專利名稱：新的具有取代活化序列的經(jīng)修飾的corin分子及其用途的制作方法
本申請是2004年6月9日提交的，發(fā)明名稱為“新的具有取代活化序列的經(jīng)修飾的corin分子及其用途”的中國專利申請200480023009.9的分案申請。
本申請是一項非臨時性申請，基于35 U.S.C§119要求享有申請日為2003年6月11日的臨時申請No.60/477,683的優(yōu)先權(quán) 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明涉及新的經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其含有取代活化序列。

背景技術(shù)：
絲氨酸蛋白酶對于包括食物消化、激素加工、凝血、補體激活、傷口愈合和胚胎發(fā)育在內(nèi)的多種生物學(xué)過程而言必不可少(Davie，E.W.等人(1991)Biochemistry 3010463-10370；Kraut，J.(1977)Annu.Rev.Biochem.46331-358；Neurath，H.(1986)J.Cell Biochem.3235-49；和Stroud，R.M.(1974)Sci.Am.231-74-88)。多數(shù)胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶是分泌蛋白質(zhì)，但是現(xiàn)在已經(jīng)描述了有一些在胞外C-末端含有胰蛋白酶樣蛋白酶結(jié)構(gòu)域的II型跨膜蛋白(Hooper，J.D.等人(2001)J.Biol.Chem.276857-860)。
Corin是胰蛋白酶超家族的II型跨膜絲氨酸蛋白酶類成員，由多個結(jié)構(gòu)上不同的結(jié)構(gòu)域組成(Yan，W.等人(1999)J.Biol.Chem.27414926-14935)。成熟的corin是一種1042個氨基酸的多肽，其由在N末端的胞質(zhì)尾區(qū)、其后的跨膜區(qū)(TM，第46位至66位氨基酸)、由兩個卷曲樣半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(CRD，第134位至259位氨基酸和第450位至573位氨基酸)組成的主干區(qū)、8個低密度脂蛋白受體重復(fù)序列(LDLR，第268位至415位氨基酸和第579位至690位氨基酸)、巨噬細(xì)胞清道夫受體樣結(jié)構(gòu)域(Scavenger Receptor-like domain，SRCR，第713位至800位氨基酸)、和在其C末端的絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域(CAT，氨基酸802至1042)(Yan，W.等人(1999)同上)組成。Corin的整體拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與其它例如hepsin(Leytus，S.P.等人(1988)Biochemistry 271067-1074)和腸激酶(Kitamoto，Y.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA917588-7592)這樣的II型跨膜絲氨酸蛋白酶相似；然而corin中的結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)的組合看上去是獨特的。
Corin含有兩個LDLR基序和一個SRCR基序，其中一個LDLR基序有5個重復(fù)序列，另一個有3個重復(fù)序列。在其它II型跨膜絲氨酸蛋白酶例如腸激酶、matriptase和TMPRSS2-4中也發(fā)現(xiàn)了這種LDLR和SRCR基序(Hooper，J.D.等人(2001)同上)。作為目前唯一的含有卷曲樣半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域的胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，corin有兩個這種CRD重復(fù)序列，每一個約有120個氨基酸長且其中含有10個保守半胱氨酸殘基。Corin中的CRD、LDLR和SRCR基序的功能仍然有待研究。
Corin的蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域與其他胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶類似。Corin和激肽釋放酶原(Chung，D.W.等人(1986)Biochemistry 252410-2417)、凝血因子XI(Fujikawa，K.等人(1986)Biochemistry252417-2424)和hepsin(Leytus，S.P.等人(1988)同上)之間的氨基酸序列同一性是38-40％。胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶的本質(zhì)特征是保守的，包括，催化三元組殘基His843、Asp892和Ser985和形成底物特異性口袋，的殘基Asp979、Gly1007和Gly1008(Yan，W.等人(1999)同上)。預(yù)測Corin的底物特異性偏好堿性殘基處于P1位置處。Arg801-Ile802-Leu803-Gly804-Gly805或RILGG的序列代表保守的活化切割位點，這表明Arg801和Ile802之間的肽鍵的蛋白水解切割對于產(chǎn)生催化活性的corin酶是必需的。殘基Cys790和Cys912的存在表明corin的催化結(jié)構(gòu)域在Arg801處的活化切割之后仍然通過二硫鍵連結(jié)到細(xì)胞表面。在體內(nèi)生理狀態(tài)下造成corin活化的酶未知。
天然corin顯示為SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡分析中～130kDa的主要條帶(Hooper，J.D.等人(2001)同上)，與經(jīng)計算的在胞外結(jié)構(gòu)域中含有19個潛在的N-連結(jié)的糖基化位點的重組人corin的分子量大小116kDa一致(Yan，W.等人(1999)同上)。
心鈉肽(ANP)和腦鈉肽(BNP)分別是主要由心房和心室中的心肌細(xì)胞產(chǎn)生的循環(huán)肽類激素(Levin，E.R.等人(1998)N.Engl.J.Med.339321-328；Wilkins，M.R.等人(1997)Lancet 3491307-1310)。在靶器官例如腎和周圍血管中，這些肽類激素結(jié)合至它們的受體并刺激這些受體固有的鳥苷酸環(huán)化酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生。ANP和BNP的生物學(xué)作用是促進鹽的排泄，減少血容量以及減少血管阻力，從而降低血壓(de Bold，A.J.等人(1981)Life Sci.2889-94；Inagami，T.(1989)J.Biol.Chem.2643043-3046；Brenner，B.M等人(1990)Physiol.Rev.70665-699；Rosenzweig，A.和Seidman，C.E.(1991)Annu.Rev.Biochem.60229-255；Wilkins，M.R.等人(1997)同上；Stein，B.C.and Levin，R.l.(1998)Am.Heart J.135914-923；Liang，F(xiàn).等人.(1997)J.Biol.Chem.27228050-28056)。BNP在心臟中也具有局部的抗纖維化效果(Tamura，N.等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 974239-4244)。ANP介導(dǎo)的途徑在維持正常血壓中的生物學(xué)重要性已經(jīng)在許多研究中得以證實。例如在敲除小鼠中，ANP或其受體的缺陷導(dǎo)致特發(fā)性高血壓(John，S.W.等人(1995)Science267679-681；John，S.W.等人.(1996)Am.J.Physiol.271R109-R114；Lopez，M.J.等人.(1995)Nature 37865-68)。
ANP和BNP在心肌細(xì)胞中被合成為前肽前體(pre-pro-peptide)，蛋白水解切割對于將前體轉(zhuǎn)化為生物活性肽類激素是必需的(Shields，P.P.and Glembotski，C.C.(1988)J.Biol.Chem.2638091-8098；Ito，T.等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA858365-8369)。響應(yīng)容量超負(fù)荷或過度生長信號，心臟提高這些激素的釋放量，它們依次降低血容量并降低血壓。ANP和BNP釋放量的增加是ANP前體(pro-ANP)和BNP前體(pro-BNP)的合成增加的結(jié)果(McBride，K.and Nemer，M.(2001)Can.J.Physiol.Pharmacol.79673-681)。
在心肌細(xì)胞中，ANP被合成為126個氨基酸的前肽前體(Schwartz，D.等人(1985)Science 229397-400；Thibault，G.等人(1987)Biochem.J.241265-272)。在除去信號肽后，ANP前體存儲在細(xì)胞的致密顆粒中。在從致密顆粒分泌后，ANP前體就通過在Arg98處的蛋白水解切割在心肌細(xì)胞的表面上獲得活化，產(chǎn)生一種N-末端前肽和一種生物活性的成熟的26個氨基酸的C-末端肽(Shields，P.P.andGlembotski，C.C.(1988)同上；Ito，T.等人(1988)同上)。BNP也被合成為前肽前體，并且切割對于產(chǎn)生成熟的活性肽是必需的。BNP前體中的活化切割序列與ANP前體相似，其蛋白水解切割位于Arg76。一些研究表明與心肌細(xì)胞膜相關(guān)的高分子量胰蛋白酶樣酶是ANP前體的活化切割的原因(Seidah，N.G.等人.(1986)Biosci.Rep.6835-844；Imada，T.等人.(1988)J.Biol.Chem.2639515-9519；Sei，C.A.等人(1992)Mol.Endocrinol.6309-319)。
Corin cDNA是首先通過在基因數(shù)據(jù)庫中對與胰蛋白酶樣蛋白酶有同源性的表達序列標(biāo)簽(EST)進行檢索識別出的，接著從人心臟文庫中將其克隆出來(Yan，W.等人(1999)同上)。Northern印跡和原位雜交分析顯示corin mRNA在產(chǎn)生ANP和BNP肽的組織中高度表達，突出地是在心臟的心房和心室中(Yan，W.等人(1999)同上)。在功能研究中(Yan，W.等人.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 978525-8529；Wu，F(xiàn).等人(2002)J.Biol.Chem.27716900-16905)，重組corin以高序列特異方式將ANP前體轉(zhuǎn)化成生物活性ANP，這表明corin是ANP前體的轉(zhuǎn)化酶。此外，重組corin將BNP前體加工成BNP(Yan，W.等人(2000)同上)。
充血性心力衰竭(CHF)是一種危及生命的疾病，使大約480萬名美國人遭受痛苦。每一年，在美國約有550,000個新病例被診斷。代償失調(diào)癥狀是CHF患者因左心室心臟收縮功能失調(diào)而住院治療的最常見的原因。最常見的癥狀包括主要由肺靜脈充血以及心輸出量的減少造成的呼吸困難和疲勞。通常用利尿劑、收縮劑、血管擴張劑和β阻滯劑治療代償失調(diào)性CHF患者(Braunwald，E.等人(1997)inHeart DiseaseA Textbo ok of CardiovascularMedicine，Braunwald，E.，ed.，W.B.Saunders，Philadelphia，pp.445-470)。治療的目的在于提高鈉和液體的排泄、降低心臟充盈壓，、減小外周血管阻力、并提高心輸出量。用于治療CHF的各種藥通常減輕癥狀，但是每一種治療都有固有限制。例如，收縮劑提高心肌收縮性和受損心臟的氧消耗，但也增加心律失常的發(fā)病率并且可能增加死亡率。重復(fù)和延長使用硝化甘油(最初由Alfred Nobel在130多年前生產(chǎn)以制備炸藥的血管擴張劑)引起硝酸鹽耐受性導(dǎo)致隨時間推移臨床效力喪失，使得患者容易受到新的局部缺血性發(fā)作的攻擊。
盡管對CHF的病理生理學(xué)的理解不斷深入，然而對重癥的有效治療是有限的，而且發(fā)病率和死亡率仍然很高。目前對于CHF的長期治療的方法目標(biāo)在于腎素-血管緊張素系統(tǒng)(血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑、血管緊張素受體阻滯劑)、交感神經(jīng)系統(tǒng)(β-阻滯劑)、內(nèi)皮縮血管肽-1(ET-1)(ET-1受體拮抗劑)和利尿鈉肽系統(tǒng)(ANP、BNP、和中性肽鏈內(nèi)切酶(NEP)抑制劑)(McMurray，J.and Pfeffer，M.A.(2000a)Circulation 1052099-2106；McMurray，J.and Pfeffer，M.A.(2000b)Circulation 1052223-2228；Corti，R.等人(2001)Circulation 1041856-1862)。臨床上，在CHF患者中發(fā)現(xiàn)高血漿濃度的ANP和BNP。這些利尿鈉肽的水平常與心室功能障礙的程度和心律失常的進程相關(guān)(Burnett，J.C.，Jr.等人(1986)Science 2311145-1147；Gottleib，S.S.等人(1989)J.Am.Coll.Cardiol.131534-1539)。BNP通常被用作CHF的診斷和預(yù)后癥狀標(biāo)記(Gottleib，S.S.等人(1989)同上；Maisel，A.S.等人.(2002)N.Engl.J.Med.347161-167)。一種人BNP的重組形式，Natrecor，在美國已獲得批準(zhǔn)用于代償失調(diào)性CHF的短期住院治療。BNP的輸注已經(jīng)顯示出比硝化甘油更為有效，這體現(xiàn)在CHF患者中血流動力學(xué)和心臟和腎功能獲得改善(Colucci，W.S.等人(2001)同上)。在日本已經(jīng)使用ANP來治療CHF和腎衰竭患者(Hayashi，M.等人(2001)同上；Mizuno，O.等人(2001)J.Am.Cardiol.88863-866；Allgren，R.L.等人(1997)N.Engl.J.Med.336828-834)。ANP和BNP的結(jié)果表明基于利尿鈉肽的治療在解除患有嚴(yán)重的CHF患者的癥狀以及改善其血流動力學(xué)和心臟功能方面是有效的。
Corin的發(fā)現(xiàn)提供了一種將重組corin用作提高體內(nèi)ANP和BNP產(chǎn)量的生物劑的機會。基于Corin的治療可以比單獨用ANP或BNP治療代償失調(diào)性CHF更為有效。此外，corin可以提供優(yōu)于必須要通過連續(xù)的靜脈注入來給藥的ANP或BNP的藥物代謝動力學(xué)好處。本申請就是作為代償失調(diào)性CHF的生物學(xué)療法的corin的一種新的可溶性形式。
發(fā)明概述 本發(fā)明提供了新的經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包含與野生型人corin活化序列不同的取代活化序列，并且提供了編碼、表達和使用穩(wěn)定的經(jīng)修飾的corin分子的方法。
在一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的corin分子是經(jīng)修飾的corin酶原或其片段或其衍生物，包含與野生型人corin活化序列不同的取代活化序列。
在另一個實施方案中，所述經(jīng)修飾的corin分子是活化的被修飾的corin或其片段或其衍生物，其中與野生型人corin活化序列不同的取代活化序列被切割從而給予corin活性。
本發(fā)明提供融合分子，其包含與非corin分子融合的經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物。在一個實施方案中，所述非corin分子是一種表位標(biāo)記或一種報告分子。本發(fā)明進而提供了編碼、表達和使用經(jīng)修飾的corin融合分子的方法。
本發(fā)明提供了嵌合分子，其包含與從不同的第二來源分離的corin分子的一部分融合的從第一來源分離的corin分子的一部分。本發(fā)明進而提供了編碼、表達和使用嵌合corin分子的方法。
本發(fā)明提供了一種宿主載體系統(tǒng)，其包含一種導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中的編碼經(jīng)修飾的corin分子的核苷酸序列，或其片段或衍生物。本發(fā)明進而提供了制備和使用所述宿主載體系統(tǒng)的方法。
本發(fā)明提供了一種藥物組合物，其包含一種藥物學(xué)可接受的載體和一種本發(fā)明的組合物。在一個實施方案中，所述藥物組合物包含一種與本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子混合的藥物學(xué)可接受的載體。
本發(fā)明提供鑒定本發(fā)明的組合物的體外和體內(nèi)檢測。
包含組合物的試劑盒也同樣包含在本發(fā)明中。在一個實施方案中，在篩選檢測中使用含有一種或多種本發(fā)明的組合物的試劑盒以鑒別corin配體或抑制劑。在另一個實施方案中，在篩選檢測中使用含有一種或多種本發(fā)明的組合物的試劑盒以鑒別活化的corin分子。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的組合物的方法。所述組合物可以被用于治療與corin的過度表達、不足表達和/或異常表達相關(guān)的疾病。在一個實施方案中，所述組合物可以被用于治療與升高的血壓相關(guān)的心血管疾病。
附圖的簡要說明

圖1.人corin編碼區(qū)域的核酸序列(SEQ ID NO1)。所述編碼序列長度為3129個核苷酸，起始于第1-3位的蛋氨酸起始密碼子ATG，終止于第3127-3129位的翻譯終止密碼子TAA。
圖2.人corin多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。人corin的全長為1042個氨基酸，包括一個N-末端胞質(zhì)尾區(qū)、接著是一個跨膜結(jié)構(gòu)域(第46至66位氨基酸)、兩個卷曲樣半胱氨酸富集結(jié)構(gòu)域(第134至259位氨基酸和第450至第573位氨基酸)、8個低密度脂蛋白受體重復(fù)序列(第268至415位氨基酸和第579至690位氨基酸)、一個巨噬細(xì)胞清道夫受體樣結(jié)構(gòu)域(第713至800位氨基酸)，以及一個C末端的絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域(第802至1042位氨基酸)。全長corin多肽的結(jié)構(gòu)圖解描述于圖3中。
圖3.跨膜人corin缺失突變體的結(jié)構(gòu)圖解。人corin內(nèi)部缺失突變體的構(gòu)建描述于實施例1中。缺失1缺少第124至267位氨基酸，缺失2缺少第124至448位氨基酸，缺失3缺少第124至576位氨基酸，缺失4缺少第124至712位氨基酸，缺失5缺少第124至788位氨基酸，缺失6缺少第269至414位氨基酸，和缺失7缺少第450至568位氨基酸。
圖4.在表達人corin的鼠HL-5細(xì)胞中重組ANP前體的加工。如實施例3所述，用指定的對照、ANP前體、或全長人corin表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染鼠HL-5細(xì)胞。通過采用抗-V5抗體的蛋白質(zhì)印跡在條件培養(yǎng)基中檢測ANP前體、ANP和corin。
圖5.從表達人corin的鼠HL-5細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基刺激細(xì)胞內(nèi)cGMP產(chǎn)生。如實施例3所述，用全長人corin表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞和鼠HL-5細(xì)胞，并測量條件培養(yǎng)基中cGMP-刺激活性。HL-5細(xì)胞中的cGMP-刺激活性由于重組人corin的表達而顯著提高。
圖6.由含有跨膜的經(jīng)修飾的人corin缺失突變體對ANP前體的加工。全長人corin表達載體和一系列人corin內(nèi)部缺失突變體表達載體，與一種ANP前體表達載體一起轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞中。通過采用抗-V5抗體的蛋白質(zhì)印跡在條件培養(yǎng)基中檢測ANP前體，ANP和corin。
圖7.可溶性人corin多肽的結(jié)構(gòu)圖解(A)全長野生型人corin(B)SolCorin-EK，其缺少跨膜結(jié)構(gòu)域；和(C)SolCorinPD-EK，其僅含有絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。如實施例1所述，導(dǎo)入腸激酶活化切割序列DDDDK取代SolCorin-EK和SolCorinPD-EK的天然corin活化切割序列。
圖8.由腸激酶對可溶性經(jīng)修飾的人corin的活化。如圖所示，將SolCorin-EK或SolCorinPD-EK表達載體轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞中。用指示量的重組腸激酶處理條件培養(yǎng)基，通過采用抗-V5抗體的蛋白質(zhì)印跡檢測可溶性corin的活化。
圖9.通過腸激酶活化的可溶性經(jīng)修飾的人corin對ANP前體的切割。如圖所示，將SolCorin-EK或SolCorinPD-EK表達載體轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞中。用指示量的重組腸激酶處理條件培養(yǎng)基，并且將腸激酶耗盡的條件培養(yǎng)基暴露于從經(jīng)ANP前體表達載體轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基。通過采用抗-V5抗體的蛋白質(zhì)印跡法檢測corin、腸激酶活化的corin、ANP前體和ANP。
圖10.可溶性經(jīng)修飾的人corin多肽SolCorin-EK的核酸序列。SolCorin-EK的核酸序列(SEQ ID NO33)由N-末端ATG起始密碼子和Igκ分泌信號序列(第1至108位)、Leu-Glu(第109至114位)、人corin第124至796位氨基酸(第115至2133位)、腸激酶活化切割序列(第2134至2148位)、人corin第802至1042位氨基酸(第2149至2871位)、C-末端病毒V5和6xHis表位標(biāo)記(第2871至2973位)、和一個TGA終止密碼子(第2974至2976位)組成。
圖11.可溶性經(jīng)修飾的人corin多肽SolCorin-EK的氨基酸序列。SolCorin-EK的氨基酸序列(SEQ ID NO34)由N-末端ATG起始密碼子和Igκ分泌信號序列(第1至36位氨基酸)、Leu-Glu(第37至38位氨基酸)、人corin第124至796位氨基酸(第39至711位氨基酸)、腸激酶活化切割序列(下劃線，第712至716位氨基酸)、人corin第802至1042位氨基酸(第717至957位氨基酸)、C-末端病毒V5和6xHis表位標(biāo)記(第958至991位氨基酸)、和一個TGA終止密碼子組成。
圖12.可溶性經(jīng)修飾的人corin刺激患心肌病倉鼠的利尿和鈉尿。如實施例6所述，在人293細(xì)胞中表達SolCorin-EK，、將其純化、通過暴露于重組腸激酶使其活化、并檢測其在BIO 14.6CM倉鼠中增加尿量和尿鈉的能力。如圖所示，在靜脈給予SolCorin-EK(Corin)或載體之前(基線)和之后(峰值響應(yīng))測定尿量和尿鈉。
發(fā)明詳述 A.定義 除非另有說明，本申請中的所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語具有本領(lǐng)域普遍所使用的含義。本申請所使用的下列詞或短語具有所指定的含義。
本申請使用的“corin”指的是具有細(xì)胞質(zhì)、跨膜和帶有活化位點的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域(這里也稱為ectodomain)的跨膜多肽分子，或其片段或其衍生物。術(shù)語“corin”包括野生型corin，包括corin酶原、活化的corin分子和其片段或衍生物；和經(jīng)修飾的corin分子，包括經(jīng)修飾的corin酶原、經(jīng)修飾的活化的corin分子和其片段或衍生物。
本申請使用的“野生型”指的是分別與天然存在的分子具有相同的核苷酸和/或氨基酸序列的核酸或多肽分子。野生型corin多肽分子具有圖1和Yan，W.等人(1999)同上所示的天然存在的corin的氨基酸序列，或其任何片段或一部分。野生型corin被合成為一種酶原，即酶的前體，它的活化基于其位于胞外結(jié)構(gòu)域的活化位點的切割。
本申請使用的術(shù)語“活性”指的是具有功能或作用的分子。活性包括酶活性，其中所述分子是酶，例如識別、結(jié)合、切割和/或修飾底物的蛋白酶。
本申請使用的術(shù)語“酶原”指的是具有活化序列的前體多肽分子，其基于同源蛋白酶的切割產(chǎn)生出活化的分子。酶原的一個實例是經(jīng)修飾的corin酶原，其包括腸激酶取代活化序列，其通過由腸激酶進行的切割被活化。
本申請使用的術(shù)語“活化序列(activation sequence)”指的是由同源蛋白酶切割并且在切割后產(chǎn)生生物活性例如蛋白酶活性的分子。在活化的分子中，活化序列被切割。Corin分子中的活化的序列的一個實例是R-ILGG。
本申請使用的術(shù)語“取代活化序列”指的是取代野生型分子中的活化序列的氨基酸序列。取代活化序列的一個實例是DDDDK-ILGG，其被用于取代corin中天然存在的活化序列R-ILGG。
本申請使用的術(shù)語“經(jīng)修飾的”指的是氨基酸或核苷酸序列不同于天然存在的即野生型的氨基酸或核苷酸序列的分子。例如，經(jīng)修飾的corin分子可以包括取代活化序列。經(jīng)修飾的分子可以保持野生型分子的功能或活性。
本申請使用的術(shù)語“衍生”意味著一種野生型分子的任何修飾或改變。衍生包括但不限于氨基酸和/或核苷酸序列分子中的保守的或非保守的取代，其包括由其它氨基酸、核苷酸、氨基酸類似物或核苷酸類似物進行的取代；一個或多個氨基酸和/或核苷酸的缺失；一個或多個氨基酸和/或核苷酸的插入；以及翻譯前修飾和/或翻譯后修飾。衍生的分子可與其母體分子具有序列相似性和/或活性。
本申請使用的術(shù)語“蛋白酶”指的是一類識別分子并切割該分子中的活化序列的酶。所述蛋白酶可以是切割內(nèi)部肽鍵的內(nèi)肽酶?；蛘撸龅鞍酌缚梢允亲噪幕虻鞍追肿拥腘-末端或C-末端開始水解肽鍵的外肽酶。所述蛋白酶折疊成一種構(gòu)象以形成催化位點，所述位點接受并切割活化序列。
本申請使用的術(shù)語“催化位點”指的是折疊蛋白酶中接受和切割活化序列的區(qū)域。
本申請使用的術(shù)語“配體”指的是與corin相互作用的任何分子。配體可以是識別和結(jié)合corin的分子?；蛘?，配體可以是由corin識別和結(jié)合的分子。例如，corin結(jié)合并切割的底物可以是一種配體。在另一個實例中，結(jié)合且切割corin的分子可以是一種配體。抗-corin抗體也可以是一種配體。
本申請使用的術(shù)語“絲氨酸蛋白酶”指的是一類蛋白酶，其特征在于存在形成該酶催化位點一部分的獨特的絲氨酸殘基。一般而言，每一個絲氨酸蛋白酶成員具有不同的底物特異性。
在本申請中，當(dāng)?shù)谝缓塑账峄虬被嵝蛄泻偷诙塑账峄虬被嵝蛄械谋容^顯示出它們完全相同時，第一核苷酸或氨基酸序列分別被稱為與第二核苷酸或氨基酸序列具有序列“同一性”。
在本申請中，當(dāng)?shù)谝缓塑账峄虬被嵝蛄泻偷诙塑账峄虬被嵝蛄械谋容^顯示出它們具有很少的序列差異時(即，第一和第二序列幾乎完全相同)，第一核苷酸或氨基酸序列被稱為與第二序列“相似”。例如，當(dāng)兩條序列間不同的核苷酸或氨基酸的百分比在大約60％至99.99％之間時兩個序列被認(rèn)為相互近似。
本申請使用的術(shù)語“互補”指的是具有嘌呤和嘧啶核苷酸堿基的核酸分子，其具有通過氫鍵鍵合而締合以形成堿基對從而調(diào)節(jié)雙鏈核酸分子形成的能力?；パa中涉及下面的堿基對鳥嘌呤和胞嘧啶；腺嘌呤和胸腺嘧啶；以及腺嘌呤和尿嘧啶。互補適用于包括兩條單鏈核酸分子在內(nèi)的所有堿基對或包括一條自身折疊的單鏈核酸分子的所有堿基對。
本申請使用的術(shù)語“保守的”指的是用一個氨基酸殘基取代另一個具有相似化學(xué)性質(zhì)的不同的氨基酸殘基。保守的氨基酸取代包括用任何疏水性(例如，非極性的)氨基酸取代其它任何疏水性氨基酸；或者用任何親水性氨基酸(極性的，不帶電荷)取代其它任何親水性氨基酸；或者用任何帶正電荷的氨基酸取代其它任何帶正電荷的氨基酸；或者用任何帶負(fù)電荷的氨基酸取代其它任何帶負(fù)電荷的氨基酸(Creighton，T.E.(1993)Proteins，W.H.Freeman and Company，NewYork)。這些氨基酸取代包括但不限于用異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、和亮氨酸(L)的任何一種取代這些疏水氨基酸的任何其它一種；用天冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)且反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)且反之亦然；以及用絲氨酸(S)取代蘇氨酸(T)且反之亦然。其它取代也可被認(rèn)為是保守的，這取決于特定氨基酸的環(huán)境及其在蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)，或甘氨酸(G)和絲氨酸(S)可以如同丙氨酸(A)和纈氨酸(V)般頻繁地互換。相對疏水的蛋氨酸(M)可以頻繁地與亮氨酸和異亮氨酸互換，有時與纈氨酸(V)互換。在氨基酸殘基的顯著特征為其電荷的位置，賴氨酸(K)和精氨酸(R)可頻繁地互換，這兩種氨基酸殘基的pK值的差異不顯著。在特定的環(huán)境中其它的改變?nèi)钥杀徽J(rèn)為是保守的。
本申請使用的術(shù)語“非保守的”指的是用一個氨基酸殘基取代另一個具有不同化學(xué)性質(zhì)的氨基酸殘基。這種非保守性取代包括但不限于以甘氨酸(G)取代天冬氨酸(D)；以賴氨酸(K)取代天冬酰胺(N)；或以精氨酸(R)取代丙氨酸(A)。
本申請使用的術(shù)語“可溶性的”是指不結(jié)合或附著于細(xì)胞上的任何分子或其片段或衍生物?？扇苄缘姆肿涌梢允茄h(huán)的。一種可溶性的分子通常缺少跨膜結(jié)構(gòu)域?？扇苄缘姆肿油ǔ０ㄒ粋€胞外結(jié)構(gòu)域。
氨基酸殘基的單個或三個字母的代碼包括下列A＝Ala＝丙氨酸，R＝Arg＝精氨酸，N＝Asn＝天冬酰胺，D＝Asp＝天冬氨酸，C＝Cys＝半胱氨酸，Q＝Gln＝谷氨酰胺，E＝Glu＝谷氨酸，G＝Gly＝甘氨酸，H＝His＝組氨酸，I＝Ile＝異亮氨酸，L＝Leu＝亮氨酸，K＝Lys＝賴氨酸，M＝Met＝蛋氨酸，F(xiàn)＝Phe＝苯丙氨酸，P＝Pro＝脯氨酸，S＝Ser＝絲氨酸，T＝Thr＝蘇氨酸，W＝Trp＝色氨酸，Y＝Tyr＝酪氨酸，和V＝Val＝纈氨酸。
本申請使用的術(shù)語“哺乳動物”包括人和馴養(yǎng)動物，如貓、狗、豬、牛、綿羊、山羊、馬、家兔等等。
本申請使用的術(shù)語“治療有效量”指的是對所需患者給藥時，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的量足以影響對如下所定義的例如充血性心力衰竭或急性心肌梗塞的治療。構(gòu)成“治療有效量”的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的量根據(jù)所述蛋白質(zhì)、病癥和病癥的嚴(yán)重性以及待治療患者的年齡的不同而改變，但可以由本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員根據(jù)其自身掌握的知識以及本說明書所公開的內(nèi)容常規(guī)地確定。
本申請使用的術(shù)語“處理”或“治療”包括哺乳動物優(yōu)選人的病狀的治療，其中所述病狀的特征在于血壓上升，并且包括 (i)防止病癥在人中出現(xiàn)，尤其是當(dāng)該人易患該病癥但還沒有被診斷出患有該疾病時； (ii)抑止所述病癥，即阻止其發(fā)展；或 (iii)減緩所述病癥，即使所述病癥消退。
B.本發(fā)明的經(jīng)修飾的Corin多肽分子 本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子包括經(jīng)修飾的corin酶原和活化的經(jīng)修飾的corin分子，或其片段或衍生物。這些經(jīng)修飾的corin分子由于包含取代的活化序列所以是有用的，所述活化序列在切割后活化該經(jīng)修飾的corin分子。本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子是穩(wěn)定的。
本發(fā)明在各個方面提供了經(jīng)修飾的corin分子，包括經(jīng)修飾的corin酶原、活化的經(jīng)修飾的corin、或其片段或衍生物；編碼該經(jīng)修飾的corin分子的核酸分子、或其片段或衍生物；重組DNA分子；經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞；宿主-載體系統(tǒng)；使用本發(fā)明的組合物的方法；生產(chǎn)本發(fā)明的組合物的方法；測試；經(jīng)修飾的corin的抑制劑；和基于核酸的測試。
經(jīng)修飾的Corin分子 corin分子的活化可以通過切割天然存在的活化序列Arg801-Ile802-Leu803-Gly804-Gly805或R-ILGG中Arg801與Ile802間的肽鍵以產(chǎn)生催化活性的酶即活性的corin來進行. 包括經(jīng)修飾的corin酶原、活化的經(jīng)修飾的corin、或其片段或衍生物在內(nèi)的本發(fā)明的所述經(jīng)修飾的corin分子，其含有取代活化序列。
在經(jīng)修飾的corin分子中，所述取代活化序列提供一種已知的活化序列，其能夠允許所述經(jīng)修飾的corin分子被蛋白酶，例如同源蛋白酶切割，產(chǎn)生經(jīng)修飾的活化corin分子。在一個實施方案中，該經(jīng)修飾的corin分子含有由腸激酶特異識別的取代活化序列，其包含氨基酸序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys或DDDDK，取代氨基酸Arg801。用腸激酶例如重組腸激酶與酶原形式的經(jīng)修飾的corin分子接觸，切割所述取代活化序列并產(chǎn)生出活化形式的經(jīng)修飾的corin分子。
取代活化序列的實例描述于下文。對所述取代活化序列的序列和長度進行選擇以使得經(jīng)修飾的corin酶原被所希望的同源蛋白酶切割，從而產(chǎn)生活化的經(jīng)修飾的corin。
本發(fā)明的活化的經(jīng)修飾的corin分子呈現(xiàn)出天然存在的野生型活化的corin的功能活性。天然存在的野生型活化corin的功能活性是識別并切割蛋白質(zhì)底物例如ANP前體或BNP前體上的序列Arg-Ser以產(chǎn)生生物活性的ANP或BNP(Yan，W.等人(2000)同上)。以類似的方式，所述活化的經(jīng)修飾的corin可以具有蛋白酶功能并能夠識別和切割與野生型活化的corin相同的底物。
根據(jù)本發(fā)明的實踐，本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子可以具有折疊結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與天然存在的野生型corin分子相同或相似。例如，活化的經(jīng)修飾的corin可以折疊成允許催化位點接受并切割野生型活化的corin所識別的底物的構(gòu)象。
全長的天然存在的人corin分子(圖1)(Yan，W.等人(1999)同上，和公開的PCT專利申請WO 99/64608)包括下列1)細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括第1至45位氨基酸殘基；2)跨膜結(jié)構(gòu)域，包括第46至66位氨基酸殘基；和3)胞外結(jié)構(gòu)域，包括第67-1042位氨基酸殘基，并且包括兩個卷曲樣半胱氨酸-富集結(jié)構(gòu)域、8個低密度脂蛋白受體重復(fù)序列、一個巨噬細(xì)胞清道夫受體樣結(jié)構(gòu)域、一個活化序列和一個絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。
本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子，包括天然存在的corin分子的片段或其衍生物。所述經(jīng)修飾的corin分子的片段或衍生物可以包括以任何組合或順序聯(lián)合和/或連接的上述結(jié)構(gòu)域的任何部分。
在一個實施方案中，經(jīng)修飾的corin分子包括天然存在的人corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域包括圖1所示序列的第67-1042位殘基或其部分。在另一個實施方案中，經(jīng)修飾的corin分子包括天然存在的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域或其部分，其被修飾成包括腸激酶或其它蛋白酶識別序列，例如腸激酶識別序列。由于它們?nèi)鄙倏缒そY(jié)構(gòu)域，因此這些實施方案通常是可溶性分子。
本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子，或其片段或衍生物，它們衍生自或分離自任何來源，無論是天然的、合成的、半合成的或是重組的。
來源包括原核或真核。真核來源包括動物、植物、真菌或原生動物。動物來源包括哺乳動物例如牛、豬、鼠(PCT專利申請WO99/64608)、馬、犬、貓、猿、人(Yan、W.等人(1999)同上)、綿羊、魚、鳥或昆蟲。
本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子，或其片段或衍生物可以作為在原核或真核宿主細(xì)胞中產(chǎn)生的重組分子被表達，或作為合成的分子被產(chǎn)生。在一個實施方案中，重組的經(jīng)修飾的corin分子可以分離自細(xì)菌宿主細(xì)胞，其產(chǎn)生包含經(jīng)修飾的corin分子的內(nèi)含體(inclusion body)。也可以用其它可供選擇的方法分離corin分子。在另一個實施方案中，可以從桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中分離出經(jīng)修飾的corin分子。
經(jīng)修飾的corin分子的純化 可以通過現(xiàn)有技術(shù)公知的技術(shù)純化本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子，或其片段或衍生物。這些純化方法包括使用與所述經(jīng)修飾的corin分子選擇性結(jié)合的抗體的親合層析法；使用與連接到所述經(jīng)修飾的corin分子的表位標(biāo)記例如6xHis標(biāo)記、V5標(biāo)記或其它公知的標(biāo)記選擇性結(jié)合的抗體的親合層析法(Marchak，D.R.等人(1996)inStrategies for Protein Purification and Characterization，Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.)；離子交換色譜法；以及凝膠過濾色譜法。分離和純化的性質(zhì)和程度依賴于預(yù)先計劃的用途。例如，純化的經(jīng)修飾的corin分子將會基本上不含有削弱配體或抗體與所述經(jīng)修飾的corin分子結(jié)合的其它蛋白質(zhì)或分子。
融合分子 本申請?zhí)峁┤诤戏肿踊蚱淦位蜓苌?，其包括一種與非corin分子編碼序列融合的經(jīng)修飾的corin分子。
本發(fā)明的融合分子包括與一種表位標(biāo)記融合的經(jīng)修飾的corin分子，所述表位標(biāo)記例如組氨酸(6xHis)標(biāo)記或V5標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、流感病毒血凝素(HA)標(biāo)記、Myc標(biāo)記、VSV-G標(biāo)記、或硫氧還蛋白(Trx)標(biāo)記。這些與表位標(biāo)記融合的分子可用于所述經(jīng)修飾的corin分子的分離和/或純化(Marchak，D.R.等人(1996)同上)。
本發(fā)明的融合分子包括一種與報告分子融合的經(jīng)修飾的corin分子。所述報告分子可以是全長蛋白質(zhì)或其片段或衍生物。一般使用的報告分子包括谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、和包括藍色熒光蛋白(BFP)在內(nèi)的自發(fā)熒光蛋白。
其它融合分子構(gòu)建可以包括麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、S-標(biāo)記、LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合、GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合、和單純皰疹病毒(HSV)BP16蛋白融合。
融合分子也可以被工程化為包括一個位于經(jīng)修飾的corin分子和非corin分子間的切割位點，以使得所述經(jīng)修飾的corin分子可以被切割并被純化而與所述非corin分子分離。所述切割位點可以包括下列酶的識別序列腸激酶、hepsin、MT-SP/matryptase、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、人類呼吸道胰蛋白酶樣蛋白酶(HAT)、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、彈性蛋白酶、纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、TMPRSS2、MBL-關(guān)聯(lián)的絲氨酸蛋白酶(MASP-1和MASP-2)、Stubble-stubbloid、弗林蛋白酶、凝血酶、或者Xa因子。
嵌合多肽 本發(fā)明提供嵌合分子或其片段或衍生物，包括與從不同的第二來源分離的corin分子的片段融合的從第一來源分離的corin分子的片段。所述第一和第二來源可以是任何來源，包括哺乳動物例如牛、豬、鼠、馬、犬、貓、猴、猿、綿羊或人，或其它來源例如魚、鳥或昆蟲。
一個或多個用于形成嵌合經(jīng)修飾的corin分子的corin片段可被修飾成例如包括腸激酶活化序列。在一個實施方案中，嵌合的經(jīng)修飾的corin分子包括與從第二來源分離的corin分子的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的從第一來源分離的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域，所述胞外結(jié)構(gòu)域包括取代活化序列。在另一個實施方案中，嵌合的經(jīng)修飾的corin分子包括與另一個從第二來源分離的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域的片段融合的從第一來源分離的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域的片段，其中這樣形成的所述嵌合corin分子包括取代活化序列。
氨基酸類似物和改變的多肽 本發(fā)明進而提供經(jīng)修飾的corin分子，或其片段或衍生物，其包含氨基酸類似物。所述氨基酸類似物可以是化學(xué)合成的，并且包括右旋或左旋形式或肽模擬物(peptidomirmetics)。
本發(fā)明還提供例如通過翻譯后途徑或通過化學(xué)合成改變的經(jīng)修飾的corin分子，包括N-或O-糖基化的氨基酸殘基。多肽的N-末端可被改變成包括?；幕蛲榛臍埢?。多肽的C-末端可以改變成包括酯化的或酰胺化的殘基。非末端氨基酸殘基可以被改變，包括但不限于氨基酸精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、組胺酸和半胱氨酸的改變。
序列變體 本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域中的序列變異。本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，任何數(shù)量的氨基酸可以被單獨改變或與其它氨基酸一起被改變且經(jīng)修飾的corin分子仍然會保持它們的功能活性(例如被同源蛋白酶切割和/或切割其底物)。經(jīng)修飾的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域的序列變體包括氨基酸取代、氨基酸插入、氨基酸缺失、突變形式、等位基因形式、同系物和直向同源物。
氨基酸取代 經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物可以包括氨基酸取代。經(jīng)修飾的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域可以有保守性或非保守性氨基酸取代?？梢愿鶕?jù)天然存在的corin分子的性質(zhì)確定經(jīng)修飾的corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域中有哪些和有多少氨基酸殘基可以被取代。這些性質(zhì)包括變性的或折疊構(gòu)象中的氨基酸長度和物理長度。這些性質(zhì)可以從預(yù)測(例如，基于氨基酸序列)和/或試驗(例如，基于X射線晶體分析法)中獲得。選擇被取代的氨基酸以使得變異的經(jīng)修飾的corin分子的性質(zhì)與天然存在的corin分子相同或相似。
突變型 本發(fā)明還提供經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其具有corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域的突變形式。所述突變變體具有與野生型corin分子的胞外結(jié)構(gòu)域氨基酸序列不同的氨基酸序列。所述突變包括氨基酸取代、缺失、插入、添加、截短或蛋白質(zhì)的加工或切割錯誤。所述突變變體可以具有與野生型corin分子相同或相似的功能活性。
等位基因變體 本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的等位基因變體。等位基因變體是由位于相同的染色體基因座的不同基因編碼的分子。
同系物 本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的同系物。同系物是由由相同基因座但是在不同染色體上的核苷酸序列編碼的分子。所述同系物可以具有相同或相似的功能活性。
直向同源物 本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包括天然存在的corin分子的直向同源物。直向同源物是由來自于不同物種的核苷酸序列編碼的corin分子。所述直向同源物可以具有與野生型corin分子相同或相似的功能性活性。
取代活化序列 本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其每一個均包括取代天然存在的活化序列的取代活化序列。所述取代活化序列與corin分子的天然存在的活化序列不同。例如，人的天然存在的活化序列，corin分子包括氨基酸序列R-ILGG(Yan，W.等人(1999)同上；Yan，W.等人(2000)同上)。所述取代活化序列由同源蛋白酶識別和切割。
所述取代活化序列可以是一種由來自于任何物種尤其是哺乳動物來源，包括牛、豬、鼠、馬、犬、貓、猿、綿羊或人，或其它來源例如魚、鳥或昆蟲的蛋白酶識別和切割的氨基酸序列。
取代活化序列可以是由蛋白酶識別和切割的氨基酸序列，所述蛋白酶包括任何絲氨酸蛋白酶、胰蛋白酶家族的任何成員、任何胰蛋白酶樣蛋白酶和任何II型跨膜蛋白酶。
所述活化序列可以是由下列酶識別和切割的氨基酸序列(Barrett，A.J.等人(eds)(1998)Handbook of Proteolytic Enzymes，AcademicPress，London)腸激酶；凝血酶；凝血因子Xa；弗林蛋白酶；胰蛋白酶；胰凝乳蛋白酶；彈性蛋白酶；血纖維蛋白溶酶；激肽釋放酶；針依瓦菊素(aerosin)；人類呼吸道胰蛋白酶樣蛋白酶(HAT)(Yamaoka，K.等人(1998)J.Biol.Chem.27311895-11901)；肥大細(xì)胞類胰蛋白酶；MBL-關(guān)聯(lián)的絲氨酸蛋白酶(MASP-1 and MASP-2)(Matsushita，M.等人.(2000)J.Immunol.1642281-2284)；hepsin(Torres-Rosado，A.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 907181-7185)；MT-SP1/matryptase(Takeuchi，T.等人(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9611054-11061；Lin，C.Y.等人(1999)J.B ol.Chem.27418231-18236)；TMPRSS2(Paoloni-Giacobina，A.等人(1997)Genomics 44309-320)；或Stubble-stubbloid(Appel，L.F.等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 904937-4941)。
在一個實施方案中，所述取代活化序列可以是由一種TMPRSS3蛋白酶或epitheliasin蛋白酶識別并切割的氨基酸序列，例如LKTPR-VVGG序列(SEQ ID NO38)(Paoloni-Giacobino，A.等人(1997)同上；Lin，B.等人(1999)Cancer Res.594180-4184)；或由一種MT-SP1蛋白酶或epithin蛋白酶識別和切割的氨基酸序列，例如TRQAR-VVGG序列(SEQ ID NO39)(Kim，M.等人(1999)Immunogenetics 49420-428)。
在另一個實施方案中，所述取代活化序列可以是由腸激酶蛋白酶識別和切割的氨基酸序列，例如DDDDK-IVGG序列(SEQ ID NO40)(Kitamoto，Y.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 917588-7592；La Vallie，E.R.等人(1993)J.Biol.Chem.26823311-23317)。在另一個實施方案中，所述取代活化序列是由人或牛腸激酶識別和切割的氨基酸序列，其包括氨基酸序列DDDDK-I(SEQ ID NO41)。
變異的取代活化序列 本發(fā)明還提供了經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包括具有上述取代活化序列的序列變異的取代活化序列。所述取代活化序列可以有保守性氨基酸取代，其中取代的氨基酸具有相似的結(jié)構(gòu)或化學(xué)性質(zhì)。變體可以有非保守性改變。變異的取代活化序列被選擇為使得折疊的經(jīng)修飾的corin分子能被同源蛋白酶切割，從而產(chǎn)生活化的經(jīng)修飾的corin分子。
取代活化序列的長度 本發(fā)明提供經(jīng)修飾的corin分子，其包括長度為大約2個至大約10個氨基酸殘基的取代活化序列。在一個實施方案中，所述取代活化序列長度為大約2個至大約6個氨基酸。
可選擇出與折疊的野生型corin分子中的活化序列跨越相同或相似的距離的取代活化序列。在一個實施方案中，所述取代活化序列不會影響經(jīng)修飾的corin分子的功能活性。
可以根據(jù)在折疊的經(jīng)修飾的corin分子中的活化序列跨越的距離確定所述取代活化序列中有哪些和有多少氨基酸殘基可以改變?？梢愿鶕?jù)野生型corin分子的氨基酸序列預(yù)測出和/或根據(jù)野生型corin分子的X-射線晶體結(jié)構(gòu)通過實驗獲得折疊的野生型corin分子中的活化序列所跨越的距離。
例如，野生型人corin的氨基酸序列(Yan，W.等人(1999)同上)可用作預(yù)測折疊的人野生型corin分子中的活化序列所跨越距離的基礎(chǔ)。包含殘基RILGG的野生型人corin分子的活化序列跨越5個氨基酸殘基的線性長度(圖2)。
C.本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin核酸分子 編碼經(jīng)修飾的corin分子的核酸分子 本發(fā)明提供了各種分離和重組的核酸分子或其片段或衍生物，其包括編碼本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子的多核苷酸序列，本文中稱為“經(jīng)修飾的corin多核苷酸序列”、“corin序列”、“corin分子序列”或“本發(fā)明的核酸分子”。本發(fā)明還提供了編碼這些經(jīng)修飾的corin分子的片段或衍生物的多核苷酸序列。本發(fā)明進而提供了相關(guān)的多核苷酸分子，例如互補的經(jīng)修飾的corin多核苷酸序列或其一部分，以及與本發(fā)明的核酸分子雜交的多核苷酸分子。
所述經(jīng)修飾的corin多核苷酸序列優(yōu)選為分離形式，包括但不限于DNA、RNA、DNA/RNA雜交體以及相關(guān)分子及它們的片段。特別包括天然來源的或合成的基因組DNA、cDNA、核酶和反義RNA或DNA分子、以及基于其他主鏈或包括其他堿基的核酸分子。
本發(fā)明的核酸分子編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子和/或其片段或衍生物，其中所編碼的經(jīng)修飾的corin分子呈現(xiàn)出與天然存在的corin分子相同或相似的功能活性。
在一個實施方案中，分離的編碼可溶性經(jīng)修飾的corin分子的核苷酸序列示于圖10，其起始于第115位的密碼子GAT并終止于第2871位的密碼子AAC。圖10第2134至2148位的核酸序列編碼腸激酶活化切割序列DDDDK。此外，圖10的第1至108位的核酸序列編碼用于蛋白質(zhì)分泌的Igκ信號序列，第2871至2973位的核酸序列編碼病毒V5和6xHis表位標(biāo)記序列。
根據(jù)本發(fā)明的實踐，本發(fā)明的核酸分子可以是分離的經(jīng)修飾的corin核酸序列的全長或部分長度的分子或寡聚物。本發(fā)明的corin序列可以編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的全部或部分，包括細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和/或細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括兩個卷曲樣半胱氨酸富集區(qū)、8個低密度脂蛋白受體重復(fù)序列、一個巨噬細(xì)胞清道夫受體樣結(jié)構(gòu)域、一個取代活化序列和一個絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域。
分離的核酸分子 本發(fā)明的核酸分子優(yōu)選是分離的形式，其中所述核酸分子基本上從序列不同于經(jīng)修飾的corin分子序列的雜質(zhì)核酸分子中分離出來。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠容易地應(yīng)用核酸分離程序以獲得分離的經(jīng)修飾的hepsin分子序列，參見例如Sambrook，J.E.等人(1989)inMolecular Cloning，Cold Spring Harbor Press，N.Y.)。本發(fā)明還提供了通過重組DNA技術(shù)或化學(xué)合成方法產(chǎn)生的分離的經(jīng)修飾的corin分子序列。本發(fā)明還提供了分離自各種哺乳動物物種的核苷酸序列，所述哺乳動物物種包括牛、豬、鼠，、馬、犬、貓、猿、綿羊或人，或者其它來源例如魚、鳥或昆蟲。
所述被分離的核酸分子包括DNA、RNA、DNA/RNA雜交體及相關(guān)分子、與編碼經(jīng)修飾的corin分子的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列互補的核酸分子或其片段或衍生物、以及與編碼所述經(jīng)修飾的corin分子的核酸分子雜交的核酸分子。優(yōu)選的核酸分子具有與本申請所公開的核苷酸序列相同或相似的核苷酸序列。特別包括基因組DNA、RNA例如小干擾RNA、cDNA、核酶和反義分子。
相同或相似的核苷酸序列 本發(fā)明提供了多核苷酸序列與本發(fā)明所公開的經(jīng)修飾的corin分子序列相同或相似的分離的核酸分子。因此，所述多核苷酸序列可與特定的經(jīng)修飾的corin分子序列相同，例如圖10所示?；蛘?，所述寡核苷酸序列可以與所公開的序列相似。
本發(fā)明的一個實施方案提供了與經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列顯示出序列同一性或相似性的核酸分子，例如與如圖10所示的本發(fā)明的序列具有至少60％-99.9％的序列相似性和最多100％序列同一性的分子。另一個實施方案提供了呈現(xiàn)出約75％至99.9％之間的序列相似性的核酸分子，另一個實施方案提供了約86％至99.9％之間的序列相似性的分子。而另一個實施方案提供了與圖10所示的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子序列具有100％序列同一性的分子。
互補的核苷酸分子 本發(fā)明還提供了與圖1和10所示序列互補的核酸分子?；パa可以是完全互補或是部分互補。完全互補的核苷酸序列是與圖1和10任一所示的完整的corin序列互補的核苷酸序列。部分互補的核苷酸序列是僅與圖1和10任一所示的序列的一部分互補的核苷酸序列。所述互補分子包括反義核酸序列。反義分子可用于RNA干擾(RNAi)、DNA干擾、抑止表達天然存在或經(jīng)修飾的corin分子的細(xì)胞的生長或使其致死(Yan，W.等人(1999)同上)。所述互補分子也包括小干擾RNA(siRNA)(Elbashir，S.M.等人(2001)Nature 411494-498；Hammond，S.M.等人(2001)Nat.Rev.Genet2110-119)。
雜交核酸分子 本發(fā)明進而提供了具有與圖1和圖10任一所示的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列選擇性雜交的多核苷酸序列的核酸分子。所述雜交的核酸分子可以在高嚴(yán)格雜交條件下雜交。典型地，在標(biāo)準(zhǔn)高嚴(yán)格條件下的雜交將出現(xiàn)在序列互補性差異為約70％至約100％的兩條互補的核酸分子間。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言顯而易見的是，兩條核酸分子間的高嚴(yán)格雜交取決于例如，同一性的程度、雜交的嚴(yán)緊度和雜交鏈的長度。用于構(gòu)建高嚴(yán)格雜交的方法和配方在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，并且可以在例如Sambrook，J.E.等人(1989)同上)中找到。
一般而言，嚴(yán)格雜交條件是(1)使用低離子強渡和高溫洗滌，例如50℃下0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉(sodium titrate)/0.1％SDS；或(2)雜交時使用一種變性劑如甲酰胺，例如42℃下加有0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/pH6.5的50mM磷酸鈉緩沖液以及750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉的50％(vol/vol)甲酰胺。
嚴(yán)格條件另一個實例包括42℃下使用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(pH6.8)、0.1％焦磷酸鈉、5×Denhardt′s溶液、經(jīng)超聲波降解的鮭精DNA(50mg/ml)、0.1％SDS、和10％葡聚糖硫酸酯，并在42℃下的0.2×SSC和0.1％SDS中洗滌。熟練的技術(shù)人員能夠容易地確定和改變適于獲得清楚且可被檢測的雜交信號的嚴(yán)格條件。
核酸片段 本發(fā)明進而提供了具有本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子序列的片段的核酸分子，例如本申請公開的以及圖1和10任一所示經(jīng)修飾的corin分子序列的一部分。片段的大小可根據(jù)其所計劃的用途來確定。例如，如果該片段是選作編碼一種包含天然存在的野生型corin分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的經(jīng)修飾的corin分子，所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域含有取代活化序列，那么本領(lǐng)域技術(shù)人員就會選擇出大到足以編碼所述結(jié)構(gòu)域的多核苷酸片段。如果所述片段被用作核酸探針或PCR引物，那么將片段長度選擇成在探測或擴增過程中獲得相對少的假陽性的長度。
本發(fā)明的核酸分子、其片段和探針及引物對于各種分子生物學(xué)技術(shù)有用，包括例如文庫的雜交篩選，或者作為一種基因轉(zhuǎn)錄和/或表達的分析方法的mRNA轉(zhuǎn)錄物的檢測和定量。所述探針和引物可以是DNA、RNA、或者DNA或RNA分子的衍生物。經(jīng)理論和實踐的考慮所建議的探針或引物長度為至少15個堿基對(Wallace，B.andMiyada，G.(1987)Methods Enzymol.152432-442)。
作為選擇性雜交探針或PCR引物格外有用的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列的片段可采用現(xiàn)有技術(shù)已知方法從經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列中容易地鑒別出來。例如，結(jié)合和/或檢測經(jīng)修飾的corin分子轉(zhuǎn)錄物的一部分的PCR引物系列可以通過美國專利No.4,965,188中描述的方法制備。本發(fā)明的探針和引物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法制備(Sambrook，J.E.等人(1989)同上)。這些探針和引物可以通過化學(xué)合成方法合成(Gait，M.J.，ed.(1984)inOligonucleotide Synthesis，IRL Press，Oxford，England)。
本發(fā)明的一個實施方案提供了與經(jīng)修飾的corin分子序列互補的核酸引物，其使得本發(fā)明的核酸分子或其任何部分的特異擴增得以進行。另一個實施方案提供了用于與所述經(jīng)修飾的corin分子序列或其任何部分選擇性或特異性雜交的互補的核酸探針。
或者，所述經(jīng)修飾的corin分子序列的片段可以被用于構(gòu)建一種具有與非corin分子序列融合的經(jīng)修飾的corin分子序列的重組融合基因。
融合基因序列 本發(fā)明提供了融合基因序列，其包括與非corin分子序列融合(例如，連接或結(jié)合)的經(jīng)修飾的corin分子序列。所述經(jīng)修飾的corin分子序列以符合讀碼框地被可操縱地與非corin分子序列融合。
本發(fā)明的融合基因序列包括編碼與表位標(biāo)記融合的經(jīng)修飾的corin分子的核苷酸序列，所述表位標(biāo)記包括但不限于組氨酸(6xHis)標(biāo)記、V5標(biāo)記、FLAG標(biāo)記、流感病毒血凝素(HA)標(biāo)記、Myc標(biāo)記、VSV-G標(biāo)記、及硫氧還蛋白(Trx)標(biāo)記。
本發(fā)明的融合基因序列包括與全長或部分長度報告基因序列融合的編碼經(jīng)修飾的corin分子的核苷酸序列，所述報告基因包括但不限于谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶，、β-葡糖苷酸酶、螢光素酶、綠色熒光蛋白(GFP)、和包括藍色熒光蛋白(BFP)在內(nèi)的自發(fā)熒光蛋白。
本發(fā)明的融合基因序列包括與編碼結(jié)合DNA分子或結(jié)合其它細(xì)胞分子的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)片段的基因序列融合的編碼經(jīng)修飾的corin分子的核苷酸序列，所述細(xì)胞分子包括但不限于麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)、S-標(biāo)記、LexA DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)融合、GAL4 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合、和單純皰疹病毒(HSV)BP16蛋白融合。
本發(fā)明的融合基因序列包括與編碼切割位點部分的基因序列融合的編碼經(jīng)修飾的corin分子的核苷酸序列。所述切割位點可以位于經(jīng)修飾的corin分子編碼序列和切割序列之間。所述切割位點部分包括但不限于hepsin、凝血酶、和因子Xa識別序列。
嵌合的核苷酸序列 本發(fā)明提供了編碼重組嵌合經(jīng)修飾的corin分子的嵌合基因序列。所述嵌合的核苷酸分子編碼與從不同的第二來源分離的corin分子的一部分融合的從第一來源分離的corin分子的一部分。所述嵌合的分子編碼符合讀碼框地被可操縱地融合的嵌合多肽。
在一個實施例中，嵌合核苷酸分子編碼與來源于第二來源的corin分子的細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的來源于第一來源的corin分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，其中所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括取代活化序列。在另一個實施例中，嵌合核苷酸分子編碼與來源于第二來源的corin分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的剩余部分融合的來源于第一來源的corin分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的一部分，其中所述嵌合分子包括具有取代活化序列的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。
密碼子選擇變體(codon usage variants) 本發(fā)明提供了不同于所公開的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列卻不改變所編碼的經(jīng)修飾的corin分子的推測的多肽序列或生物活性的分離的密碼子選擇變體。例如，許多氨基酸是由多于一種的三聯(lián)體密碼子所指定。由于遺傳密碼的簡并性，指定相同的氨基酸的密碼子可能存在。實例包括編碼氨基酸精氨酸(R)的核苷酸密碼子CGU、CGG、CGC、和CGA；或編碼氨基酸天冬氨酸(D)的密碼子GAU和GAC。因此，一種蛋白質(zhì)可以由一種或多種具體核苷酸序列不同但仍然編碼具有相同序列的蛋白質(zhì)分子的核酸分子編碼。氨基酸編碼序列如下 所述密碼子選擇變體可以通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生。根據(jù)宿主細(xì)胞使用密碼子的頻率，可以對密碼子進行選擇以優(yōu)化特定的原核或真核表達宿主中經(jīng)修飾的corin分子轉(zhuǎn)錄物或經(jīng)修飾的corin分子的產(chǎn)生水平。改變編碼經(jīng)修飾的corin分子的可供選擇的理由包括生產(chǎn)具有更理想的性質(zhì)的RNA轉(zhuǎn)錄物，所述更理想的性質(zhì)例如延長的半衰期或提高的穩(wěn)定性。作為遺傳密碼簡并性的結(jié)果，可以分離出許多編碼各個經(jīng)修飾的corin分子的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列的變體。因此，本發(fā)明提供了選擇每個可能的三聯(lián)體密碼子以產(chǎn)生編碼所公開的經(jīng)修飾的corin分子或編碼具有經(jīng)修飾的corin分子的生物活性的分子的核苷酸序列的每一種可能的組合。該特定的實施方案中提供了與圖1和10任一所示序列不同的經(jīng)分離的核苷酸序列，以便每一種變異的核苷酸序列編碼一種與圖2和圖11所示氨基酸序列具有序列同一性的分子。
變異的核苷酸序列 本發(fā)明提供了含有編碼任何本發(fā)明的經(jīng)修飾corin分子的變異形式的多核苷酸序列的核酸分子。所述變異的核苷酸序列編碼經(jīng)修飾的corin分子的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的變體形式。所述變異的核苷酸序列編碼位于本發(fā)明的經(jīng)修飾corin分子中的取代活化序列的變異形式。在一個實施方案中，所述變異的核苷酸序列編碼一種與天然存在的野生型corin分子具有相同或相似功能活性的變異的經(jīng)修飾的corin分子。
本發(fā)明的這些變異的核苷酸序列包括保守的或非保守的氨基酸取代。變異的核苷酸序列包括突變例如氨基酸取代、缺失、插入、添加、截短或蛋白質(zhì)的加工或切割錯誤。所述變異的核苷酸序列包括天然存在的corin分子的等位基因變體、同系物變體、或直系同源物變體。
衍生的核酸分子 本發(fā)明的核酸分子還包括與DNA或RNA分子不同的衍生的核酸分子以及反義分子。衍生的分子包括肽核酸(PNAs)和包括硫代磷酸酯、磷酸三酯、磷酰胺和甲基膦酸酯分子在內(nèi)的以依賴于堿基對的形式與單鏈DNA或RNA結(jié)合的非核酸分子(Zamecnik，P.C.等人(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75280284；Goodchild，P.C.等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146)。肽核酸分子包含加入了氨基酸殘基如賴氨酸和氨基的核酸寡聚物。這些小分子，也稱為抗基因劑，通過與其核酸互補鏈(模板)結(jié)合阻止轉(zhuǎn)錄物的延伸(Nielsen，P.E.等人(1993)Anticancer Drug Des 853-63)。DNA、RNA、以及它們的類似物的合成方法的綜述可以在Eckstein，E.等人，eds.(1991)in Oligonucleotides and Analogues，IRL Press，New York；and Gait，M.J.，ed.(1984)in Oligonucleotide Synthesis，IRL Press，Oxford，England中找到。此外，反義RNA技術(shù)的方法描述于美國專利Nos.5,194,428和5,110,802中。熟練的技術(shù)人員使用本申請描述的經(jīng)修飾的hepsin分子多核苷酸序列能夠容易地獲得這些類的衍生的核酸分子，參見例如Egholm，M.等人(1992)Innovative andPerspectives in Solid Phase Synthesis，pp.325-328，或美國專利No.5,539,082。
標(biāo)記的核酸分子 本發(fā)明提供了用可檢測的標(biāo)記連接或標(biāo)記的本發(fā)明的核酸分子?？蓹z測的標(biāo)記的實例包括但不限于放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。生產(chǎn)標(biāo)記的核酸分子的技術(shù)是公知的，參見例如Sambrook，J.E.等人(1989)同上。
D.重組的經(jīng)修飾的Corin核酸分子 本發(fā)明提供了包括編碼經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物的核苷酸序列的重組DNA分子(rDNA)，如本文所描述的。本申請使用的rDNA分子是一種已經(jīng)被用于體外分子操作的DNA分子。生產(chǎn)重組DNA分子的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，例如參考Sambrook，J.E.等人(1989)同上。在一個實施方案中，本發(fā)明的重組DNA分子被可操縱地與一個或多個表達控制序列和/或載體序列連接。
載體 本發(fā)明的核酸分子可以是重組分子，其每個都含有編碼經(jīng)修飾的corin分子的多核苷酸序列或其片段或衍生物，其與載體連接以產(chǎn)生重組載體分子。
術(shù)語載體包括但不限于質(zhì)粒、粘粒、BAC、YAC、PAC和噬菌粒。所述載體可以是自主復(fù)制的載體，其包含在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞內(nèi)指導(dǎo)rDNA復(fù)制的復(fù)制子?；蛘?，所述載體指導(dǎo)所述重組載體整合到宿主細(xì)胞中。也可以使用各種病毒載體，例如，許多已知的逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒載體(Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6616-629)。
本發(fā)明的載體使得所述經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物能夠在原核或真核宿主細(xì)胞中表達。所述載體可以是含有表達控制元件例如啟動子序列的表達載體，其使得插入的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列能夠轉(zhuǎn)錄而且其能夠被用于調(diào)節(jié)所連接的經(jīng)修飾的corin分子序列在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中的表達(例如轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)。
所述表達控制元件可以是各種來源，包括天然存在的以及合成的。天然存在的元件可以是細(xì)胞或病毒來源的。表達控制元件在現(xiàn)有技術(shù)中已知，其包括但不限于可誘導(dǎo)的啟動子、組成型啟動子、分泌信號、增強子、轉(zhuǎn)錄終止子和其它轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件。
翻譯中涉及的其它的表達控制元件在現(xiàn)有技術(shù)中是已知的，包括SD(Shine-Dalgarno)序列(例如，原核宿主細(xì)胞)以及起始密碼子和終止密碼子。外源轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是各種來源，包括天然和合成的。
啟動子可以是可誘導(dǎo)型的，其受環(huán)境刺激或細(xì)胞的生長培養(yǎng)基調(diào)節(jié)，包括從編碼熱激蛋白、醇脫氫酶2、異細(xì)胞色素C(isocytochromeC)、酸性磷酸酶、與氮分解代謝相關(guān)的酶以及負(fù)責(zé)麥芽糖和半乳糖利用的酶的基因獲得啟動子。
啟動子可以是組成型的，包括酵母β-因子、醇氧化酶、巨細(xì)胞病毒和PGH。綜述參見Ausubel，F(xiàn).M.等人(1987)in CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)和Bitter，G.A.等人(1987)Methods Enzymol.153516-544。
轉(zhuǎn)錄的效率可通過包含適于所使用的細(xì)胞系統(tǒng)的增強子來增強(Scharf，D.等人(1994)Results Probl.Cell.Differ.20125-162；Bitter，G.A.等人(1987)同上)。病毒啟動子包括SV40早期啟動子或包含在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的LTR中的啟動子。其它病毒啟動子包括巨細(xì)胞病毒啟動子(Boshart，M.等人(1985)Cell 41521-530)。
通常使用的在表達載體中使用的真核控制序列包括與哺乳動物細(xì)胞相容的啟動子和控制序列，例如，CMV啟動子和鳥肉瘤病毒(ASV)(πLN載體)。其它通常使用的啟動子包括猿猴病毒40(SV40)的早期和晚期啟動子(Fiers，W.等人(1978)Nature 273113-120)，或者其它病毒啟動子例如從多瘤病毒、腺病毒2和牛乳頭瘤病毒獲得的啟動子。也可以使用可誘導(dǎo)的啟動子例如hMTII(Karin，M.等人(1982)Nature 299797-802)。
酵母載體的轉(zhuǎn)錄控制序列包括用于合成糖酵解酶的啟動子(Hess，B.等人(1968)J.Adv.Enzyme Reg.7149；Holland，M.J.andHolland，J.P.(1978)Biochemistry 174900-4097)?，F(xiàn)有技術(shù)中已知的其它啟動子包括CDM8載體中提供的CMV啟動子(Toyama，R.和Okayama，H.(1990)FEBS Lett.268217-221)；3-磷酸甘油酸激酶的啟動子(Hitzeman，R.A.等人(1980)J.Biol.Chem.25512073-12080)和其它糖酵解酶的啟動子。
對于經(jīng)修飾的corin分子序列的有效翻譯也需要特異的翻譯起始信號。這些信號包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。天然corin分子的ATG起始序列或上游序列可被插入到適當(dāng)?shù)谋磉_載體中?；蛘撸梢允褂煤铣傻腁TG起始密碼子和其它序列。ATG起始密碼子必須在正確的讀碼框中以確保插入序列的翻譯。
表達控制元件可以被置于編碼序列的3′端。這些序列可以起到穩(wěn)定信使RNA的作用。這些終止子在位于幾個源于酵母和哺乳動物基因的編碼序列后的3′未翻譯區(qū)中發(fā)現(xiàn)。
表達載體可以包括至少一種選擇性標(biāo)記基因，所述標(biāo)記基因編碼的基因產(chǎn)物提供抗藥性，例如對卡那霉素、氨芐青霉素或四環(huán)素的抗性。
表達載體可以包括任何標(biāo)記基因。它們包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)Cell 11223-232)和腺苷酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(Lowy，I.等人(1980)Cell 22817-823)基因，它們可以分別用于tk-陰性或aprt-陰性細(xì)胞中。而且，也可以將抗代謝物抗性、抗生素抗性或除草劑抗性用作選擇基礎(chǔ)；例如，可提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 773567-3570)；提供氨基糖苷類新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).等人(1981)J.Mol.Biol.1501-14)和分別提供氯磺隆(chlorsulfuron)和膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶抗性的als或pat(Murry，L.E.(1992)in McGraw Yearbook of Science and Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp191-196)。其它的選擇性基因已經(jīng)被描述了，例如trpB，其使得細(xì)胞利用吲哚從而替代色氨酸，或者h(yuǎn)isD，其使得細(xì)胞利用組氨醇(histinol)從而替代組氨酸(Hartman，S.C.and Mulligan，R.C.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 858047-8051)。近來，可見標(biāo)記的使用獲得了普遍性，這些標(biāo)記例如花青素、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS和螢光素酶及其底物熒光素，這些標(biāo)記不僅被廣泛用于鑒別轉(zhuǎn)化體，也被用于對特定載體系統(tǒng)的短暫或穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達定量(Rhodes，C.A.等人(1995)Methods Mol.Biol.55121-131)。
所述載體還包括多個能夠使外源DNA序列方便地插入的核酸內(nèi)切酶限制性位點。產(chǎn)生編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的重組表達載體的方法是現(xiàn)有技術(shù)中公知的(Sambrook，J.E.等人(1989)同上；Ausubel，F(xiàn).M.等人(1989)同上)。
用于產(chǎn)生經(jīng)修飾的corin分子的表達載體與真核宿主細(xì)胞相容。所述載體可以與脊椎動物細(xì)胞相容。這些載體可以包括表達控制元件例如從哺乳動物基因或哺乳動物病毒中獲得的啟動子和/或增強子。其它表達載體可以包括從哺乳動物基因或哺乳動物病毒中獲得的組織-或細(xì)胞-特異性啟動子和/或增強子。
所述表達載體可以與其它的真核宿主細(xì)胞相容，包括昆蟲、植物或酵母細(xì)胞。所述表達載體可包括表達控制元件，例如用于在昆蟲細(xì)胞中表達的桿狀病毒多角體蛋白啟動子。也可以使用來源于植物細(xì)胞(例如熱激蛋白、RUBISCO、儲備蛋白(storage protein)基因)、病毒啟動子或前導(dǎo)序列的啟動子和/或增強子或來源于植物病毒的啟動子和/或增強子。
真核細(xì)胞表達載體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且可以從幾個商業(yè)來源獲得，所述載體包括PSVL和pKSV-10(Pharmacia)、pBPV-1/pML2d(International Biotechnologies，Inc.)、pTDT1(ATCC，#31255)、以及相似的真核表達載體。用于真核宿主細(xì)胞的表達載體的實例包括但不限于用于哺乳動物宿主細(xì)胞的載體，如BPV-1；pHyg；pRSV；pSV2；pTK2；pIRES(Clontech)；pRc/CMV2；pRc/RSV；pSFV1(Life Technologies)；pVPakc載體；pCMV載體；pSG5載體(Stratagene)；逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(例如pFB載體(Stratagene))；pCDNA-3(Invitrogen)或其經(jīng)修飾的形式；腺病毒載體；腺相關(guān)病毒載體；桿狀病毒載體。其它用于真核宿主細(xì)胞的表達載體包括用于酵母的pESC載體(Stratagene)和用于在昆蟲細(xì)胞中表達的pFastBac(Gibco/BRL，Rockville，MD)。
所述表達載體可以包括用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達的表達控制元件。這些表達控制元件可受環(huán)境條件例如熱激誘導(dǎo)，或受添加異丙基-β-D硫代半乳糖苷(例如IPTG)這樣的試劑所誘導(dǎo)(Yamaguchi，N.等人.(2002)J.Biol.Chem.2776806-6812)。原核細(xì)胞表達載體在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的，并且可以從一些商業(yè)來源獲得。例如，pGEX載體(Promega，Madison，WI)、pTrcHisB載體(Invitrogen)、pET載體(e.g.，pET-21，Novagen Corp.)、BLUESCRIPT噬菌粒(Stratagene，LaJolla，CA)、pSPORT(Gibco BRL，Rockville，MD)、或ptrp-lac雜合體可用于在細(xì)菌宿主細(xì)胞中表達所述經(jīng)修飾的corin分子。
E.經(jīng)修飾的corin宿主-載體系統(tǒng) 本發(fā)明進而提供了宿主-載體系統(tǒng)，其包括轉(zhuǎn)導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞的含有經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列或其片段或衍生物的載體、質(zhì)粒、噬菌粒、BAC、PAC、YAC或粘粒。
所述宿主-載體系統(tǒng)可被用于轉(zhuǎn)錄和/或表達(例如，產(chǎn)生)本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子?？梢允褂酶鞣N表達載體/宿主系統(tǒng)來攜帶和表達所述經(jīng)修飾的corin分子序列。所述宿主細(xì)胞可以是真核或原核細(xì)胞。
真核宿主細(xì)胞 合適的真核宿主細(xì)胞的實例包括昆蟲細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞例如哺乳動物細(xì)胞。
一種可用于表達經(jīng)修飾的corin分子的表達系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在一個這樣的系統(tǒng)中，苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒(AcNPV)可被用作在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)昆蟲細(xì)胞或粉紋夜蛾(Trichoplusia)幼蟲中表達外源基因的載體?？蓪⒕幋a經(jīng)修飾的corin分子的序列克隆到所述病毒的非必要區(qū)域例如多角體蛋白基因中，并將其置于多角體蛋白啟動子的控制之下。經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列的成功插入會使得多角體蛋白基因失活并產(chǎn)生缺少衣殼蛋白的重組病毒。然后這些重組病毒可用于感染可表達經(jīng)修飾的corin分子的草地夜蛾細(xì)胞或粉紋夜蛾幼蟲(Smith，G.E.等人(1983)J.Virol.46584-593；Engelhard，E.K.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA913224-3227)。
在哺乳動物宿主細(xì)胞中，可以使用許多基于病毒的表達系統(tǒng)。當(dāng)采用腺病毒作為表達載體時，可以將經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列連接到帶有晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列(tripartite leader sequence)的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯載體中。病毒基因組的非必要E1或E3區(qū)內(nèi)的插入產(chǎn)生能夠在被感染的宿主細(xì)胞中表達經(jīng)修飾的corin分子的有活性的病毒(Logan，J.and Shenk，T.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813655-3659)。此外，也可以使用像勞氏肉瘤病毒(RSV)增強子這樣的轉(zhuǎn)錄增強子增加在哺乳動物宿主細(xì)胞中的表達。
在以前的一項研究中，利用脂轉(zhuǎn)染試劑(Lipofectin)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染步驟將一種含有人corin cDNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進人胚腎(HEK)293細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞表達人corin，其活化ANP前體(Yan，W.等人(2000)同上)。
在酵母釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，可以使用許多包括組成型或可誘導(dǎo)型啟動子的載體，所述啟動子例如β-因子/醇氧化酶和PGH。綜述參見Ausubel，F(xiàn).M.等人(1989)同上and Bitter，G A.等人(1987)同上。
在使用植物表達載體時，編碼經(jīng)修飾的corin分子的序列的表達可由多種啟動子中的任何一種來啟動。例如，可以單獨使用像CaMV的35S和19S啟動子這樣的病毒啟動子(Brisson，N.等人(1984)Nature310511-514)，或者與來自TMV的Ω前導(dǎo)序列聯(lián)合使用(Takamatsu，N.等人(1987)EMBO J.6307-311)。或者，可以使用植物啟動子例如RUBISCO的小亞基(Coruzzi，G.等人(1984)EMBO J.31671-1680；Broglie，R.等人(1984)Science 224838-843)；或熱激啟動子(Winter，J.and Sinibaldi，R.M.(1991)Results Probl.Cell Differ.1785-105)。
此外，可選擇一種能夠調(diào)節(jié)插入的經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列表達或能夠以希望的方式加工表達的蛋白質(zhì)的宿主細(xì)胞株。表達的經(jīng)修飾的corin分子的這些修飾包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化、以及酰化。切割蛋白質(zhì)前體形式(例如pre-pro-蛋白質(zhì))的翻譯后加工對于正確插入、折疊和/或功能也是重要的。不同的宿主細(xì)胞例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等等對于這種翻譯后活性具有特異的細(xì)胞系統(tǒng)和特性機制，可被選擇以確保所導(dǎo)入的外源蛋白的正確修飾和加工。
原核宿主細(xì)胞 合適的原核宿主細(xì)胞的實例包括來自于像埃希氏菌屬(Escherichia)、桿菌屬(Bacillus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、和鏈霉菌屬(Streptomyces)這樣的屬的細(xì)菌菌株。例如像Epicurian coli XL-1 Blue細(xì)胞(Stratagene)這樣的細(xì)菌細(xì)胞，以前用于產(chǎn)生天然hepsin(Kazama，Y.等人(1995)J.Biol.Chem.27066-72)，也可以用于產(chǎn)生所述經(jīng)修飾的corin分子。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，許多表達載體可以根據(jù)經(jīng)修飾的corin分子所希望的用途進行選擇。例如，當(dāng)需要大量經(jīng)修飾的corin分子時，例如用于誘導(dǎo)抗體，那么就希望指導(dǎo)可溶性且容易純化的融合蛋白高水平表達的載體。這種載體包括但不限于多功能大腸桿菌克隆和表達載體例如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列可與半乳糖苷酶的氨基端Met及隨后7個殘基的序列被符合讀碼框地連接到載體中以便產(chǎn)生雜化蛋白質(zhì)。其它載體包括pIN載體(VanHeeke，G.and Schuster，S.M.(1989)J.Biol.Chem.2645503-5509)等等。也可以使用pGEX載體(Promega，Madison Wis.)以與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的融合蛋白形式表達外源蛋白。一般而言，這種融合蛋白是可溶的，并且可以通過吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖珠上，然后在游離的谷胱甘肽存在下洗脫而從溶解的細(xì)胞中將其純化。這些系統(tǒng)中制備的蛋白質(zhì)被設(shè)計為包括hepsin、凝血酶或因子Xa蛋白酶切割位點以便所克隆的目的蛋白質(zhì)可以在需要時從GST部分中釋放。
將經(jīng)修飾的corin核酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法 將經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞的方法是公知的方法，其取決于所使用的載體類型和所使用的宿主系統(tǒng)。
例如，在脊椎動物細(xì)胞中，采用各種方法用載體將所述核酸序列導(dǎo)入，包括磷酸鈣介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染(Graham，F(xiàn).L.and Van der Eb，A.J.(1973)Virology 52456-467；Wigler，M.等人(1977)同上)或其它陽離子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染方法、電穿孔(Neuman，E.等人(1982)EMBO J.1841-845)、顯微注射(Anderson，W.F.等人1(980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 775399-5403；Cappechi，M.R.(1980)Cell 22479-488；Graessman，A.等人(1979)J.Virol.32989-994)、或包括在脂質(zhì)囊泡中包裹DNA的脂質(zhì)方法(Schaefer-Ridder，M.(1982)Science 215166-168)。其它方法包括基因槍方法。其它方法包括利用含有晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列的腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯載體。核酸序列可以插入進腺病毒基因組的非必要E1或E3區(qū)以產(chǎn)生能夠表達由該核酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的有存活能力的病毒(Logan，J.and Shenk，T(1984)同上)?；蛘撸€可以使用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移法(Gilboa，E.等人(1986)BioTechniques 4504-512)。
植物細(xì)胞可通過直接DNA轉(zhuǎn)化或病原體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染而被導(dǎo)入。這些技術(shù)的綜述參見Hobbs，S.(1992)in McGraw Yearbook of Scienceand Technology，McGraw Hill，New York，N.Y.，pp 191-196 andWeissbach，A.and Weissbach，H.(1988)in Methods for Plant MolecularBiology，Academic Press，New York，N.Y.，pp 421-463。或者，可通過利用金屬顆粒的基因槍法導(dǎo)入植物細(xì)胞。
通過電穿孔或鹽處理法將核酸分子導(dǎo)入(例如，轉(zhuǎn)化)到原核宿主細(xì)胞中(Cohen，S.N.et a/.(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 692110-2114；Sambrook，J.E.等人.(1989)同上)。
轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的選擇 導(dǎo)入了經(jīng)修飾的corin分子核苷酸序列的細(xì)胞可以通過現(xiàn)有技術(shù)中公知技術(shù)鑒別?？梢詫@些細(xì)胞進行選擇、溶解并利用DNA凝膠印跡法或類似的方法檢測其DNA內(nèi)容物中所導(dǎo)入的序列的存在(Southern，E.M.(1975)J.Mol.Biol.98503-517；Berent，S.L.等人(1985)Biotechniques 3208-220)?；蛘?，由本發(fā)明的細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可以通過生物化學(xué)檢測或免疫學(xué)方法進行檢測。
可以使用許多選擇系統(tǒng)來重新獲得被導(dǎo)入的(例如轉(zhuǎn)化的或轉(zhuǎn)染的)細(xì)胞?？梢曰诜謩e可使用于tk-陰性或aprt-陰性細(xì)胞的單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)同上)或腺苷酸轉(zhuǎn)磷酸核糖基酶(Lowy，I.等人(1980)Cell 22817-23)基因的表達選擇被導(dǎo)入的細(xì)胞。也可以使用抗代謝物抗性、抗生素抗性或除草劑抗性作為選擇的基礎(chǔ)；例如，提供氨甲蝶呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)同上)；提供氨基糖苷類新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F(xiàn).等人(1981)同上)和分別提供氯磺隆(chlorsulfuron)和膦絲菌素乙?；D(zhuǎn)移酶抗性的als或pat。另外的選擇性基因已經(jīng)被描述了，例如trpB，其使得細(xì)胞利用吲哚從而替代色氨酸，或者h(yuǎn)isD，其使得細(xì)胞利用組氨醇(histinol)替代組氨酸(Hartman，S.C.and Mulligan，R.C.(1988)同上)。近來，可見標(biāo)記的使用更加普遍，這些標(biāo)記例如花青素、β-葡糖醛酸糖苷酶及其底物GUS和螢光素酶及其底物螢光素，這些標(biāo)記不僅被廣泛用于識別轉(zhuǎn)化體，也被用于對特定載體系統(tǒng)的短暫或穩(wěn)定的蛋白質(zhì)表達定量(Rhodes，C.等人(1995)同上)。
F.細(xì)胞和基因治療 本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子可根據(jù)本發(fā)明通過稱為“細(xì)胞治療”的方法在體內(nèi)表達這些經(jīng)修飾的corin分子從而得以利用。因此，例如，可以用編碼經(jīng)修飾的corin分子的多核苷酸(DNA或RNA)對細(xì)胞進行回體(ex vivo)工程化，然后被工程化的細(xì)胞被提供給要用經(jīng)修飾的corin分子治療的患者。這些方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。例如，可采用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法利用含有編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的RNA的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒對細(xì)胞進行工程化。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子還可根據(jù)本發(fā)明通過稱為“基因治療”的方法在體內(nèi)表達這些經(jīng)修飾的corin分子從而得以利用。因此，例如，可以用編碼經(jīng)修飾的corin分子的多核苷酸(DNA或RNA)對病毒進行工程化，然后被工程化的病毒被提供給要用經(jīng)修飾的corin分子治療的患者。這些方法在現(xiàn)有技術(shù)中是公知的。例如，可采用現(xiàn)有技術(shù)中公知的方法對重組腺病毒進行工程化，使其含有編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的DNA。
利用細(xì)胞或基因治療的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的局部輸送可給目的區(qū)域(內(nèi)襯血管的內(nèi)皮細(xì)胞)提供治療劑。
本發(fā)明包括體內(nèi)和體外的細(xì)胞和基因治療方法。將潛在的治療基因轉(zhuǎn)移到規(guī)定的細(xì)胞群的一些方法是公知的，參見例如Mulligan，R.C.(1993)Science 260926-932。這些方法包括直接基因轉(zhuǎn)移(參見，例如Wolff，J.A.等人(1990)Science 2471465-1468)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(參見，例如Caplen，N.J.等人(1995)Nature Med.339-46；Crystal，R.G(1995)Nature Med.115-17；Gao，X.and Huang，L.(1991)Biochem.Biophys.Res.Comm.179280-285)、逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移(參見，例如Kay，M.A.等人(1993)Science 262117-119；Anderson，W.F.(1992)Science 256808-813)；和DNA病毒介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)移。這些DNA病毒包括腺病毒(優(yōu)選基于Ad2或Ad5的載體)、皰疹病毒(優(yōu)選基于單純皰疹病毒的載體)和細(xì)小病毒(優(yōu)選基于“有缺陷的”或非自主性細(xì)小病毒的載體，更優(yōu)選基于腺相關(guān)病毒的載體，最優(yōu)選基于AAV-2的載體)。參見，例如Ali，M.等人(1994)Gene Therapy 1367-384；并入本文作為參考的美國專利4,797,368，以及并入本文作為參考的美國專利5,139,941。
用于轉(zhuǎn)移目的基因的特定的載體系統(tǒng)的選擇取決于各種因素。一個重要的因素是靶細(xì)胞群的特性。盡管逆轉(zhuǎn)錄病毒載體已經(jīng)被廣泛地研究，并被應(yīng)用于許多基因治療中，這些載體一般不適于感染非分裂細(xì)胞。此外，逆轉(zhuǎn)錄病毒具有致癌性的可能。然而，在慢病毒載體領(lǐng)域中的最新發(fā)展可能超越這些限制。參見Naldini，L.等人(1996)Science 272263-267。
由上文提到的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒可以來源于包括但不限于莫洛尼氏鼠白血病毒、脾壞死病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒例如勞氏肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、長臂猿猿白血病病毒(Gibbon ape leukemia virus)、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳癌病毒。在一個實施方案中，所述逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體源自于莫洛尼氏鼠白血病毒。
腺病毒的優(yōu)點在于它們宿主范圍廣，能夠感染休眠或終末分化的細(xì)胞，例如神經(jīng)元或肝細(xì)胞，并且本質(zhì)上呈現(xiàn)非致瘤性。參見，例如Ali，M.等人(1994)，同上。腺病毒看來并不整合到宿主基因組中。由于它們存在于染色體外，因而插入突變的風(fēng)險大大減小了(Ali，M.等人(1994)，同上)。
腺相關(guān)病毒顯示與基于腺病毒的載體相似的優(yōu)點。然而，AAVs顯示出在人染色體19上位點特異性整合(Ali，M.等人(1994)，同上). 在一個優(yōu)選的實施方案中，編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的DNA被用于心血管疾病的細(xì)胞或基因治療中，所述疾病包括但不限于心力衰竭、高血壓、心臟肥大、心肌病、心臟纖維化、局部缺血性心臟病、瓣膜性心臟病、心肌炎和先兆子癇。
根據(jù)該實施方案，用編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的DNA進行的細(xì)胞或基因治療在診斷同時或診斷后立即被提供給需要的患者。
熟練的技術(shù)人員會理解根據(jù)該實施方案可以使用含有編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的DNA或編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的片段或衍生物的DNA的任何合適的基因治療載體。構(gòu)建這種載體的技術(shù)是已知的，參見例如Anderson，W.F.(1998)Nature 39225-30；Verma，I.M.and Somia，N.(1998)Nature 389239-242?？梢允褂靡阎夹g(shù)完成含有經(jīng)修飾的corin分子DNA的載體向靶位點的導(dǎo)入。
細(xì)胞或基因治療載體包括一個或多個啟動子?？梢允褂玫暮线m的啟動子包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR；SV40啟動子；和描述于Miller，A.D and Rosman，G.J.(1989)Biotechniques 7980-990的人巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子，或其它任何啟動子(例如，細(xì)胞啟動子例如真核細(xì)胞啟動子，包括但不限于組蛋白、pol III和β-肌動蛋白啟動子)。其它可以使用的病毒啟動子包括但不限于腺病毒啟動子、胸苷激酶(TK)啟動子和B19細(xì)小病毒啟動子?；诒疚陌慕虒?dǎo)，合適的啟動子的選擇對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。
編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的核酸序列處于合適的啟動子的控制之下?？墒褂玫暮线m的啟動子包括但不限于腺病毒啟動子，例如腺病毒主要晚期啟動子；或異源啟動子，例如巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動子；呼吸道合胞病毒(RSV)啟動子；可誘導(dǎo)的啟動子，例如MMT啟動子，金屬硫蛋白啟動子；熱激啟動子；白蛋白啟動子；ApoAI啟動子；人球蛋白啟動子；病毒胸苷激酶啟動子，例如單純性皰疹胸苷激酶啟動子；逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs(包括上述經(jīng)修飾的逆轉(zhuǎn)錄病毒LTRs)；β-肌動蛋白啟動子；和人生長激素啟動子。
逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體被用于轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞系以形成生產(chǎn)細(xì)胞系?？杀晦D(zhuǎn)染的包裝細(xì)胞系的實例包括但不限于全文并入本文作為參考的Miller，A.D.(1990)Hum.Gene Ther.15-14中所述的PE501、PA317、ψ-2、ψ-AM、PA12、T19-14X；VT-19-17-H2、ψCRE、ψCRIP、GP+#-86、GP+envAm12和DAN細(xì)胞系。所述載體可以通過現(xiàn)有技術(shù)中已知的任何方法轉(zhuǎn)導(dǎo)包裝細(xì)胞。這些方法包括但不限于電穿孔、使用脂質(zhì)體和CaPO4沉淀?；蛘撸孓D(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒載體可以被包含在一種脂質(zhì)體中，或被偶聯(lián)到脂質(zhì)上，然后施用于宿主。生產(chǎn)細(xì)胞系產(chǎn)生傳染性的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒，其包括編碼所述多肽的核酸序列。然后可將這些逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顆粒用于在體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)真核細(xì)胞。所轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞會表達編碼所述多肽的核酸序列。可以被轉(zhuǎn)導(dǎo)的真核細(xì)胞包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎瘤細(xì)胞和造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、成肌細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞。
基因治療的一種不同的方法是“transkaryotic治療”，其中患者的細(xì)胞被回體處理以誘導(dǎo)休眠染色體基因從而在重導(dǎo)入患者后生產(chǎn)出目的蛋白。Transkaryotic治療假設(shè)個體具有對于活化所必需的基因的正?；パa體。Transkaryotic治療包括將能夠活化初生基因的啟動子或其它外源調(diào)節(jié)序列導(dǎo)入到回體患者細(xì)胞的染色體DNA中、培養(yǎng)和選擇活化的蛋白質(zhì)生產(chǎn)細(xì)胞、然后將活化的細(xì)胞重導(dǎo)入到患者中以使它們能夠得以完全確立。然后“基因活化”的細(xì)胞在相當(dāng)長的時間內(nèi)生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)，可能是患者的一生。美國專利5,641,670和5,733,761具體公開了這個概念，并且將它們并入本文作為參考。
G.藥物組合物 本發(fā)明提供了包含與一種本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的可接受的載體或佐劑混合的本發(fā)明的分子的藥物組合物。所述藥物組合物優(yōu)選包含合適的載體和佐劑，其包括當(dāng)與本發(fā)明的分子結(jié)合時保持分子活性并且與患者的免疫系統(tǒng)不反應(yīng)的任何材料。這些載體和佐劑包括但不限于離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、緩沖物質(zhì)例如磷酸鹽、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和的植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳劑(例如油/水乳劑)、鹽或電解質(zhì)例如硫酸魚精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽、硅膠、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、基于纖維素的物質(zhì)和聚乙二醇。其它的載體還可包括無菌溶液、片劑包括包衣片和膠囊。典型的是這些載體包括賦形劑例如淀粉、奶、糖(例如蔗糖、葡萄糖、麥芽糖)、粘土的某些形式、明膠、硬脂酸或其鹽、硬脂酸鎂或硬脂酸鈣、滑石粉、植物脂肪或油類、樹膠、乙二醇或其它已知的賦形劑。這些載體還可以包括調(diào)味劑和著色劑或其它成分。通過公知的常規(guī)方法配制含有這些載體的組合物。這些組合物也可以被配制于各種脂質(zhì)組合物中，例如脂質(zhì)體和各種聚合組合物如聚合物微球。
H.試劑盒 本發(fā)明進而涉及用于研究或診斷的試劑盒。試劑盒通常包括一種或多種含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的容器。在一個優(yōu)選實施方案中，所述試劑盒包括含有處于適于與第二分子一起衍生的形式的經(jīng)修飾的corin分子的容器。在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述試劑盒包括含有SEQ ID NO34的經(jīng)修飾的corin分子的容器。本發(fā)明進而提供含有處于游離形式或藥物可接受形式的本發(fā)明的組合物的試劑盒。所述試劑盒可以包括其實施的用法說明。本發(fā)明的試劑盒可以用于本發(fā)明的任何方法中。
在另一個實施方案中，所述試劑盒可含有編碼本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的DNA序列。優(yōu)選地編碼這些經(jīng)修飾的corin分子的DNA序列被提供到適于轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞并由宿主細(xì)胞表達的質(zhì)粒中。所述質(zhì)粒可含有啟動子(往往是可誘導(dǎo)的啟動子)以調(diào)節(jié)所述DNA在宿主細(xì)胞中的表達。所述質(zhì)粒還可含有適當(dāng)?shù)南拗菩晕稽c以利于其它DNA序列插入所述質(zhì)粒中從而生產(chǎn)出各種經(jīng)修飾的corin分子。所述質(zhì)粒還可以含有許多其它的元件以利于被編碼的蛋白質(zhì)的克隆和表達。這些元件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是公知的，例如選擇性標(biāo)記、起始密碼子、終止密碼子等等。在一個更為優(yōu)選的實施方案中，試劑盒包括含有SEQ ID NO33所示的DNA序列的容器。
I.本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的應(yīng)用 本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子可用于治療任何病原學(xué)的心血管疾病，這些疾病包括但不限于心力衰竭、高血壓、心臟肥大、心肌病、心臟纖維化、局部缺血性心臟病、瓣膜性心臟病、心肌炎和先兆子癇。
J.本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子的測試 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子的體外利用可以在實施例3至5描述的測定中以及在新生大鼠心肌肥大模型中進行測試(van Rooij，E.等人(2002)J.Biol.Chem.27748617-48626 and Liang，F(xiàn).等人(2003)J.Biol.Chem.27815073-15083)。
可以在實施例6描述的測定中以及在冠狀動脈結(jié)扎后的小鼠心肌梗塞模型(Feng，Q.等人(2001)Circulation 104700-704)中、在進行了通過橫向胸主動脈結(jié)扎進行的主動脈收縮后的小鼠壓力超負(fù)荷模型(Meguro，T.等人(1999)Circ.Res.84735-740)中、小鼠壓力超負(fù)荷模型(Rockman，H.A.等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888277-8281)中、小鼠遺傳模型(Beggah，A.T.等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci USA 997160-7165)中、心肌癥倉鼠低體溫心臟麻痹模型(Hoshijima，M.等人(2002)Nature Med.8864-871 and Ikeda，Y.等人(2002)Circulation 105502-508)中、和狗起搏心力衰竭模型(Shen，W.等人(2002)J.Pharmacol.Exp.Ther.303673-680 andShen，W.等人(1999)Circulation 1002113-2118)中對本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子的體內(nèi)利用進行測試。
K.本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子的給藥 本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽以純化形式或以適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物形式的給藥可以通過任何一種可接受的給藥模式或通過用于相似用途的物質(zhì)實現(xiàn)。因此，給藥可以是例如，經(jīng)口、鼻、腸胃外、局部、經(jīng)皮或直腸，以固體、半固體、凍干粉末或液體劑型形式給藥，例如片劑、栓劑、丸劑、彈性軟膠囊和硬質(zhì)明膠膠囊、粉末、溶液、混懸劑、或氣霧劑等等，優(yōu)選以適于精確劑量單一給藥的單位劑型給藥。所述組合物會包括一種常規(guī)的藥物載體或賦形劑以及作為活性劑的一種本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子，此外還可包括其它藥劑、藥物劑、載體、佐劑等等。
一般而言，依賴于所希望的給藥形式，藥物學(xué)可接受的組合物會含有約1％至約99％重量百分比的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子，或其藥物學(xué)可接受的鹽，以及約99％至1％重量百分比的適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑。優(yōu)選地，所述組合物是約5％至75％重量百分比的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子，或其藥物學(xué)可接受的鹽，剩下的是適當(dāng)?shù)乃幬镔x形劑。
一種優(yōu)選的給藥途徑是口服，其采用一種方便的日給藥方案，可根據(jù)待治療的病狀的嚴(yán)重程度進行調(diào)節(jié)。對于這種口服給藥，一種含有本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽的藥物學(xué)可接受的組合物是通過摻入任何一般使用的賦形劑來形成的，所述賦形劑例如各種藥物等級的甘露糖醇、乳糖、淀粉、預(yù)膠凝淀粉、硬脂酸鎂、糖鈉(sodium saccharine)、滑石粉、纖維素醚衍生物、葡萄糖、明膠、蔗糖、檸檬酸鹽、沒食子酸丙酯等等。這些組合物采取溶液、混懸液、片劑、丸劑、膠囊、粉末、持續(xù)釋放劑型等等形式。
優(yōu)選地，這些組合物采取膠囊、薄膜衣片(caplet)或片劑形式，因此也含有一種稀釋劑例如乳糖、蔗糖、磷酸二鈣等等；一種崩解劑例如交聯(lián)羧甲基纖維素鈉或其衍生物；一種潤滑劑例如硬脂酸鎂等等；和一種粘合劑例如淀粉、阿拉伯樹膠、聚乙烯吡咯烷酮、明膠、纖維素醚衍生物等等。
給藥的另一種優(yōu)選的途徑是腸胃外給藥，例如靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥，其中本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子可被用于藥物組合物中。因此，上述經(jīng)修飾的corin分子優(yōu)選與一種可接受的無菌的藥物載體組合，所述藥物載體例如百分之五的葡萄糖、乳酸鹽林格液、生理鹽水、無菌水或任何其它商業(yè)制備的用于靜脈注入的生理緩沖溶液。應(yīng)當(dāng)理解的是載體溶液以及組合物的劑量和給藥的選擇根據(jù)患者和特定的臨床設(shè)置的不同而改變，并且由標(biāo)準(zhǔn)醫(yī)學(xué)程序所控制。
所述融合蛋白質(zhì)的給藥可以通過一種快速靜脈注射、定速靜脈內(nèi)注入或這兩種途徑結(jié)合來給藥?；蛘撸虺酥?，與適當(dāng)?shù)馁x形劑混合的融合蛋白質(zhì)可從肌肉內(nèi)或皮下位點被吸收到循環(huán)中。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地確定出用于靜脈內(nèi)、皮下或肌內(nèi)給藥的典型的藥物組合物。給藥量顯然是具有蛋白質(zhì)特異性的，并取決于其效力和藥物代謝動力學(xué)性質(zhì)。目前用于制備可腸胃外給藥的組合物的方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言已知的或是顯而易見的，像Remington′sPharmaceutical Science，18th Ed.(Mack Publishing Company，Easton，PA，1990)這樣的出版物中對其有更為詳細(xì)的描述。所述組合物的單一或多次給藥可以依賴于患者所需以及可以忍受的劑量和頻率進行。無論如何，所述組合物應(yīng)該提供足夠量的本發(fā)明的蛋白質(zhì)以有效治療患者。
本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽也可配制成一種栓劑，其中利用例如約0.5％至約50％置于一種在體內(nèi)緩慢溶解的載體中的活性成分，所述載體例如聚氧乙烯基二醇和聚乙二醇(PEG)，如PEG 1000(96％)和PEG 4000(4％)。
可以通過例如將本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子(約0.5％至約20％)或其藥物學(xué)可接受的鹽以及任選的藥物佐劑在載體中進行溶解、分散等而形成溶液或混懸液以制備液體藥物學(xué)可給藥的組合物，所述載體例如水、鹽水、水性葡萄糖、甘油、乙醇等等。
如果希望，本發(fā)明的藥物組合物也可含有較少量的輔助物質(zhì)，例如濕潤劑或乳化劑、pH緩沖劑、抗氧化劑等等，例如檸檬酸、失水山梨醇單月桂酸酯(sorbitan monolaurate)、三乙醇胺油酸酯、丁基化羥基甲苯等等。
制備這些劑型的現(xiàn)實方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的或是顯而易見的；例如，參見Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thEd.，(Mack Publishing Company，Easton，Pennsylvania，1990)。根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，用于給藥的組合物無論如何應(yīng)含有治療有效量的本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽以治療特征在于血壓升高的病狀。
以治療有效量給予本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽，所述治療有效量根據(jù)各種因素而改變，所述因素包括所使用的特異的經(jīng)修飾的corin分子的活性；所述經(jīng)修飾的corin分子的代謝穩(wěn)定性和作用持續(xù)時間；患者的年齡、體重、全身的健康狀況、性別以及飲食；給藥模式和時間；排泄率；藥劑組合；特定病狀的嚴(yán)重性；和接受治療的宿主。一般而言，一種治療有效日劑量是每天約0.14mg至約14.3mg/kg體重的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽；優(yōu)選地每天約0.7mg至約10mg/kg體重；最優(yōu)選的是每天約1.4mg至約7.2mg/g體重。例如，對一名體重為70kg的患者給藥，劑量范圍在每天約10mg至約1.0克的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽，優(yōu)選每天約50mg至約700mg，最優(yōu)選為每天約100mg至約500mg。
L.優(yōu)選的實施方案 如發(fā)明概述中所述的本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子中，有幾組經(jīng)修飾的corin分子是尤為優(yōu)選的。
在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子包含corin或其片段或衍生物的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及替換野生型corin活化序列RILGG的取代活化序列。
在一個更為優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子包含corin或其片段或衍生物的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及替換野生型corin活化序列RILGG的取代活化序列DDDDKILGG。
在一個更為優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子包含corin或其片段或其衍生物的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，以及替換野生型corin活化序列RILGG的取代活化序列DDDDKILGG，而且還含有N末端Igκ信號序列和C末端表位標(biāo)記。
SEQ ID NO34所示的經(jīng)修飾的corin分子是本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案。
***** 下面這些具體的實施例是作為一種用以幫助實施本發(fā)明的指導(dǎo)而提供的，并非意欲限制本發(fā)明的范圍。
實施例1 人Corin表達載體的構(gòu)建 為了檢驗corin在體外對前肽的加工，構(gòu)建出編碼全長人corin多肽及其衍生物的哺乳動物表達載體。
全長人corin表達載體的構(gòu)建 從人心臟cDNA文庫中克隆出野生型人corin cDNA(Yan，W.等人(1999)同上)。全長人corin cDNA序列長度為4933個核苷酸，包括翻譯起始蛋氨酸密碼子和翻譯終止密碼子在內(nèi)的人corin編碼序列長度為3129個核苷酸(參見圖1，SEQ ID NO1)。野生型corin多肽序列由1042個氨基酸(see Figure2，SEQ ID NO2)組成，經(jīng)計算的分子量為～116kDa(Yan，W.等人(1999)同上)。
一種含有全長人corin cDNA的質(zhì)粒構(gòu)建體按所述方式產(chǎn)生(Yan，W.等人(2000)同上)。使用正向引物(5′-ATGAAACAGTCTCCTGCCCTCGCTCCGGAAGAGC-3′；SEQ IDNO3)和反向引物(5′-GTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTA-3′；SEQID NO4)，通過PCR擴增出人corin編碼區(qū)域，即自第94位的翻譯起始密碼子至第3219位的C末端氨基酸。然后將其插入到哺乳動物表達載體pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)的PCR產(chǎn)物位點中。利用這種表達載體產(chǎn)生的重組corin含有C末端病毒V5表位和6xHis標(biāo)記，因此利于由抗-V5或抗-His抗體對所述重組蛋白的檢測。經(jīng)限制性酶消化和DNA測序證實所得質(zhì)粒pcDNA3.1 Corin表達重組corin，其由人corin第1-1042位氨基酸和其后的C末端V5表位和6xHis標(biāo)記構(gòu)成。
含有跨膜的人corin缺失突變體表達載體的構(gòu)建 為了便于含有內(nèi)部缺失的重組corin分子的產(chǎn)生，通過如下PCR方法在全長人cDNA序列中導(dǎo)入一個XhoI限制性位點。使用pcDNA3.1Corin作為DNA模板(參見上文)，用正向引物Cor/TMa(5′-GGGGGAATTCATGAAACAGTCTCCTGCCCTCGCTCCGGAAGAGC-3′；SEQ ID NO5)和反向引物Cor/TMb(5′-GGGGCTCGAGCGTAGTCCAGGCTGGAACGTGTTGGTCG-3′；SEQID NO6)通過PCR擴增人corin的N末端區(qū)域，即SEQ ID NO1的第1至369位，其對應(yīng)于SEQ ID NO2的第1至123位氨基酸。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位點。這種中間質(zhì)粒為pcDNA4NCorin1。再次使用pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用正向引物CorFL(5′-GGGGCTCGAGGATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAGTCACAGG-3′；SEQ ID NO7)和反向引物CorEnd(5′-GGGGGGGCCCTTAGTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG-3′；SEQ ID NO8)通過PCR擴增人corin的C末端區(qū)域，即SEQ IDNO1的第370至3129位，其對應(yīng)于SEQ ID NO2的第124至1042位氨基酸。用XhoI和ApaI(New England Biolabs)消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4NCorin1的XhoI和ApaI位點。獲得的質(zhì)粒pcDNA4FLCorin表達重組corin，其由人corin氨基酸第1-123位、由導(dǎo)入XhoI位點(CTCGAG)帶來的1個兩個氨基酸的插入(Leu-Glu)、以及人corin第124-1042位氨基酸組成(SEQ ID NO9)。
通過下述PCR方法以人corin的跨膜形式產(chǎn)生內(nèi)部缺失突變體1至5。以pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用正向引物CorDelI(5′-GGGGCTCGAGCTCTGTGGAAGGGGTGAGAACTTTCTGTGTGC-3′；SEQ ID NO10)、CorDel II(5′-GGGGCTCGAGCTGAATAACTGTAGTCAATGTGAACC-3′；SEQID NO11)、CorDelIII(5′-GGGGCTCGAGGTGGAAGAATGCTCACCTAGTCATTTCAAG-3′；SEQ ID NO12)、CorDel IV(5′-GGGGCTCGAGGTGTGTGCAGATGGCTGGCAGGAGATATTG-3′；SEQ ID NO13)和CorDel V(5′-GGGGCTCGAGGACTGTGGGCGCCGCCCTGCTGCCCGAATG-3′；SEQ ID NO14)，和反向引物CorEnd(SEQ ID NO8)通過PCR擴增人corin的C末端區(qū)域。用XhoI和ApaI消化各個PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4NCorin1的XhoI和ApaI位點。獲得的質(zhì)粒表達重組corin，其由人corin第1-123位氨基酸、1個兩個氨基酸的插入(Leu-GIu)、及人corin第268至1042位氨基酸(缺失1，SEQ ID NO15)、第449至1042位氨基酸(缺失2，SEQ ID NO16)，第577至1042位(缺失3，SEQ ID NO17)、第713至1042位氨基酸(缺失4，SEQ ID NO18)或第789至1042位氨基酸(缺失5，SEQ ID NO19)組成。
通過下述PCR方法在人corin的跨膜形式中產(chǎn)生內(nèi)部缺失6。以pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用正向引物Cor/TMa(SEQ ID NO5)和反向引物Del62(5′-GGGGCTCGAGAGGTGAGAAGCAAATTCTGCTGACATTGC-3′；SEQ IDNO20)通過PCR擴增人corin的N末端區(qū)域，即自SEQ IDNO1的第1至777位，其對應(yīng)于SEQ ID NO2的第1至259位氨基酸。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位點。這種中間質(zhì)粒為pcDNA4NCorin2。使用pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用正向引物Del61(5′-GGGGCTCGAGAGCGTCATTCAGACTTCATGTCAAGAAGG-3′；SEQ ID NO21)和反向引物CorEnd(SEQ ID NO8)通過PCR擴增人corin的C末端區(qū)域，即SEQ ID NO1的第1247至3129位，其對應(yīng)于SEQ ID NO2的第415至1042位氨基酸。用XhoI和ApaI(NewEngland Biolabs)消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4Ncorin2的XhoI和ApaI位點。獲得的質(zhì)粒表達一種重組corin，其由人corin第1-259位氨基酸、Leu-Glu、以及人corin第415-1042位氨基酸組成(缺失6，SEQ ID NO22)。
通過下述PCR方法在人corin的跨膜結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生內(nèi)部缺失7。以pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用正向引物Cor/TMa(SEQ ID NO5)和反向引物Del72(5′-GGGGCTCGAGAGGTGAGAAGCAAATTCTGCTGACATTGC-3′；SEQ ID NO23)通過PCR擴增人corin的N末端區(qū)域，即自SEQ IDNO1的第1至1347位，其對應(yīng)于SEQ ID NO2的第1至449位氨基酸。用EcoRI和XhoI(New England Biolabs)消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4/HisMaxC(Invitrogen)的EcoRI和XhoI位點。這種中間質(zhì)粒為pcDNA4NCorin3。使用pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用正向引物Del71(5′-GGGGCTCGAGACCTGCCTGATGCCTGATGAATATGTGG-5′，SEQ ID NO24)和反向引物CorEnd(SEQ ID NO8)通過PCR擴增人corin的C末端區(qū)域，即SEQ ID NO1的第1705至3129位，其對應(yīng)于SEQ ID NO2的第569至1042位氨基酸。用XhoI和ApaI(NewEngland Biolabs)消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4NCorin3的XhoI和ApaI位點。獲得的質(zhì)粒表達一種重組corin，其由人corin氨基酸第1-449位、Leu-Glu、以及人corin氨基酸第569-1042位組成(缺失7，SEQ ID NO25)。
全長人corin以及含有跨膜的人corin內(nèi)部缺失突變體的示意性結(jié)構(gòu)描述于圖3中。它們是缺失1，其缺少了CRD1結(jié)構(gòu)域(第124至267位氨基酸)；缺失2，其缺少了CRD1和LDLR1-5結(jié)構(gòu)域(第124至448位氨基酸)；缺失3，其缺少了CRD1、LDLR1-5和CRD2結(jié)構(gòu)域(第124至576位氨基酸)；缺失4，其缺少了CRD1、LDLR1-5、CRD2和LDLR6-8結(jié)構(gòu)域(第124至712位氨基酸)；缺失5，其缺少了CRD1、LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8和SRCR結(jié)構(gòu)域(第124至788位氨基酸)；缺失6，其缺少了LDLR1-5結(jié)構(gòu)域(第260至414位氨基酸)；和缺失7，其缺少了CRD2結(jié)構(gòu)域(第450至568位氨基酸)。
含有跨膜的經(jīng)修飾的人corin表達載體的構(gòu)建 與大多數(shù)胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶類似，corin被合成為酶原(Yan，W.等人(1999)同上；Yan，W.等人(2000)同上)。Corin中的預(yù)測的活化切割序列位于氨基酸Arg801與Ile802之間。目前，corin的生理激活物質(zhì)是未知的。為產(chǎn)生具有酶活性的corin，本文描述的基于細(xì)胞的檢測依賴于未知的表達于HL-5或293細(xì)胞的絲氨酸蛋白酶。另一種產(chǎn)生具有酶活性的corin的方法是導(dǎo)入一種由已知的絲氨酸蛋白酶特異性識別的活化切割序列，例如被腸激酶所識別的肽序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)(Kitamoto，Y.等人(1994)同上)。
使用一種誘變試劑盒(Stratagene)按下述方式通過PCR方法生產(chǎn)表達含有跨膜的經(jīng)修飾的人corin質(zhì)粒構(gòu)建體。以pcDNA4FLCorin作為DNA模板，采用以下兩組引物通過PCR擴增人corin的C末端區(qū)域(1)正向引物EntPCR1a(5′-CAACACGTTCCAGCCTGGACTACGCTC-3′；SEQ ID NO26)和反向引物EntPCR1b(5′-CCTCCAAGGATCTTATCGTCATCGTCCCCACAGTCTTGTTTAGTACA-3′；SEQ ID NO27)，它們跨越人corin第116至791位氨基酸、腸激酶活化切割序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(DDDDK)、和人corin第802至805位氨基酸和(2)正向引物EntPCR2a(5′-GGTTTAAACGGGCCCTTAGTTTAGGAG-3′，SEQ ID NO28)和反向引物EntPCR2b(5′-GACGATGACGATAAGATCCTTGGAGGTCGGACGAGTCG-3′，SEQ ID NO29)，它們跨越腸激酶活化序列和人corin第802第1042位氨基酸。所使用的PCR條件為95℃下2分鐘；95℃下30秒；56℃下30秒；72℃下2分鐘；30個循環(huán)；和72℃下10分鐘。用XhoI和ApaI消化PCR產(chǎn)物，插入到pcDNA4FLCorin的XhoI和ApaI位點。獲得的質(zhì)粒pcDNA4FLCorin-EK表達一種重組corin多肽，其由人corin第1-123位氨基酸、Leu-Glu、以及人corin第124-791位氨基酸、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、和人corin第802至1042位氨基酸組成(FLCorin-EK，SEQ ID NO30)。
可溶性經(jīng)修飾的人corin表達載體的構(gòu)建 據(jù)預(yù)測II型跨膜絲氨酸蛋白酶的N末端跨膜結(jié)構(gòu)域是將蛋白酶的活性限制在細(xì)胞表面特異位點的調(diào)節(jié)機制的一部分(Hooper，J.D.eta/.(2001)同上)。然而，由于重組可溶性腸激酶(Lu，D.et a/.(1997)J.Biol.Chem.27231293-31300)和matriptase(Lin，C.Y.等人(1997)J.Biol.Chem.2729147-9152；Takeuchi，T.等人(2000)J.Biol.Chem.27526333-26342)已經(jīng)顯示出具有催化活性，因此該跨膜結(jié)構(gòu)域看來對于II型跨膜絲氨酸蛋白酶的酶活性而言并不需要。
預(yù)測的人corin的N末端跨膜結(jié)構(gòu)域包含第46至66位氨基酸殘基(Yan，W.等人(1999)同上)。因此，人corin的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包含圖2中的第67至1042位氨基酸殘基，對應(yīng)于圖1中的第199至3129位。按下述PCR方法生產(chǎn)表達缺少跨膜結(jié)構(gòu)域且含有腸激酶活化切割序列的可溶性人corin的質(zhì)粒構(gòu)建體。以pcDNA4FLCorin-EK作為DNA模板，用正向引物CorFL-1(5′-GGGGCTCGAGGATGCTTCTCTCCCAGGGGACCAAAGTCACAGG-3′；SEQ ID NO31)和反向引物CorSol2Apa2(5′-GGGGGGGCCCGTTTAGGAGAAAGGTCTGGATGTAAATCTG-3′，SEQ ID NO32)通過PCR擴增缺少跨膜結(jié)構(gòu)域且含有腸激酶活化切割序列Asp-Asp-Asp-Asp-Lys的人corin區(qū)域，所述區(qū)域跨越人corin第124至1024位氨基酸以及腸激酶活化切割序列。所使用的PCR條件是95℃下2分鐘；95℃下30秒；56℃下2分鐘；72℃下3分鐘；30個循環(huán)；和72℃下15分鐘。PCR產(chǎn)物插入到pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。獲得的質(zhì)粒表達一種重組corin多肽SolCorin-EK(核酸序列SEQ ID NO33，氨基酸序列SEQ IDNO34)，其由N末端Igκ分泌信號序列(第1至36位氨基酸)、Leu-Glu(第37至38位氨基酸)、人corin第124至796位氨基酸(第39至711位氨基酸)、腸激酶活化切割序列(第712至716位氨基酸)、人corin第802至1042位氨基酸(第717至957位氨基酸)和一個C末端病毒V5和6xHis表位標(biāo)記(第958至991位氨基酸)組成。
人corin的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域是第802至1042位氨基酸(Yan，W.等人(1999)同上)。按下述方式通過PCR產(chǎn)生表達含有腸激酶活化切割序列和絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域的可溶性人corin的質(zhì)粒構(gòu)建體。以pcDNA3.1Corin作為DNA模板，用兩條正向引物SolCat1(5′-CTGCTGCCGACGATGACGATAAGATCCTTGGAGGTCGGACGAGTCG-3′，SEQ ID NO35)和SolCat2(5′-AAACAAGACTGTGGGCGCCGCCCTGCTGCCGACGATGACGATAAG-3′，SEQ ID NO36)，和反向引物CorSol2Apa2(SEQ ID NO32)，通過PCR擴增人corin的絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，所述絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域跨越人corin氨基酸第787至796位、Asp-Asp-Asp-Asp-Lys、和人corin第802至1042位氨基酸。所使用的PCR條件是95℃下2分鐘；95℃下30秒；58℃下1分鐘；72℃下1分鐘；30個循環(huán)；和72℃下15分鐘。PCR產(chǎn)物插入到pSecTag/FRT/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。獲得的質(zhì)粒表達一種重組corin多肽SolCorinPD-EK(氨基酸序列SEQ ID NO37)，其由N末端Igκ分泌信號序列(第1至36位氨基酸)、人corin第787至796位氨基酸(第37至46位氨基酸)、腸激酶活化切割序列(第47至51位氨基酸)、人corin第802至1042位氨基酸(第52至292位氨基酸)和一個C末端病毒V5和6xHis表位標(biāo)記(第293至326位氨基酸)組成。
SolCorin-EK和SolCorinPD-EK的示意性結(jié)構(gòu)描述于圖7中。SolCorin-EK的核酸和氨基酸序列分別示于圖10和11中。
實施例2 ANP前體和BNP前體表達載體的構(gòu)建 為了檢驗corin在體外對前肽的加工，構(gòu)建出編碼人ANP前體和BNP前體的哺乳動物表達載體。
按所述方式產(chǎn)生出表達人野生型ANP前體或人野生型BNP前體的質(zhì)粒構(gòu)建體(Yan，W.等人(2000)同上)。從人心臟cDNA文庫中通過PCR擴增出人ANP前體(Oikawa，S.等人(1984)Nature 309724-726)和人BNP前體的編碼區(qū)域(Sudoh，T.等人(1989)Biochem.Biophys.Res.Commun.1591427-1434)，然后將它們一個一個單獨地插入到pcDNA3.1/V5-His-TOPO(Invitrogen)中。利用這種表達載體產(chǎn)生的重組ANP前體和BNP前體含有C末端病毒V5表位和6xHis表位標(biāo)記，因此利于由抗-V5或抗-His抗體對所述重組蛋白的檢測。經(jīng)限制性酶切和DNA測序?qū)λ觅|(zhì)粒進行了證實。
實施例3 由corin對前肽的體外加工 為了在體外檢驗corin對前肽的加工，用一種corin表達載體和一種前肽表達載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。通過使用針對重組corin或前肽連接的肽標(biāo)記的抗體的蛋白質(zhì)印跡法分析前肽的切割。
細(xì)胞培養(yǎng) 在含有10％FBS、15μg/ml胰島素、50μg/ml內(nèi)皮生長添加物(Upstate Biotechnology Institute)、1μM視黃酸、0.1mM去甲腎上腺素、100μg/ml青霉素/鏈霉素、292μg/ml L-谷氨酰胺和0.1mM MEM非必需氨基酸的Ex-Cell 320培養(yǎng)基(JRH Biosciences)中培養(yǎng)鼠HL-5心肌細(xì)胞。人293細(xì)胞被培養(yǎng)于添加有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的α-MEM(Life Technologies，Inc.)中。幼倉鼠腎(BIIK)細(xì)胞被培養(yǎng)于添加有10％FBS的EMEM(Life Technologies，Inc.)中。所有的細(xì)胞都培養(yǎng)于37℃下充有5％CO2和95％空氣的濕潤培養(yǎng)箱中。
轉(zhuǎn)染和蛋白質(zhì)印跡分析 按照生產(chǎn)商的說明利用Lipofectin(Invitrogen)在HL-5細(xì)胞中進行瞬時轉(zhuǎn)染。按照生產(chǎn)商的說明利用Lipofectin2000(LifeTechnologies，Inc.)在293細(xì)胞中進行瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。用對照表達載體(pcDNA)或重組corin表達載體(pcDNA3.1 Corin)與重組ANP前體表達載體(pcDNApro-ANP)共轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48或72小時后收集條件培養(yǎng)基。為了分析ANP前體加工，通過一種抗V5抗體(Invitrogen)免疫沉淀條件培養(yǎng)基中的重組ANP前體及其衍生物，以及重組corin。通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)，并通過使用一種與抗V5抗體(Invitrogen)綴合的辣根過氧化物酶的蛋白質(zhì)印跡法對其進行分析。如圖4所示，ANP前體的加工在只被ANP前體表達載體轉(zhuǎn)染的HL-5細(xì)胞中被檢測到。然而，重組corin的表達進而增強了HL-5細(xì)胞中ANP前體的加工。
cGMP測定 為了檢測經(jīng)加工的重組ANP的活性，使用一種酶免疫測定(EIA)試劑盒(Biotrak，Amersham Biosciences，Inc.)進行cGMP測定。在該測定中，幼倉鼠腎(BHK)細(xì)胞于補充有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的MEM培養(yǎng)基中在96孔板中生長。用無血清培養(yǎng)基清洗匯合的細(xì)胞。在每孔中加入從被感染的人293細(xì)胞或鼠HL-5細(xì)胞中獲得的含有重組ANP前體及其衍生物的條件培養(yǎng)基(180μl)，于37℃下溫育10分鐘。通過加入20μl含有2％十二烷基三甲銨和50mM醋酸鈉，pH5.8的溶解緩沖液溶解細(xì)胞。用Biotrak EIA試劑盒測定經(jīng)ANP刺激的BHK細(xì)胞中的細(xì)胞內(nèi)cGMP濃度。每一種實驗條件都是一式四份進行測定的。如圖5所示，從未經(jīng)全長人corin表達載體轉(zhuǎn)染或經(jīng)其轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基沒有提高BHK細(xì)胞中的cGMP水平。從未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HL-5細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基促進細(xì)胞內(nèi)cGMP的產(chǎn)生；這種產(chǎn)生通過使用從經(jīng)全長人corin表達載體轉(zhuǎn)染的HL-5細(xì)胞獲得的條件培養(yǎng)基獲得提高。
實施例4 在體外由Corin內(nèi)部缺失突變體對ANP前體的加工 為了在體外檢驗前肽加工對人corin的各個結(jié)構(gòu)域的需求，用一種全長人corin表達載體或一系列人corin內(nèi)部缺失突變體表達載體(參見實施例1)與一種前肽表達載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。通過使用針對與重組corin和前肽連接的標(biāo)記的抗體的蛋白質(zhì)印跡法分析前肽的切割。
按照生產(chǎn)商的說明利用Lipofectamine2000將pcDNApro-ANP和表達全長人corin和各種人corin內(nèi)部缺失突變體的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人293細(xì)胞。24小時后收集含有重組人ANP前體及其衍生物的條件培養(yǎng)基，并通過使用一種抗V5抗體的免疫沉淀以及隨后的SDS-PAGE以及使用一種與HRP綴合的抗V5抗體的蛋白質(zhì)印跡法分析ANP前體的加工。圖6顯示了全長人corin多肽和缺少了CRD1結(jié)構(gòu)域的缺失1能夠加工ANP前體，而缺失2至5在該測定中均沒有活性。缺失6和7在該測定中也沒有活性(數(shù)據(jù)未顯示)。從經(jīng)轉(zhuǎn)染的293細(xì)胞中制備的細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡法證實了所有的內(nèi)部缺失突變構(gòu)建體表達預(yù)期大小的corin多肽(圖6以及數(shù)據(jù)未示出)。
實施例5 在體外由腸激酶對經(jīng)修飾的corin的加工 為了在體外檢驗由腸激酶對經(jīng)修飾的corin的加工，用一種corin表達載體共轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。通過使用針對與重組corin連接的肽標(biāo)記的抗體的蛋白質(zhì)印跡法分析corin的切割。
細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在含有10％FBS和1％L-谷氨酰胺的α-MEM培養(yǎng)基(LifeTechnologies，Inc.)中培養(yǎng)人293細(xì)胞。按照生產(chǎn)商的說明利用Lipofectin 2000(Life Technologies，Inc.)在293細(xì)胞中進行瞬時或穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。
由腸激酶對經(jīng)修飾的Corin的活化 重組SolCorin-EK或SolCorinPD-EK在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人293細(xì)胞中獲得表達。收集含有SolCorin-EK或SolCorinPD-EK的條件培養(yǎng)基(0.5ml)，并與0、2、10、20或40單位的純化的腸激酶(Calbiochem)一起于25℃下培養(yǎng)4小時。為了分析corin的活化，將20μl試樣用于進行SDS-PAGE，然后進行使用抗V5抗體(Invitrogen)的蛋白質(zhì)印跡法。如圖8所示，通過暴露于腸激酶，長型(SolCorin-EK)和短型(SolCorinPD-EK)可溶性經(jīng)修飾的人corin以劑量依賴性方式被切割。
由腸激酶活化的經(jīng)修飾的corin對人ANP前體的括化 按照生產(chǎn)商的說明利用Lipofectamine 2000(Life Technologies，Inc.)將重組人ANP前體瞬時轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞中。24小時后收集含有ANP前體的條件培養(yǎng)基，將其置于冰上用于后續(xù)使用。由經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人293細(xì)胞中獲得的條件培養(yǎng)基中的SolCorin-EK或SolCorinPD-EK的活化按上述方式進行。為了除去腸激酶，使用了一種腸激酶切割捕獲試劑盒(Enterokinase Cleavage Capture Kit)(Calbiochem)。將條件培養(yǎng)基的每份試樣與100μl EKapture瓊脂糖小珠一起于25℃下溫育30分鐘，并經(jīng)旋轉(zhuǎn)過濾器過濾。將對照OPTI-MEM(Life Technologies，Inc.)或腸激酶耗竭的條件培養(yǎng)基(250μl)與1ml含有ANP前體的條件培養(yǎng)基一起于4℃下溫育3小時。通過利用抗V5抗體的免疫沉淀以及隨后的SDS-PAGE以及使用一種與HRP綴合的抗V5抗體的蛋白質(zhì)印跡法分析ANP前體的加工。由于含有C末端病毒V5表位標(biāo)記，因此重組corin在蛋白質(zhì)印跡試驗中也被這種抗V5抗體所識別。如圖9所示，在體外ANP前體被長型可溶性經(jīng)修飾的人corin加工成ANP(SolCorin-EK)，而不能被短型可溶性經(jīng)修飾的人corin(SolCorin-PD-EK)加工成ANP。
實施例6 可溶性經(jīng)修飾的人Corin的體內(nèi)活性 為了檢驗可溶性經(jīng)修飾的人Corin的體內(nèi)活性，在哺乳動物細(xì)胞中表達重組SolCorin-EK、將其純化、用腸激酶使其活化、然后檢測其對倉鼠的利尿和鈉尿的刺激能力。
重組SolCorin-EK或SolCorinPD-EK的純化 重組SolCorin-EK被表達于經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人293細(xì)胞中(參見實施例5)。由SolCorin-EK表達細(xì)胞中獲得的條件培養(yǎng)基經(jīng)Opticab 4包膜一次性筒式過濾器(Opticab4 capsule disposable cartridge filter)(Millipore)過濾、濃縮約10倍、并且于20mM Tris-HCl，pH7.5，300mM NaCl中滲濾。然后通過Zeta PlusBioCap過濾器(Cuno)的過濾除去脂類。
將經(jīng)濃縮和滲濾的含有SolCorin-EK的條件培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至10mM咪唑，然后經(jīng)0.45μm醋酸纖維素濾膜過濾，然后上樣到用20mMTris-HCl，pH7.5，300mM NaCl平衡的Ni-NTA-Superflow(Qiagen)柱上。用20mM Tris-HCl，pH7.5，300mM NaCl，20mM咪唑清洗該柱，以20mM至250mM的咪唑梯度將蛋白質(zhì)從20mM Tris-HCl，pH7.5，300mM NaCl中的柱上洗脫下來。
將含有SolCorin-EK的Ni-NTA的洗脫液上樣到以20mMTris-HCl，pH7.5平衡的Poros50聚乙烯亞胺(PI)(PerseptiveBiosystems)陰離子交換柱上。以20mM Tris-HCl，pH7.5，300mMNaCl清洗該柱以除去聚合的蛋白，用具有300mM至1M的NaCl梯度的20mM Tris-HCl，pH7.5將蛋白質(zhì)從柱上洗脫下來。
含有SolCorin-EK的PI洗脫液稀釋至約50mM NaCl，以10kDa截留值(cut-off)(Millipore)的超濾進行濃縮，然后上樣到經(jīng)20mMTris-HCl，pH7.5平衡的DEAE-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)陰離子交換柱上。用20mM Tris-HCl，pH7.5清洗該柱，用20mM Tris-HCI，1M NaCl將蛋白質(zhì)從柱上洗脫下來。含有SolCorin-EK的洗脫液按1∶2被20mM Tris-HCl，pH7.5稀釋。
經(jīng)由分析的大小排阻色譜法所確定，SolCorin-EK制備物的純度為約94％。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠色譜法以及隨后的考馬斯藍染色確證了SolCorin-EK的大小和完整性。
由腸激酶對SolCorin-EK的活化 通過在20mM Tris-HCl，pH7.5，約260mM NaCl，2mM CaCl2中以每50μg蛋白質(zhì)1單位腸激酶的比例室溫下將純化的SolCorin-EK暴露于重組腸激酶(Novagen)4小時而活化。通過在Eppendorf微型離心管中10,000rpm離心10分鐘除去凝聚蛋白質(zhì)。活化的SolCorin-EK被分成1mg等分試樣，在干冰/乙醇水浴中迅速冷凍，保存于-80℃。
SolCorin-EK對心肌癥倉鼠的利尿和鈉尿作用 BIO14.6心肌癥(CM)倉鼠是一種常染色體隱性品系，其在δ-肌聚糖基因中存在突變(Nigro，V.等人(1997)Hum.Mol.Genet6601-607).BIO14.6倉鼠逐漸獲得伴隨著肥大的特征和心力衰竭的嚴(yán)重的心肌癥，但是顯示出相對溫和的骨骼肌表型。研究已經(jīng)顯示根據(jù)減少的利尿和鈉尿判斷，BIO 14.6CM倉鼠在ANP活性方面有缺陷，然而ANP的產(chǎn)生、釋放和/或活化可被誘導(dǎo)(Dlouha，H.andMcBroom，M.J.(1986)Proc.Soc.Exp.Biol.Med.181411-415)。
按以下方式準(zhǔn)備正常倉鼠(F1B)和BIO 14.6CM倉鼠。在異氟烷(1-2％)麻醉下，將導(dǎo)管插入膀胱和右側(cè)頸靜脈以分別進行尿采集和給藥。當(dāng)需要測量血壓時，將壓力轉(zhuǎn)換器(transducer pressure)插入左側(cè)頸動脈。在約30分鐘的包含外科手術(shù)所需時間的時期后，以35μl/分鐘開始5％葡萄糖溶液輸注，以10分鐘的周期收集尿液，并在整個實驗中一直持續(xù)進行上述輸注和尿液收集。在尿液輸出量穩(wěn)定之后(自葡萄糖輸注1小時后)，以大鼠ANP、SolCorin-EK或載體對倉鼠靜脈內(nèi)給藥，快速注射到頸靜脈中。將1mg/ml大鼠ANP儲液(Sigma)稀釋于0.9％NaCl中，并以固定的100μl體積，以1、3、10、和30μg/kg的劑量對F1B倉鼠給藥，以10、30和100μg/kg對BIO 14.6CM倉鼠給藥。每只動物以3mg/kg的劑量，以約300μl體積給予處于20mMTris-HCl、pH7.5、約260mM NaCl、2mM CaCl2、45.9單位/ml腸激酶中的SolCorin-EK儲液，所述SolCorin-EK儲液的濃度為1.27或1.39mg/ml，所述約300μl體積根據(jù)溶液濃度和體重的不同而改變。以每只動物約300μl的體積給予載體(20mM Tris-HCl，pH7.5，260mM NaCl，2mM CaCl2，45.9單位/ml腸激酶)，根據(jù)體重的不同而改變。
通過計算尿量和尿鈉分別測定倉鼠中的利尿和鈉尿。在靜脈注射ANP、SolCorin-EK或載體前(基線)和注射后(峰值響應(yīng)(peak response))根據(jù)10分鐘周期收集的尿計算出表示為μl.kg-1.min-1的尿量，以及表示為μEq.kg-1.min-1的尿鈉(Na+)。在采用BIO 14.6CM倉鼠的對照實驗中(未顯示)，在前10分鐘大鼠ANP提高了尿量和尿鈉的排泄，峰值響應(yīng)。如圖12所示，SolCorin-EK提高了BIO 14.6CM倉鼠的尿量和尿鈉的峰值響應(yīng)。與經(jīng)corin處理的動物的基線和經(jīng)載體處理的動物的峰值響應(yīng)相比，這種提高在統(tǒng)計學(xué)上是顯著的(p＜0.05)。因此，可溶性經(jīng)修飾的人corin能夠在心肌癥倉鼠體內(nèi)誘導(dǎo)ANP的活性。
實施例7 本實施例闡述了用于口服給藥的代表性的藥物組合物的制備，所述藥物組合物含有本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽 A. 成分 ％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子20.0％ 乳糖 79.5％ 硬脂酸鎂 0.5％ 混合上述成分，配制成硬殼明膠膠囊，其中每個膠囊含100mg，一個膠囊大約就是每天的總劑量。
B. 成分 ％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子20.0％ 硬脂酸鎂 0.9％ 淀粉 8.6％ 乳糖 69.6％ PVP(聚乙烯吡咯烷酮)0.9％ 將上述成分除了硬脂酸鎂外進行組合，并用水作為?；菏怪闪?。然后將該配制品干燥，與硬脂酸鎂混合，并用一種合適的壓片機制片。
C. 成分 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子0.1g 丙二醇 20.0g 聚乙二醇40020.0g 聚山梨酸酯801.0g 水 加水直至100ml 將本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子溶于丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨酸酯80中。然后一邊攪拌一邊加入足夠量的水直至溶液體積為100ml，將其過濾并裝瓶。
D. 成分％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子 20.0％ 花生油 78.0％ 失水山梨糖醇單硬脂酸酯602.0％ 將上述成分熔化、混合、裝入彈性軟膠囊中。
E. 成分 ％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子 1.0％ 甲基或羧甲基纖維素2.0％ 0.9％鹽水 q.s.加水直至100ml 將本申請的經(jīng)修飾的corin分子溶于纖維素/鹽水溶液，將其過濾并裝瓶備用。
實施例8 本實施例闡述了用于腸胃外給藥的代表性的藥物組合物的制備，所述藥物組合物含有本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽 成分 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子 0.02g 丙二醇 20.0g 聚乙二醇400 20.0g 聚山梨酸酯801.0g 0.9％鹽水溶液 q.s.加水直至100ml 將本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子溶解于丙二醇、聚乙二醇400和聚山梨酸酯80。然后一邊攪拌一邊加入足夠量的0.9％鹽水溶液直至提供100ml靜脈內(nèi)(I.V.)溶液，經(jīng)0.2μm薄膜過濾器過濾，并在無菌條件下包裝。
實施例9 本實施例闡述了栓劑形式的代表性的藥物組合物的制備，所述藥物組合物含有本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽 成分％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子 1.0％ 聚乙二醇100074.5％ 聚乙二醇400024.5％ 將各成分溶和在一起，并在蒸氣浴上混合，灌入含有2.5g總重量的模具中。
實施例10 本實施例闡述了用于吹入法的代表性的藥物配制品的制備，所述配制品含有本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽 成分 ％重量/重量 微粉化的本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子1.0％ 微粉化的乳糖 99.0％ 將這些成分碾碎、混合、并包裝入一種裝有給藥泵(dosing pump)的吹入器中。
實施例11 本實施例闡述了噴霧形式的代表性的藥物配制品的制備，所述配制品含有本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽 成分 ％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子 0.005％ 水 89.995％ 乙醇 10.000％ 將本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子溶于乙醇中，與水混合。然后將該配制品包裝于一種裝有給藥泵(dosing pump)的噴霧器中。
實施例12 本實施例闡述了氣溶膠形式的代表性的藥物配制品的制備，所述配制品含有本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子或其藥物學(xué)可接受的鹽 成分 ％重量/重量 本發(fā)明經(jīng)修飾的corin分子 0.10％ 推進劑11/12 98.90％ 油酸1.00％ 將本發(fā)明的經(jīng)修飾的corin分子分散于油酸和推進劑中。然后將所得混合物灌入裝有計量閥(metering valve)的空氣溶膠容器中。
***** 盡管本發(fā)明參考其具體的實施方案進行描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解的是可以在不離開本發(fā)明的真實精神和范圍條件下進行各種變化，及進行等價物替換。此外，可進行多種修飾以使特定的情況、材料、物質(zhì)的組合、加工、加工步驟適應(yīng)本發(fā)明的目的、精神和范圍。所有的修飾視為包含在所附權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。
序列表
權(quán)利要求
1.分離的經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其包含取代活化序列。
2.權(quán)利要求1的分離的分子，其中所述經(jīng)修飾的corin分子包含細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，或其片段或衍生物。
3.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域和選自由CRD1、LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8和SRCR組成的一組中的至少一個額外的結(jié)構(gòu)域，或其片段或衍生物。
4.權(quán)利要求3的分離的分子，其中所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域和LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8以及SRCR結(jié)構(gòu)域，或其片段或衍生物。
5.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列取代野生型人corin活化序列RILGG。
6.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列是DDDDKILGG。
7.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列選自由LKTPRVVGG(SEQ ID NO38)、LKQARVVGG(SEQ ID NO39)、DDDDKIVGG(SEQ ID NO40)和DDDDKI(SEQ ID NO41)組成的一組。
8.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列由蛋白酶識別和切割。
9.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列由絲氨酸蛋白酶識別和切割。
10.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列由II型跨膜蛋白酶識別和切割。
11.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列是DDDDKILGG，其由腸激酶識別和切割。
12.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列由凝血酶、凝血因子Xa、弗林蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶、凝血酶、纖溶酶、激肽釋放酶、針依瓦菊素、人呼吸道胰蛋白酶樣蛋白酶(HAT)、肥大細(xì)胞類胰蛋白酶、MBL關(guān)聯(lián)的絲氨酸蛋白酶(MASP-1和MASP-2)、hepsin、MT-SP1/matryptase、TMPRSS2或Stubble-stubbloid識別和切割。
13.權(quán)利要求2的分離的分子，其進一步包含信號肽序列。
14.權(quán)利要求13的分離的分子，其中所述信號肽序列是細(xì)菌、真菌、昆蟲、植物或動物來源的。
15.權(quán)利要求13的分離的分子，其中所述信號肽是Igκ信號序列。
16.權(quán)利要求2的分離的分子，其進一步包含表位標(biāo)記。
17.權(quán)利要求16的分離的分子，其中所述表位標(biāo)記是氨基酸標(biāo)記。
18.權(quán)利要求16的分離的分子，其中所述表位標(biāo)記是組氨酸(6×His)或半胱氨酸。
19.權(quán)利要求16的分離的分子，其中所述表位標(biāo)記是V5或flag。
20.權(quán)利要求2的分離的分子，其來源于原核或真核生物來源。
21.權(quán)利要求20的分離的分子，其中所述真核生物是哺乳動物。
22.權(quán)利要求21的分離的分子，其中所述哺乳動物是牛、豬、鼠、馬、犬、貓、鳥、魚、綿羊、昆蟲、猿、或人類動物。
23.一種活化的經(jīng)修飾的corin分子，其包括由蛋白酶切割的取代活化序列。
24.權(quán)利要求2的分離的分子，其中所述取代活化序列已經(jīng)被切割從而產(chǎn)生經(jīng)修飾的活化的corin分子。
25.一種編碼權(quán)利要求2或24的經(jīng)修飾的corin分子的分離的核酸分子。
26.一種互補的核酸分子，其包括一種與權(quán)利要求25的核酸分子互補的核苷酸序列。
27.權(quán)利要求25的核酸分子，其是DNA或RNA。
28.權(quán)利要求25的核酸分子，其是肽核酸分子(PNA)。
29.權(quán)利要求25的核酸分子，其是硫代磷酸酯衍生分子。
30.權(quán)利要求25的核酸分子，其被選自于由放射性標(biāo)記、酶、發(fā)色團和熒光劑組成的一組的化合物標(biāo)記以便直接或間接產(chǎn)生可檢測的信號。
31.含有權(quán)利要求25的核酸分子的載體。
32.權(quán)利要求31的載體，其中所述載體是質(zhì)粒、粘粒、BAC、YAC、PAC或噬菌粒。
33.一種宿主載體系統(tǒng)，其含有處于合適的宿主細(xì)胞中的權(quán)利要求31的載體。
34.權(quán)利要求33的宿主載體系統(tǒng)，其中所述合適的宿主細(xì)胞是原核或真核細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的宿主載體系統(tǒng)，其中所述原核細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞。
36.權(quán)利要求34的宿主載體系統(tǒng)，其中所述真核細(xì)胞是酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞。
37.包含權(quán)利要求2的分離的分子的藥物組合物，所述組合物含有藥物學(xué)可接受的賦形劑和治療有效量的所述經(jīng)修飾的corin分子。
38.權(quán)利要求37的藥物組合物，其中所述的藥物賦形劑選自于如下一組磷酸緩沖鹽水溶液、水、乳劑、油/水乳劑、濕潤劑、無菌溶液、賦形劑、淀粉、奶、糖、粘土、明膠、硬脂酸、硬脂酸的鹽、硬脂酸鎂、硬脂酸鈣、滑石粉、植物脂肪或油類、樹膠和乙二醇。
39.權(quán)利要求38的藥物組合物，其被配制成脂質(zhì)體、聚合組合物或聚合物微球。
40.權(quán)利要求38的藥物組合物，其被配制成片劑、包衣片劑或膠囊劑。
41.一種試劑盒，其包含權(quán)利要求2的分離的分子。
42.包含權(quán)利要求25的核酸分子的試劑盒。
43.用于預(yù)防充血性心力衰竭的方法，其包括以治療有效量的權(quán)利要求2的分子給藥，其中所述的經(jīng)修飾的corin分子降低血壓。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述方法用于預(yù)防高血壓、心臟肥大、心肌病、心臟纖維化、局部缺血性心臟病、瓣膜性心臟病、心肌炎和先兆子癇中的充血性心力衰竭。
45.用于預(yù)防和治療患者充血性心力衰竭的方法，其包括對所述患者以治療有效量的權(quán)利要求2的分子給藥。
46.一種基因治療組合物，其包括與治療有效量的基因治療載體組合的編碼由SEQ ID NO34所示的氨基酸序列構(gòu)成的經(jīng)修飾的corin分子的SEQ ID NO33所示的核酸序列。
47.經(jīng)修飾的corin分子，其包括corin的細(xì)胞外區(qū)域或其片段或衍生物，以及取代活化序列DDDDKILGG，其中所述細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域包括LDLR1-5、CRD2、LDLR6-8、SRCR和絲氨酸蛋白酶催化結(jié)構(gòu)域，或其片段或衍生物。
48.權(quán)利要求47的分子，具中所述經(jīng)修飾的corin分子包含SEQID NO34所示的氨基酸序列。
49.編碼權(quán)利要求48的分子的分離的核酸分子，其包含SEQ IDNO33所示的核酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的經(jīng)修飾的corin分子或其片段或衍生物，其含有取代活化序列。所述經(jīng)修飾的corin分子在所述取代活化序列處被切割，從而產(chǎn)生活化的corin分子或其片段或衍生物，它們呈現(xiàn)出天然存在的野生型corin分子的功能活性。所述經(jīng)修飾的corin分子能夠被用于治療多種疾病或紊亂，包括充血性心力衰竭和急性心肌梗塞。
文檔編號A61P9/00GK101109011SQ20071012805
公開日2008年1月23日 申請日期2004年6月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月11日
發(fā)明者吳慶宇 申請人:舍林股份公司