一種北沙參多糖及其制備方法和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種北沙參多糖及其制備方法和應(yīng)用，涉及多糖類技術(shù)領(lǐng)域。北沙參多糖的分子量為26.3 kDa；北沙參多糖的單糖組成和摩爾比為：鼠李糖：半乳糖：葡萄糖=2.05：1.00：7.06；并提供了北沙參多糖的一級結(jié)構(gòu)重復(fù)單元。本發(fā)明北沙參多糖具有提取工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、毒副作用小的優(yōu)點，適用于抗氧化或抗腫瘤新藥的開發(fā)和應(yīng)用。
【專利說明】
一種北沙參多糖及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及多糖類技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 北沙參為傘形科植物珊瑚菜(Glehnia littoralis F. Schmidt ex Miq.)，以根入 藥。北沙參味甘甜，是臨床常用的滋陰藥，養(yǎng)陰清肺，祛痰止咳。主治肺燥干咳、熱病傷津、口 渴等癥。主產(chǎn)于山東、河北、遼寧、內(nèi)蒙古等地。別名萊陽參、海沙參、銀沙參、遼沙參、蘇條 參、條參、北條參。北沙參主要含香豆素類成分、佛手柑內(nèi)酯、補骨脂素、花椒毒素及多糖等。 而多糖是其最主要的活性成分，總糖含量達(dá)70%以上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種北沙參多糖及其制備方法和應(yīng)用，具有提取 工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、毒副作用小的優(yōu)點，適用于抗氧化或抗腫 瘤新藥的開發(fā)和應(yīng)用。
[0004] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:一種北沙參多糖，北沙參多糖 的分子量為26.3 kDa;北沙參多糖的單糖組成和摩爾比為：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05: 1.00:7.06;北沙參多糖的一級結(jié)構(gòu)重復(fù)單元如下：
[0005] 上述北沙參多糖的制備方法，包括以下步驟： (1) 提取 取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，除去含有的脂溶性化合物;藥材殘渣蒸餾水提 取，濃縮，加入無水乙醇沉淀，干燥后得北沙參粗多糖； (2) 分離和純化 a、 除蛋白； b、 除色素； c、 進(jìn)一步分離和純化，得到所述的北沙參多糖。
[0006] 優(yōu)選的，進(jìn)一步分離和純化，包括： 1) 、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入透析袋，分別用自來水、蒸餾水透析，透析 后袋內(nèi)液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖； 2) 、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖維素柱層析對北沙參二級粗多糖進(jìn)行 分離純化，收集，減壓濃縮、透析和冷凍干燥，得到北沙參精多糖； 3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-IOO柱層析對北沙參精多糖進(jìn)行純化，收 集，得到組分單一的北沙參多糖。
[0007] 優(yōu)選的，步驟（1)提取為：取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用體積分?jǐn)?shù)為 95%的食用乙醇提取，除去含有的脂溶性化合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入蒸餾水提取，水提 液減壓濃縮，在攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙醇體積含量為75-85%，在3_5°C下靜置 22-26 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多糖。
[0008] 進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟(1)提取為:取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用北沙參 6-10倍質(zhì)量的體積分?jǐn)?shù)為95%的食用酒精55-65 °C條件下提取2-3次，除去含有的脂溶性化 合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入藥材殘渣18-22倍質(zhì)量的蒸餾水，使用超聲功率200-300 W的 超聲波提取儀75-85°C條件下輔助提取15-20 min，然后在75-85°C恒溫下水浴提取2.5-3.5 h，過濾后重復(fù)提取2-3次，合并水提液，減壓濃縮至水提液體積的八分之一至十分之一;在 攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙醇體積含量為75-85%，在3-5°C下靜置22-26 h，離心，收 集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多糖。
[0009] 優(yōu)選的，步驟(2)分離和純化中： a、 除蛋白為:將北沙參粗多糖溶于8-12倍質(zhì)量的蒸餾水中，溫度調(diào)至45-55°C，保持25-35 min，緩慢加入木瓜蛋白酶，調(diào)pH值為6，攪拌1.5-2.5 h后，溫度調(diào)至85-95 °C，保持25-35 min，冷至室溫，離心，收集上清液，即北沙參粗多糖溶液，再使用Sevag法除蛋白，北沙參粗 多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙參粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的體積比例為25:5:1;震 蕩15-25 min，靜置，離心，去掉下層的有機層和中間層的白色蛋白；重復(fù)萃取操作直至中間 層無白色蛋白出現(xiàn)，在紫外分光光度計下200-400 nm掃描，在260-280 nm之間無吸收，說明 除蛋白完全； b、 除色素為:除蛋白后的北沙參粗多糖溶液用HPD-100型大孔樹脂吸附色素;大孔樹脂 先用無水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸餾水徹底清洗，充分溶脹;除蛋白后的北沙參粗多糖溶 液的毫升數(shù)和大孔樹脂的克數(shù)比例為12:1，靜態(tài)吸附12 h，抽濾，減壓濃縮，得到除色素的 北沙參粗多糖。
[0010] 優(yōu)選的，步驟(2)分離和純化中：1)、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入截留 量為3500 Da的透析袋，分別用自來水、蒸餾水透析48 h和24 h，透析后袋內(nèi)液冷凍干燥后 得北沙參二級粗多糖。
[0011] 優(yōu)選的，步驟(2)分離和純化中：2)、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖 維素柱層析對北沙參二級粗多糖進(jìn)行分離純化，稱取北沙參二級粗多糖，使用北沙參二級 粗多糖95-105倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣于DEAE-cellulose 52 纖維素層析柱 ，分別使用蒸餾水和 0-0.8 M 的梯度 NaCl 溶液進(jìn)行洗脫 ，流速設(shè) 定為0.5 mL/min，自動部分收集器收集，每管收集5.0 mL;苯酸-硫酸法跟蹤檢測北沙參多 糖的流出；以吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫液管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集第二個洗脫主 峰，減壓濃縮、分別用自來水、蒸餾水透析48h和冷凍干燥，得到北沙參精多糖。
[0012] 優(yōu)選的，步驟(2)分離和純化中：3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100 柱層析對北沙參精多糖進(jìn)行純化，稱取北沙參精多糖，用95-105倍質(zhì)量蒸餾水溶解，過0.45 ym的微孔濾膜過濾，上清液上樣于Sephadex G-100層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速設(shè)定為 0.5 mL/min，自動部分收集器收集洗脫液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖的 流出；以吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫液管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集第一個洗脫峰，得到 組分單一的北沙參多糖。
[0013]另一方面，本發(fā)明還提供了北沙參多糖在制備抗腫瘤藥物或抗氧化活性藥物中的 應(yīng)用。
[0014]采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明北沙參多糖具有提取工藝簡 單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、其對人肝癌細(xì)胞IfepG2的IC5q是43.26 yg/mL，毒副 作用小的優(yōu)點，適用于抗氧化或抗腫瘤新藥的開發(fā)和應(yīng)用。
【附圖說明】
[0015] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明； 圖1是本發(fā)明北沙參多糖Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析洗脫曲線圖； 圖2是本發(fā)明北沙參多糖的紫外-可見掃描圖（700-200 nm); 圖3是本發(fā)明北沙參多糖的紅外譜圖； 圖4 A是本發(fā)明北沙參多糖的核磁譜圖（1H-13C HSQC); 圖4 B是本發(fā)明北沙參多糖的核磁譜圖（1H-13C HMBC); 圖5是本發(fā)明北沙參多糖的抗氧化活性(清除DPPH自由基)結(jié)果圖； 圖6是本發(fā)明北沙參多糖的抗氧化活性(螯合Fe2+)結(jié)果圖； 圖7是本發(fā)明北沙參多糖對人肝癌細(xì)胞HepG2的抑制活性(丨，_ n=：3〕圖； 圖8是本發(fā)明北沙參多糖抑制S18q荷瘤小鼠腫瘤生長實驗各組腫瘤組織圖； 圖9是本發(fā)明S18q荷瘤小鼠體重變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1 一種北沙參多糖，北沙參多糖的分子量為26.3 kDa;北沙參多糖的單糖組成和摩爾比 為：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06;北沙參多糖的一級結(jié)構(gòu)重復(fù)單元如下：
[0017] 上述北沙參多糖的制備方法，包括以下步驟： (1)提取 取干燥的河北道地藥材北沙參500 g，粉碎，使用北沙參7.89倍質(zhì)量的體積分?jǐn)?shù)為95% 的食用酒精60°C條件下提取2次，除去含有的脂溶性化合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入藥材 殘渣20倍質(zhì)量的蒸餾水，使用超聲功率260 W的超聲波提取儀80°C條件下輔助提取15 min， 然后在80°C恒溫下水浴提取3 h，過濾后重復(fù)提取2次，合并水提液，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃 縮至水提液體積的十分之一;在攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙醇體積含量為80%，在4 °C下靜置24 h，5000rpm條件下離心10 min，收集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多糖。
[0018] (2)分離和純化 a、除蛋白：將北沙參粗多糖溶于10倍質(zhì)量的蒸餾水中，溫度調(diào)至50°C，保持30 min，緩 慢加入木瓜蛋白酶，調(diào)pH值為6，攪拌2 h后，溫度調(diào)至90°C，保持30 min，冷至室溫，5000rpm 離心15 min，收集上清液，即北沙參粗多糖溶液;北沙參粗多糖溶液使用Sevag法除蛋白，北 沙參粗多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙參粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的體積比例為25: 5:1;劇烈震蕩20 min，靜置，用離心機5000rpm離心15 min，去掉下層的有機層和中間層的 白色蛋白；重復(fù)萃取操作5次，直至中間層無白色蛋白出現(xiàn)，在紫外分光光度計下200-400 nm掃描，在260-280 nm之間無吸收，說明除蛋白完全。
[0019] b、除色素:除蛋白后的北沙參粗多糖溶液用HPD-100型大孔樹脂(滄州寶恩吸附材 料科技有限公司）吸附色素;大孔樹脂先用無水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸餾水徹底清洗，充 分溶脹;除蛋白后的北沙參粗多糖溶液的毫升數(shù)和大孔樹脂的克數(shù)比例為12: l(v/w)，靜態(tài) 吸附12 h，抽濾，減壓濃縮，得到除色素的北沙參粗多糖。
[0020] C、進(jìn)一步分離和純化，包括： 1)、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入截留量為3500 Da的透析袋，分別用自來 水、蒸餾水透析48 h和24 h，透析后袋內(nèi)液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖。
[0021 ] 2)、離子交換柱層析:使用DEAE-Cellulose 52纖維素(瑞典Pharmacia公司）柱層 析對北沙參二級粗多糖進(jìn)行分離純化，稱取北沙參二級粗多糖，使用北沙參二級粗多糖100 倍質(zhì)量的蒸餾水溶解，過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣于DEAE-cellulose 52纖維 素層析柱，分別使用蒸餾水和梯度NaCl溶液(0-0.8 M)的進(jìn)行洗脫，流速設(shè)定為0.5 mL/ min，自動部分收集器收集，每管收集5.0 mL;苯酚-硫酸法跟蹤檢測北沙參多糖的流出；以 吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫液管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集第二個洗脫主峰，減壓濃縮、 透析和冷凍干燥，得到北沙參精多糖。
[0022] 3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100(瑞典Pharmacia公司）柱層析對 北沙參精多糖進(jìn)行純化，稱取北沙參精多糖，用100倍質(zhì)量蒸餾水溶解，過〇.45 μπι的微孔濾 膜過濾，上清液上樣于Sephadex G-100層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速設(shè)定為0.5 mL/ min，自動部分收集器收集洗脫液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖的流出；以 吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫液管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集第一個洗脫峰，得到組分單一 的北沙參多糖。
[0023] 實施例2 北沙參多糖的純度驗證： 經(jīng)過旋光度法、紫外-可見光譜掃描法、凝膠柱層析(GPC)法驗證北沙參多糖的純度，結(jié) 果表明北沙參多糖為均一性良好的精多糖。在常溫下(20°C)，在水中具有良好的溶解性，不 溶于乙醇、丙酮、乙醚等有機溶劑。
[0024]旋光度法驗證北沙參多糖的純度:經(jīng)分離純化后的北沙參多糖醇沉所得的20%和 40%乙醇沉淀物水溶液，測定其旋轉(zhuǎn)角，計算其比旋光度，數(shù)值基本恒定，平均值為[(?^=-20.60° (c = 0.5 mg/mL，H2O)，表明純化后多糖樣品均一性良好。
[0025]凝膠柱層析(GPC)法驗證北沙參多糖的純度：見圖1所示，由圖1洗脫曲線圖可知， 分離純化后的北沙參多糖在Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析中獲得單一、對稱的洗脫峰。 [0026]紫外-可見光譜掃描法驗證北沙參多糖的純度：見圖2所示，由圖2可知，在700 - 200 nm處，北沙參多糖的掃描曲線呈平滑曲線，并無明顯的蛋白及核酸雜質(zhì)吸收。
[0027] 實施例3 北沙參多糖的結(jié)構(gòu)表征 采用完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化反應(yīng)等化學(xué)分析方法； 紅外光譜、氣質(zhì)聯(lián)用、高效離子色譜、核磁共振等儀器分析技術(shù)，表征了北沙參多糖的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。
[0028] (1)北沙參多糖分子量的測定 采用凝膠滲透過濾法(GPC)測定多糖分子量，分別稱取1.0 mg標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖T4、T7、T10、 丁40、了70、了200，溶解于1.0 11^蒸餾水中，分別上凝膠柱56口1^(^7 3-300冊（1.6\90.0 cm)，以蒸餾水作洗脫液，調(diào)節(jié)流速為0.3 mL/min，自動部分收集器收集每管0.6 mL，用苯 酚-硫酸法檢測樣品出峰液分布，計算各標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖出峰的洗脫體積Ve，通過已知分子量為 200萬的藍(lán)葡聚糖來確定凝膠柱的空體積Vo,通過無水葡萄糖來確定凝膠柱的總柱體積Vt。 以有效分配系數(shù)(Kav)為縱坐標(biāo)，以IgMw為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分配系數(shù)Kav由以下公式求 得：
式中：Ve:待測樣品的洗脫體積;Vo:凝膠層析柱的空體積;Vt:凝膠柱層析柱的總體 積。
[0029] 精確稱取北沙參多糖樣品2.0 mg，溶于2.0 mL洗脫液，上Sephacry S-300 HR凝膠 層析柱，同上法測定多糖的分子量分布，根據(jù)所得的多糖樣品的出峰洗脫體積，代入上述標(biāo) 準(zhǔn)曲線中，計算出樣品的分子量為26.3 kDa。
[0030] (2)北沙參多糖的單糖組成 取北沙參多糖樣品使用三氟乙酸完全酸水解后，進(jìn)行HPAEC-PAD測定，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)單糖的 高效離子色譜保留時間對照，并根據(jù)各峰的保留時間和峰面積比計算出各單糖的組成和摩 爾比，為鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06。
[0031] (3)北沙參多糖的紅外圖譜如圖3所示： 由圖3可知:3436、2961、1641 ^413^0770^1為多糖的特征吸收峰。
[0032] (4)北沙參多糖的核磁共振圖譜如圖4A、圖4B所示： 采用化學(xué)分析法（如完全酸水解、部分酸水解、高碘酸氧化-Smith降解、甲基化等）以 及儀器分析方法（如紫外光譜、紅外光譜、核磁共振、氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用、高效離子色譜 等)對多糖的初級結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，得到北沙參多糖的一級結(jié)構(gòu)重復(fù)單元如下：
結(jié)構(gòu)式中，A、B、C、D、E是代表對應(yīng)核磁共振圖譜（圖4A、圖4B)上面的吸收峰的符號。
[0033] 實施例4 北沙參多糖的抗腫瘤和抗氧化活性： 考察了北沙參多糖體外抗氧化活性，包括清除DPPH自由基活性和鐵離子螯合能力測定 兩個實驗： (I)DPPH自由基清除活性 稱取20.0 mg的DPPH試劑，加入無水乙醇溶解，用250 mL容量瓶定容至刻度，得到濃度2 X10-4 mol/L的DPPH溶液(4°C冰箱保存），96孔酶標(biāo)板中，加入190 yL· DPPH，10 yL不同濃度 的抗壞血酸(維生素 C，Vc)以及樣品（水溶，設(shè)終濃度梯度為1600、800、400、200、100、50、25、 〇 yg/mL)，反應(yīng)總體積為200 yL，混合均勻后避光，水平搖床上振搖反應(yīng)30 min，測定在490 nm波長下吸光度值的變化，每個濃度設(shè)3組平行，取平均值。對DPPH自由基的抑制率按下列 公式進(jìn)行計算：
其中，A1為樣品溶液+DPPH溶液;A2為樣品溶液+無水乙醇;Ao為DPPH溶液+無水乙醇。 [0034]實驗結(jié)果如圖5所示。
[0035] (2)Fe2+螯合作用測試 取0.8 mL不同濃度的北沙參多糖樣品水溶液，加入氯化亞鐵溶液，渦旋均勻，然后加螯 合劑Ferroizine，混勾后于562 nm處測定吸光度值。然后取超純水代替北沙參多糖樣品水 溶液，加入氯化亞鐵和Ferroizine，混勾后在室溫下放置10 min，于562 nm處測定吸光度 值，作為空白對照組，乙二胺四乙酸(EDTA)作為陽性對照品。螯合作用計算公式如下： 鐵離子螯合能力(％) = (A空白-A樣品)/A空白X 100% 實驗結(jié)果如圖6所示。
[0036]從兔和圖6結(jié)果顯示:在25到1600yg/mL的濃度范圍內(nèi)，北沙參多糖具有較強的體 外抗氧化作用，并且呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。
[0037] (3)體外抗腫瘤活性測試 人肝癌細(xì)胞HepG2 (購于中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞庫），采用MTT實驗檢測法，即將處于對數(shù) 生長期的腫瘤細(xì)胞，制成含有細(xì)胞3-4 X IO3個/mL單細(xì)胞懸液，分別接種于無菌的96孔板 中，100 UL/孔。置于5% C02,37°C培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)12 h。設(shè)空白對照組(加等體積RPMI1640培 養(yǎng)液）、陽性對照組(順鉑)和給藥組，每個濃度組3個復(fù)孔，加入藥物，每孔總反應(yīng)體積為200 μL。將其置5% CO2培養(yǎng)箱中，37°C培養(yǎng)48 h，實驗終止前4 h加入20 uL的MTT(5.0 mg/mL)， 繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄去上清液，加入二甲基亞砜200 μL7孔，置于振蕩儀上振蕩10 min，用酶標(biāo) 儀于波長570 nm處測定吸光度值A(chǔ)57〇,按下列公式求出生長抑制率。
[0038] 生長抑制率(％)=(1 -給藥組A57Q值/對照組A57〇)X100 使用人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞株檢測了北沙參多糖的體外抗腫瘤活性，見圖7所示，由圖7 可知，北沙參多糖具有較強的抗腫瘤活性，其對人肝癌細(xì)胞IfepG2的IC5q是43.26 yg/mL。
[0039] (4)體內(nèi)抗腫瘤活性測試 實驗動物為昆明小鼠，雄性，體重18-22g。購于中山大學(xué)實驗動物中心，許可證號:SCXK (粵）2011-0029。
[0040] 小鼠飼養(yǎng)于中山大學(xué)實驗動物中心。攝食專用飼料，自由飲水。光照黑暗各12 h， 室溫20~24°C，相對濕度40%~70%。每盒6只，每周更換2次墊底木肩，每周消毒2次給水瓶， 每日更換新鮮無菌水。適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實驗。
[0041 ] a腫瘤模型建立 1)細(xì)胞復(fù)蘇、接種 從液氮罐中取出Si8〇凍存細(xì)胞，37°C速融，轉(zhuǎn)移入離心管中離心，800 rpmX 5 min，離 心完畢棄上清。加入I3BS緩沖液重懸后離心800 rpm X 5 min，離心完畢棄上清，重復(fù)一次。 加入PBS緩沖液重懸，臺盼藍(lán)染液染色后細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為3 X IO7 cells/ml。于超 凈工作臺中按0.2 ml/只接種于昆明小鼠腹腔。
[0042] 2)腫瘤細(xì)胞小鼠體內(nèi)傳代 10 d后，腹水形成。抽取小鼠腹水，臺盼藍(lán)染液染色后細(xì)胞計數(shù)。調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7個/ml。于超凈工作臺中按0.2 ml/只接種于昆明小鼠腹腔。傳代兩次后建立實驗動物腫 瘤模型。
[0043] 3)建立實驗動物腫瘤模型 取接種8 d生長良好的S18q小鼠，消毒其腹部皮膚，用無菌注射器抽吸腹水，生理鹽水二 倍稀釋，瘤細(xì)胞懸液為乳白色半透明狀態(tài)，臺盼藍(lán)染色后用血球計數(shù)板在倒置式顯微鏡下 計數(shù)，活細(xì)胞數(shù)為98%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X IO7個/ml。無菌條件下接種細(xì)胞懸液于小鼠 右前肢腋下，每只0.2 ml。
[0044] b實驗分組和給藥 將40只接種S18q細(xì)胞的小鼠稱重，隨機分為4組：空白對照組、陽性對照組（環(huán)磷酰 胺，CTX)、北沙參多糖低劑量組、北沙參多糖高劑量組，每組10只。
[0045] 接種24 h后，開始給藥，給藥容積為0.2 ml/10g。陽性對照組CTX劑量為25 mg/kg， 參照云芝多糖給藥劑量200 mg/kg，設(shè)定北沙參多糖低、高劑量組分別為100、400 mg/kg，空 白對照組給予等量的0.5% CMC溶液，除陽性對照組腹腔注射給藥外，其他三組灌胃給藥。每 天固定時間給藥1次并記錄小鼠體重及活動情況，連續(xù)10 d。
[0046] c抑瘤率和臟器指數(shù)的計算 末次給藥24 h后稱體重，計算體重增加值;頸椎脫白處死小鼠，剖取瘤塊、脾臟及胸腺 并稱重，計算抑瘤率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。公式如下： 抑瘤率(％) =(空白組瘤重-給藥組瘤重)/空白組瘤重X 1 〇〇% 脾臟指數(shù)=小鼠脾重(mg)/小鼠體重(g) 胸腺指數(shù)=小鼠胸腺重(mg)/小鼠體重(g)。
[0047] d統(tǒng)計方法 所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差丨:如)：表示。t檢驗采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件包完成，以 p〈0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0048] e實驗結(jié)果 北沙參多糖對小鼠 S18O移植瘤的生長抑制作用，見表1所示：
::注r;與空:白鄉(xiāng)照:組1?較，Cl.賅,，〇Jl·。 利用S18Q荷瘤小鼠模型對北沙參多糖體內(nèi)抗腫瘤作用進(jìn)行初步研究。實驗結(jié)果表明：空 白對照組平均瘤重大于lg，陽性對照藥環(huán)磷酰胺顯著抑制&80移植瘤的生長，其瘤重與空白 對照組比較具有顯著性差異(P〈〇. 01);北沙參多糖高低劑量組的抑瘤率分別為33.1%和 20.7%，其中高劑量組瘤重與空白對照組比較具有明顯差異(p〈0.05)。各組腫瘤組織見圖8 所示。
[0049] 北沙參多糖對Siso荷瘤小鼠體重的影響見圖9所示。
[0050] 如圖9所示:在給藥過程中，陽性對照環(huán)磷酰胺組小鼠體重增加緩慢。而北沙參多 糖對S18q荷瘤小鼠的體重?zé)o顯著影響。
[0051] 北沙參多糖對S18q荷瘤小鼠免疫器官指數(shù)的影響，見表2所示： 由表2可知：與空白對照組相比，陽性對照藥環(huán)磷酰胺顯著減小S18q荷瘤小鼠的脾臟指 數(shù)和胸腺指數(shù)(P〈〇. 01 )，而北沙參多糖對318〇荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)無顯著影響。 :閨:與_自頻纖_
[0052] 本發(fā)明北沙參多糖具有提取工藝簡單、組分純度高、抗腫瘤和抗氧化活性好、其對 人肝癌細(xì)胞HepG2的IC5q是43.26 yg/mL，毒副作用小的優(yōu)點，適用于抗氧化或抗腫瘤新藥的 開發(fā)和應(yīng)用。
【主權(quán)項】
1. 一種北沙參多糖，其特征在于:所述北沙參多糖的分子量為26.3 kDa;北沙參多糖的 單糖組成和摩爾比為：鼠李糖:半乳糖:葡萄糖=2.05:1.00:7.06;北沙參多糖的一級結(jié)構(gòu)重 復(fù)單元如下：2. 如權(quán)利要求1所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 提取 取干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，除去含有的脂溶性化合物；藥材殘渣蒸餾水提 取，濃縮，加入無水乙醇沉淀，干燥后得北沙參粗多糖； (2) 分離和純化 a、 除蛋白； b、 除色素； c、 進(jìn)一步分離和純化，得到所述的北沙參多糖。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，所述進(jìn)一步分離和 純化，包括： 1) 、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入透析袋，分別用自來水、蒸餾水透析，透析 后袋內(nèi)液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖； 2) 、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖維素柱層析對北沙參二級粗多糖進(jìn)行 分離純化，收集，減壓濃縮、透析和冷凍干燥，得到北沙參精多糖； 3) 、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對北沙參精多糖進(jìn)行純化，收 集，得到組分單一的北沙參多糖。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(1)提取為:取 干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用體積分?jǐn)?shù)為95%的食用乙醇提取，除去含有的脂溶 性化合物;藥材殘渣揮干乙醇，加入蒸餾水提取，水提液減壓濃縮，在攪拌條件下加入無水 乙醇使最終乙醇體積含量為75-85%，在3-5°C下靜置22-26 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥后 得北沙參粗多糖。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(1)提取為:取 干燥的河北道地藥材北沙參，粉碎，使用北沙參6-10倍質(zhì)量的體積分?jǐn)?shù)為95%的食用酒精 55-65Γ條件下提取2-3次，除去含有的脂溶性化合物；藥材殘渣揮干乙醇，加入藥材殘渣 18-22倍質(zhì)量的蒸餾水，使用超聲功率200-300 W的超聲波提取儀75-85°C條件下輔助提取 15-20 min，然后在75-85 °C恒溫下水浴提取2.5-3.5 h，過濾后重復(fù)提取2-3次，合并水提 液，減壓濃縮至水提液體積的八分之一至十分之一;在攪拌條件下加入無水乙醇使最終乙 醇體積含量為75-85%，在3-5 °C下靜置22-26 h，離心，收集沉淀，冷凍干燥后得北沙參粗多 糖。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中： a、 除蛋白為:將北沙參粗多糖溶于8-12倍質(zhì)量的蒸餾水中，溫度調(diào)至45-55°C，保持25-35 min，緩慢加入木瓜蛋白酶，調(diào)pH值為6，攪拌1.5-2.5 h后，溫度調(diào)至85-95 °C，保持25-35 min，冷至室溫，離心，收集上清液，即北沙參粗多糖溶液，再使用Sevag法除蛋白，北沙參粗 多糖溶液中加入氯仿和正丁醇，北沙參粗多糖溶液、氯仿和正丁醇的體積比例為25:5:1;震 蕩15-25 min，靜置，離心，去掉下層的有機層和中間層的白色蛋白；重復(fù)萃取操作直至中間 層無白色蛋白出現(xiàn)，在紫外分光光度計下200-400 nm掃描，在260-280 nm之間無吸收，說明 除蛋白完全； b、 除色素為:除蛋白后的北沙參粗多糖溶液用HPD-100型大孔樹脂吸附色素;大孔樹脂 先用無水乙醇浸泡，清洗，然后用蒸餾水徹底清洗，充分溶脹;除蛋白后的北沙參粗多糖溶 液的毫升數(shù)和大孔樹脂的克數(shù)比例為12:1，靜態(tài)吸附12 h，抽濾，減壓濃縮，得到除色素的 北沙參粗多糖。7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中：1)、透析:將除色素完畢的北沙參粗多糖裝入截留量為3500 Da的透析袋，分別用自來 水、蒸餾水透析48 h和24 h，透析后袋內(nèi)液冷凍干燥后得北沙參二級粗多糖。8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中：2)、離子交換柱層析:使用DEAE-cellulose 52纖維素柱層析對北沙參二級粗多糖進(jìn) 行分離純化，稱取北沙參二級粗多糖，使用北沙參二級粗多糖95-105倍質(zhì)量的蒸餾水溶解， 過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣于DEAE-cellulose 52纖維素層析柱，分別使用蒸 餾水和0-0.8 Μ的梯度NaCl溶液進(jìn)行洗脫，流速設(shè)定為0.5 mL/min，自動部分收集器收集， 每管收集5.0 mL;苯酚-硫酸法跟蹤檢測北沙參多糖的流出；以吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫液 管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集第二個洗脫主峰，減壓濃縮、分別用自來水、蒸餾水透析 48h和冷凍干燥，得到北沙參精多糖。9. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種北沙參多糖的制備方法，其特征在于，步驟(2)分離和純 化中：3)、凝膠柱層析:使用葡聚糖凝膠Sephadex G-100柱層析對北沙參精多糖進(jìn)行純化， 稱取北沙參精多糖，用95-105倍質(zhì)量蒸餾水溶解，過0.45 μπι的微孔濾膜過濾，上清液上樣 于Sephadex G-100層析柱，以蒸餾水為洗脫液，流速設(shè)定為0.5 mL/min，自動部分收集器收 集洗脫液，每管收集5.0 mL，苯酚-硫酸法跟蹤檢測多糖的流出；以吸光度值為縱坐標(biāo)，洗脫 液管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線，收集第一個洗脫峰，得到組分單一的北沙參多糖。10. 如權(quán)利要求1所述的一種北沙參多糖的應(yīng)用，其特征在于，北沙參多糖在制備抗腫 瘤藥物或抗氧化活性藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P39/06GK105859903SQ201610280824
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年4月29日
【發(fā)明人】景永帥, 張丹參, 吳蘭芳, 戎欣玉
【申請人】河北科技大學(xué)