jì)60年代，先后建立了自體血注入的狗、猴、兔、貓、豬、鼠等動(dòng)物模型。目前常用的實(shí)驗(yàn)性腦出血模型有以下4種自體血注入法、膠原酶誘導(dǎo)法、微球囊充脹法、自發(fā)性腦出血。①自體血注入腦出血模型不僅可以通過(guò)控制注血量做分級(jí)實(shí)驗(yàn)性腦出血研究，而且因?yàn)槭欠歉嗡鼗泽w血，可觀察血液凝固過(guò)程中血管活性物質(zhì)釋放對(duì)腦循環(huán)及腦組織的影響，因而較接近臨床腦出血，適合研究腦實(shí)質(zhì)出血的自然過(guò)程，病理形態(tài)學(xué)等特點(diǎn)，可更好地觀察凝固過(guò)程中各種因子對(duì)腦組織代謝和血流的影響，從而為臨床治療提供依據(jù)。這種模型制作方法用于大動(dòng)物時(shí)，產(chǎn)生的血腫大小和形態(tài)較為一致，②膠原酶誘導(dǎo)法與急性腦出血相比，血腫形成時(shí)間長(zhǎng)，且出血為一彌漫性滲血與腦組織混合在一起，這是本模型的不足之處。③微球囊充脹法是一種純機(jī)械性的腦出血模型，盡管這種模型制作方法簡(jiǎn)單、易操作、重復(fù)性好且無(wú)注入自體血模型的諸多弊端，但由于其與臨床脫節(jié)太多，除用于腦出血血腫清除方面的研究外，較少應(yīng)用。④自發(fā)性腦出血盡管與臨床腦出血的病理生理接近，但由于其遺傳性血管損害以及模型的不穩(wěn)定性、所需時(shí)間的不確定性、病灶大小的易變性以及模型的不可比性，使其應(yīng)用大大受限。
如上所述局灶性腦梗死、腦出血模型的建立均已成熟，但尚未見(jiàn)成熟、穩(wěn)定的出血性腦梗死動(dòng)物模型。有學(xué)者采用自體血血栓注入法建立局灶性腦梗死動(dòng)物模型，然后在不同的時(shí)間點(diǎn)經(jīng)下頜靜脈給予尿激酶溶栓，從而建立出血性腦梗死動(dòng)物模型，該模型較符合臨床上的出血性腦梗死發(fā)生的病理生理狀態(tài)，但由于該模型的梗死部位及出血部位、出血量及時(shí)間的不確定性，使該模型的穩(wěn)定性、可重復(fù)性較差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是要克服現(xiàn)有出血性腦梗死動(dòng)物模型所存在的不足，提供一種建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，用該方法建立的大鼠模型成本低廉、易于復(fù)現(xiàn)、穩(wěn)定性強(qiáng)且與人類情況類似。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，發(fā)明人通過(guò)深入研究和大量的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)第一步，利用線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型；第二步，經(jīng)立體定向法將自體尾動(dòng)脈血注入大鼠尾殼核，最終可以得到不同出血量的出血性腦梗死動(dòng)物模型。具體地，本發(fā)明提出的建立出血性腦梗死大鼠模型的方法包括以下步驟(1)鼠的準(zhǔn)備；(2)制備線栓；(3)線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa、Kuga等采用頸外動(dòng)脈插入線栓法造模；(4)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，即刻行自體尾動(dòng)脈血注入建立出血性腦梗死模型；(5)將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死大鼠模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，分別在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。
本發(fā)明取得的積極效果在于，采用本發(fā)明所建立的大鼠模型具有如下優(yōu)點(diǎn)一、大鼠模型穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好，遺傳背景清晰，使系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性研究出血性腦梗死的病理生理機(jī)制，開(kāi)辟新的藥物治療途徑成為可能。
二、該方法采用兩步法建立出血性腦梗死動(dòng)物模型，即梗塞模型和出血模型的結(jié)合。梗塞模型的制作采用應(yīng)用最廣泛的線栓法，梗塞部位較為恒定且接近臨床。出血模型采用尾動(dòng)脈自體血注入法，可重復(fù)性好，提高了模型制作的成功率。
三、該方法采用一次麻醉完成兩次手術(shù)，手術(shù)時(shí)間短，并且減少了二次麻醉造成的大鼠死亡率。
四、該方法所選大鼠均為成年雄性SD大鼠，大鼠血管變異率低，提高了造模成功率。
五、本方法采用尾動(dòng)脈取血，手術(shù)創(chuàng)傷小，不影響大鼠肢體功能且行為學(xué)評(píng)分準(zhǔn)確。
六、自體血注入尾殼核法使出血量及出血時(shí)間可人為控制，更加接近臨床，克服了以往模型出血量及出血時(shí)間的不準(zhǔn)確性。
七、行為學(xué)評(píng)分采用傳統(tǒng)的Longa、Berderson、肢體對(duì)稱試驗(yàn)、平衡木試驗(yàn)評(píng)分方法，造模效果評(píng)定可信性高。
具體實(shí)施例方式
以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明。
實(shí)施例本實(shí)施例給出的建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，包括以下步驟(1)大鼠的準(zhǔn)備選擇清潔級(jí)雄性SD大鼠，在動(dòng)物繁育實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)備用。大鼠的體重選擇在280～320g的范圍，因?yàn)檫@個(gè)體重范圍的大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處至大腦中動(dòng)脈間其始段的距離穩(wěn)定約為18.5±0.5mm，并且易于立體定位。動(dòng)物級(jí)別為清潔級(jí)，以防止其他污染對(duì)所建模型的干擾和影響，提高模型的存活率。給予大鼠標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)和飲用純凈水，飼養(yǎng)環(huán)境為我院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心多層層流架。
(2)制備線栓按照傳統(tǒng)的制備方法，將長(zhǎng)為30～40mm，直徑0.235mm的尼龍釣魚(yú)絲的一端加熱成光滑的球形，分別于20mm、18mm、15mm、10mm處記號(hào)筆標(biāo)記，酒精浸泡消毒生理鹽水沖洗后備用。
(3)線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa、Kuga等采用頸外動(dòng)脈插入線栓法造模。
(4)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，即刻行自體尾動(dòng)脈血注入建立出血性腦梗死模型。
①大腦中動(dòng)脈閉塞造模成功后，參考Hua等方法進(jìn)行定位，取Bregma點(diǎn)右側(cè)中線旁開(kāi)3mm，前1mm，用牙科鉆鉆一直徑1mm的圓孔，深度為到達(dá)硬腦膜，不穿透硬腦膜，腦立體定向儀垂直位固定一微量注射器，使針頭與牙科鉆孔的方向在一直線上，固定好立體定向儀，取下微量注射器。
②將大鼠雙下肢翻轉(zhuǎn)朝上固定，暴露尾根部腹側(cè)，消毒后在腹側(cè)正中做一縱行切口，長(zhǎng)約2～3cm，細(xì)致分離暴露尾動(dòng)脈，在尾動(dòng)脈下墊一手術(shù)刀柄，使動(dòng)脈放于刀柄上，用鹽水沖洗過(guò)的微量注射器穿刺尾動(dòng)脈，抽取不加抗凝劑的動(dòng)脈血液50μl。
③迅速將微量注射器針頭通過(guò)牙科鉆孔垂直緩慢注入腦內(nèi)，進(jìn)針深度為6.5mm(大鼠尾殼核位置)，緩慢注入50μl自體動(dòng)脈血液，注射時(shí)間以2min為宜，注射完畢后，將針留置10min，以防血液流出，然后緩慢將微量注射器針頭拔出，拔除后用醫(yī)用骨蠟封閉骨孔，觀察無(wú)出血后，縫合頭部皮膚，加壓包扎尾部切口。
(5)將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死動(dòng)物模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。分別在術(shù)后3h、6h、12h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行傳統(tǒng)的行為學(xué)評(píng)分，包括以下評(píng)分①Longa評(píng)分法；②Berderson評(píng)分法；③肢體對(duì)稱試驗(yàn)評(píng)分法；④平衡木評(píng)分法。
由此，選用健康雄性SD大鼠可建立類似人類的出血性腦梗死的動(dòng)物模型，且出血量及出血時(shí)間可人為控制，以模擬臨床腦梗死后不同的出血量及出血時(shí)間。
權(quán)利要求
1.一種建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，其特征是該方法包括以下步驟(1)鼠的準(zhǔn)備選用成年健康雄性SD大鼠；(2)制備線栓按照傳統(tǒng)的制備方法，將一長(zhǎng)為30～40mm，直徑0.235mm的尼龍釣魚(yú)絲的一端加熱成光滑的球形，分別于20mm、18mm、15mm、10mm處標(biāo)記，酒精浸泡消毒生理鹽水沖洗后備用；(3)線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型參照Longa、Kuga等采用頸外動(dòng)脈插入線栓法造模；(4)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，即刻行自體尾動(dòng)脈血注入建立出血性腦梗死模型；(5)將經(jīng)以上步驟獲得的出血性腦梗死動(dòng)物模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，分別在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。
2.按權(quán)利要求1所述的建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，其特征是大鼠的體重在280～320g范圍。
3.按權(quán)利要求1所述的建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，其特征是步驟(5)中在術(shù)后3h、6h、12h、24h、48h不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分。
4.按權(quán)利要求1所述的建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，其特征是步驟(5)中對(duì)大鼠進(jìn)行行為學(xué)評(píng)分包括以下四種評(píng)分方法Longa評(píng)分法、Berderson評(píng)分法、肢體對(duì)稱試驗(yàn)評(píng)分法、平衡木評(píng)分法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種建立出血性腦梗死大鼠模型的方法，包括以下步驟(1)選用成年健康雄性SD大鼠；(2)制備線栓；(3)參照Longa、Kuga等采用頸外動(dòng)脈插入線栓法建立SD大鼠的大腦中動(dòng)脈閉塞模型；(4)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞成功后，即刻行自體尾動(dòng)脈血注入建立出血性腦梗死模型；(5)將獲得的出血性腦梗死動(dòng)物模型放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)，對(duì)動(dòng)物進(jìn)行傳統(tǒng)行為學(xué)評(píng)分。本發(fā)明建立的大鼠模型穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好，遺傳背景清晰，使系統(tǒng)性、動(dòng)態(tài)性研究出血性腦梗死的病理生理機(jī)制，開(kāi)辟新的藥物治療途徑成為可能。
文檔編號(hào)A61B19/00GK101023864SQ20071006144
公開(kāi)日2007年8月29日 申請(qǐng)日期2007年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年1月22日
發(fā)明者張祥建, 李俐濤, 尹靜, 楊燚, 胡明, 狄楠, 劉薇, 崔海瑛, 劉瑞春 申請(qǐng)人:河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院