專(zhuān)利名稱：褐藻多糖硫酸酯在預(yù)防和治療帕金森病中的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及褐藻多糖硫酸酯在治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的一種新用途，尤其涉及褐 藻多糖硫酸酯在預(yù)防和治療帕金森病方面的用途，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
褐藻多糖硫酸酯是含有巖藻糖的一類(lèi)硫酸化多糖，存在于褐藻中，首先由Kylin 在1913年用稀酸從掌狀海帶中提取出來(lái)。Kylin將提取物水解后分離出L-巖藻糖， 他將這種多糖命名為fUcoidin，現(xiàn)根據(jù)多糖的命名原則一般定名為fucoidan，中文名 稱為墨角藻多糖、巖藻多糖、巖藻聚糖、巖藻聚糖硫酸酯、褐藻糖膠或褐藻多糖硫 酸酯?，F(xiàn)在人們對(duì)褐藻多糖硫酸酯的組成有較為清晰的了解，它是一類(lèi)化學(xué)組成和 結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜的多糖，以巖藻糖和硫酸基為主，隨著藻的種類(lèi)不同還含有半乳糖、 木糖、糖醛酸等其他成分。
褐藻多糖硫酸酯化學(xué)結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，不同褐藻中分離到的褐藻多糖硫酸酯其結(jié) 構(gòu)有很大差異。到目前為止，對(duì)來(lái)源于墨角藻(Fucus vesiculosus)和泡葉藻 (Ascophyllumnodosum)的褐藻多糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)研究最多，墨角藻褐藻多糖硫酸 酯主要以a (1—3)糖苷鍵連接，硫酸化主要發(fā)生在Q位。對(duì)泡葉藻褐藻多糖硫酸 酯的多項(xiàng)研究都表明其中存在大量的a (1—3)和a (1—4)糖苷鍵。此外還有幾 種褐藻褐藻多糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)被報(bào)道。昆布(Eckkmiakurome)褐藻多糖硫酸酯主 要為a (1—3)連接，硫酸化在C4位。來(lái)源于枝管藻(Cladosiphonokamuranus)和 繩藻(Chorda filum)的褐藻多糖硫酸酯主鏈均為a (1—3)的巖藻糖，硫酸化在 Q位，而且，二者均有少量的2 — 0—乙?；ｊP(guān)于海帶褐藻多糖硫酸酯的結(jié)構(gòu)， 多數(shù)的研究資料表明海帶褐藻多糖硫酸酯主要是以a-(1—3)連接的L-巖藻糖組成， 硫酸化發(fā)生在Q或C2位，而且研究顯示存在部分(1—2)連接的L-巖藻糖作為側(cè)鏈。 當(dāng)然分子中還存在半乳糖、木糖、鼠李糖等單糖，半乳糖可能參與了主鏈的組成， 而木糖、鼠李糖等是以側(cè)鏈的形式存在。
褐藻多糖硫酸酯已被發(fā)現(xiàn)具有多種生物學(xué)活性，目前已經(jīng)公開(kāi)報(bào)道的活性包括褐藻多糖硫酸酯具有抗凝血、提高免疫力、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、降血糖、降血 脂、抗補(bǔ)體活化、抗氧化、抗輻射、抑制腹水瘤等活性。但尚未有文獻(xiàn)表明褐藻多 糖硫酸酯在預(yù)防和治療帕金森病方面的用途。
帕金森病(Parkinson's disease, PD)是多發(fā)于中老年期的一種常見(jiàn)的神經(jīng)系統(tǒng) 退行性疾病，病人多出現(xiàn)震顫、肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩等癥狀(張成，等.1995)。 PD的 主要病理學(xué)改變?yōu)橹心X黑質(zhì)致密部多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)元慢性進(jìn)行性死 亡，導(dǎo)致紋狀體DA含量顯著減少。因此，補(bǔ)充DA的前體一左旋多巴(L-DOPA)可 以緩解PD的癥狀。但L-DOPA本身不能延緩DA能神經(jīng)元的進(jìn)一步壞死，遠(yuǎn)期療 效無(wú)法令人滿意，且可能出現(xiàn)癥狀波動(dòng)、運(yùn)動(dòng)障礙等嚴(yán)重副作用，因此，人們一直 試圖找到一種可以延緩DA能神經(jīng)元的變性壞死，對(duì)DA能神經(jīng)元有營(yíng)養(yǎng)保護(hù)作用 的藥物。最新資料表明，中國(guó)有170萬(wàn)PD患者，其中55歲以上的人群發(fā)病率為l 2%，估計(jì)每年新增PD病人約20萬(wàn)人。隨著世界人口老齡化進(jìn)程的加劇，PD病人 的數(shù)量不斷增長(zhǎng)，已經(jīng)成為日益嚴(yán)重的社會(huì)問(wèn)題，使得全世界對(duì)其給予眾多的關(guān)注， PD的治療藥物研究成為老年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的一個(gè)重要課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的之一是提供褐藻多糖硫酸酯的一種新用途，即在預(yù)防和治療帕金森 病中的用途。
本發(fā)明所述的褐藻多糖硫酸酯可以是從任何一種或多種褐藻中提取得到的褐 藻多糖硫酸酯，例如，可以來(lái)源于海帶(Laminaria japonica)(包括人工養(yǎng)殖的海 帶)，也可以是來(lái)源于其它褐藻，例如馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、 昆布、泡葉藻或墨角藻等的一種或多種。作為一種優(yōu)選的方案，優(yōu)選來(lái)源于海帶中 的褐藻多糖硫酸酯，即海帶褐藻多糖硫酸酯(海帶褐藻多糖硫酸酯主要由巖藻糖、 半乳糖組成的硫酸多糖，其中巖藻糖含量為31%，硫酸基含量為32%，平均分子 量為180KD)。
為達(dá)到更好的治療效果，本發(fā)明所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量?jī)?yōu)選為2kD— 1000kD，更優(yōu)選為3KD 30KD，最優(yōu)選為5KD 20KD。
褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)是褐藻類(lèi)海藻特有的化學(xué)組分，是褐藻類(lèi)海藻細(xì) 胞間的產(chǎn)物，是一種水溶性雜聚糖，它的主要組分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，其次還伴 隨有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、糖醛酸及蛋白質(zhì)、K、 Na、Ca、 Mg等金屬離子，不管它的分子組分和結(jié)構(gòu)多復(fù)雜，它的結(jié)構(gòu)特征是1,2-聯(lián)結(jié) 的聚ot-L-吡喃褐藻糖，而硫酸酯主要是在C-4位的羥基上。所以不論是從何種褐藻 中提取得到的褐藻多糖硫酸酯，其主要成分相同，基本結(jié)構(gòu)相同，都具有相同的藥 理功效，即，都可用于預(yù)防和治療帕金森病。
從褐藻中提取褐藻多糖硫酸酯的方法為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)(請(qǐng)參考中國(guó)專(zhuān)利授
權(quán)公告號(hào)CN1044607C)，作為一種優(yōu)選的方法，可參考本申請(qǐng)實(shí)施例從海帶中提 取褐藻多糖硫酸酯的方法；此外，褐藻多糖硫酸酯也可從商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)得到(例如，
山東日照潔晶海洋生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn)并出售褐藻多糖硫酸酯，其商品名稱 是"巖藻聚糖硫酸酯(Fucoidan)"，該產(chǎn)品以海帶為原料所提取得到，主要由含硫 酸基巖藻糖(Fucose)組成，其次還伴有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、 糖醛酸等，其主要有效成份是a-L-巖藻糖-4-硫酸酯；另外，上海元吉化工有限公司 也有售，其商品名稱是"褐藻多糖硫酸酯")。
此外，本發(fā)明中所述的褐藻多糖硫酸酯還包括將褐藻多糖硫酸酯通過(guò)降解制備 得到的低分子量硫酸多糖和寡糖類(lèi)物質(zhì)。
本發(fā)明人通過(guò)大量的離體帕金森病細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物金森病模型實(shí)驗(yàn)， 發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的DA能神經(jīng)元有一定的神經(jīng)保護(hù) 效應(yīng)，初步推測(cè)，褐藻多糖硫酸酯具有降低中腦脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，提高抗氧化系統(tǒng) 活性等功效。
本發(fā)明目之二是提供一種能夠預(yù)防和治療帕金森病的藥物組合物，該藥物組合 物包含治療上有效量的褐藻多糖硫酸酯和至少一種藥學(xué)上可接受的輔料或載體，所 述輔料或載體可以是淀粉、氯化鈉、微晶纖維素、山梨酸和/或甘露醇等。
該組合物的給藥方式可以是但不限于經(jīng)靜脈注射、口服、肌肉、皮下、皮膚表 面、局部注射等方式給藥，其劑型可以但不限于是注射液、凍干粉針劑、注射微球、 脂質(zhì)體、片劑、膠囊劑、水劑、散劑、糊劑、噴霧劑、顆粒劑、軟膠囊、滴丸劑、 凝膠劑、貼片、膏劑等，其中優(yōu)選注射液、凍干粉針劑、片劑和膠囊劑。本領(lǐng)域技 術(shù)人員根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)以及制劑領(lǐng)域的公知常識(shí)可以方便地制備出所需劑型。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)
1.安全性高，可長(zhǎng)期服用。在目前階段，帕金森病通常是不可逆的神經(jīng)退行 性疾病，病因復(fù)雜。為了保持患者病情不繼續(xù)惡化，病人用藥周期較長(zhǎng)。褐藻多糖 硫酸酯作為來(lái)源于食用海藻的一種天然海洋多糖產(chǎn)物.，其高安全性可以保證病人長(zhǎng)期用藥的需要。經(jīng)急性毒性試驗(yàn)證明褐藻多糖硫酸酯安全性非常高，毒副作用小 (Li,N.， et al. Toxicological evaluation of fucoidan extracted from Laminaria japonica in Wistarrats,2004;徐祖洪等,褐藻多糖硫酸酯在制備治腎衰病藥品中的應(yīng)用，中國(guó)專(zhuān)利 授權(quán)公告號(hào)CN1069523C)。
2.使用效果好。褐藻多糖硫酸酯優(yōu)選來(lái)源于食用海藻海帶，其它食用褐藻如 裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、馬尾藻等也是褐藻多糖硫酸酯的制備原料。可以用于神
經(jīng)系統(tǒng)疾病如帕金森病和老年性癡呆的治療。
根據(jù)小鼠有效劑量和小鼠與人的體表折算系數(shù)換算，褐藻多糖硫酸酯用于治 療帕金森病臨床患者的參考用量為8.75 17.5毫克/70公斤/日。


圖l 不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞損傷形態(tài)學(xué)改變的 影響；
A.空白對(duì)照；B. 50 (iM 6-OHDA; C. Fucoidan 0.1 mg/ml+50 fiM 6-OHDA; D. Fucoidan 1.0mg/ml+ 50 (iM 6-OHDA。
圖2不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響。
圖3不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞損傷LDH釋放量 的影響。
圖4不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)MPP+誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞損傷形態(tài)學(xué)改變的影
響；
A.空白對(duì)照；B.50pMMPP+; C. Fucoidan 0.1mg/ml+50 |iMMPP+; D. Fucoidan 1.0mg/ml+ 50岸MPP+。
圖5不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)MPP+誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞損傷細(xì)胞活力的影響。 圖6不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)MPP+誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞損傷LDH釋放量的影響。
圖7不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)6-OHDA誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的 影響；
A.空白對(duì)照；B. 50 |iM 6-OHDA; C. Fucoidan 0.1 mg/ml+50 |itM 6-OHDA; D. Fucoidan 1.0mg/ml+ 50 nM 6-OHDA 。圖8不同濃度褐藻多糖硫酸酯對(duì)MPP+誘導(dǎo)MN9D細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響； A.空白對(duì)照；B. 50 |iM MPP+;C. Fucoidan 0.1mg/ml+ 50 |aM MPP+;; D. Fucoidan 1.0mg/ml+ 50 )iM MPP+。
圖9不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠60分鐘總活動(dòng)距離的影
響；
圖10不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠60分鐘平均運(yùn)動(dòng)速度 的影響；
圖11不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠60分鐘每次活動(dòng)平均 運(yùn)動(dòng)距離的影響；
圖12 不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)致密部TH免疫 陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目的影響；
A: saline; B: MPTP; C: fUcoidan25mg/kg+MPTP， 40x; D,EandF為左圖相應(yīng) 區(qū)域的放大圖200x。
圖13不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦TH蛋白表達(dá) 的影響。
圖14不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠紋狀體TH蛋白表達(dá)的 影響。
圖15不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠紋狀體DA含量的影響。 圖16不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠紋狀體DOPAC含量的 影響。
圖17不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠紋狀體HVA含量的影響。
圖18不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠紋狀體(DOPAC+HVA) /DA比值的影響。
圖19褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠紋狀體MPP+含量的影響。 圖20不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦丙二醛(MDA) 含量的影響。
圖21不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦超氧化物岐 化酶(SOD)活性的影響。
圖22不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦谷胱苷肽過(guò)氧化物酶(GSH-px)活性的影響。
圖23不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦過(guò)氧化氫酶 (catalase)活性的影響。
圖24不同劑量褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦總抗氧化能 力(TAOC)的影響。
圖25不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠60分鐘總活動(dòng)距離的影響。
圖26不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠60分鐘平均運(yùn)動(dòng)速度的影響。
圖27不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠60分鐘每次活動(dòng)平均運(yùn)動(dòng) 距離的影響。
圖28不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠15分鐘運(yùn)動(dòng)軌跡圖的影響； A. saline;B. MPTP; C. Fucoidan50mg/kgl+MPTP;D. Fucoidan 100mg/kg+ MPTP。
圖29不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠紋狀體多巴胺(DA)含量 的影響。
圖30不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠紋狀體二羥苯乙酸(DOPAC) 含量的影響。
圖31不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠紋狀體高香草酸(HVA)含 量的影響。
圖32不同劑量褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP小鼠紋狀體(DOPAC+HVA) / DA比值的影響。
具體實(shí)施例方式
以下通過(guò)具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明。這里想要指出的是，下面的具體實(shí)施方式
僅用來(lái)說(shuō)明本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解本發(fā)明精神的前提下，可 以根據(jù)本技術(shù)領(lǐng)域的現(xiàn)有技術(shù)和公知知識(shí)對(duì)本發(fā)明進(jìn)行相應(yīng)變換，這些技術(shù)方案均 落入本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
實(shí)施例l海帶褐藻多糖硫酸酯的制備
將海帶粉碎后添加蒸餾水沸水提取，提取液以硅藻土助濾過(guò)濾，濾液先以自來(lái)水流水透析一天，然后以蒸餾水透析一天，將透析液濃縮，加乙醇至濃度為75%沉 淀，沉淀干燥得粗褐藻多糖硫酸酯。將粗品重溶于水，在0.05mol/L MgCl2存在下 20%乙醇沉淀除去水溶性褐藻膠，濾液透析、濃縮后75%乙醇沉淀，干燥后即得到 純化的褐藻多糖硫酸酯。經(jīng)過(guò)分析，海帶褐藻多糖硫酸酯主要是由巖藻糖、半乳糖 組成的硫酸多糖。其中巖藻糖含量為31%，硫酸基含量為32%。平均分子量為 180KD。
實(shí)施例2低分子量海帶褐藻多糖硫酸酯F1的制備
取海帶褐藻多糖硫酸酯50g配成1.5%的水溶液，在該溶液中加入30mM抗壞 血酸和30mM過(guò)氧化氫，常溫反應(yīng)2小時(shí)。將該反應(yīng)液用截留分子量為3600Da的 透析袋分別在自來(lái)水和蒸餾水透析，之后濃縮，凍干。得到低分子量褐藻多糖硫酸 酯樣品F1。對(duì)F1進(jìn)行化學(xué)分析結(jié)果表明巖藻糖含量為30X，硫酸基含量為31%， 平均分子量為7KD。
實(shí)施例3褐藻多糖硫酸酯注射劑的制備
取實(shí)施例1所制備的褐藻多糖硫酸酯100g，加入注射用水1000ml，甘露醇100g， 調(diào)PH值至7.0，分裝，冷凍干燥。
實(shí)施例4褐藻多糖硫酸酯片劑的制備
取實(shí)施例2所制備的低分子量海帶褐藻多糖硫酸酯50g，加入微晶纖維素，聚 乙烯吡咯垸酮，混合，加入適量水，制軟材，制粒，干燥。粒子加入交聯(lián)羧甲基纖 維素鈉、硬脂酸鎂，混合，壓片，每片含海帶褐藻多糖硫酸酯100mg。
試驗(yàn)例1褐藻多糖硫酸酯拮抗6-OHDA的神經(jīng)毒性
選用小鼠多巴胺(dopamine, DA)能神經(jīng)前體細(xì)胞系MN9D細(xì)胞(由Novartis 公司Bastian Hengerer博士贈(zèng)送)，以DA能神經(jīng)毒素6-OHDA為工具藥建立帕金森 病細(xì)胞模型。
MN9D細(xì)胞在含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，按lx105/ 孔和lxlO"孔的密度分別接種于24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，穩(wěn)定24小時(shí)后，更換新 鮮培養(yǎng)基時(shí)加入不同濃度的(0.01 lmg/ml)褐藻多糖硫酸酯(實(shí)施例.l所制備的海帶褐藻多糖硫酸酯)預(yù)孵育1小時(shí)后再加入50nM的DA能神經(jīng)毒素6-OHDA， 空白對(duì)照組加入等體積的生理鹽水，繼續(xù)孵育24小時(shí)后，倒置相差顯微鏡下觀察 細(xì)胞形態(tài)，MTT法鑒定細(xì)胞活力，同時(shí)測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)釋放量評(píng)定細(xì)胞損傷率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50pM 6-OHDA作用 24小時(shí)，細(xì)胞形態(tài)變圓，胞體變小，突起變短或消失(圖1)，細(xì)胞活力明顯下降 (圖2)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量明顯增加(圖3)，與空白對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì) 學(xué)意義；用0.1 lmg/ml的褐藻多糖硫酸酯預(yù)處理可以明顯提高細(xì)胞活力，減少細(xì) 胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量，與6-OHDA處理組相比較差異有顯著性，說(shuō)明褐藻多 糖硫酸酯可以有效對(duì)抗6-OHDA所致MN9D細(xì)胞的損傷。
試驗(yàn)例2褐藻多糖硫酸酯拮抗MPP+的神經(jīng)毒性
選用小鼠多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞系MN9D細(xì)胞(由Novartis公司Bastian Hengerer 博士贈(zèng)送)，以DA能神經(jīng)毒素MPP+為工具藥建立帕金森病細(xì)胞模型。
MN9D細(xì)胞在含10%新生牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，按1><105/ 孔lxlO"孔的密度接種于24孔和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，穩(wěn)定24小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng) 基時(shí)加入不同濃度(0.1 lmg/ml)的褐藻多糖硫酸酯(實(shí)施例2所制備的低分子量 海帶褐藻多糖硫酸酯Fl)預(yù)孵育1小時(shí)后加入50pM的DA能神經(jīng)毒素MPP+，空 白對(duì)照組加入等體積的生理鹽水，繼續(xù)孵育36小時(shí)后，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì) 胞形態(tài)，MTT法鑒定細(xì)胞活力，LDH釋放法測(cè)定細(xì)胞損傷率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，50pM MPP+ 作用36小時(shí)后，細(xì)胞變圓，胞體變小，突起變短或消失(圖4)，細(xì)胞活力明顯下 降(圖5)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量明顯增加(圖6)，與空白對(duì)照組相比有統(tǒng) 計(jì)學(xué)意義；用0.1 lmg/ml的褐藻多糖硫酸酯預(yù)處理可以明顯提高細(xì)胞活力，減少 細(xì)胞培養(yǎng)上清中LDH釋放量，與MPP+處理組相比較差異有顯著性，說(shuō)明褐藻多糖 硫酸酯可以有效對(duì)抗MPP+所致MN9D細(xì)胞的損傷。
試驗(yàn)例3褐藻多糖硫酸酯拮抗6-OHDA和MPP+所致的氧化應(yīng)激水平增高
DCF - DA是一種可通過(guò)細(xì)胞膜的熒光色素,進(jìn)入細(xì)胞后經(jīng)酯酶脫去二酯,與活
性氧作用生成DCF，后者不能透過(guò)細(xì)胞膜，在488nm激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，可以
用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀況。
MN9D細(xì)胞在含10%新生牛血清的DMEM/F 12培養(yǎng)基中培養(yǎng)傳代，按]x 105/孔的密度接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，穩(wěn)定24小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基時(shí)加入不同濃度(0.1 lmg/ml)的褐藻多糖硫酸酯(實(shí)施例l所制備的海帶褐藻多糖硫酸酯)預(yù)孵育l小時(shí) 后再加入5(VM的DA能神經(jīng)毒素6-OHDA或MPP+，空白對(duì)照組加入等體積的生理鹽 水，繼續(xù)孵育8小時(shí)或12小時(shí)后，1itig/ml的DCF-DA孵育15分鐘，熒光顯微鏡觀察 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激情況?？梢?jiàn)6-OHDA或MPP+處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯高于空白對(duì) 照組(圖7，圖8)，說(shuō)明6-OHDA或MPP+的神經(jīng)毒性作用與增加細(xì)胞內(nèi)氧自由基的產(chǎn) 生有關(guān)，但用0.1 lmg/ml的褐藻多糖硫酸酯預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度低于單純 6-OHDA或MPP+處理組，提示褐藻多糖硫酸酯的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)與降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng) 激水平有關(guān)。
試驗(yàn)例4褐藻多糖硫酸酯腹腔注射給藥保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元的在體研究
MPTP是一種脂溶性的神經(jīng)毒素，全身給藥可迅速透過(guò)血腦屏障，在腦內(nèi)經(jīng)膠 質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的B型單胺氧化酶作用轉(zhuǎn)化成其活性形式MPP+后，被DA神經(jīng)元上的DA 轉(zhuǎn)運(yùn)體特異性攝取，通過(guò)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I和氧化應(yīng)激選擇性地?fù)p傷黑質(zhì) 致密部的DA能神經(jīng)元，導(dǎo)致紋狀體內(nèi)DA含量明顯減少，是目前應(yīng)用最為廣泛的 帕金森病動(dòng)物模型。
選用8 10周齡的雄性C57BL/6J小鼠(購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物繁殖中心)，按 15mg/kg體重腹腔注射MPTP，每2小時(shí)一次，連續(xù)注射4次，空白對(duì)照組注射等 量的生理鹽水(NS)可使紋狀體中DA含量的降低達(dá)到90%以上。將動(dòng)物分為4組 (1)NS + NS組；(2) NS + MPTP組；(3)褐藻多糖硫酸酯(實(shí)施例2所制備的低 分子量海帶褐藻多糖硫酸酯F1) 12.5mg/kg+ MPTP組；(4)褐藻多糖硫酸酯(實(shí) 施例2所制備的低分子量海帶褐藻多糖硫酸酯Fl) 25mg/kg+ MPTP組。
在MPTP損毀的前一周開(kāi)始腹腔注射褐藻多糖硫酸酯或NS;造模當(dāng)天腹腔注 射褐藻多糖硫酸酯或NS后1小時(shí)開(kāi)始腹腔注射MPTP或NS;再繼續(xù)每天一次腹腔 注射褐藻多糖硫酸酯或NS—周，完成行為學(xué)測(cè)試后處死動(dòng)物，分別對(duì)黑質(zhì)酪氨酸 羥化酶(tyrosine hydroxylase, TH)免疫陽(yáng)性神經(jīng)元、紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物含 量、腹側(cè)中腦脂質(zhì)過(guò)氧化物含量和抗氧化系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下
1.褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著改善MPTP小鼠的行為
應(yīng)用Truscan動(dòng)物活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)連續(xù)記錄小鼠自主活動(dòng)，記錄時(shí)間為60分鐘， 用隨機(jī)軟件對(duì)各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，MPTP小鼠在相同時(shí)間內(nèi)的總活動(dòng)距離、平均運(yùn)動(dòng)速度和每次活動(dòng)的平均移動(dòng)距離均顯著低于NS對(duì)照組，但褐藻
多糖硫酸酯腹腔注射組小鼠的上述運(yùn)動(dòng)指標(biāo)均有好轉(zhuǎn)，其中25mg/kg褐藻多糖硫酸 酯組每次活動(dòng)的平均移動(dòng)距離結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖9、圖10、圖11)，結(jié)果提 示褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以減輕MPTP所致小鼠的運(yùn)動(dòng)障礙。
2. 褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著增加MPTP小鼠黑質(zhì)致密部TH免疫陽(yáng)性 神經(jīng)元的數(shù)量
TH是DA合成的限速酶，存在于DA能神經(jīng)元的胞漿內(nèi)，通過(guò)TH免疫組化染 色法，可以鑒定DA能神經(jīng)元，并觀察DA能神經(jīng)元形態(tài)和數(shù)量的改變。TH免疫組 化顯示，腹腔注射MPTP后，黑質(zhì)致密部的DA能神經(jīng)元大量死亡(圖12B， 12E)， 與NS組(圖12A， 12D)相比TH免疫陽(yáng)性神經(jīng)元的數(shù)目明顯減少；褐藻多糖硫酸 酯25mg/kg組(圖12C, 12E)黑質(zhì)致密部的TH陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)基本正常，結(jié)構(gòu)完整， 數(shù)目明顯多于MPTP組。
3. 褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著對(duì)抗MPTP引起的小鼠腹側(cè)中腦和紋狀 體TH蛋白表達(dá)減少
用蛋白裂解液分別提取小鼠腹側(cè)中腦和紋狀體蛋白，用Western蛋白免疫印跡 法檢測(cè)其TH蛋白表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腹腔注射MPTP后，小鼠腹側(cè)中腦和紋狀體 TH蛋白表達(dá)較NS對(duì)照組明顯減少，而12.5mg/kg和25mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔 注射可以顯著對(duì)抗MPTP引起的腹側(cè)中腦和紋狀體TH蛋白表達(dá)減少(圖13，圖14)。
4. 褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著提高M(jìn)PTP小鼠紋狀體內(nèi)DA和DOPAC 的含量
用高效液相一電化學(xué)法(HPLC-ECD)對(duì)小鼠紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物二羥 苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)的含量進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)DA、 DOPAC、 HVA 含量和(HVA+DOPAC) /DA的比值進(jìn)行了計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25mg/kg劑量組的褐藻多糖硫酸酯能使MPTP小鼠紋狀體中DA和 DOPAC的含量顯著地增高(圖15、圖16)， HVA含量無(wú)明顯變化(圖17);同時(shí)，
(HVA+DOPAC) /DA的比值為所有組中最低(圖18)。 HVA和DOPAC是DA在 腦內(nèi)的最終代謝產(chǎn)物，(HVA+DOPAC)/DA比值升高，說(shuō)明DA的代謝速率增快， 代謝產(chǎn)物生成增多，多見(jiàn)于DA能神經(jīng)元不完全損傷時(shí)。褐藻多糖硫酸酯能使(HVA +DOPAC) /DA的比值降低，說(shuō)明其能減緩MPTP損傷鼠DA能神經(jīng)元中的DA代 謝更新速率，從而有效地保護(hù)了神經(jīng)元的存活，對(duì)MPTP導(dǎo)致的PD小鼠模型中腦DA能神經(jīng)元的損傷具有一定的保護(hù)作用。
5.褐藻多糖硫酸酯保護(hù)MPTP小鼠DA能神經(jīng)元的相關(guān)機(jī)制研究 5丄褐藻多糖硫酸酯腹腔注射對(duì)MPTP代謝的影響
最后一次注射MPTP后2小時(shí)，用高效液相一紫外檢測(cè)法對(duì)小鼠紋狀體MPTP 代謝產(chǎn)物MPP+含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，25mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射組紋狀 體MPP+含量與單獨(dú)注射MPTP組沒(méi)有明顯區(qū)別，說(shuō)明褐藻多糖硫酸酯不影響MPTP 的代謝(圖19)。
5.2. 褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著降低MPTP小鼠腹側(cè)中腦的丙二醛 (malonaldehyde， MDA)含量
在正常腦組織，活性氧(reactive oxygen species, ROS)的產(chǎn)生，如超氧陰離子基 團(tuán)、過(guò)氧化氫、羥基和過(guò)氧化亞硝基陰離子，與內(nèi)源性酶[超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-px)、過(guò)氧化 氫酶(catalase)等抗氧化防御體系保持平衡。既往研究表明，遺傳、環(huán)境、老化等 多種因素作用可以導(dǎo)致PD患者腦內(nèi)的這種平衡狀態(tài)被破壞，過(guò)多的自由基攻擊生 物膜、蛋白質(zhì)和DNA等生物大分子產(chǎn)生損傷效應(yīng)；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究也支持氧化應(yīng)激 參與了DA能神經(jīng)元變性、死亡的啟動(dòng)和進(jìn)展過(guò)程，因此針對(duì)氧化應(yīng)激的抗氧化藥 物的研發(fā)是PD治療學(xué)的研究熱點(diǎn)。
脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量測(cè)定是反映組織的氧化應(yīng)激水平的常用指標(biāo)。在最 后一次注射MPTP后48小時(shí)，用MDA試劑盒對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦組織勻漿上 清中的MDA含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，MPTP小鼠腹側(cè)中腦MDA的含量顯著增高，是 生理鹽水對(duì)照組的152.35%，而12.5mg/kg和50mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可 以顯著降低MPTP小鼠腹側(cè)中腦MDA的含量，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖20)。
5.3. 褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著提高M(jìn)PTP小鼠腹側(cè)中腦的抗氧化酶的
在最后一次注射MPTP后48小時(shí)，用SOD、 GSH-px、 Catalase和總抗氧化能 力(total antioxidant capability, TAOC)測(cè)定試劑盒分別對(duì)MPTP小鼠腹側(cè)中腦組 織勻漿上清中的SOD、 GSH-px、 Catalase含量和TAOC進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，MPTP小鼠 腹側(cè)中腦SOD、 GSH-px、 Catalase含量和TAOC與生理鹽水對(duì)照組相比顯著降低， 而12.5mg/kg和50mg/kg褐藻多糖硫酸酯腹腔注射可以顯著增加MPTP小鼠腹側(cè) 中腦SOD、 GSH-px、 Catalase含量和TAOC，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖21 ，圖22，圖23,圖24)。
試驗(yàn)例5褐藻多糖硫酸酯灌胃給藥對(duì)MPTP小鼠DA能神經(jīng)元的保護(hù)作用觀察
為了給將來(lái)方便臨床用藥提供依據(jù)，繼續(xù)觀察了褐藻多糖硫酸酯灌胃對(duì)MPTP 小鼠行為學(xué)和紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物DOPAC的影響。
選用8 10周齡的雄性C57BL/6J小鼠，按15 mg/kg體重腹腔注射MPTP，每 2小時(shí)一次，連續(xù)注射4次，可使紋狀體中DA含量的降低達(dá)到90。/。以上，空白對(duì) 照組給予等體積NS。將動(dòng)物分為4組(1)NS + NS組；(2) NS + MPTP組；(3) 褐藻多糖硫酸酯(實(shí)施例2所制備的低分子量海帶褐藻多糖硫酸酯Fl) 50mg/kg 灌胃+MPTP組；(4)褐藻多糖硫酸酯(實(shí)施例2所制備的低分子量海帶褐藻多糖 硫酸酯F1) 100mg/kg灌胃+ MPTP組。
在MPTP損毀的前一周開(kāi)始灌胃褐藻多糖硫酸酯或NS;造模當(dāng)天灌胃褐藻多 糖硫酸酯或NS后1小時(shí)開(kāi)始腹腔注射MPTP或NS;再繼續(xù)每天一次灌胃褐藻多糖 硫酸酯或NS—周后，完成行為學(xué)測(cè)試后處死動(dòng)物，對(duì)紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物含 量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如下
1. 褐藻多糖硫酸酯灌胃可以顯著改善MPTP小鼠的行為
應(yīng)用Truscan動(dòng)物活動(dòng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)連續(xù)記錄小鼠自主活動(dòng)，記錄時(shí)間為60分鐘， 用隨機(jī)軟件對(duì)各項(xiàng)運(yùn)動(dòng)指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，MPTP小鼠在相同時(shí)間內(nèi)的總活 動(dòng)距離、平均運(yùn)動(dòng)速度和每次活動(dòng)的平均移動(dòng)距離均顯著低于生理鹽水對(duì)照組，但 100mg/kg褐藻多糖硫酸酯灌胃15天組小鼠的上述運(yùn)動(dòng)指標(biāo)均明顯好轉(zhuǎn)，結(jié)果具有 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖25、圖26、圖27)。圖28為各組小鼠15分鐘的運(yùn)動(dòng)軌跡圖，結(jié)果 提示褐藻多糖硫酸酯灌胃可以減輕MPTP小鼠的運(yùn)動(dòng)減少和運(yùn)動(dòng)遲緩。
2. 褐藻多糖硫酸酯灌胃可以顯著提高M(jìn)PTP小鼠紋狀體內(nèi)DA和DOPAC的含
用高效液相一電化學(xué)法(HPLC-ECD)對(duì)小鼠紋狀體中DA及其代謝產(chǎn)物 DOPAC和HVA的含量進(jìn)行了檢測(cè)，并對(duì)DA、 DOPAC和HVA的含量及(HVA+ DOPAC) /DA的比值進(jìn)行了計(jì)算及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。
分析發(fā)現(xiàn)100mg/kg的褐藻多糖硫酸酯能使MPTP小鼠紋狀體中DA和DOPAC 的含量顯著地增高，HVA含量無(wú)明顯變化；同時(shí)，(HVA+DOPAC) /DA的比值為 所有組中最低(圖29，圖30，圖31，圖32)。
通過(guò)以上離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的DA能神經(jīng)元有一定的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，推測(cè)其機(jī)制可能與褐藻多糖硫 酸酯的降低中腦脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)、提高抗氧化系統(tǒng)活性有關(guān)。
權(quán)利要求
1、褐藻多糖硫酸酯在制備預(yù)防和治療帕金森病藥物中的用途。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述褐藻多糖硫酸酯的主要組分是L-褐藻糖-4-硫酸酯，還含有少量的半乳糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、 糖醛酸、蛋白質(zhì)、K、 Na、 Ca和Mg。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述褐藻多糖硫酸酯從以下褐 藻中的一種或多種中提取得到海帶、馬尾藻、裙帶菜、羊棲菜、鼠尾藻、海黍子、昆布、泡葉藻、墨角藻。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用途，其特征在于所述的褐藻多糖硫酸酯是從海帶中提取得到的海帶褐藻多糖硫酸酯。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于所述的海帶褐藻多糖硫酸酯主要是由巖藻糖和半乳糖組成，其中巖藻糖含量為31%，硫酸基含量為32%,平均 分子量為180KD。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的褐藻多糖硫酸酯還包括將褐藻多糖硫酸酯通過(guò)降解而制備得到的低分子量硫酸多糖或寡糖類(lèi)物質(zhì)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量為2kD—1000Kd。
8、 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于所述的褐藻多糖硫酸酯的分子量是3KD 30KD。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于所述的褐藻多糖硫酸酯的分子 量是5KD 20KD。
10、 一種藥物組合物，該藥物組合物包含治療上有效量的褐藻多糖硫酸酯和至 少一種藥學(xué)上可接受的輔料或載體。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了褐藻多糖硫酸酯在預(yù)防和治療帕金森病中的新用途。通過(guò)離體帕金森病(PD)細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)和在體動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)表明，褐藻多糖硫酸酯對(duì)PD細(xì)胞模型和動(dòng)物模型的DA能神經(jīng)元有一定的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，可用于預(yù)防和治療帕金森病。本發(fā)明所述褐藻多糖硫酸酯可以是從海帶、墨角藻、泡葉藻、昆布或繩藻等褐藻中提取得到的天然多糖提取物，也可以是經(jīng)任何方法將褐藻多糖硫酸酯通過(guò)降解而制得的低分子量硫酸多糖或寡糖類(lèi)物質(zhì)。
文檔編號(hào)A61P25/28GK101301310SQ200710099008
公開(kāi)日2008年11月12日 申請(qǐng)日期2007年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2007年5月8日
發(fā)明者張全斌, 王曉民, 羅鼎真 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué);中國(guó)科學(xué)院海洋研究所