專利名稱：預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的受體阻斷劑、制備及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物制劑-受體阻斷劑，特別涉及一種預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和 仔豬水腫病的受體阻斷劑、制備以及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在本發(fā)明之前，在全球范圍內(nèi)沒有任何商品化疫苗用于斷奶仔豬腹瀉和仔豬 水肺病的預(yù)防，而只是在臨床上發(fā)生斷奶仔豬腹渴和仔豬水腫病病例時(shí)， 一律被 動采用抗生素臨床治療，在一定程度上降低了初生仔豬和斷奶仔豬腹瀉率，但針 對伃豬水腫病病例的抗生素臨床治療，基本無效，其患水肺病的仔豬病程結(jié)局最 后大多死亡，且長期和大量復(fù)合抗生素的使用，導(dǎo)致多種耐藥性產(chǎn)腸毒素大腸桿 菌(ETEC)F18和K88菌4朱不斷產(chǎn)生和在動物體水平傳播擴(kuò)散，并造成抗生素低 效和在動物體內(nèi)的畜積，也會導(dǎo)致動物胃腸道正常菌群紊亂，消化不良，引發(fā)胃 腸道和機(jī)體抵抗力下降，易繼發(fā)或并發(fā)多種疾病。斷奶仔豬腹瀉的主要病原菌是 F18 ETEC和K88 ETEC大腸桿菌兩種，仔豬水腫病的主要病原菌是F18 ETEC, 鑒于F18 ETEC 4姿粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個(gè)血清型抗原變種，K88 ETEC 按粘附素K88分為K88ab、 K88ac、 K88ad 3種血清型抗原變種，其臨床流行株的 菌體抗原血清型則更多，因而研制出針對斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的有效預(yù)防 疫苗至今存在著很大難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，研制一種預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫 病的受體阻斷劑及制備方法。 本發(fā)明的技術(shù)是
預(yù)防斷奶仔豬腹竭和仵豬水腫病的受體阻斷劑，其主要技術(shù)特征在于受體阻 斷劑是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌系列為2種豬源優(yōu)勢益生素菌 抹，其中1種為豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2，第2種為豬源優(yōu)勢乳酸桿 菌益生素菌林LP2，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌內(nèi)含表面分泌表達(dá)F18 或Fed粘附素亞單位基因FedF，K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的MisL e重組載體，其中粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個(gè)血清型抗原變種，是由 F18產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，F(xiàn)18ab質(zhì)粒大小在48和98Mu 之間，而F18ac大質(zhì)粒在98Mu左右 粘附素Fed的表達(dá)和合成需要大質(zhì)粒基因 組中一組操縱子5個(gè)基因共同參與完成，它們分別是FedA、 B、 C、 E和F,其中 FedF亞單位為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，F(xiàn)18ab FedF和F18ab FedF結(jié)合 相同的仔豬腸上走細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的共同功能性粘附素；粘附 素K88分為K88ab、 K88ac、 K88ad 3種血清型抗原變種，是由K88產(chǎn)腸毒素大腸 桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由FaeA到FaeJ共10個(gè)基因參與其菌毛粘附素的 生物合成，其中FaeG亞單位為為K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬腸 上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的功能性粘附素。
本發(fā)明的另一技術(shù)方案是
所述的受體阻斷劑的制備方法，其主要技術(shù)步驟如下
(1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP2和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2 分離自仔豬正常小腸粘膜，按常規(guī)細(xì)菌法分離、鑒定，符合大腸桿菌和乳 酸桿菌形態(tài)、培養(yǎng)和生物學(xué)的一般特性，進(jìn)一步通過仔豬小腸上皮細(xì)胞體 外粘附試驗(yàn)和體內(nèi)口服后仔豬腸道定植、增殖試驗(yàn)細(xì)菌數(shù)檢測，篩選出對 小腸上皮細(xì)胞粘附能力強(qiáng)、易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的EP2和 LP2 二種細(xì)菌并保存；
(2 )選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2,按大腸桿菌常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和 增殖，選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2,按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；
(3 )擴(kuò)增；鑒定FedF和FaeG亞單位基因，根據(jù)FedF和FaeG基因已知的發(fā)表 序列，以F18ab、 F18ac和K88ac優(yōu)勢血清型大腸桿菌大質(zhì)粒DNA為模板， 采用高保真PCR Kit擴(kuò)增上述亞單位基因FedF和FaeG,進(jìn)一步將3，末 端帶有A的PCR片段插入克隆載體pGEM-T,制備轉(zhuǎn)化工程菌DH5 &感受態(tài) 細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的重組質(zhì)粒 pGEM-T DNA,序列測定驗(yàn)證；
(4 )表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)MisL p重組載體 系統(tǒng)構(gòu)建，按常規(guī)DM重組技術(shù)操作，將編碼FedF、 FaeG亞單位基因和 V型分泌系統(tǒng)的分泌表達(dá)載體MisL p分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切消化、 連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5 A感受態(tài)細(xì)菌，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含 目的片段的陽性質(zhì)粒DM, PCR檢測，結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)陽性和序 列測定驗(yàn)證結(jié)果，篩選到能功能性表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位的V 型分泌系統(tǒng)Mi sL P重組載體；
(5)鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即 ASD完整編碼基因根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5 &染色 體DNA為模板，采用長距離PCR法擴(kuò)增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測， 經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得 ASD完整編碼基因，約2Kb大?。?br> (6 )表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL P重 組栽體系統(tǒng)構(gòu)建。步驟5中表面分泌表達(dá)FedF和FaeG粘附素亞單位基因 的Mi sL P重組載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于步驟5中 MisLP重組栽體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，失活了原MisLp載休上的抗性基因 活性，在工程菌DH5 SASD缺失突變抹DH5 & △ ASD指示細(xì)胞中篩選出含表 達(dá)ASD編碼基因和表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因的MisL P 重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除 了 MisL P原載體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；
(7)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌構(gòu)建和篩選，提取含表面分泌表達(dá) FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisLp重組質(zhì)粒栽體 DNA，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌EP2內(nèi)，從 篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA,結(jié)合細(xì)菌粘附素 凝集反應(yīng)、仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗(yàn)和仔豬腸道定植試驗(yàn)細(xì)菌數(shù)檢 測陽性結(jié)果，篩選出能將FedF和FaeG兩種粘附素亞單位有效和功能性展 呈和分泌表達(dá)在仔豬腸道上皮細(xì)胞的EP2重組菌表面；
(8 )受體阻斷劑產(chǎn)品制備挑取步驟(7 )中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重
組菌和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP2單個(gè)菌落，在37。C過夜培養(yǎng)18小時(shí)菌液作 為種子液，再分別擴(kuò)大培養(yǎng)、增殖16 18小時(shí)，經(jīng)常規(guī)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)， 以菌落形成單位cfu度量，濃度達(dá)2 6 x 109cfu,重組菌EP2和LP2擴(kuò)大 培養(yǎng)后混合配置而成益生素重組菌系列。
本發(fā)明的又一技術(shù)方案是
所述的受體阻斷劑作為預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病藥物的應(yīng)用，其主要 技術(shù)特征在于
1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2，經(jīng)DNA遺傳修飾，即利用入噬菌體 Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失其菌林染色體上的天門冬氨酸半酪脫 氬酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹栽體菌 ASD缺失突變4朱EP2 A ASD;
2 )表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重組
載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于表面分泌表達(dá)FedF和FaeG 粕附素亞單位基因的Mi sL (3重組載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，失活了原Mi sL p 栽體上的抗性基因活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變林加5 & △ ASD指示細(xì) 胞中篩選出含表達(dá)ASD編碼基因和表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位 基因的MisLP重組載體，以ASD存在為'歸選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選 標(biāo)志，且祛除了 MisL(3原栽體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；
3 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌基于ASD非抗生素抗性為選擇壓力的染
色體一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌抹構(gòu)建，其系統(tǒng)本身不帶有任何抗生素 抗性基因篩選標(biāo)志；
4)豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林LP2能有效促進(jìn)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2 重組菌和其ASD缺失突變林EP2 △ ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖； 5 )受體阻斷劑產(chǎn)品用于一 日齡仔豬，口服2ml 4小時(shí)后能在仔豬腸道定植、定 居、增殖。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果在于組合細(xì)菌染色體DNA大分子重組技術(shù)、病原菌受體 和其粘附素結(jié)合和檢測技術(shù)、粘附素受體封閉/阻斷技術(shù)、表面分泌表達(dá)粘附素 技術(shù)和畜禽益生素多年的研究工作基礎(chǔ)，研制出的一種受體阻斷劑，它是基于豬 源優(yōu)勢益生素載體菌重組菌林組合，仔豬口服后能在腸道很快定植、定居、增殖， 且在腸道上皮細(xì)胞表面功能性展呈分泌表達(dá)的高度保守的共同功能性粘附素 FedF和FaeG,即F18和K88粘附素受體結(jié)合域，優(yōu)先和仔豬腸道上皮細(xì)胞表面 受體結(jié)合，從而封閉了腸道上皮細(xì)胞與F18和K88粘附素介導(dǎo)的ETEC病原菌的 結(jié)合靶位點(diǎn)，即使外界污染有大量病原菌，由于失去了結(jié)合仔豬腸道上皮細(xì)胞的 能力，而不能感染易感仔豬。本發(fā)明的最大優(yōu)點(diǎn)在于該種受體阻斷劑與常規(guī)抗生 素藥物和疫苗的功效作用階段完全不同，后者是抵抗、抑制、中和體內(nèi)已侵襲感 染的ETEC病原菌，保護(hù)仔豬不發(fā)病，而前者則是阻止外界病原菌不能進(jìn)入動物 體內(nèi)，兩者比較，后者能最直接、最有效地封閉/阻止仔豬腸道上皮細(xì)胞受體靶 位點(diǎn)與F18和K88粘附素介導(dǎo)的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合，在臨床上用于 抗F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的預(yù)防。事實(shí)上，我們已將此受體阻斷劑產(chǎn) 品用于通常都發(fā)生斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病病例一些豬場，產(chǎn)生明顯保護(hù)效 果，對F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌感染的預(yù)防效果好，使用方法為仔豬 口服，非常筒單，很易于推廣應(yīng)用。它是一種全新的、廣譜的、非抗生素預(yù)防斷 奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的高科技生物制劑。該受體阻斷劑高科技生物制劑本身 不帶有任何抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，因而不會造成任何抗生素耐藥基因在病原 菌和動物機(jī)體的存在和傳播。
本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)和效果將在下面繼續(xù)描述。


圖1 一_功能性表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)Mi sL
P重組載體系統(tǒng)構(gòu)建圖。 圖2—一豬源優(yōu)勢益生素林載體菌EP2表面分泌表達(dá)的FedF和FaeG亞單位 系統(tǒng)構(gòu)建及其功能性展呈表達(dá)檢測圖。a.重組DNA技術(shù)涉及到ColE ori復(fù)制原點(diǎn)，PnirB啟動子，LTB信號肽，V型分泌系統(tǒng)MisL a linker+ p元件的克隆、鑒定。b.以F18ab/F18ac和K88ac大腸桿菌 大質(zhì)粒DNA為模板，釆用高保真PCR Kit擴(kuò)增FedF或FaeG,克隆 和序列測定。
圖3——V型分泌系統(tǒng)MisL |3 -FedF和FaeG重組質(zhì)粒MisL P -FedF和FaeG 的構(gòu)建圖。
圖4一_豬源優(yōu)勢益生素抹載體菌EP2菌林功能性展呈表面分泌表達(dá)的 F18FedF亞單位(a)和 K88FaeG亞單位(b)和仔豬腸道上皮細(xì)胞 表面受體的結(jié)合圖。
具體實(shí)施例方式
如圖1、圖2、圖3、圖4所示
受體阻斷劑是有效和功能性表面分泌表達(dá)F18FedF亞單位和K88FaeG亞單 位，即粘附素F18和K88受體結(jié)合域的益生素重組菌組合系歹'j,其制備為
1. 首先，自仔豬正常小腸粘膜材料分離、鑒定豬源大腸桿菌益生素林和豬源優(yōu)勢 乳酸桿菌益生素菌，進(jìn)一步通過仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試lir和體內(nèi)口服后 仔豬腸道定植、增殖試驗(yàn)細(xì)菌數(shù)檢測，篩選出對小腸上皮細(xì)胞粘附性能強(qiáng)、易 在仔豬腸道定植、定居和增殖的豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌，代號為EP2, 和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林，代號為LP2，并分別保存；
2. 選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌EP2,按大腸桿菌常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和增 殖；選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素林即LP2,按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；
3. 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2菌抹染色體ASD缺失突變林構(gòu)建。經(jīng) DNA遺傳修飾，即利用入噬菌體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失其菌林 染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬源優(yōu) 勢大腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變林，代號為EP2AASD，經(jīng)體外生 長特性，仔豬腸道定植、定居和增殖試驗(yàn)細(xì)菌數(shù)檢測和比較，EP2AASD缺失 突變林和EP2在體外生長特性，仔豬腸道定植、定居和增殖特性上基本一致；
4. 擴(kuò)增、鑒定FedF和FaeG亞單位基因。根據(jù)FedF和FaeG基因已知的發(fā)表序 列，以F18ab、 F18ac和K88ac優(yōu)勢血清型大腸桿菌大質(zhì)粒DNA為才莫板，采用 高保真PCR Kit擴(kuò)增上述亞單位基因FedF和FaeG，進(jìn)一步將3，末端帶有A 的PCR片殺:插入克隆載體pGEM-T,制備轉(zhuǎn)化工程菌DH5 A感受態(tài)細(xì)菌，經(jīng)藍(lán) 白斑篩選，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的重組質(zhì)粒pGEM-TDNA，序 列測定驗(yàn)證；
5. 表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)MisL p重組載體系統(tǒng)
構(gòu)建。按常規(guī)DNA重組技術(shù)操作，將編碼FedF和FaeG亞單位基因和V型分
泌系統(tǒng)的分泌表達(dá)載體Mi sL p分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切消化、連接后， 分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5&感受態(tài)細(xì)菌，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的 陽性質(zhì)粒DNA， PCR抬r測，結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)陽性和序列測定驗(yàn)證結(jié)果， 篩選到能功能性表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位的V型分泌系統(tǒng)MisL P重 組載體；
6. 鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半趁脫氫酶管家基因即ASD 完整編碼基因。根據(jù)ASD基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5 &染色體DNA 為模板，釆用長模板PCR法擴(kuò)增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特定 的限制性內(nèi)切酶PstI酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得ASD完整編 碼基因，約2Kb;
7. 表面分泌表達(dá)FedF和FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重 組載體系統(tǒng)構(gòu)建。步驟5中表面分泌表達(dá)FedF和FaeG粘附素亞單位基因的 MisL P重組載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于步驟5中MisL P重組栽體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，失活了原MisLP載體上的抗性基因活性，在 工程菌DH5 & ASD缺失突變林DH5 & AASD指示細(xì)胞中篩選出含表達(dá)ASD編 碼基因和表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因的MisLp重組栽體， 以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除了 MisL P原 載體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；
8. 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹載體菌ASD缺失突變林即EP2AASD構(gòu)建。經(jīng) DNA遺傳修飾，即利用人噬菌體Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失EP2 菌林染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬 源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變林即EP2厶ASD,經(jīng)體外生長 特性，仔豬腸道定植、定居和增殖試驗(yàn)檢測和比較，EP2AASD缺失突變林 和豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素抹EP2菌在體外生長特性，仔豬腸道定植、定居 和增殖特性上基本一致；
9. 大腸桿菌優(yōu)勢益生素EP2 △ ASD重組菌構(gòu)建和篩選。提取步驟7中表面分泌 表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重組質(zhì)粒載體 DM,經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌ASD缺失突變 林EP2 △ ASD內(nèi)，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的陽性重組質(zhì)粒DM, 結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)、仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗(yàn)和仔豬腸道定植 試-瞼細(xì)菌數(shù)才僉測陽性結(jié)果，篩選出能將FedF和FaeG兩種粘附素亞單位有效 和功能性展呈表面分泌表達(dá)在仔豬腸道上皮細(xì)胞的EP2AASD重組菌；
10. 豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌抹能有效促進(jìn)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌 和EP2△ ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖試驗(yàn)。分別選取EP2， EP2 △ ASD, EP2和LP2， EP2AASD和LP2四組益生素重組菌，用于一日齡仔 豬口服，經(jīng)仔豬腸道定植試驗(yàn)和細(xì)菌數(shù)檢測比較，豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素 菌林LP2能有效促進(jìn)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌EP2或EP2 △ ASD重組 菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖；
11. 受體阻斷劑產(chǎn)品制備。挑取步驟9中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2A ASD和步驟1中豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP2單個(gè)菌落在普通LB肉湯或常規(guī)M17 培養(yǎng)基37。C過夜培養(yǎng)18小時(shí)菌液作為種子液，再分別擴(kuò)大培養(yǎng)、增殖16 18小時(shí)，經(jīng)常規(guī)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，以菌落形成單位cfu度量，濃度達(dá)2 6x
.109cfu,重組菌EP2AASD, 重組菌EP2AASD和LP2擴(kuò)大培養(yǎng)菌液混合配 置而成益生素ASD缺失突變抹重組菌系列。
得到的受體阻斷劑產(chǎn)品是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌組合系列 為2種豬源優(yōu)勢益生素菌林，包括豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌和豬源優(yōu)勢乳 酸桿菌益生素菌林。豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌內(nèi)含分泌表達(dá)F18或Fed 粘附素亞單位基因FedF, K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的V型分泌系 統(tǒng)MlsL(3重組栽體，其中粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個(gè)血清型抗原變種， 是由F18產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，F(xiàn)18ab質(zhì)粒大小在48和98Mu 之間，而F18ac大質(zhì)粒在98Mu左右。粘附素Fed的表達(dá)和合成需要大質(zhì)粒基因 組中一組操縱子5個(gè)基因共同參與完成，它們分別是FedA、 B、 C、 E和F，其中 FedF亞單位為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，F(xiàn)18ab FedF和F18 ac FedF結(jié) 合相同的仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的共同功能性粘附素；粘 附素K88分為K88ab、 K88ac、 K88ad 3種血清型抗原變種，是由K88產(chǎn)腸毒素大 腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由FaeA到FaeJ共10個(gè)基因參與其菌毛粘附素 的生物合成，其中FaeG亞單位為為K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬 腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的功能性粘附素。
經(jīng)血清學(xué)凝集反應(yīng)檢測，研制成的受體阻斷劑產(chǎn)品能分別凝集兔或鼠抗 F18ab、 F18 ac和K88粘附素亞單位FedF和FaeG抗體，玻片凝集反應(yīng)效價(jià)達(dá) 1:10以上，經(jīng)仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗(yàn)檢測，受體阻斷劑具有對小腸上 皮細(xì)胞粘附能力強(qiáng)，動物體內(nèi)粘附試驗(yàn)檢測，最早用于一日齡仔豬,仔豬口服后 能在腸道最早4小時(shí)定植、定居、增殖，繼而在仔豬腸道上皮細(xì)胞表面功能性展 呈表達(dá)Fed粘附素亞單位FedF和Fae粘附素亞單位基因FaeG。由于粘附素亞單 位FedF和FaeG能特異性結(jié)合存在于仔豬小腸上皮細(xì)胞表面的大分子受體，當(dāng)受 體阻斷劑產(chǎn)品使用在仔豬后，定植、增殖在仔豬小腸上皮細(xì)胞并進(jìn)一步在其表面 功能性分泌表達(dá)FedF和Fae粘附素亞單位，該二種功能性表達(dá)的粘附素亞單位 其作用首先優(yōu)先和伃豬腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而封閉了腸道上皮細(xì)胞表 面大分子受體與F18和K88粘附素介導(dǎo)的ETEC病原菌結(jié)合的同樣靼位點(diǎn)，從而 失去了 F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌感染機(jī)體的第一步也是最最重要一步 的可能性，即失去病原菌其感染粘附素和宿主細(xì)胞表面相應(yīng)的特異性受體把位點(diǎn) 結(jié)合。在仔豬使用受體阻斷劑產(chǎn)品后，封閉了腸道上皮細(xì)胞表面大分子受體情況 下的仔豬，等同于體內(nèi)不存在上迷二種病原菌的特異受體，即使外界污染有大量 病原菌，由于病原菌失去了感染動物的作用靼位點(diǎn)，不再會發(fā)生感染，即使仔豬 體質(zhì)弱、抵抗力差，也不會感染發(fā)病。
本發(fā)明中，受體阻斷劑的制備方法由于采用了對小腸上皮細(xì)胞粘附能力強(qiáng)、 易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的豬源優(yōu)勢益生素菌林組合系列，其功能性分 泌表達(dá)FedF和Fae粘附素亞單位能長時(shí)間逗留在仔豬腸道，優(yōu)先并能長時(shí)間和 仔豬腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，抗感染作用持久。由于受體阻斷劑的制備方法 中含有FedF亞單位和FaeG亞單位，分別為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域和 K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，從而阻 止外界病原菌不能侵襲感染腸道并進(jìn)一步進(jìn)入動物體內(nèi)，與常規(guī)抗生素藥物和疫 苗的功效作用階段完全不同，后者是抵抗、抑制、中和體內(nèi)已侵襲感染的ETEC 病原菌，保護(hù)仔豬不發(fā)病，兩者比較，受體阻斷劑能最直接、最有效地封閉/阻 止仔豬腸道上皮細(xì)胞表面受體與F18和K88粘附素介導(dǎo)的產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原 菌的靼位點(diǎn)結(jié)合,在臨床上用于抗F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌感染的直接、高 效防治。受體阻斷劑最早可用于一 日齡仔豬，口服后能在仔豬腸道最早4小時(shí)定
植、定居、增殖和封閉仔豬腸道上皮細(xì)胞受體與F18和K88粘附素介導(dǎo)的產(chǎn)腸 毒素大腸桿菌病原菌的結(jié)合，使產(chǎn)下仔豬在很短時(shí)間內(nèi)由于口服受體阻斷劑而成 為非#感仔豬，應(yīng)用在實(shí)際生產(chǎn)中，因而能顯著提高預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水 腫病效果。
受體阻斷劑作為預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水肺病藥物的應(yīng)用 1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2，經(jīng)DNA遺傳修飾，其菌林染色體上 的天門冬氨酸半醛脫氳酶管家基因(ASD編碼基因)缺失，構(gòu)建出豬源優(yōu)勢大 腸桿菌益生素林載體菌ASD缺失突變林，經(jīng)體外生長特性，仔豬腸道定植、 定居和增殖試驗(yàn)檢測和比較，EP2 AASD缺失突變抹和豬源優(yōu)勢大腸桿菌益 生素;f朱EP2在上述特性上基本一致； 2 )表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL P重 組載體，經(jīng)重組DNA技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于表面分泌表達(dá)FedF 和FaeG粘附素亞單位基因的MisL P重組載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，失活了 原MisL P載體上的抗性基因活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變抹DH5 & △ ASD指示細(xì)胞中篩選出含表達(dá)ASD編碼基因和表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG 粘附素亞單位基因的MisL p重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生 素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除了 MisLP原載體上的氨卞青霉素抗性基因篩 選標(biāo)志；
3)上述益生素重組菌基于非抗生素抗性(ASD編碼基因)為選擇壓力的染色體 一一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌林構(gòu)建，本身不帶有任何抗生素抗性基因 篩選標(biāo)志，因而不會造成任何抗生素耐藥基因在病原菌和動物機(jī)體的存在 和傳播。
4 )豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素LP2菌抹能有效促進(jìn)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素 EP2和ASD缺失突變林EP2 A ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖， 能在仔豬腸道很快定植、定居、增殖。
5 )上述受體阻斷劑最早可用于一 日齡仔豬，口服2ml后能在仔豬腸道最早4
小時(shí)定植、定居、增殖，因而能顯箸提高預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病 發(fā)生效果。
一日齡仔豬10只口服使用本發(fā)明的2ml受體阻斷劑產(chǎn)品，十五日齡再次口 服2ml ，至三十五日齡時(shí)，用F18和K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌病原菌人工感染， 沒有一只仔豬發(fā)生仔豬水腫病和出現(xiàn)腹瀉癥狀，攻毒保護(hù)率達(dá)100%。選擇原先 每窩仔豬通常都發(fā)生斷奶仔豬腹瀉的3個(gè)豬場和仔豬水腫病的3個(gè)豬場，使用本 發(fā)明的受體阻斷劑產(chǎn)品后，不再發(fā)生斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病。原患有斷奶仔 豬腹瀉仔豬，即使采用常規(guī)治療方法即口服或注射復(fù)合抗生素，療程5 7天， 一般治療效果不佳，大多耐過治愈的仔豬，引發(fā)胃腸道和機(jī)體抵抗力下降，易繼 發(fā)或并發(fā)多種疾病，生長較慢，飼料報(bào)酬較高，生產(chǎn)性能也會影響，因而生產(chǎn)效 益明顯降低。由于本發(fā)明的受體阻斷劑是一種全新的、非抗生素預(yù)防斷奶仔豬腹 渴和仔豬水腫病策略和途徑，而使用本發(fā)明受體阻斷劑產(chǎn)品后，可望在斷奶仔豬 腹瀉和仔豬水腫病的治療和預(yù)防上大大減少或沒有抗生素使用，也預(yù)期著本發(fā)明 的受體阻斷劑替代基因工程苗和常規(guī)疫苗使用。
權(quán)利要求
1.預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的受體阻斷劑，其特征在于受體阻斷劑是益生素重組菌組合系列，該益生素重組菌系列為2種豬源優(yōu)勢益生素菌株，其中1種為豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2，第2種為豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌株LP2，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌內(nèi)含表面分泌表達(dá)F18或Fed粘附素亞單位基因FedF，K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的MisL β重組載體，其中粘附素F18分為F18ab和F18ac 2個(gè)血清型抗原變種，是由F18產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，F(xiàn)18ab質(zhì)粒大小在48和98Mu之間，而F18ac大質(zhì)粒在98Mu左右。粘附素Fed的表達(dá)和合成需要大質(zhì)粒基因組中一組操縱子5個(gè)基因共同參與完成，它們分別是FedA、B、C、E和F，其中FedF亞單位為F18大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，F(xiàn)18ab FedF和F18ab FedF結(jié)合相同的仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的共同功能性粘附素；粘附素K88分為K88ab、K88ac、K88ad 3種血清型抗原變種，是由K88產(chǎn)腸毒素大腸桿菌野生型大質(zhì)粒DNA編碼，由FaeA到FaeJ共10個(gè)基因參與其菌毛粘附素的生物合成，其中FaeG亞單位為為K88大腸桿菌粘附素受體結(jié)合域，結(jié)合仔豬腸上皮細(xì)胞表面大分子受體，為高度保守的功能性粘附素。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體阻斷劑的制備方法，其步驟如下(1) 豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2 分離自仔豬正常小腸粘膜，按常規(guī)細(xì)菌法分離、鑒定，符合大腸桿菌和乳 酸桿菌形態(tài)、培養(yǎng)和生物學(xué)的一般特性，進(jìn)一步通過仔豬小腸上皮細(xì)胞體 外粘附試驗(yàn)和體內(nèi)口服后仔豬腸道定植、增殖試驗(yàn)細(xì)菌數(shù)檢測，篩選出對 小腸上皮細(xì)胞粘附能力強(qiáng)、易能在仔豬腸道定植、定居和增殖的EP2和 LP2 二種細(xì)菌并保存；(2) 選取豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2，按大腸桿菌常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)和 增殖，選取豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌LP2，按乳酸桿菌常規(guī)培養(yǎng)和增殖；(3 )擴(kuò)增、鑒定FedF和FaeG亞單位基因，根據(jù)FedF和FaeG基因已知的發(fā)表 序列，以F18ab、 F18ac和K88ac優(yōu)勢血清型大腸桿菌大質(zhì)粒DNA為模板， 采用高保真PCR Kit擴(kuò)增上述亞單位基因FedF和FaeG,進(jìn)一步將3，末 端帶有A的PCR片段插入克隆載體pGEM-T,制備轉(zhuǎn)化工程菌DH5 a感受態(tài) 細(xì)菌，經(jīng)藍(lán)白斑篩選，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含目的片段的重組質(zhì)粒 pGEM-T DNA,序列測定驗(yàn)證；(4 )表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位基因的V型分泌系統(tǒng)MisL β重組載體 系統(tǒng)構(gòu)建，按常規(guī)DNA重組技術(shù)操作，將編碼FedF、 FaeG亞單位基因和 V型分泌系統(tǒng)的分泌表達(dá)載體MisL β分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切消化、 連接后，分別轉(zhuǎn)化工程菌DH5 a感受態(tài)細(xì)菌，從篩選的培養(yǎng)菌液中提取含 目的片段的陽性質(zhì)粒DNA， PCR檢測，結(jié)合細(xì)菌粘附素凝集反應(yīng)陽性和序 列測定驗(yàn)證結(jié)果，篩選到能功能性表面分泌表達(dá)FedF和FaeG亞單位的V 型分泌系統(tǒng)MisLβ 重組載體；(5)鑒定、克隆編碼大腸桿菌染色體上的天門冬氨酸半醛脫氫酶管家基因即 ASD完整編碼基因根據(jù)上述基因已知的發(fā)表序列，以工程菌DH5a敘染色 體DNA為模板，采用長距離PCR法擴(kuò)增ASD完整基因，核酸分子雜交檢測，經(jīng)特定的限制性內(nèi)切酶Pstl酶切消化結(jié)合核苷酸序列分析而最后獲得 ASD完整編碼基因，約2Kb大??；(6 )表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重 組載體系統(tǒng)構(gòu)建。步驟5中表面分泌表達(dá)FedF和FaeG祐附素亞單位基因 的MisL p重組載體，經(jīng)重組DM技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于步驟5中 MisLp重組載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，失活了原MisLP載體上的抗性基因 活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變株DH5 & △ ASD指示細(xì)胞中篩選出含表 達(dá)ASD編碼基因和表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因的MisL P 重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選標(biāo)志，且祛除 了 MisL P原載體上的氨卞青霉素抗性基因歸選標(biāo)志；(7)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌構(gòu)建和篩選，提取含表面分泌表達(dá) FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisLp重組質(zhì)粒載體 DNA，經(jīng)DNA轉(zhuǎn)化法分別導(dǎo)入豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素載體菌EP2內(nèi)，從 篩選的培養(yǎng)菌液中提取舍目的片段的陽性重組質(zhì)粒DNA，結(jié)合細(xì)菌粘附素 凝集反應(yīng)、仔豬小腸上皮細(xì)胞體外粘附試驗(yàn)和仔豬腸道定植試驗(yàn)細(xì)菌數(shù)檢 測陽性結(jié)果，篩選出能將FedF和FaeG兩種粘附素亞單位有效和功能性展 呈和分泌表達(dá)在仔豬腸道上皮細(xì)胞的EP2重組菌表面；(8 )受體阻斷劑產(chǎn)品制備糸沐步驟(7 )中豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重 組菌和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌LP2單個(gè)菌落，在37。C過夜培養(yǎng)18小時(shí)菌液作 為種子液，再分別擴(kuò)大培養(yǎng)、增殖16 18小時(shí)，經(jīng)常規(guī)細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)， 以菌落形成單位cfu度量，濃度達(dá)2 6 x 109cfu，重組菌EP2和LP2擴(kuò)大 培養(yǎng)菌液混合配置而成益生素重組菌系列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體阻斷劑作為預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病藥物 的應(yīng)用，其特征在于1)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌EP2,經(jīng)DM遺傳修飾，即利用A噬菌體 Red重組酶系統(tǒng)和同源重組技術(shù)，缺失其菌林染色體上的天門冬氨酸半醛脫 氫酶管家基因即ASD編碼基因，構(gòu)建出豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素林載體菌 ASD缺失突變沖朱EP2 △ ASD;2 )表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位基因和ASD編碼基因的MisL p重組載體，經(jīng)重組DM技術(shù)操作，插入ASD編碼基因于表面分泌表達(dá)FedF和FaeG 粘附素亞單位基因的MisL 3重組載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域，失活了原MisL P 載體上的抗性基因活性，在工程菌DH5 & ASD缺失突變林DH5 & AASD指示細(xì) 胞中篩選出含表達(dá)ASD編碼基因和表面分泌表達(dá)FedF、 FaeG粘附素亞單位 基因的MisLP重組載體，以ASD存在為篩選標(biāo)志替代抗生素抗性基因篩選 標(biāo)志，且祛除了 MisL p原載體上的氨卞青霉素抗性基因篩選標(biāo)志；3 )豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2重組菌基于ASD非抗生素抗性為選擇壓力的染色體_一質(zhì)粒致死平衡系統(tǒng)的載體菌抹構(gòu)建，其系統(tǒng)本身不帶有任何抗生素 抗性基因篩選標(biāo)志；4) 豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌林LP2能有效促進(jìn)豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素EP2 重組菌和其ASD缺失突變林EP2 △ ASD重組菌在仔豬腸道的定植、定居和增殖；5) 受體阻斷劑產(chǎn)品用于一日齡仔豬，口服2ml 4小時(shí)后能在仔豬腸道定植、定 居、增殖。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種預(yù)防斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病的受體阻斷劑、制備以及應(yīng)用。本發(fā)明受體阻斷劑是益生素重組菌組合系列，豬源優(yōu)勢大腸桿菌益生素重組菌EP2和豬源優(yōu)勢乳酸桿菌益生素菌株LP2，表達(dá)F18或Fed粘附素亞單位基因FedF，K88或F4或Fae粘附素亞單位基因FaeG的MisLβ重組載體，菌體表面良好展呈表達(dá)抗原技術(shù)，仔豬口服后能在腸道很快定植、定居、增殖，且在腸道上皮細(xì)胞表面功能性展呈分泌表達(dá)的高度保守的共同功能性粘附素FedF和FaeG，即F18和K88粘附素受體結(jié)合域，優(yōu)先和仔豬腸道上皮細(xì)胞表面受體結(jié)合，從而控制斷奶仔豬腹瀉和仔豬水腫病。解決了現(xiàn)有抗生素臨床治療存在的基本無效，其患水腫病的仔豬病程結(jié)局大多死亡和導(dǎo)致多種耐藥性的缺陷。
文檔編號A61K35/66GK101199556SQ20071019146
公開日2008年6月18日 申請日期2007年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月19日
發(fā)明者原志偉, 張建軍, 朱國強(qiáng), 朱曉芳, 王建業(yè), 董國雄 申請人:揚(yáng)州大學(xué)